CN102027020A - 用于诊断和预防丛林斑疹伤寒的重组嵌合抗原 - Google Patents

Abstract

提供重组嵌合抗原，其包含多种丛林斑疹伤寒虫株(如Karp、Kato(Ktr56)、Gilliam(Gmr56)和TA763(TAr56))的重组56kDa蛋白的表达产物的未修饰和修饰的反应性多肽片段。本发明用于基于针对嵌合蛋白的反应的强度而检测针对众多丛林斑疹伤寒虫株的既往暴露，并且用作疫苗制剂中的组分和用于产生被动预防用免疫球蛋白和受试者中的抗异源感染免疫。

Description

用于诊断和预防丛林斑疹伤寒的重组嵌合抗原

与相关申请的交叉参照

本申请要求2008年05月16日提交的美国临时申请号61/054,022的优先权。通过引用的方式并入该申请的内容。

技术领域

本发明涉及包含来自多于一种恙虫病东方体虫株的56kDa蛋白的反应性多肽片段的重组嵌合抗原和借助使用这些嵌合抗原的血清诊断测定法来检测丛林斑疹伤寒的方法。本发明也涉及在疫苗生产、被动预防和治疗药中使用嵌合抗原。根据本发明产生的产物可以与其他的可药用生物活性物质组合。

背景技术

丛林斑疹伤寒，也称作恙螨立克次氏体病、螨传播斑疹伤寒、日本河流热、热带或农村斑疹伤寒或羌虫病，是由羌虫(先前的立克次氏体)东方体(Orientia tsutsugamushi.)感染引起的一种急性、热性疾病。它占据亚洲-太平洋区的地方流行地区中多达23％的全部热性发作事件(1)。本疾的特征是体温上升、皮肤皮疹和严重头痛。该疾病可以影响神经系统，具有如谵妄、昏呆和肌肉纤颤的临床表现。根据感染性虫株的毒力，死亡率从1至30％变动。

丛林斑疹伤寒特别流行于东南亚、韩国、澳大利亚、中国、日本和印度。过去几年期间，疾病现患率已经在一些国家升高(40)。丛林斑疹伤寒的病原生物通过羌螨叮咬传播至人。这些生物发现遍及螨身体，在唾液腺中存在最多。当羌螨在包括骆驼、啮齿动物或人的哺乳动物上采食时，致病生物从螨传播至脊椎动物宿主(受试者)。通常在参与如下活动的人群中存在丛林斑疹伤寒感染，其中所述的活动使人们不经意地接触螨侵染的栖息地或这些节肢动物的任何脊椎动物宿主携带者。这些宿主可以包括家养或非家养动物如牛或啮齿动物。这些宿主可以携带没有开始在所述宿主上采食的螨。在这种情况下，活螨可以从脊椎动物转移至人。特别易感的个体包括屠夫、工业屠宰厂工人、牧场工人和参与户外活动的其他人。这些人可能因接触携带螨的动物而感染。另外，啮齿类能够携带并散播感染性螨至居住地区的人群。幼年纤恙螨属(Leptotrombidium)螨以脊椎动物宿主为食。幼螨通过它们的雌性亲代获得恙虫病东方体(O.tsutsugama)。这种类型的病原体接受叫做“经卵传播”。

一旦传播至宿主，该生物在疾病发作前潜伏约10至12日。感染后5至8日，钝性红色皮疹和/或焦痂可以在身体上、尤其在躯干上出现。如果不予治疗，恙虫病东方体可以引起多达35％的死亡率。最近来自印度的报告记录了17％的病例死亡率(3)。在目前，无疫苗可用于保护幸免丛林斑疹伤寒。恙虫病东方体的抗生素耐药性的最近证据进一步强调需要丛林斑疹伤寒疫苗(13，14)。

