CN102286617B - 斑疹伤寒群立克次体荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测无形体及立克次体等5种病原体实时荧光定量PCR试剂盒及其方法。本发明依据无形体及立克次体等5种病原体特异基因核苷酸序列设计了特异寡核苷酸引物和探针。本发明提供了检测无形体及立克次体的方法和以特异性引物所组成的高灵敏性检测试剂盒。所述试剂盒操作简便、快速，灵敏度高且特异性强。采用本发明的试剂盒可对5种相关立克次体进行快速特异性检测并且适于在临床实验室及疾病监测组织实验室使用。本发明还公开了利用试剂盒检测无形体及立克次体的方法。
Description
技术领域
本发明涉及无形体及立克次体等5种病原体的检测试剂盒及方法。具体而言，本发明涉及以无形体及立克次体等5种病原体特异基因高度保守核苷酸序列为基础，设计特异性的寡核苷酸引物和探针，采用实时荧光定量PCR技术组装无形体及立克次体检测试剂盒，本发明也涉及其检测方法。
无形体、恙虫病东方体、斑点热群立克次体、斑疹伤寒、贝氏柯克斯体均属于立克次体目致病成员。
无形体病是严重威胁人、畜健康的新发蜱传自然疫源性立克次体病，由嗜吞噬粒细胞无形体感染引起。目前美国CDC已经将该病列为法定报告传染病。人类感染主要通过硬蜱的叮咬而传播。2006年，我国安徽省某医院却发生了人-人传播的院内感染事件。大量的病原学、分子生物学及血清学调查数据证实上述疾病普遍存在我国及周边国家。2006年，我国天津地区农业人群血清抗体流行率8.8％，连续动态监测结果显示，该病人群血清流行率明显增加。全国农业人群调查结果显示，平均阳性率为13.9％。该病病死率为1-5％。作为新发传染病，该病还没有得到足够认识。
恙虫病(tsutsugamushi disease，scrub typhus)是由恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi，Ot)引起的自然疫源性疾病，主要分布于热带、亚热带的亚太平洋地区，在我国广泛分布。以鼠类为主要传染源，经恙螨幼虫叮咬而传给人。临床上以发热、焦痂或溃疡、淋巴结肿大及皮疹为特征。恙虫病又名丛林热斑疹伤寒，在我国有悠久的历史。早在晋朝的《肘后方》和《抱朴子》中记载一种名沙虱的小虫能致沙虱毒，并详细记载了该病的流行病学、症候学、预防和治疗等。明朝李时珍在《本草纲目》中记述闽粤有一种恶生流行热症，系由沙虱传染，其症状有溃疡、发热和疹子，此种记载与今日恙虫病的特征相符。
1948年广东报告了恙虫病的第一例病例。1985年以前，我国恙虫病仅在北纬31°以南的广大地区流行，即南方疫源地，流行范围东至台湾、福建，西至云南、四川和西藏南部，南至海南、广东和广西，北至浙江和湖南、江西诸省区均有流行。1986年以来，我国恙虫病疫源地北移的现象已被许多学者的调查研究所证实。目前，除个别省份没有报道外，全国均有散发或局部流行爆发。
斑点热群立克次体(SFGR)属于立克次体属，是一种专性细胞内寄生的革兰阴性菌，在世界范围内广泛分布。该病原体可通过蜱、螨及蚤进行垂直或水平传播，并在脊椎动物和节肢动物中循环，这些动物对SFGR在自然界中的持久循环起着重要作用。然而，近年来通过血清学和分子流行病学调查发现在家畜和宠物中立克次体病的感染率很高，说明人的患病风险也不断增加。
斑疹伤寒是严重威胁人类健康最古老的立克次体病。当前，世界反生物恐怖已将流行性斑疹伤寒病原体列为生物战剂名录。斑疹伤寒分为流行性斑疹伤寒及地方性斑疹伤寒两种，前者主要通过体虱传播-既人-体虱-人；而后者主要通过鼠蚤传播-既鼠-鼠蚤-人。两者引起的临床表现相似，但流行性斑疹伤寒表现较为严重，主要表现高热、头痛、斑疹、肌肉痛、肝酶升高，严重患者可发生多脏器衰竭甚至死亡，该病病死率可高达15％。斑疹伤寒目前在发达国家已经得到控制，但在发展中国家如非洲、亚洲等地区仍广泛流行，同发达国家一样，我国流行性斑疹伤寒基本得到控制，然而，地方性斑疹伤寒仍在广大农村地区流行。最新流行病学调查结果显示，我国云南地区地方性斑疹伤寒病原体-莫氏立克次体在当地农业人群中血清IgG抗体阳性率为16.46％。当地主要家畜包括牛、羊及狗等IgG抗体总阳性率高达61.48％。
贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii，Cb)俗称Q热立克次体，为Q热的病原体，可引起人类急、慢性Q热(Q fever)。该病原体严格寄生于活细胞内，对理化因子抵抗力极强，人类和动物普遍易感，可通过气溶胶广泛传播，因此美国反恐怖组织将其列为生物战剂。目前Q热已成为世界上分布最广的人兽共患病之一。感染的家畜牛、羊为主要传染源，猫、狗等宠物和啮齿动物鼠及节肢动物蜱、螨等均可传播本病。
无形体、恙虫病东方体、斑点热群立克次体、斑疹伤寒、贝氏柯克斯体的检测方法需要进一步改进。
间接免疫荧光(IFA)是诊断无形体及立克次体疾病的金标准。然而，该方法依赖于患者急期及恢复期体内特异性的抗体的检出，并不能作为疾病早期快速诊断的方法。分离培养技术是一种可靠的方法，但需要较长时间才能获得阳性结果并且只能在P3实验室中进行，这些因素限制了其用途。
由于对该类疾病的认识不足及缺乏必要的实验室诊断技术，因此，临床容易误诊及漏诊，往往导致病人多器官受累死亡。目前，我国临床对该类疾病的诊断还主要依赖临床表现及经验治疗，少数较好的单位仍然使用特异性较差的传统外斐氏反应。国外许多专业实验室已经发展了各种PCR技术，替代分离率较低的病原分离技术。随着荧光定量PCR技术的发展，本研究室以无形体msp2特异基因、恙虫病东方体56KD蛋白基因、斑点热群立克次体ompA基因、斑疹伤寒群立克次体热休克蛋白groEL基因、贝氏柯克斯体IS1111a基因等保守序列设计MGB探针，建立了敏感、特异、快速的定量PCR技术。
发明内容
本发明公开了检测无形体及立克次体等5种病原体的实时荧光定量PCR试剂盒及其方法。
本发明首先公开了一种检测无形体的实时荧光定量PCR试剂盒。本发明的试剂盒包括特异性引物、特异性探针、标准DNA模板以及其他常规荧光定量PCR试剂。本发明的试剂盒可采用以下方法实施：
根据GenBank提供的无形体msp2基因序列(EF143798)进行BLAST比较进行探针及引物设计，设计探针可检测39株不同分离株。采用ABI primer Express 2.0软件设计探针和引物。设计引物MF、MR和探针MP，其中引物MF的序列见Sequence NO.1，引物MR的序列见Sequence NO.2，该对引物扩增产物为159bp。特异性探针MP的序列见Sequence NO.3，
或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；
或者与上述序列同源性大于85％的序列；
或者上述序列的互补序列；
或者使用上述序列中任意一种或一种以上的组合。
采用25μl反应体积，每个反应中含12.5μl通用PCR反应混合物[TaqMan 
Universal PCR Master Mix(2×)]；800nM各引物；400nM探针；2μlDNA模板；补无菌水至25μl。反应条件为95℃10min后，以95℃40s和60℃1min循环45次。
本发明公开了一种检测恙虫病东方体的实时荧光定量PCR试剂盒。本发明的试剂盒包括特异性引物、特异性探针、标准DNA模板以及其他常规荧光定量PCR试剂。本发明的试剂盒可采用以下方法实施：
根据GenBank提供的我国恙虫病东方体常见的Karp(M33004.1)、Kato(GenBank)及Gillim(DQ789360.1)等优势型56KD特异基因保守序列进行BLAST比较进行探针及引物设计，设计探针和引物。采用ABI primer Express 2.0软件设计探针和引物。设计引物56KDF、56KDR和探针56KDP，引物56KD F的序列见Sequence NO.4，56KD R的序列见Sequence NO.5，该对引物扩增产物为159bp，特异性探针56KDP的序列见Sequence NO.6，
或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；
或者与上述序列同源性大于85％的序列；
或者上述序列的互补序列；
或者使用上述序列中任意一种或一种以上的组合。
采用25μl反应体积，每个反应中含12.5μl通用PCR反应混合物[TaqMan 
