CN112899383B

CN112899383B - 一种基于实时荧光rpa技术的鼠疫耶尔森菌检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN112899383B
Application number: CN202110175761.0A
Authority: CN
Inventors: 袁媛; 王景林; 宋亚军; 李佳欣; 辛文文; 康琳; 王菁; 李岩伟; 高姗
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2021-02-09
Filing date: 2021-02-09
Publication date: 2021-11-23
Anticipated expiration: 2041-02-09
Also published as: CN112899383A

Abstract

本发明公开了一种基于实时荧光RPA技术的鼠疫耶尔森菌检测试剂盒及其应用，所述试剂盒成套试剂，由引物对和名称为YPS723‑1‑P1的探针组成，所述引物对由名称分别为YPS723‑F1和YPS723‑R1的单链DNA组成。本发明的试剂盒能够快速、便携、灵敏度高、特异性好的检测鼠疫耶尔森菌，有望成为临床样本的快速诊断辅助工具。

Description

一种基于实时荧光RPA技术的鼠疫耶尔森菌检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及一种基于实时荧光RPA技术的鼠疫耶尔森菌检测试剂盒及其应用。

背景技术

鼠疫(plague)是由革兰氏阴性菌鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis，以下简称“鼠疫菌”)引起的烈性传染病，可通过跳蚤在啮齿类动物中引起大规模流行。居住在鼠疫疫源地附近的人类可通过接触感染的动物或者跳蚤叮咬而被感染。鼠疫在人与人之间可通过污染性气溶胶进行传播，且有效传播距离仅需2米，如果患者在症状出现后不尽快进行抗生素治疗，很可能危及生命。此外，鼠疫菌一直被认为是典型的生物战剂之一。目前，鼠疫在全世界已造成2亿多人死亡。在我国，自然疫源地的鼠间鼠疫一直存在，而近年来出现的人间鼠疫(2019-2020年先后确诊7例鼠疫患者)引起人们的广泛关注。鼠疫因其传染速度快、传染性强、发病急剧、致死率高等特点，如果防控不及时，极易形成大流行，引起公众恐慌和社会混乱。为了能够实现对该菌疫源地的快速筛查和精准医疗的实施，及时预防和控制鼠疫，降低对人类社会带来的恶劣影响，快速准确诊断该病原体尤为重要。目前，公认检测鼠疫菌的常用方法主要有分离培养病原菌，酶联免疫吸附测定(ELISA)，实时荧光PCR(qPCR)等。这些方法虽然可准确的检测到鼠疫菌，但是较长的测定时间(不少于几个小时)，昂贵精密的仪器(如，qPCR仪器)，专业的生物技术人员和较高的实验环境要求限制了野外及现场检测。

重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)是近年来新兴的一项核酸检测技术，目前已用于多种传染源的核酸检测。常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，而RPA反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下即可快速进行^[5]。优化后的RPA引物一般可在39℃左右十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。此外，由于不需要温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。

发明内容

本发明的目的在于：应用实时荧光RPA技术为鼠疫的现场快速诊断和流行病调查提供一种全新的技术支持。

本发明提供一种成套试剂，由引物对和名称为YPS723-1-P1的探针组成，所述引物对由名称分别为YPS723-F1和YPS723-R1的单链DNA组成；

所述YPS723-F1为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(a2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述YPS723-R1为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

(a4)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；

所述YPS723-1-P1依次由DNA片段甲、四氢呋喃和DNA片段乙组成；所述DNA片段甲为序列4所示的单链DNA分子；所述DNA片段乙为序列5所示的单链DNA分子。

其中，所述YPS723-F1、所述引物YPS723-R1和所述探针YPS723-R1的摩尔量比为7:7:2；

所述DNA片段甲自5’端起最后一位碱基T为荧光基团修饰的碱基T，所述荧光基团可为FAM、6-FAM、FITC、HEX、JOE、Phosphate、Rhodamine Green、Rhodamine Red、RhodamineB、ROX、TAMRA、NBD、TET或DyLight 770；所述荧光基团具体为FAM；

所述DNA片段乙自5’端起第二位碱基T为淬灭基团修饰的碱基T；所述淬灭基团可为DABCYL、TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2或BHQ3；所述淬灭基团具体为BHQ1。

所述探针中的DNA片段乙的3’端用C3 spacer修饰。

所述的由YPS723-F1和YPS723-R1组成的引物对也应在本发明的保护范围之内。

所述引物对在制备用于检测鼠疫耶尔森菌的试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。

所述引物对在制备用于检测待测样本是否含有鼠疫耶尔森菌的试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。

