CN103360478A - 一组用于诊断斑疹伤寒的蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组用于诊断斑疹伤寒的蛋白及其应用。该组蛋白由Sca5蛋白、FtsZ蛋白、GroEL蛋白和Rp828蛋白组成。由这四种蛋白可以制成用于诊断斑疹伤寒的蛋白芯片和试剂盒。本发明所提供的该组蛋白、蛋白芯片及试剂盒可对斑疹伤寒人或动物的血清进行快速、准确的分析诊断，结果准确可靠。操作简便，样本用量少，省时省力，可以代替传统的繁琐的血清学诊断方法用来进行斑疹伤寒血清学诊断。

Description

一组用于诊断斑疹伤寒的蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及一组用于诊断斑疹伤寒的蛋白及其应用。

背景技术

斑疹伤寒是由立克次氏体引起的急性传染病，可分为流行性斑疹伤寒和地方性斑疹伤寒。前者又称虱型斑疹伤寒，由普氏立克次体（Rickettsia prowazekii）引起，经人虱传播的急性传染病，在发展中国家，尤其是在衣虱孳生的人群中时有流行。后者又称蚤型斑疹伤寒或鼠型斑疹伤寒，由莫氏立克次体（Rickettsia typhi）引起，经鼠蚤传播的急性传染病。地方性斑疹伤寒是全世界性的，凡是有老鼠和跳蚤的地方都可能有地方性斑疹伤寒疫源地的存在。

斑疹伤寒潜伏期为5～21天，多为10～12天。表现有起病急，寒战、高热、剧烈头痛、肌肉疼痛及压痛，尤以腓肠肌明显，颜面潮红、眼球结膜充血，精神神经症状如失眠、耳鸣、谵妄、狂躁，甚至昏迷。可有脉搏增快或中毒性心肌炎。多于病期第5天全身出现充血性斑疹或斑丘疹，以后可变为出血性，并有脾肿大。地方性斑疹伤寒上述表现较轻。

立克次体目可分为立克次体属和东方体属，其中对人类致病的立克次体主要包括立克次体属斑疹伤寒群的普氏立克次体、莫氏立克次体，斑点热群的立氏立克次体以及东方体属的恙虫病东方体等。而原伯杰氏细菌手册（1984年出版）将Q热的病原体贝氏柯克斯体也归为立克次体。

用立克次体全菌抗原做间接免疫荧光(IFA)是最常用的实验室血清学诊断斑疹伤寒的方法，但是该IFA存在不同种属立克次体菌体之间的抗体交叉反应，影响血清学诊断的可靠性。若用纯化的普氏或莫氏立克次体全菌作为抗原，又存在提取纯化立克次体的防护要求高、工艺复杂、成本昂贵等问题，因此这些方法都难以被广泛推广和使用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一组用于诊断斑疹伤寒的蛋白及其应用。

本发明所提供的一组用于诊断斑疹伤寒的蛋白，由如下（1）-（4）种抗原蛋白组成：

（1）Sca5蛋白

Sca5的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

（2）FtsZ蛋白

FtsZ的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

（3）GroEL蛋白

GroEL的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；

（4）Rp828蛋白

Rp828的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

上述编码基因可为如下中至少一种：

（1）Sca5编码基因

1）SEQ ID No.5所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述Sca5蛋白的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述Sca5蛋白的DNA分子；

（2）FtsZ编码基因

1）SEQ ID No.6所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述FtsZ蛋白的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述FtsZ蛋白的DNA分子；

（3）GroEL编码基因

1）SEQ ID No.7所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述GroEL蛋白的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述GroEL蛋白的DNA分子；

（4）Rp828编码基因

1）SEQ ID No.8所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述Rp828蛋白的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述Rp828蛋白的DNA分子。

含有上述任一所述蛋白编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种用于诊断斑疹伤寒的蛋白芯片。

本发明所提供的用于诊断斑疹伤寒的蛋白芯片，包括基底和设于基底之上的若干个检测点；每个检测点上设有一种蛋白，所述若干个检测点上共设有如下四种蛋白：上述Sca5蛋白、上述FtsZ蛋白、上述GroEL蛋白和上述Rp828蛋白。