丛林斑疹伤寒的诊断通常基于临床表现和患者病史。然而，区分丛林斑疹伤寒与其他急性热带热性病如钩端螺旋体病、鼠型斑疹伤寒、疟疾、登革热和病毒性出血热可能因体征和症状的相似性而是困难的。高度灵敏的聚合酶链反应(PCR)方法已经使疾病发作时检测恙虫病东方体成为可能，此时抗体滴度没够高到足以进行检测(41，44，48)。已经显示56kDa蛋白基因的PCR扩增是丛林斑疹伤寒的可靠诊断方法(41，46)。另外，可能通过不分离该生物而分析该基因的可变区来鉴定与不同东方体属(Orientia)血清型相关的不同基因型(41，42，43，46，49)。然而，基因扩增经常需要复杂仪器和昂贵试剂，它们通常在农村医疗设施是不可得的。现有血清诊断测定法，如间接免疫过氧化物酶(IIP)试验、间接免疫荧光抗体(IFA)试验或微量免疫荧光抗体(MIF)试验，要求在受孕鸡卵的感染的卵黄囊或无抗生素的细胞培养基中增殖立克次氏体(51)。

目前，唯一市售的点印迹免疫学测定试剂盒DIP-S-蜱丛林斑疹伤寒诊断试验试剂盒(Panbio，昆士兰，澳大利亚)要求在组织培养中培育致病生物、使用泛影葡胺密度梯度法纯化该生物并且提取完整细胞抗原的步骤(50)。然而，仅少数专业化实验室具有培养并纯化恙虫病东方体的能力，因为这些过程必须在生物安全水平3(BL3)条件下实施。另外，东方体的大规模培育和纯化是极为昂贵的。因而，获得可以大量产生和纯化并对东方体衍生性抗原具有相似灵敏度和专一性的重组立克次氏体蛋白质抗原会大大降低目前与丛林斑疹伤寒诊断试验相关的成本、运输和再现性问题。

恙虫病东方体也显示出大量的虫株变种(15-18)。因天然感染引发的同源保护作用持续至少1年，但是异源保护作用可能维持少于6个月(19，20)。体液免疫应答和细胞介导的免疫应答在针对丛林斑疹伤寒的保护性免疫中是重要的(21-25)。使用完整生物的现有疫苗开发成果表明丛林斑疹伤寒疫苗是可能的。已经用包含与氯霉素组合的单剂量活生物的生物疫苗或包含γ辐射过的活生物的疫苗在小鼠中实现有效接种(26，27)。与氯霉素预防组合用活疫苗志愿者的免疫作用激发了与天然感染可比的免疫(19)。虽然最近一份报告表明在卵黄囊中的长期适应已经提高东方体的产率(28)，但是在大量生产纯化的恙虫病东方体和贮藏时保持其稳定性方面依旧存在巨大困难。因此，对于用当前良好制造规范行为的纯度、效力和批次间一致性标准制造而言，完整细胞疫苗产品不可能在经济上是可行或适合的。另外，并不是完整细胞抗原中的每种组分均有保护性。已经显示22kDa抗原不仅不提供任何保护作用，而且还抑制由其他抗原提供的保护作用(29)。因而，需要开发一种由能够诱导人受试者中保护性免疫的基因工程抗原组成的亚单位疫苗。

发明概述

因此，本发明的目的是提供重组嵌合抗原，它们包含来自多于一种恙虫病东方体虫株的r56kDa蛋白的修饰和未修饰的反应性多肽片段。

本发明的又一个目的是提供进行再折叠以产生可溶性部分的重组嵌合抗原。

本发明的另外目的是提供重组嵌合抗原在基于抗体的测定法中的用途，所述的测定法作为用于检测研究样品和临床样品中恙虫病东方体暴露的改良方法。

本发明的再一个目的是重组嵌合抗原用于抗丛林斑疹伤寒感染的不同疫苗制剂中的用途。

本发明的这些目的和其他目的、特征和优势在以下对优选实施方案的详细描写中描述或因其显而易见。

附图简述

图1A：显示TA763、Karp的r56蛋白抗原和嵌合抗原1、2和3(C1、C2和C3)的SDS-PAGE，全部抗原均纯化至实现大于95％的纯度。

图1B：显示被测试的全部r56蛋白与针对Karp虫株56kDa蛋白的特异性抗体反应的蛋白质印迹结果。所述结果表明在TA763r56、C1、C2和C3与针对Kpr56而特异性产生的抗体之间存在交叉反应性。