本发明提供一种试剂盒，包括所述成套试剂。

所述试剂盒的功能为制备用于鉴定鼠疫耶尔森菌的试剂盒或者制备用于检测待测样本是否含有鼠疫耶尔森菌的试剂盒也应在本发明的保护范围之内。

本发明提供一种试剂盒，包括所述的由YPS723-F1和YPS723-R1组成的引物对。

本发明开发了一种快速、便携、灵敏度高、特异性好的核酸等温扩增方法来检测鼠疫耶尔森菌，有望成为临床样本的快速诊断辅助工具。该技术方法前景广阔，将来其上游也可与核酸免提取技术结合，下游与测流层析试纸结合研发，使之能更好的应用于条件艰苦环境下(如疫源地、战现场等)的现场筛查。

附图说明

图1为鼠疫菌实时荧光RPA检测技术灵敏度评价。

图2为鼠疫菌实时荧光RPA检测技术的特异性检验。

图3为实时荧光RPA检测模拟样本灵敏度分析。

图4为模拟盲样样本检测。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)在文献《程鹏博，陆灏，曹超越，蒋南，张丽丽，赵月峨，鹿建春，周冬生，胡凌飞，杨文慧.鼠疫耶尔森菌caf1基因缺失株体外生物学特性和对小鼠致病性分析.中国人兽共患病学报[J],2020,36(8):605-610》中公开；炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthraci)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderiapseudomallei)、鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei)、牛布鲁氏菌(Brucellabovis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)菌株均在文献《张玲,翟俊辉,周冬生,郭兆彪,王津,杨瑞馥.荧光定量PCR快速检测炭疽芽孢杆菌的实验研究.中国人兽共患病杂志.2005,21(11):976-9》中公开，上述菌种公众均可由中国人民解放军军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所获取。将上述1mL灭活供试细菌菌液采用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，货号DP320)提取菌液全基因组DNA，用100μL TE缓冲液洗脱，采用Qubit 3.0荧光法进行基因组核酸定量。

下述实施例中的高保真酶PrimeSTAR HS DNAPolymerase(TaKaRa)；UniversalDNA Purification Kit(TianGen)；A-overhang mixture(TaKaRa)；Peasy-T1 SimpleCloning Vector(transgen)；Trans1-T1感受态细胞(transgen)；TIANprep Mini PlasmidKit(中国天根生化有限公司)；荧光RPA扩增试剂盒

引物及探针(生工生物工程股份有限公司)；RPA仪器(OptiGene，Genie II)。

实施例1

1细菌基因组模板的制备

1.1将1mL热灭活鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)菌液采用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，货号DP320)提取菌液全基因组DNA，用100μL TE缓冲液洗脱，采用Qubit 3.0荧光法进行基因组核酸定量，得到鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)的基因组模板。

1.2分别将步骤1.1中的鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)替换为炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthraci)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderiapseudomallei)、鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei)、牛布鲁氏菌(Brucella bovis)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，其他操作不变，得到各菌株的基因组模板。

2引物探针设计

实时荧光RPA引物设计选择鼠疫菌的特异性片段(YPS723)(其序列如序列表中的序列1所示)作为靶序列进行检测，利用常用的PCR设计软件Primer Premier 6，更改该软件的默认参数(对引物Tm值，长度和扩增片段长度等参数进行相应的更改)，利用该软件对靶序列设计RPA引物；按照荧光法RPA探针设计原则(英国TwistDX公司RPA试剂盒说明书)设计相应探针。引物和探针均由上海生工生物工程股份有限公司合成，其序列及修饰见表1。

表1靶序列，引物与探针

表1中的YPS723-1-P1表示探针序列为：ATTATTATCTTTAACTCTGATGGAATTACTGT(序列4)(THF)ATGGTAACATCTGGAGAG[C3 spacer](序列5)。其中，序列4自5’端起最后一位胸腺嘧啶核苷酸为修饰了FAM荧光报告基团胸腺嘧啶核苷酸(FAMdT)，序列5自5’端起第二位胸腺嘧啶核苷酸为修饰了BHQ1荧光淬灭基团的胸腺嘧啶核苷酸(BHQ1dT)；；C3-spacer：序列5的3’端用C3-spacer修饰。