Universal PCR Master Mix(2×)]；800nM各引物；400nM探针；2μlDNA模板；补无菌水至25μl。反应条件为95℃10min后，以95℃40s和60℃1min循环45次。
本发明首先公开了一种检测斑点热群立克次体的实时荧光定量PCR试剂盒。本发明的试剂盒包括特异性引物、特异性探针、标准DNA模板以及其他常规荧光定量PCR试剂。本发明的试剂盒可采用以下方法实施：
通过DNAStar软件包MegAlign多序列比对程序，根据GenBank提供的14种常见斑点热群立克次体ompA基因-R.australis(AF149108)、R.heilongjiangii(AF179362)、R.japonica(U43795)、R.massiliae(U43799)、R.parkeri(U43802)、R.rickettsii(U43804)、R.honei(U43809)，R.conorii(U43806)，R.montanensis(U43801)，R.rhipicephali(U43803)，R.sibirica(U43807)，R.slovaca(U43808)，R.africae(U43790)，R.aeschlimannii(U43800).采用ABI Primer Express2.0 Software，遵循TaqMan探针设计原则，设计引物Rh-F、Rh-R和探针Rh-P，引物Rh-F的序列见Sequence NO.7，引物Rh-R的序列见Sequence NO.8，该对引物扩增产物为79bp，特异性探针Rh-P的序列见Sequence NO.9，
或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；
或者与上述序列同源性大于85％的序列；
或者上述序列的互补序列；
或者使用上述序列中任意一种或一种以上的组合。
采用25μl反应体积，每个反应中含12.5μl通用PCR反应混合物[TaqMan 
Universal PCR Master Mix(2×)]；800nM各引物；400nM探针；2μlDNA模板；补无菌水至25μl。反应条件为95℃10min后，以95℃40s和60℃1min循环45次。
本发明公开了一种检测斑疹伤寒群立克次氏体(R.prowazekii及R.typhi)的试剂盒。本发明建立了一种快速、敏感特异的可检测两型斑疹伤寒病原体的定量PCR方法以及基于该方法的检测试剂盒，可用于临床病例的诊断及鉴别诊断，也适用于疾病监测组织对疫情的实验室检测分析。具体地，本发明的试剂盒包括特异性引物、荧光探针、标准DNA模板以及其他常规荧光定量PCR试剂。
本发明可采用以下方法实施：
根据GenBank提供的斑疹伤寒群立克次体-普氏立克次体(R.prowazekii-Y15783)及莫氏立克次体(R.typhi-AF463073)热休克蛋白groEL基因保守序列，采用ABI primer Express 2.0软件设计探针和引物。设计引物R-FP、R-RP和探针R-MGB-Fam-Probe，引物R-FP的序列见Sequence NO.10，引物R-RP的序列见Sequence NO.11，探针R-MGB-Fam-Probe的序列见Sequence NO.12，
或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；
或者与上述序列同源性大于85％的序列；
或者上述序列的互补序列；
或者使用上述序列中任意一种或一种以上的组合。
荧光定量PCR 25μl反应体系包括：12.5μl 2×TaqMan Universal PCR Master Mix(美国ABI公司)，800nM引物，400nM探针，5.5μl无菌水及107-100copies/μl，DNA模板各2μl。反应程序为95℃10min预变性，接45个循环：95℃40s，60℃1min。
本发明还公开了一种荧光定量PCR法检测贝氏柯克斯体的试剂盒。