图2A：来自Karp虫株的全长56kDa和Kp r56克隆序列。

图2B：来自TA 763的全长56kDa和TA763r56克隆序列。

图3A：嵌合抗原1，其显示出对Karp虫株和TA763虫株的56kDa蛋白抗原的可变结构域的修饰。

图3B：嵌合抗原2，其显示出对Karp虫株和TA763虫株的56kDa蛋白抗原的可变结构域的修饰。

图3C：嵌合抗原3，其显示出对Karp虫株和TA763虫株的56kDa蛋白抗原的可变结构域的修饰。

实施方案描述

用丛林斑疹伤寒患者血清对完整细胞裂解物的蛋白质印迹分析已经鉴定到分子量为22kDa、47kDa、56kDa和110kDa的至少4种恙虫病东方体蛋白质抗原(30)。在它们当中，56kDa抗原是天然优势的蛋白质抗原，其占10-15％的总细胞蛋白。几乎每位临床诊断的患者的血清都与56kDa抗原反应，但并非每位患者的血清都与22kDa、47kDa或110kDa抗原反应(31，32)。在一项研究中，仅15％(2/13)的患者血清识别47kDa抗原(31)。重组56kDa蛋白(r56)已经显示在小鼠中具有对同种攻毒(homologous challenge)的保护作用(33-35)。也在小鼠血清中检测针对恙虫病东方体的高滴度抗体。在来自免疫小鼠的脾单核细胞中观察到淋巴细胞增殖和IFN-γ和IL-2产生水平的剂量依赖性模式(Th1细胞的细胞因子谱)(33)。56kDa蛋白在恙虫病东方体黏附并内化至宿主细胞中发挥作用(25)。针对这种抗原的多克隆和单克隆抗体均可以阻断成纤维细胞的立克次氏体感染(36-38)。全部这些结果表明56kDa蛋白是疫苗开发的理想候选物。

已经开发了来自Karp虫株的重组蛋白(Kp r56)，该蛋白已经在远交小鼠模型中显示幸免于同种攻毒的60-100％保护作用。另外，已经显示它在使用食蟹猴的丛林斑疹伤寒非人灵长类模型是安全和有免疫原性的。这种疫苗候选物最近用5个恙虫病东方体非Karp虫株评价幸免于异种攻毒(heterologous challenge)的保护作用。在用Kato(56％)、TA763(45％)、TH1812(39％)、TH1814(33％)、Citrano(11％)攻毒的CD-I小鼠中观察到各种程度的保护作用。Karp(Kp)r56和Kato(Kt)r56的共同施用导致针对Karp、TA263和TH1814的相似保护作用，但针对Kato、TH1812和Citrano的保护作用或多或少升高(Karp 67％、Kato 78％、TA76333％、TH181267％、TH181433％、Citrano45％)。还已经显示针对TA 763r56(SEQ ID No.4)产生的小鼠血清与许多异源虫株(39)反应并且TA763r56与许多血清型的血清反应，这提示TA763r56的宽泛反应性。近来，已经添加额外的r56抗原至Kp r56以产生多价疫苗(KpKtGm r56)。这种疫苗已经显示某些、但非完全的异源保护作用。

因此，本发明的一个目的是使用来自多于一种恙虫病东方体虫株的反应性多肽片段设计嵌合抗原，其中所述的恙虫病东方体虫株包括但不限于Karp、Kato、Gilliam、TA763、TH1811、TH1812、TH1814、AFC27、18032460、18032404、Woods、Citrano、MAK119和MAK243。这种重组嵌合抗原将提供不同虫株之间宽泛的交叉反应性并且可以用于检测测定法中或用作针对丛林斑疹伤寒的接种组合物的部分。

在本发明的一个实施方案中，通过修饰Karp和TA763虫株的56kDa蛋白抗原的可变结构域来设计重组嵌合抗原1、2和3。这是产生此类蛋白质的尝试，其中所述蛋白质具有针对恙虫病东方体多种虫株的潜在宽泛反应性。这些嵌合抗原的交叉反应性用虫株特异性的小鼠血清评价并与来自Karp和TA763虫株的r56的反应性比较。已经显示嵌合蛋白抗原与如14种之多的迥异恙虫病东方体虫株极好地反应。所述结果提示可能联合最少数目的r56以提供与大部分恙虫病东方体虫株的交叉反应性，并且还表明在疫苗制剂中联合这些r56可以针对异种攻毒提供更好的保护作用。