表1中的YPS723-1-P2表示探针序列为：AGAGAATGCGTCATACGAATTCTTCACCAATTC(序列6)(THF)TTCAAAGCAAAGAGTGAT。其中，序列4自5’端起最后一位胸腺嘧啶核苷酸为修饰了FAM荧光报告基团胸腺嘧啶核苷酸(FAMdT)，序列5自5’端起第二位胸腺嘧啶核苷酸为修饰了BHQ1荧光淬灭基团的胸腺嘧啶核苷酸(BHQ1dT)。

3阳性参考质粒的构建

选择鼠疫菌的特异性片段(YPS723)作为靶序列进行检测。利用Primer Premier 6软件对上述靶序列设计PCR引物，以提取的基因组DNA为模板，利用高保真酶PrimeSTAR HSDNA Polymerase(TaKaRa)对目的片段进行PCR扩增，得到的产物使用Universal DNAPurification Kit(TianGen)进行纯化。利用A-overhang mixture(TaKaRa)对纯化产物3’端添加“A”碱基，随后加入Peasy-T1 Simple Cloning Vector(Ttransgen)完成T-A克隆，克隆完成后，转入Trans1-T1感受态细胞(transgen)，向感受态细胞中加入500μL LB培养液，37℃，180r/min培养1h，随后离心浓缩，并将浓缩后的菌液涂板，37℃下培养12-16h，用挑菌环挑取单菌落转入5mL LB培养液中37℃，180r/min，培养6-8h。培养结束后，吸取部分菌液煮沸离心，取上清液作为模板进行PCR，并用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将含有目的条带的菌液测序进行进一步确认。确定无误后，利用TIANprep Mini Plasmid Kit(TianGen)提取质粒。

4RPA引物与探针的设计与筛选

目前对于RPA引物设计的技术提示信息极其有限。相比于普通PCR，人们对RPA技术的研究还不够透彻。RPA技术需要特殊的引物设计，RPA分析的关键在于扩增引物或探针的设计。普通PCR引物多半不适用于该技术，因为RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-35个碱基。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。在设计RPA引物时，在避免形成二级结构、引物-引物互作、发夹结构的序列，减少引物二聚体的等方面难以全部满足。在本研究中，我们首次通过更改常用引物设计软件Primer Premier 6的默认参数(对引物Tm值，长度和扩增片段长度等参数进行相应的更改)，利用该软件对鼠疫菌染色体特异靶序列(YPS723)设计了两对RPA引物，采用基础RPA扩增对引物进行筛选。对于扩增信号强的引物进一步设计相应的探针并利用实时荧光RPA进行探针的筛选。

采用基础RPA反应筛选RPA引物：按RPA试剂盒(TwistAmpTM Basic Kit；货号：INTABAS)方法进行RPA的扩增反应，反应体系为50μL：综合基础反应缓冲液29.5μL，RPA引物(10μM)各2.4μL，ddH2O 11.32μL与阳性参考质粒2μL充分混匀。打开反应单元，在管盖上加入2.5μL的280mM醋酸镁(MgOAc)，充分混匀。盖上盖子后稍离心，迅速放入Genie II等温扩增仪系统进行RPA反应。反应条件：39℃，20min，进行凝胶电泳检查扩增情况。其中RPA引物分别为表1中的YPS723-F1/R1，YPS723-F2/R2。

采用实时荧光RPA反应筛选RPA探针：使用TwistampTM exo Quick Kit(TwistDX)试剂盒进行实时荧光-RPA扩增，反应体系为50μL：将表1中RPA引物(10μM)各2.1μL，探针(10μM)0.6μL，基础缓冲液29.5μL，ddH2O 11.2μL与阳性参考质粒2μL充分混匀后，加入到基础反应单元，并充分混匀。打开反应单元，在管盖上加入2.5μL的280mM醋酸镁(MgOAc)，充分混匀。使用Genie II等温扩增仪39℃下反应15min并采集荧光信号。其中RPA引物和探针分别为表1中的YPS723-F1/R1，YPS723-1-P1，YPS723-1-P2。

经基础RPA反应，RPA引物对1(YPS723-F1/R1)比RPA引物对2(YPS723-F1/R1)扩增的目的条带亮度更强。针对RPA引物对1扩增序列设计了2条备选探针(YPS723-1-P1，YPS723-1-P2)，采用实时荧光RPA反应评价备选探针，最终探针YPS723-1-P1荧光信号更强，效果更佳。