本发明根据贝氏柯克斯体htpAB基因相关重复序列(IS1111a)设计引物与探针，建立荧光定量PCR检测方法，建立了一种快速、灵敏、特异检测贝氏柯克斯体的Real-Time quantitative PCR试剂盒。具体地，本发明的试剂盒包括特异性引物和荧光探针，标准DNA模板以及其它常规Real-Time quantitative PCR反应试剂。具体地，本发明可采用以下方法实施：
通过DNAStar软件包MegAlign多序列比对程序，根据GenBank贝氏柯克斯体IS1111a基因序列(GenBank：M80806)，采用ABI Primer Express2.0 Software，遵循TaqMan探针设计原则，设计引物IS111-Fp、IS111-Rp和探针IS111-TAQMAN-Probe，引物IS111-Fp的序列见Sequence NO.13，引物IS111-Rp的序列见Sequence NO.14，探针IS111-TAQMAN-Probe的序列见Sequence NO.15，
或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；
或者与上述序列同源性大于85％的序列；
或者上述序列的互补序列；
或者使用上述序列中任意一种或一种以上的组合。
荧光定量PCR 25μl反应体系包括：12.5μl 2×TaqMan Universal PCR Master Mix(美国ABI公司)，800nM引物，400nM探针，5.5μl无菌水及107-100copies/μl， DNA模板各2μl。反应程序为95℃10min预变性，接45个循环：95℃40s，60℃1min。
与现有技术相比，本发明提供了无形、恙虫病东方体、斑点热群立克次体、斑疹伤寒立克次氏体与贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR试剂盒，操作简便、快速，灵敏度高且特异性强。采用本发明的试剂盒可对相关立克次体进行快速特异性检测并且适于在临床实验室。
本发明提供了上述5种病原体特异基因的特异性引物在检测立克次体检测试剂盒中的应用。本发明的特异性引物，可以使无形体及立克次体检测达高灵敏性，能检测到200copies/反应，因此可以用于疾病早期的快速诊断。同时，上述5种病原体特异基因特异性引物具有良好的特异性，每种方法特异性均达100％。重复性批内CV％均控制在5％内，批间CV％均控制在10％内。
附图说明
图1.无形体msp2基因定量检出范围及各浓度对应循环参数(Ct值)。图中曲线从左到又依次代表标准质粒浓度为107copies/μl、106copies/μl、105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、101copies/μl时的荧光定量PCR曲线。
图2.无形体msp2基因拷贝数与循环数(Ct值)与之间相关系数。
图3.恙虫病东方体体56KD基因定量检出范围及各浓度对应循环参数(Ct值)。从左到又依次代表标准质粒浓度为107copies/μl、106copies/μl、105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、101copies/μl时的荧光定量PCR曲线。
图4.恙虫病东方体体56KD基因拷贝数与循环数(Ct值)与之间相关系数。
图5.斑点热群立克次体ompA基因定量检出范围及各浓度对应循环参数(Ct值)。从左到又依次代表标准质粒浓度为107copies/μl、106copies/μl、105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、101copies/μl时的荧光定量PCR曲线。
图6.斑点热群立克次体ompA基因拷贝数与循环数(Ct值)与之间相关系数。
图7.斑疹伤寒群立克次氏体(R.prowazekii及R.typhi)热休克蛋白groEL基因定 量检出范围及各浓度对应循环参数(Ct值)。
图8.斑疹伤寒群立克次氏体(R.prowazekii及R.typhi)热休克蛋白groEL基因拷贝数与循环数(Ct值)与之间相关系数。