嵌合蛋白的设计

使用来自恙虫病东方体Karp和TA763虫株的56kDa蛋白序列作为嵌合蛋白的构件(building block)。设计嵌合抗原1(C1)以使用Karp 56kDa蛋白序列作为主链，同时将其可变结构域1(图2A)替换为TA763虫株56kDa蛋白抗原的带有轻微修饰的可变结构域1(图2B)。C1的最终序列在SEQ ID No.1(图3A)中描述。相似的策略用于嵌合抗原2(C2)的设计中。使用TA763虫株的56kDa蛋白的序列(图2B)作为嵌合抗原2的主链，其中所述56kDa蛋白的可变结构域3被替换为Karp虫株的56kDa蛋白抗原的轻微修饰的可变结构域3(图2A)。C2的序列在SEQ ID No.2(图3B)中描述。嵌合抗原3(C3)包含来自Karp和TA763虫株的修饰的可变结构域1、2和3。可变结构域1和2基于TA 763虫株的56kDa蛋白抗原的相同结构域但轻微地受到修饰(图2B)，并且C3的可变结构域3基于Karp虫株的56kDa蛋白抗原的可变结构域3，也带有轻微的修饰(图2A)。C3的序列在SEQ ID No.3(图3C)中描述。DNA由Bioclone(San Diego，CA)合成并克隆至带有内建NdeI和XhoI限制性位点的pET29a载体(

Gibbstown，NJ)中。所得序列得到证实。具体设计策略在表1中显示(附录A)。

克隆来自恙虫病东方体Karp和TA763虫株的56kDa蛋白质基因

基于NCBI数据库中Karp和TA763虫株可获得的DNA序列设计针对56kDa蛋白基因(可读框第80～456位氨基酸)的带有内建BamH1和Ndel限制性位点的引物。使用泛影葡胺梯度法，从感染的L929细胞纯化恙虫病东方体的相应虫株(52)。在分级后，纯的生物重悬于水中并冷冻在-80℃直至使用。使用QiaAmp DNA mini试剂盒(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)，按照制造商的描述提取每种恙虫病东方体虫株的DNA。DNA的纯度以分光光度测定方式确定并且OD260/OD280的值大于1.8。提取的DNA随后作为模板与针对每种特定虫株的适宜引物组合用于聚合酶链反应(PCR)中。扩增子克隆至pET24a载体(

Gibbstown NJ)中。选择菌落并验证扩增子的存在。证实扩增子的序列。质粒转化入BL21(DE3)细胞用于蛋白质表达。

从BL21(DE3)转化体表达重组56kDa蛋白

选择含有正确扩增子的BL21(DE3)转化体，在37℃摇床内在LB中于50μg/mL卡那霉素存在下培养并且以200rpm振荡。当OD600达到0.8-1.0时，细胞用1mM IPTG诱导。在诱导19小时后，细胞以4000rpm在SS34转头中离心30分钟以从LB培养基分离细胞。确定细胞沉淀的湿重。取出诱导之前和之后的至少100uL每种细胞混悬液以检查诱导的水平。将具有证实诱导的样品加工用于蛋白质纯化。

含有重组56kDa蛋白的包含体的提取和增溶

3克细胞沉淀物W/V比1∶5重悬于20mM Tris-HCl(pH 7.5)中的15ml 2％脱氧胆酸盐(DOC)中并且充分地分散以确保完全溶解。细胞混悬液在冰上以输出设置3超声处理6次，每次10秒。细胞随后在4℃以10,000rpm离心30分钟。移走上清液并将2M脲溶液添加至沉淀物。沉淀物通过使用一支10ml吸管上下抽吸充分地分散并在摇床上放置30分钟。将混悬液离心并弃去上清液并且将与2％DOC相同体积的在20mM Tris-HCl(pH 7.5)中的4M脲添加至该沉淀物。将沉淀物充分分散并孵育30分钟，伴以柔和摇动。将溶液在4℃以10,000rpm离心30分钟并倾去上清液。添加20mM Tris-Hcl，pH 7.5中的10ml6M脲至该沉淀物并使沉淀物充分分散并孵育30分钟，伴以柔和摇动。溶液在相同条件下再次离心并弃去上清液。添加20mM Tris-HCl，pH 7.5中的8M脲10ml至该沉淀物并使沉淀物充分分散。沉淀物在摇床上孵育30分钟。使用SDS-PAGE，检验蛋白质在每个部分中的分布。含有大部分嵌合蛋白的上清液(大约10ml)位于6M-脲中。将这种上清液收集在一支15ml管中并且在进一步纯化之前贮藏于4℃。