上述蛋白芯片中，在所述基底上还可设有阳性质控点和阴性质控点。

上述蛋白芯片中，基底可为任何适于做蛋白芯片的基底，具体可为醛基化玻片基底。

上述蛋白芯片中，每个检测点的蛋白含量为11ng。

本发明的另一个目的是提供一种诊断斑疹伤寒的试剂盒。

本发明所提供的诊断斑疹伤寒的试剂盒，由上述任一所述的蛋白芯片、Cy5标记的能与待测血清相结合的抗体、封闭液和漂洗液组成；

所述的封闭液是将牛血清白蛋白与PBS缓冲液按照1g：100ml的配比混合得到的；

所述漂洗液为PBST缓冲液。

上述试剂盒中还可包括说明书，所述说明书中记载如下内容：

使用方法：将待测样本的血清与转入空载体pET-32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液在25℃共孵育2h，离心取上清液，得到中和后血清；将中和后血清加入到所述蛋白芯片上，25℃作用1h；再加入Cy5标记的能与待测血清相结合的抗体，25℃作用1h；检测每个蛋白检测点的荧光信号值；

结果判断方法：以样本荧光平均值减去背景荧光平均值作为每个蛋白检测点的反应荧光值，每种蛋白所有重复点的反应荧光值的平均值作为该种蛋白的荧光信号值；以未感染任何病菌的正常血清作为对照，若一种蛋白的荧光信号值大于对照的荧光信号平均值与2倍SD之和，则认为该种蛋白的结果为阳性；若四种蛋白中3个以上显示阳性时，则判定所述待测样本候选为斑疹伤寒病样本。

上述4种蛋白上述蛋白芯片、上述试剂盒在制备诊断斑疹伤寒的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述诊断斑疹伤寒可为血清学诊断。

上述应用中，所述斑疹伤寒由病原菌普氏立克次体（Rickettsia prowazekii）或莫氏立克次体（Rickettsia typhi）感染引起的。

上述蛋白、或芯片、或试剂盒既可用于检测人也可用于检测除人以外的动物血清。

本发明所提供的该组蛋白、蛋白芯片及诊断试剂盒可对人或除人以外的动物的血清进行快速、准确的分析诊断，结果准确可靠，操作简便，样本用量少，省时省力，可以代替传统的繁琐的血清学诊断方法用来进行斑疹伤寒血清学诊断。

附图说明

图1为抗原蛋白的电泳结果。

图2为蛋白芯片点样示意图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。

下述实施例中使用的实验材料、来源及配制方法如下：

每1升裂解缓冲液按照如下方法制备：将50mmol NaH₂PO₄·H₂O、300mmol NaCl、10mmol咪唑和ddH₂O混合，用NaOH调节pH至8.0，用ddH₂O定容至1L，得到裂解缓冲液。

0.1mol/L Tris-HCl缓冲液配制：将12.11g Tris、800mL ddH₂O和49mL的HCl混合，滴加浓盐酸调pH至8.0，用ddH₂O定容至1L，得到0.1mol/L Tris-HCl缓冲液。

每1升回收缓冲液按照如下方法制备：将100mmol NaH₂PO₄·H₂O、0.1L Tris-Cl缓冲液（0.1mol/L）、8mol尿素和ddH₂O混合，用NaOH调节pH至8.0，用ddH₂O定容至1L，得到回收缓冲液。

复性缓冲液的制备：

6M尿素复性缓冲液按照如下方法制备：将500mmol NaCl、0.2L Tris-HCl缓冲液（0.1mol/L）、6mol尿素、0.2L甘油和ddH₂O混合，调节pH至7.4，用ddH₂O定容至1升，得到含6M尿素复性缓冲液。