图9.贝氏柯克斯体IS1111a基因定量检出范围及各浓度对应循环参数(Ct值)。从左到又依次代表标准质粒浓度为107copies/μl、106copies/μl、105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、时的荧光定量PCR曲线
图10.拷贝数与循环数(Ct值)与之间相关系数。
具体实施方式
实施例1：检测无形体的实时荧光定量PCR试剂盒
1.引物设计与探针合成
根据GenBank提供的无形体msp2基因序列(EF143798)进行BLAST比较进行探针及引物设计，设计探针可检测39株不同分离株。采用ABI primer Express 2.0软件设计探针和引物(上海基康公司合成)。特异引物、探针名称及序列及可检测菌株GeneBanK接受号见表1。
表1 无形体msp2基因检测使用引物、探针及可检测菌株
2.标准DNA模板制备及灵敏性分析
采用表1中MPF及MPR引物对以A.phagocytophilum Webster株为模板分别扩增出159bp片段，PCR产物纯化(QIAgen，German)并连接到PGM-T克隆载体后转化到DH5α感受态细胞。特异引物筛选阳性克隆后提取质粒DNA，此质粒DNA即为标准DNA模板，所包含的159bp msp2基因的保守序列，为本领域研究人员根据设计的引物和所述模板通过分子学实验可直接得到其序列信息，此处不再赘述。采用NanoDrop ND-1000核酸定量仪定量质粒DNA(NanoDrop Technologies，Wilmington，Delaware)并做10倍系列稀释后(标准质粒浓度范围在107～100copies/μl)，作为TaqMan MGB探针标准品，制备标准曲线以及灵敏性分析，结果见图1和图2。灵敏分析显示最小能检测到200copies/反应。实验批内重复2-3次，批间重复2-3次以分析其重复性。重复性结果显示批内CV％＜5％内，批间CV％＜10％。
3.特异性分析
特异性检测所用菌株：普氏立克次体B株、莫氏立克次体W株、恙虫病东方体Karp及Kato型、黑龙江立克次体054株、贝纳柯克斯体、西伯利亚立克次体、康氏立克次体、R.marmionii、小珠立克次体、立氏立克次体、非洲立克次体、派氏立克次体、加拿大立克次体、汉赛巴尔通体、五日热巴尔通体、嗜吞噬无形体、伯氏疏螺旋体、查菲埃立克体、大肠埃希菌、霍乱弧菌、炭疽芽胞杆菌、流感嗜血杆菌、鼠疫耶尔森菌、李斯特菌、军团菌。原核细菌16S rRNAPCR通用引物用于菌株DNA的鉴定，阳性者进一步进行特异性鉴定。健康人血及小鼠的鼠血和鼠脾脏提取DNA作为阴性对照。除此之外，还将无菌水同样品一起提取DNA作为阴性对照。特异性分析结果显示除了嗜吞噬无形体DNA检测阳性外，其他细菌均为阴性。特异性为100％。
4.荧光定量PCR反应条件
荧光定量PCR仪为Line-Gene K(杭州博日，中国)，25微升反应体系包括：12.5μl 2×TaqMan Universal PCR Master Mix(美国ABI公司)、800nM引物、400nM 探针，5.5μl无菌水及2μlDNA模板。反应程序为95℃10min预变性，接45个循环：95℃40s，60℃1min。无菌水、正常人血、正常小鼠血及脾脏DNA用于阴性对照。
实施例2：检测恙虫病东方体的实时荧光定量PCR试剂盒
1.引物设计与探针合成
根据GenBank提供的我国恙虫病东方体常见的Karp(M33004.1)、Kato(GenBank)及Gillim(DQ789360.1)等优势型56KD特异基因保守序列进行BLAST比较进行探针及引物设计，设计探针和引物。采用ABI primer Express 2.0软件设计探针和引物。
表2 恙虫病东方体56KD特异基因检测使用引物、探针及可检测菌株
2.标准DNA模板制备及灵敏性分析