在6M脲存在下层析纯化r56蛋白

使用Waters 2195HPLC，将含有重组蛋白(r56)的6M脲上清液进行阴离子交换层析(DEAE，21.5x15cm)。使用的缓冲液是20mM Tris-HCl(终末pH＝8.0)中的6M脲，其含有1mM DTT和1mM EDTA(溶剂A)，溶剂A中的500mMNaCl(洗脱缓冲液)和溶剂A中的2M NaCl(结束缓冲液)。DEAE柱用起始缓冲液(溶剂A)以4mL/分钟平衡至少1个柱体积。6M脲上清液通过泵以1mL/分钟加载到该柱上。一旦样品加载到该柱上，启动梯度，以100％起始缓冲液持续25分钟，随后在10分钟内缓慢地增加至6％洗脱缓冲液。洗脱缓冲液的浓度缓慢地在50分钟内递增至14％。嵌合蛋白在该时间段内洗脱并以0.15分钟/级分(0.6mL)收集。通过使用100％结束缓冲液持续40分钟进一步清洗DEAE柱以除去任何残余量的结合的蛋白质。通过实施SDS-PAGE检验每个级分中蛋白质的纯度。纯级分汇集起来。如果蛋白质的纯度不令人满意(如过载的SDS-PAGE上所表现的＞95％纯度)，则对汇集的级分透析以除去NaCl后，实施第二轮DEAE层析。第二DEAE的流程与第一DEAE纯化相似，但是调整了梯度，从而洗脱缓冲液缓慢地在10分钟内从6％增加至12％。根据需要，可以通过串联连接的2个凝胶过滤柱首先纯化含有嵌合蛋白的6M脲上清液，使用溶剂A作为缓冲液。含有嵌合蛋白的级分可以汇集起来并且通过如上所述的阴离子交换层析法纯化。使用SDS-PAGE，评价含有嵌合蛋白的终末级分的蛋白质纯度。

纯r56借助透析再折叠

透析管(

Chemical和Laboratory产品，Gardena，CA)在碳酸钠溶液中煮沸，用水淋洗并随后于4℃贮藏在含有0.02％NaN₃的水中。透析缓冲液和样品的体积是20∶1(即，200mL透析缓冲液中的10mL样品)。纯的嵌合蛋白位于含有NaCl的溶剂A中。透析以逐步方式进行以除去NaCl并将脲的浓度从6M降低至零。首先，纯化的汇集级分转移至准备好的透析管并在冷室中在柔和搅拌下对溶剂A中的4M脲透析30分钟两次。在对4M脲的第二次透析结束时，将4M脲替换为2M脲并以相同方式透析该样品。随后将2M脲替换为1M脲并使用相同的透析流程透析相同的时间段。最终，将1M脲替换为20mM Tris-HCl(pH7.5)并且透析相同的时间段。

蛋白质纯化和蛋白质印迹验证

全部r56纯化至大于95％纯度(图1A)。在全部情况下，在每条泳道中过量地加载蛋白质以确保纯度。相同量的每种r56加载到用于蛋白质印迹的凝胶上。图1B显示全部r56蛋白与针对Karp虫株56kDa蛋白的特异性抗体反应。该结果提示TA763r56、C1、C2和C3中存在交叉反应性表位，它们可以被针对Kpr56特异性产生的抗体识别。透析的嵌合r56由SDS-PAGE分析以检验纯度。使用标准方法，将凝胶转移到PVDF膜上。PVDF膜用CodeBlue染色液染色以显现蛋白质条带。从该膜切下在37kDa和50kDa之间的单一条带并且由蛋白质氨基末端测序仪(Applied Biosystems 490，Applied Biosystems，Foster City，CA)分析以证实表达的蛋白质是设计的56kDa蛋白。将额外的凝胶转移到硝化纤维素膜上。该硝化纤维素膜用TBS-tween20(TBST)中的10％乳封闭1小时，伴以柔和摇动。膜随后用TBST洗涤5分钟3次，伴以摇动。将针对56kDa蛋白抗原的第一抗体添加至TBST中的5％乳内并与该膜在室温孵育1小时，伴以柔和摇动。该膜随后洗涤3次，每次5分钟。HRP缀合的抗小鼠IgG抗体是第二抗体并且与TBST内的5％乳中的膜孵育1小时。膜随后被洗涤并与过氧化物酶底物(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)孵育至多30分钟以显色。在37kDa和50kDa之间存在条带表明嵌合蛋白与针对56kDa蛋白的抗体之间的阳性反应性(图1B)。