无尿素复性缓冲液按照如下方法制备：将500mmol NaCl、0.2L Tris-HCl缓冲液（0.1mol/L）、0.2L甘油和ddH₂O混合，调节pH至7.4，用ddH₂O定容至1升，得到无尿素复性缓冲液。

5M-1M尿素复性缓冲液由6M尿素复性缓冲液和无尿素复性缓冲液按照不同体积配比得到。

每1升洗涤缓冲液组成：将50mmol NaH₂PO₄·H₂O、300mmol NaCl、20mmol咪唑和ddH₂O混合，用NaOH调节pH至8.0，用ddH₂O定容至1L，得到洗涤缓冲液。

每1升洗脱缓冲液组成：将50mmol NaH₂PO₄·H₂O、300mmol NaCl、250mmol咪唑、0.3L甘油和ddH₂O混合，用NaOH调节pH至8.0，用ddH₂O定容至1L，得到洗脱缓冲液。

每1升LB液体培养基组成：将10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠和ddH₂O混合，用ddH₂O定容至1L，121℃,灭菌20min得到LB液体培养基。

每1升磷酸盐缓冲液（PBS）按照如下方法制备：将8g NaCl、0.2g KCl、3.53gNa₂HPO₄·12H₂O、0.24g KH₂PO₄和ddH₂O混合，用ddH₂O定容至1升，得到的溶液的pH值为7.4，即得到PBS缓冲液。

每1升PBST缓冲液按照如下方法制备：将磷酸盐缓冲液（PBS）与Tween-20混合，磷酸盐缓冲液（PBS）与Tween-20的配比为1升：1ml，得到PBST缓冲液。

鼠源IgG购自中科晨宇（北京）生物科技中心，产品目录号为161022。

鼠源IgG溶液的配制：将鼠源IgG溶于PBS缓冲液中，使鼠源IgG的浓度为300μg/ml，得到鼠源IgG溶液。

转入空载体pET-32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液按照如下方法制备：将转入空载体pET-32a(+)的BL21(DE3)接入含氨苄的LB液体培养基中，37℃，200rpm震摇过夜，次日按体积比1：100接种到含氨苄的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀＝0.4，加入诱导剂IPTG，至终浓度为0.4mM，37℃，200rpm继续培养4小时，得到菌液。取诱导表达的菌液100ml，8000rpm离心5min，收集菌体，弃上清液。用30ml裂解缓冲液重悬菌体，以25%振幅超声破碎（超3s，停9s）1小时，得到转入pET-32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液。

普氏立克次体（Rickettsia prowazekii）Madrid E株，在文献“实时荧光定量PCR检测普氏立克次体，中华流行病学杂志2006，27，963-967”中公开过，公众可在法律及军队相关规定允许的范围内从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。

莫氏立克次体（Rickettsia typhi）Wilmington株，在文献“实时荧光定量PCR检测莫氏立克次体，解放军医学杂志2007，32，1054-1056”中公开过，公众可在法律及军队相关规定允许的范围内从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。

立氏立克次体（Rickettsia rickettsii）Smith株，在文献“立氏立克次体实时荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立，中华流行病学杂志2006，27，526-529”中公开过，公众可在法律及军队相关规定允许的范围内从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。

贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）新桥株在文献“Wen,B.,S.Yu,G.Yu,Q.Li,and X.Zhang.1991.Analysis of proteins and lipopolysaccharides fromChinese isolates of Coxiella burnetii with monoclonal antibodies.Acta Virol35:538-544.”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。

恙虫病东方体（Orientia tsutsugamushi）Karp株在文献“实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体，中华流行病学杂志,2006,22(3),228-231.”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。