实施例2灵敏性分析

为了验证实时荧光RPA反应的灵敏度，将含有目的片段的质粒(即实施例1步骤3中制备的阳性质粒)按照10倍倍比稀释，使其浓度分别在10⁴～10^-1拷贝/μL之间，以稀释的质粒为模板与筛选出的鼠疫菌RPA引物(YPS723-F1/R1)和探针(YPS723-1-P1)进行实时荧光RPA反应，并且用无核酸水做阴性对照，反应体系实施例1中所述，反应结果如图1所示，图1中，A为灵敏度荧光图，从上至下各扩增曲线使用阳性质粒模板浓度分别为10⁴-10^-1拷贝数/μL；B为独立重复性检测散点图，n＝4次独立重复实验，t检验，ns，不显著；*，p<0.05；**，P<0.01；***，p<0.001。

图1A可以看出，荧光信号会随着拷贝数的增加而提前，即使当模板浓度达到10¹拷贝/μL时，在8分钟后就可看到明显的荧光信号(图1A)。为了检验灵敏度的稳定性，我们将实验重复了4次，4次灵敏度均可达到10¹拷贝/μL(图1B)。

实施例3特异性分析

将炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthraci)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderiapseudomallei)、鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderiamallei)、牛布鲁氏菌(Brucellabovis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、土拉弗朗西斯菌(Tularaemia)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、创伤弧菌(vibriovulnificus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)15种病原菌DNA混合基因组进行特异性验证分析，并且以鼠疫耶尔森菌DNA为阳性对照。

具体实验步骤为：分别将实施例1中的步骤1中的15中病原菌的基因组的混合基因组为模板，与筛选出的鼠疫菌RPA引物(YPS723-F1/R1)和探针(YPS723-1-P1)进行实时荧光RPA反应，反应体系实施例1中所述，以鼠疫耶尔森菌的基因组模板作为阳性对照，反应条件相同，反应结果如图2所示，图2中，A为特异性荧光图；B为独立重复性检测散点图，n＝4次独立重复实验，t检验，ns，不显著；*，p<0.05；**，P<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001。

用15种非鼠疫菌细菌混合全基因组来检测实时荧光RPA的特异性，并用鼠疫菌基因组作为阳性对照。结果如图2所示：只有鼠疫菌DNA结果呈阳性，非鼠疫菌细菌混合基因组和空白对照均未扩增，说明引物探针及方法的特异性良好(图2A所示)。为了检验特异性的稳定性，我们将特异性检验实验重复了4次，4次结果一致(图2B)。

实施例4模拟样本的制备及实时荧光RPA检测

1.实时荧光RPA检测血液模拟样本灵敏度分析

血液样本是临床和实验室诊断鼠疫的常见样本，将实施例1中步骤1提取的鼠疫菌全基因组核酸梯度后加入到人血清和小鼠全血样本中，使样本中核酸浓度为5pg/μL，500fg/μL，50fg/μL，5fg/μL，并以未加入鼠疫菌核酸的血液样本作为阴性对照，使用

DNA Mini Kit(QIAGEN)对模拟的样本进行提取核酸，以提取的核酸为模板与筛选出的鼠疫菌RPA引物(YPS723-F1/R1)和探针(YPS723-1-P1)进行实时荧光RPA反应，结果如图3所示。图3为实时荧光RPA检测模拟样本灵敏度分析。其中，A为人血清模拟样本；B为鼠全血模拟样本。

从图3中可以看出，鼠疫菌核酸梯度稀释后分别加入到人血清样本和鼠全血样本中，提取核酸后进行实时荧光RPA检测，结果显示，人血清样本和鼠全血样本最低检测浓度均为50fg/μL(图3A,B)。

2.血液模拟盲样样本检测

为了验证实时荧光RPA样本的实用性，分别在10份人血清，10份小鼠全血样本中各随机选取5份加入灭活鼠疫菌并充分混合，并对20份样本进行盲测：以20份样本煮沸离心后的上清液为模板与筛选出的鼠疫菌RPA引物。

(YPS723-F1/R1)和探针(YPS723-1-P1)进行实时荧光RPA反应，结果如图4所示。图4为模拟盲样样本检测；其中，A为人血清模拟样本，实际加入鼠疫菌全基因组的样本为2、4、5、8、9；B为鼠全血模拟样本，实际加入鼠疫菌全基因组的样本为3、4、5、7、8。

从图4中可以看出，检测人员分别对10个人血清模拟样本，10个小鼠全血样本进行盲测，结果正确率高达100％(图4)，说明本研究建立的鼠疫菌RPA检测技术具有较好的特异性，与人和小鼠宿主血液基因组无交叉反应。