采用表2中WF及WR引物对以恙虫病东方体Karp株为模板分别扩增出361bp片段，PCR产物纯化(QIAgen，German)并连接到PGM-T克隆载体后转化到DH5α感受态细胞。特异引物筛选阳性克隆后提取质粒DNA，此质粒DNA即为标准DNA模板，所包含的361bp 56KD特异基因保守序列，为本领域研究人员根据设计的引物和所述模板通过分子学实验可直接得到其序列信息，此处 不再赘述。采用NanoDrop ND-1000核酸定量仪定量质粒DNA(NanoDrop Technologies，Wilmington，Delaware)并做10倍系列稀释后(标准质粒浓度范围在107～100copies/μl)，作为TaqMan MGB探针标准品，制备标准曲线以及灵敏性分析，结果见图3和图4。灵敏分析显示最小能检测到200copies/反应。实验批内重复2-3次，批间重复2-3次以分析其重复性。重复性结果显示批内CV％＜5％内，批间CV％＜10％。
3.特异性分析
特异性检测所用菌株：普氏立克次体B株、莫氏立克次体W株、恙虫病东方体Karp及Kato型、黑龙江立克次体054株、贝纳柯克斯体、西伯利亚立克次体、康氏立克次体、R.marmionii、小珠立克次体、立氏立克次体、非洲立克次体、派氏立克次体、加拿大立克次体、汉赛巴尔通体、五日热巴尔通体、嗜吞噬无形体、伯氏疏螺旋体、查菲埃立克体、大肠埃希菌、霍乱弧菌、炭疽芽胞杆菌、流感嗜血杆菌、鼠疫耶尔森菌、李斯特菌、军团菌。原核细菌16S rRNAPCR通用引物用于菌株DNA的鉴定，阳性者进一步进行特异性鉴定。健康人血及小鼠的鼠血和鼠脾脏提取DNA作为阴性对照。除此之外，还将无菌水同样品一起提取DNA作为阴性对照。特异性分析结果显示除了恙虫病东方体常见Karp、Kato及Gillim DNA检测阳性外，其他细菌均为阴性。特异性为100％。
4.荧光定量PCR反应条件
荧光定量PCR仪为Line-Gene K(杭州博日，中国)，25微升反应体系包括：12.5μl 2×TaqMan Universal PCR Master Mix(美国ABI公司)、800nM引物、400nM探针，5.5μl无菌水及2μlDNA模板。反应程序为95℃10min预变性，接45个循环：95℃40s，60℃1min。无菌水、正常人血、正常小鼠血及脾脏DNA用于阴性对照。
实施例3：检测斑点热群立克次体的实时荧光定量PCR试剂盒
1.引物设计与探针合成
通过比对GenBank上14种斑点热群立克次体SFGR ompA的序列，采用ABI primer Express 2.0软件设计荧光定量PCR的探针和引物(上海基康公司合成)。荧光定量PCR特异性引物、探针及构建标准质粒引物序列见表3。
表3 斑点热群立克次体ompA基因的荧光定量PCR特异性引物及构建标准质粒引物
2.标准DNA模板制备及灵敏性分析
引物Rh-F及Rh-Rr从R.heilongjiangii-054菌株DNA(该菌株为我国本土分离株，1984年从我国黑龙江省森林革蜱中分离)中扩增出305bp的片段，该片段包含79bp的目标序列，将该片断纯化回收后，与T载体连接，构建重组质粒，特异引物筛选阳性克隆后提取质粒DNA，此质粒DNA即为标准DNA模板，所包含的79bp的斑点热群立克次体SFGR ompA基因的保守序列，为本领域研究人员根据设计的引物和所述模板通过分子学实验可直接得到其序列信息，此处不再赘述。测定浓度后将其作倍比稀释(107copies/μl～100copies/μl)作为Real-Time PCR定性和定量模板，制备标准曲线以及灵敏性分析结果见图5和图6。灵敏分析显示最小能检测到200copies/反应。实验批内重复2-3次，批间重复2-3次以分析其重复性。结果显示批内CV％＜5％内，批间CV％＜10％。
3.特异性分析
特异性检测所用菌株：普氏立克次体B株、莫氏立克次体W株、恙虫病东方体Karp及Kato型、黑龙江立克次体054株、贝纳柯克斯体、西伯利亚立克次体、康氏立克次体、R.marmionii、小珠立克次体、立氏立克次体、非洲立克次体、派氏立克次体、加拿大立克次体、汉赛巴尔通体、五日热巴尔通体、嗜吞噬无形体、伯氏疏螺旋体、查菲埃立克体、大肠埃希菌、霍乱弧菌、炭疽芽胞杆菌、流感嗜血杆菌、鼠疫耶尔森菌、李斯特菌、军团菌。原核细菌16S rRNAPCR通用引物用于菌株DNA的鉴定，阳性者进一步进行特异性鉴定。健康人血及小鼠的鼠血和鼠脾脏提取DNA作为阴性对照。除此之外，还将无菌水同样品一起提取DNA作为阴性对照。特异性分析结果显示，在理论设计的14种常见斑点热群立克次体中，我室保存有相应立克次体DNA模板均检测阳性，而其他的立克次体及临床常见病原体均为阴性。特异性为100％。