Cy5标记的羊抗鼠IgG购自美国SouthernBiotech公司，产品目录号为D3305-S226C；

鼠抗His标签购自上海希美化学有限公司；

PolymerSlideTMG高分子醛基化蛋白芯片购自博奥生物有限公司，目录号为420040。

小鼠为6周龄雄性BALB/c小鼠，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。

实施例1、4种抗原蛋白及其制备

一、4种抗原蛋白的氨基酸序列及核苷酸序列

4种抗原蛋白的氨基酸序列及核苷酸序列如表1所示。

表1氨基酸及核苷酸序列

蛋白名称	蛋白序列	基因名称	核苷酸序列
				Sca5	SEQ ID No.1	sca5	SEQ ID No.5
FtsZ	SEQ ID No.2	ftsZ	SEQ ID No.6
				GroEL	SEQ ID No.3	groEL	SEQ ID No.7
Rp828	SEQ ID No.4	rp828	SEQ ID No.8

二、4种抗原蛋白的制备

（一）基因片段的扩增

以普氏立克次体（Rickettsia prowazekii）Madrid E株的基因组DNA为模板，分别用sca5、ftsZ、groEL和rp828基因的引物（见表2）进行PCR扩增，得到4种基因的扩增产物。PCR扩增的通用条件：94℃预变性5min；95℃30sec，55℃30sec，72℃1.5min，循环35次；72℃延伸7min。

（二）重组载体的构建

将sca5基因的扩增产物用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切，回收sca5基因片段；将出发载体pET-32a(+)用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切，回收载体大片段；将目的基因片段和载体大片段连接，得到重组载体pET-sca5。

将ftsZ基因的扩增产物用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切，回收ftsZ基因片段；将出发载体pET-32a(+)用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切，回收载体大片段；将目的基因片段和载体大片段连接，得到重组载体pET-ftsZ。

将groEL基因的扩增产物用限制性内切酶BamHI和SalI双酶切，回收groEL基因片段；将出发载体pET-32a(+)用限制性内切酶BamHI和SalI双酶切，回收载体大片段；将目的基因片段和载体大片段连接，得到重组载体pET-groEL。

将rp828基因的扩增产物用限制性内切酶BamHI和SalI双酶切，回收rp828基因片段；将出发载体pET-32a(+)用限制性内切酶BamHI和SalI双酶切，回收载体大片段；将目的基因片段和载体大片段连接，得到重组载体pET-rp828。

表2引物序列、酶切位点和出发载体

注：引物的酶切位点为下划线所示序列

（三）重组菌的制备

将4种重组质粒pET-sca5，pET-ftsZ，pET-groEL和pET-rp828分别转入出发菌大肠杆菌BL21中，得到4种重组菌。

将4种重组菌分别接入含有氨苄的固体LB平板培养基中，37℃培养，挑取单克隆；将单克隆接入含有氨苄的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养，提取得到4种重组质粒，进行测序，结果表明构建的4种重组质粒正确。含有重组质粒的重组菌为阳性重组菌。

（四）蛋白表达

将4种阳性重组菌分别接入含有氨苄的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜，次日按体积比1：100接种到含有氨苄的LB液体培养基，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀=0.4，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.4mM，37℃，200rpm培养4小时，得到菌液。

（五）蛋白纯化

1、分别取上一步诱导表达的4种菌液各100ml，8000rpm离心5min，收集菌体，弃上清。

2、各管中加入30ml裂解缓冲液重悬菌体，以25%振幅超声破碎（超3s，停9s）1小时。

3、取出超声裂解物，以12000rpm离心20min，弃沉淀，收集上清液。

4、向4种上清液中分别加入10ml回收缓冲液，混匀，1h后12000rpm离心20min，弃沉淀，收集上清液。

5、将4种上清液置于15ml离心管中，分别与2mlNi-NTA混合，室温200rpm振荡混匀4h，使4种目的蛋白与Ni-NTA完全结合。

6、用移液管直接吸掉上清，依次加入与上清液等体积的含6M～0M（6M、5M、4M、3M、2M、1M、0M）尿素的复性缓冲液逐级复性，每次加入复性缓冲液后混匀，室温静置作用4h。每次加入下一复性缓冲液之前将上一缓冲液直接吸弃,待加入含0M尿素的复性缓冲液作用4h后，倒入纯化空柱中。