在鼠疫出现的早期，快速诊断对于预防疫情的大范围传播，避免酿成惨痛的后果至关重要。由于鼠疫的暴发主要出现在农村等偏远地区，交通不便，缺少专业的实验室检测设备，因此需要能够便携至疫源地进行快速，准确诊断的技术设备。在本研究中，我们对RPA引物进行了筛选和优化，最终获得一组高灵敏度的引物探针组合(YPA723-F1,YPS723-R1,YPS723-1-P1)(表1)。利用这组引物探针可检测到浓度为10拷贝/μL的样本，且整个过程仅需8min便可看到明显的阳性结果(图1)。为了评价引物探针的特异性，我们将15种非鼠疫菌细菌DNA混合在一起，以鼠疫菌DNA为阳性对照，实时荧光RPA可以很容易的扩增和检测出正确的核酸靶点(图2)，我们将一定量的鼠疫菌基因加入至人类血清，小鼠全血制备模拟样本，提取核酸后进行实时荧光RPA，两种模拟样本最低检测浓度均可达到50fg/μL(图3)。为了进一步确定实时荧光RPA的实用性，制备了模拟-盲样样本，模拟-盲样样本仅进行了煮沸、离心处理便进行实时荧光RPA实验，检测正确率高达100％(图4)，并且没有加入鼠疫菌基因组的样本没有产生扩增信号，模拟样本的检测充分反应了该技术方法良好的灵敏性和特异性。RPA反应可在小型(250*165*85mm)、重量轻(1.75KG)、带锂电池的便携式设备(OptiGgene Genie II)上进行，非常便于现场检测，并且根据荧光强度可以方便直观地读出实验结果，对操作人员技术要求不高。以上所说的这些特点均有利于野外鼠疫菌的快速，准确鉴定。

总之，本发明开发了一种快速、便携、灵敏度高、特异性好的核酸等温扩增方法来检测鼠疫耶尔森菌，有望成为临床样本的快速诊断辅助工具。该技术方法前景广阔，将来其上游也可与核酸免提取技术结合，下游与测流层析试纸结合研发，使之能更好的应用于条件艰苦环境下(如疫源地、战现场等)的现场筛查。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种基于实时荧光RPA技术的鼠疫耶尔森菌检测试剂盒及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 424

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caccaaactt aaaggctgat aaaaaaccca gtccttttga accttgaaca attctcttta 60

ttccattctg acttacttcg caaccatatt ttttagtgct ttttgatata tgaaataaag 120

aatgaatttc gtctaccgac ataccgtttc cgtaatcgga aattattatc tttaactctg 180

atggaattac tgtaatggta acatctggag agaatgcgtc atacgaattc ttcaccaatt 240

cattcaaagc aaagagtgat gaaggtattt tttgagatag ttcctcaatt atcttcccac 300

caaatttcaa tgacgtagac accatatata aaaactccct ctcaaaaaat taaataacgt 360

tattcaaaat agcattactt cctcattata agaatcaatt ctttatccat cgtattagca 420

atgc 424

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgaatttcgt ctaccgacat accgtttccg taatc 35

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggtgtcta cgtcattgaa atttggtggg aag 33

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

attattatct ttaactctga tggaattact gt 32

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggtaacat ctggagag 18

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agagaatgcg tcatacgaat tcttcaccaa ttc 33

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttcaaagcaa agagtgat 18

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

actgtaatgg taacatctgg agagaatgcg tcata 35

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggtgtcta cgtcattgaa atttggtggg aag 33

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caccaaactt aaaggctgat 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcattgctaa tacgatggat 20

Claims

1.引物对和探针在制备检测待测样本中是否含有鼠疫耶尔森菌的成套试剂中的应用，所述成套试剂由引物对和名称为YPS723-1-P1的探针组成，所述引物对由YPS723-F1和YPS723-R1组成；

所述YPS723-F1为序列表的序列2所示的单链DNA分子；

所述YPS723-R1为序列表的序列3所示的单链DNA分子；

所述YPS723-1-P1依次由DNA片段甲、四氢呋喃和DNA片段乙组成；所述DNA片段甲为序列4所示的单链DNA分子；所述DNA片段乙为序列5所示的单链DNA分子；所述DNA片段甲自5’端起最后一位碱基T为荧光基团修饰的碱基T，所述DNA片段乙自5’端起第二位碱基T为淬灭基团修饰的碱基T。

2.权利要求1所述的成套试剂在制备用于检测待测样本是否含有鼠疫耶尔森菌的试剂盒中的应用。