实施例2：分析多种r56蛋白和来自被多种恙虫病东方体虫株所感染小鼠的血清的反应性

使用虫株特异性的小鼠血清，分析三种嵌合r56的交叉反应性。这些虫株(表2)在丛林斑疹伤寒地方流行区内的地点被报道。

表2.所测试的不同恙虫病东方体虫株的地理分布

地点        虫株名

马来西亚    18032460，18032404

泰国T       H-1811，TH1812，TH1814，AFC-27，TA763

日本        Kato

缅甸        Gilliam

新几内亚    Karp

中国台湾    MAK119，MAK243

澳大利亚    Woods，Citrano

为了解嵌合蛋白的设计是否改善交叉反应性，使用相同的血清组，也分析了亲代r56(Kpr56和TA763r56)。

每种蛋白质抗原(Kpr56、TA763r56、C1、C2和C3)的浓度由Bradford方法确定。初步研究已经建立包被平板所需的抗原的量是0.3ug/孔(总体积是100μL)。因而，用0.2X PBS调整每种嵌合蛋白抗原的浓度至0.3ug/100uL。平板在4℃包被过夜。在实验当日，平板首先用含有0.1％20的1XPBS(1X PBST)洗涤3次。平板随后以200uL/孔用1XPBST中的10％乳封闭并且在室温孵育1小时。第一抗体(小鼠血清)在1XPBS的5％乳中稀释。第一抗体出于筛选目的作1∶100稀释。对于滴定目的而言，将第一抗体制备为连续稀释物，区别在于系数4(1∶100、1∶400、1∶1600等)。在封闭后，平板用1XPBST洗涤3次并且添加100μL/孔的稀释的第一抗体。平板在室温孵育1小时。孵育后，平板用1XPBST洗涤3次。使用HRP缀合的山羊抗小鼠IgG作为第二抗体。将抗体在1XPBST的5％乳中稀释至1∶4000并且施加100μL/孔的稀释的第二抗体，并且平板在室温孵育1小时。孵育结束后，平板用1XPBST洗涤3次。制备并以100μL/孔添加1∶1比率的

过氧化物酶底物溶液A和过氧化物酶底物溶液B(Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)。平板在暗屉中孵育15-30分钟。30分钟孵育后，平板在405nm-650nm于UVmax动力微量平板读数仪(Molecular Devices，Philadelphia，PA)上读数。

通过ELISA用小鼠血清评价r56的交叉反应性

在这些虫株当中，r56免疫不对小鼠模型中MAK119和243的后续攻毒产生保护。因而，从感染这两种虫株的患者收集的血清用于评价。稀释100倍时，全部被测试的血清与每种r56反应。对5种r56确定每份血清的滴度，作为反应性的度量。在所述r56之间存在反应性差异。Kpr56和TA763r56对来自同种感染攻毒的血清具有最高的滴度(表3)，从而证实预期的假设：这些抗原对其自身抗体的反应最大。除了对同种血清的反应性之外，Kpr56还是对源自Th1812、18032460、18032404、Woods、Citrano感染小鼠的血清反应性最大的抗原。TA763r56是对TH1811、TH1812、TH1814、AFC-27、18032404、Woods、Citrano和MAK243反应性最大的抗原(表3)。嵌合抗原C1、C2和C3对任意的给定血清相似地反应(表4)。