4.荧光定量PCR反应条件
荧光定量PCR仪为Line-Gene K(杭州博日，中国)，25微升反应体系包括：12.5μl 2×TaqMan Universal PCR Master Mix(美国ABI公司)、800nM引物、400nM探针，5.5μl无菌水及2μlDNA模板。反应程序为95℃10min预变性，接45个循环：95℃40s，60℃1min。无菌水、正常人血、正常小鼠血及脾脏DNA用于阴性对照。
实施例4.检测斑疹伤寒立克次氏体的荧光定量PCR检测试剂盒
1.引物设计与探针合成
根据GenBank提供的斑疹伤寒群立克次体-普氏立克次体(R.prowazekii-Y15783)及莫氏立克次体(R.typhi-AF463073)热休克蛋白基因保守序列，采用ABI primer Express 2.0软件设计探针和引物(上海基康公司合成)。特异引物及探针名称及序列为：
表4 斑疹伤寒群立克次体groEL基因的荧光定量PCR特异性引物及构建 标准质粒引物
2.标准DNA模板及敏感性分析
采用表4中引物WF及WR，以R.typhi strain，Wilmington DNA为模板，扩增出206bp的片段，该片段包含90bp探针扩增目标序列，PCR产物纯化(QIAgen，German)并连接到PGM-T克隆载体，随后转化到DH5α感受态细胞。通过WF及WR特异引物筛选阳性克隆。阳性克隆增殖后提取质粒DNA，此质粒DNA即为标准DNA模板，所包含的90bp热休克蛋白基因保守序列，为本领域研究人员根据设计的引物和所述模板通过分子学实验可直接得到其序列信息，此处不再赘述。质粒DNA采用NanoDrop ND-1000核酸定量仪定量(NanoDrop Technologies，Wilmington，Delaware)并做10倍系列稀释作为标准品用于标准曲线的制备(标准质粒浓度范围在109-101copies/μl)以及灵敏性分析结果见图7和图8。灵敏分析显示最小能检测到200copies/反应。实验批内重复2-3次，批间重复2-3次以分析其重复性。重复性结果显示批内CV％＜5％内，批间CV％＜10％。
3.特异性分析
特异性检测所用菌株普氏立克次体B株、莫氏立克次体W株、恙虫病东方体Karp及Kato型、黑龙江立克次体054株、贝纳柯克斯体、西伯利亚立克次体、康氏立克次体、R.marmionii、小珠立克次体、立氏立克次体、非洲立克次体、派氏立克次体、加拿大立克次体、汉赛巴尔通体、五日热巴尔通体、嗜吞噬无形体、伯氏疏螺旋体、查菲埃立克体、大肠埃希菌、霍乱弧菌、炭疽芽胞杆菌、流感嗜血杆菌、鼠疫耶尔森菌、李斯特菌、军团菌。原核细菌16S rRNAPCR通用引物用于菌株DNA的鉴定，阳性者进一步进行特异性鉴定。健康人血及小鼠的鼠血和鼠脾脏提取DNA作为阴性对照。除此之外，还将无菌水同样品一起提取DNA作为阴性对照。特异性分析结果显示，普氏立克次体(R.prowazekii-Y15783)及莫氏立克次体扩增阳性，而其他的立克次体及临床常见病原体均为阴性。特异性为100％。
4.荧光定量PCR反应条件
荧光定量PCR仪为Line-Gene K(杭州博日，中国)，25微升反应体系包括：12.5μl 2×TaqMan Universal PCR Master Mix(美国ABI公司)、800nM引物、400nM探针，5.5μl无菌水及2μlDNA模板。反应程序为95℃10min预变性，接45个循环：95℃40s，60℃1min。无菌水、正常人血、正常小鼠血及脾脏DNA用于阴性对照。
实施例5.检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR试剂盒
1.引物设计与探针合成
采用DNAStar软件包MegAlign多序列比对程序，根据GenBank贝氏柯克斯体IS1111a基因序列(M80806)，采用ABI Primer Express2.0 Software，遵循TaqMan探针设计原则，设计引物和探针名称及序列见表5。
表5 贝氏柯克斯体IS1111a基因的荧光定量PCR特异性引物及构建标准质粒引物