表3.使用ELISA^a用14种小鼠血清测量Kpr56和TA763r56的反应性

a.ELISA如材料和方法中所述进行。全部血清均来自小鼠，例外是MAK119和MAK243来自人。阳性临界值至少是阴性血清平均OD₄₀₅+2个标准差。在小鼠血清的情况下，临界值是0.1。对于MAK119和MAK243，临界值是0.6。

b.以红色突出显示的滴度是对Kpr56显出最高滴度的那些血清，以蓝色突出显示的滴度是对TA763r56显出最高滴度的那些血清。

表4.在ELISA^a中用14份虫株特异性小鼠血清和2份患者血清测量嵌合r56的反应性

所用的抗原

a ELISA如材料和方法中所述进行。全部血清均来自小鼠，例外是MAK119和MAK243来自人。阳性临界值至少是阴性血清OD₄₀₅平均数+2个标准差。在小鼠血清的情况下，临界值是0.1。对于MAK119和MAK243，临界值是0.6。

b粗体字虫株是在嵌合体及亲代Kpr56和/或TA763r56至少之一者中具有相同滴度的那些虫株。

c以红色突出显示的滴度是所述嵌合体当中对C1显出最高滴度的那些血清，以蓝色突出显示的滴度是所述嵌合体当中对C2显出最高滴度的那些血清，并且以绿色突出显示的滴度是所述嵌合体当中对C3显出最高滴度的那些血清。

另外，对于绝大多数测试的血清，除Karp、TA763、TH1811和TH1812之外，嵌合抗原(C1、C2和C3)都具有如Kpr56或TA763r56那样的反应性。这些结果表明虽然对亲代56kDa蛋白进行序列修饰，这些嵌合抗原仍保持对大多数血清的相似反应性。因而，提升了以下可能性：使用这三种嵌合抗原之一作为Kpr56和TA763r56的替代物。仅在所述嵌合抗原之间进行比较时，C1似乎是最好抗原，原因是它具有针对全部14种血清的最高滴度。实际上，对于7种测试的血清而言，对C1的滴度高达针对Kpr56或TA763r56的那些滴度。虽然几乎不能将针对特定抗原的滴度与免疫应答的总体刺激作用关联，然而滴度的测量确实提供了关于某种抗原对抗体的反应性的信息。因而，这些嵌合体可以作为试剂用于诊断目的以及用作疫苗候选物，这是合理的。

实施例3：在小鼠攻毒模型中评价嵌合抗原的保护效力

CD1雌性小鼠用r56免疫并随后进行攻毒以评价由各种r56提供的保护效力。用5ug每种蛋白质抗原连同根据实验设计作为佐剂的CpG(aligo 1826)和montanide以皮下方式免疫10只小鼠。通过腹膜内注射活恙虫病东方体进行攻毒并且将小鼠监测额外的21日。先前实验已经显示使用Kpr56一次或两次免疫提供低劣的异种保护作用。因而，在本研究中以4周间隔给予小鼠三次免疫。

进行同种攻毒以相对于亲本蛋白质(即Kpr56和TA763r56)比较这些嵌合蛋白的保护性作用。我们发现嵌合抗原1和2提供与Kpr56相似或比Kpr56更好的针对Karp虫株攻毒的保护作用。虽然所述嵌合体均没有提供比TA763r56更好的针对TA763虫株攻毒的保护作用，但观察到由全部嵌合体提供的部分保护作用。所述结果表明这些嵌合蛋白抗原可以提供针对Karp虫株的优异同种保护作用和针对异种TA763虫株的部分保护作用。需要进一步研究来比较TA763r56或Kpr56针对异种攻毒的保护效力与嵌合蛋白的保护效力。嵌合蛋白的组合可以提供更宽泛的保护作用。

表5评价重组蛋白抗原在小鼠攻毒模型中的保护效力

a所用的免疫原是来自Karp(Kpr56)和TA763(TA763r56)虫株的r56蛋白抗原和如前所述的3种嵌合r56蛋白抗原。

b小鼠以4周间隔免疫三次。攻毒在最后一次免疫4周后进行。

c小鼠以2周间隔免疫三次。攻毒在最后一次免疫2周后进行。

因为这些新产生的嵌合蛋白与亲本蛋白质相似地与血清反应，故可以使用三种嵌合体之一，尤其C1来替代亲本蛋白质用于诊断恙虫病东方体感染或用作疫苗候选物以改善宽泛的保护效力。

本发明的一个实施方案是用于检测丛林斑疹伤寒抗体的测定法，

包括：

a.从受试者获得样品；

b.使该样品在选自由ELISA平板、点印迹基质和手持式色谱与流通分析装置组成的组的分析设备中暴露于重组嵌合抗原；其中所述的嵌合抗原含有含有来自多于一种恙虫病东方体虫株的未修饰和修饰的反应性多肽片段，如前述章节中所述的嵌合抗原蛋白C1、C2和C3。

可能的是：可以建立相似的方法以基于来自不同虫株的56kDa蛋白序列产生更多嵌合体，旨在使最终疫苗配方中所包含蛋白质的数目最小化，但仍提供尽可能针对绝大多数虫株的极宽泛保护作用。

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附件A：表1

考虑事项：VDI：虫株特异性

          VDII：交叉反应性

          VDIII：无抗体应答(构象表位？)

          VDIV：虫株特异性(Karp和TA763是极相似的)

嵌合1(基于Karp)

VDI(带修饰的TA763)+VDII(Kp)+VDIII(Kp)+Const(Kp)+VDIV(Kp)

Karp    GFRAEIGVMYLTNITAQ VEEGKVKADS VGETKADS VGGK

Chiml   SFRAELGVMYLRNITAQVEEGKVK7ADSGSKTKADSGGET(seq-1)

TA763   SIRAELGVMYLRNISAEVELGKVKADSGSKTKADSGGET

嵌合2(基于TA763)改变Y106至C106

VDI(TA763)+VDII(TA763)+VDIII(带修饰的Kp)+Const(Kp或TA)+VDIV(Kp)

Karp   GPMVINPILLNIPQGNPNP VGNPPQRANPPAGF AIHNHEQWRH-L

Chiml  SFRAELGVMYLRNITAQVEEGKVK7ADSGSKTKADSGGET(seq-1)

TA763  GRM^1VNPVLLNIPQGPP--AQNP--RAAMQP-CNILDHDHWKH-

嵌合3全部3个可变结构域被修饰，外加改变Y106至C106

VDI(带修饰Seq-1的TA763)+VDII(带修饰Seq-3的TA763)+VDIII(带修饰Seq-2的Kp)+Const(Kp或TA)+VDIV(Kp)

Claims (12)

1.一种重组嵌合蛋白，包含来自多于一种恙虫病东方体虫株的修饰和未修饰的反应性多肽片段。

2.根据权利要求1的重组嵌合抗原，其中，所述恙虫病东方体虫株选自由Karp、Kato、Gilliam、TA763、TH1811、TH1812、TH1814、AFC27、18032460、18032404、Woods、Citrano、MAK119、MAK243及其组合组成的组。

3.根据权利要求1的重组嵌合抗原，其中，所述反应性多肽片段是恙虫病东方体的截短非融合r56kDa基因的表达产物的再折叠片段。

4.根据权利要求1的重组嵌合抗原，其中，所述嵌合蛋白包含SEQ ID NO：1中所述的氨基酸序列。

5.根据权利要求1的重组嵌合蛋白，其中，所述嵌合蛋白包含SEQ ID NO：2中所述的氨基酸序列。

6.根据权利要求1的重组嵌合蛋白，其中，所述嵌合蛋白包含SEQ ID NO：3中所述的氨基酸序列。

7.用于检测针对丛林斑疹伤寒的抗体的测定法，包括：

a.从受试者获得样品；和

b.在选自由ELISA平板、点印迹基质和手持式色谱与流通分析装置组成的组中的分析设备中，使该样品暴露于重组嵌合抗原；

其中所述的重组嵌合抗原含有来自多于一种恙虫病东方体虫株的未修饰和修饰的反应性多肽片段。

8.根据权利要求7的测定法，其中，所述重组嵌合抗原用于检测受试者中的既往丛林斑疹伤寒暴露。

9.根据权利要求7的测定法，其中，所述反应性多肽片段是恙虫病东方体的截短非融合56kDa基因的表达产物的再折叠片段。

10.根据权利要求9的测定法，其中，所述嵌合蛋白是SEQ ID NO.：1、SEQ ID NO.：2或SEQ ID NO.：3中所述的氨基酸序列。

11.用于诱导针对恙虫病东方体的免疫应答的方法，包括将权利要求1的嵌合抗原连同合适的可药用载体施用给受试者。

12.用于诱导针对恙虫病东方体的免疫应答的方法，包括将SEQ ID NO.：1、SEQ ID NO.：2或SEQ ID NO.：3中所述的嵌合抗原1连同合适的可药用载体施用给受试者。

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