2.标准DNA模板的建立及敏感性分析
以DNA为模板采用引物IS111F1和IS111R1扩增贝氏柯克斯体htpAB基因相关重复序列(IS1111a)485bp的片断，将该片断纯化回收后，与T载体连接，构建重组质粒，特异引物筛选阳性克隆后提取质粒DNA，此质粒DNA即为标准DNA模板，所包含的485bp htpAB基因的保守序列，为本领域研究人员根据上述所设计的引物和所述模板通过分子学实验可直接得到其序列信息，此处不再赘述。将该质粒作为标准DNA模板，依公式：模板拷贝数(copy/μl)＝DNA含量(g/μl)/片断大小×615％×1.67×10-24(g)计算该该标准DNA模板的拷贝数。应用核酸定量仪测得本次实验的DNA模板浓度为163.23ng/μl，带入公式计算DNA模板浓度(拷贝数/μl)，将其作倍比稀释(107copies/μl～100copies/μl)作为Real-Time PCR定性和定量模板，制备标准曲线以及灵敏性分析结果见图9和图10。采用25μl反应体积，每个反应中含12.5μl通用PCR反应混合物(TaqMan 
Universal PCR Master Mix)；浓度为10μmol/引物IS111-Fp及IS111-Rp各自1μl；10μmol/L探针IS111-TAQMAN-Probe 0.25μl；将稀释的标准DNA模板(107copies/μl、106copies/μl、105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、101copies/μl、100copies/μl)，分别加2μl到反应体系中；补无菌水至25μl。反应条件为50℃ 2min和95℃10min后，以95℃15s和60℃1min循环50次。本实验建立的Real-Time PCR灵敏度为10copies/μl。实验批内重复2-3次，批间重复2-3次以分析其重复性。重复性结果显示批内CV％＜5％内，批间CV％＜10％。
3.特异性分析
特异性检测所用菌株：普氏立克次体B株、莫氏立克次体W株、恙虫病东 方体Karp及Kato型、黑龙江立克次体054株、贝纳柯克斯体、西伯利亚立克次体、康氏立克次体、R.marmionii、小珠立克次体、立氏立克次体、非洲立克次体、派氏立克次体、加拿大立克次体、汉赛巴尔通体、五日热巴尔通体、嗜吞噬无形体、伯氏疏螺旋体、查菲埃立克体、大肠埃希菌、霍乱弧菌、炭疽芽胞杆菌、流感嗜血杆菌、鼠疫耶尔森菌、李斯特菌、军团菌。原核细菌16SrRNAPCR通用引物用于菌株DNA的鉴定，阳性者进一步进行特异性鉴定。健康人血及小鼠的鼠血和鼠脾脏提取DNA作为阴性对照。除此之外，还将无菌水同样品一起提取DNA作为阴性对照。特异性分析结果显示，贝氏柯克斯体扩增阳性，而其他的立克次体及临床常见病原体均为阴性。特异性为100％。
4.荧光定量PCR反应条件
荧光定量PCR仪为Line-Gene K(杭州博日，中国)，25微升反应体系包括：12.5μl 2×TaqMan Universal PCR Master Mix(美国ABI公司)、800nM引物、400nM探针，5.5μl无菌水及2μlDNA模板。反应程序为95℃10min预变性，接45个循环：95℃40s，60℃1min。无菌水、正常人血、正常小鼠血及脾脏DNA用于阴性对照。
Claims (4)
1.一种检测斑疹伤寒群立克次氏体的特异性引物和荧光探针的组合产品，所述特异性引物为R-FP和R-RP：
R-FP的序列为Sequence NO.10；
R-RP的序列为Sequence NO.11；
所述荧光探针的序列为Sequence NO.12。
2.一种检测斑疹伤寒群立克次氏体的试剂盒，其包括权利要求1所述的特异性引物和荧光探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其还包括标准DNA模板。
4.权利要求1所述的特异性引物和荧光探针的组合产品在制备检测斑疹伤寒群立克次氏体检测试剂盒中的应用。
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