7、各个柱中分别加入10ml洗涤缓冲液洗涤，并控制流速为3ml/min。

8、待洗涤缓冲液流净，加入洗脱缓冲液，共洗脱4次，每次0.5ml，流速为1ml/min。将收集的洗脱液合并，即得到4种抗原蛋白溶液。

9、将纯化得到的4种抗原蛋白溶液进行电泳检测，结果如图1所示。

计算得到4种蛋白的分子量大小为：Sca5:36+17=53KD；FtsZ:40+17=57KD；GroEL：43+17=60KD；Rp828:23+17=40KD；由于重组蛋白带有pET-32a(+)上带有的17KD的标签蛋白，所以4种蛋白大小分别增加了17KD。

图1表明，纯化得到的4种蛋白的大小与预期一致。结果表明制备的4种抗原蛋白Sca5、FtsZ、GroEL和Rp828正确。

纯化得到的蛋白中，标签蛋白不影响Sca5、FtsZ、GroEL和Rp828的与抗体结合的性能。

实施例2、诊断斑疹伤寒的蛋白芯片及其制备

一、蛋白芯片的结构

蛋白芯片由醛基化玻片基底、检测点、阳性质控点和阴性质控点组成，其中检测点、阳性质控点和阴性质控点均点制在基底上。每种检测点、阳性质控点和阴性质控点均有5个重复。检测点、阳性质控点和阴性质控点在基底上呈矩阵式排列。蛋白芯片结构如图2所示。

（一）检测点分为4种：分别由蛋白Sca5、FtsZ、GroEL和Rp828蛋白点制而成，上述蛋白均以蛋白溶液形式点制。

（二）阳性质控点是鼠源IgG，鼠源IgG以溶液形式点制（如果检测人血清，则用人源IgG)。

（三）阴性质控点为由转入空载体pET-32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液点制而成。

二、蛋白芯片的制备

（一）将实施例1得到的4种蛋白溶液：Sca5蛋白溶液、FtsZ蛋白溶液、GroEL蛋白溶液和Rp828蛋白溶液均用洗脱缓冲液调整至300ug/ml，分别取蛋白溶液15μl至384孔板，用Arrayit

Ⅱ点样仪将蛋白点制在醛基化玻片上形成一个蛋白检测点，每个蛋白样品重复5次。

（二）取15ul，300ug/ml的鼠源IgG溶液至384孔板，用Arrayit

Ⅱ点样仪将其点制在醛基化玻片上形成一个检测点，重复5次，作为阳性质控，并作为矩阵的位置标识点。

（三）取15ul转入空载体pET-32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液至384孔板，用Arrayit

Ⅱ点样仪将其点制在醛基化玻片上形成一个检测点，重复5次，作为阴性质控。

（四）点制完成后，在25℃放置1h，得到蛋白芯片，4℃保存备用。

每15μl蛋白样品（含约4.5μg蛋白）或对照（阳性对照与阴性对照）可点制80张芯片×5个检测点/张=400个检测点，其中每个检测点蛋白量约为11ng。

实施例3、诊断斑疹伤寒的试剂盒

一、诊断斑疹伤寒试剂盒的组成

由实施例2制备得到的蛋白芯片、Cy5标记的羊抗鼠IgG、封闭液和漂洗液组成。

封闭液：将BSA溶于PBS缓冲液中，牛血清白蛋白（BSA）与PBS缓冲液的配比为1g：100ml，得到的溶液即为封闭液；

漂洗液：PBST缓冲液。

二、诊断斑疹伤寒试剂盒的应用

（一）诊断准确率的检测

1、血清样本的制备

感染小鼠血清的制备：用普氏立克次体（Rickettsia prowazekii）Madrid E株和莫氏立克次体（Rickettsia typhi）Wilmington株分别感染20只和15只BALB/c小鼠（六周龄小鼠，重量为200±20g每只），每只小鼠腹腔注射1×10⁸个菌体,分别在感染后第4周取尾静脉血，收集血清用于检测。

取20只正常BALB/c小鼠的尾静脉血血清作为对照。

取感染小鼠及正常小鼠的尾静脉血血清100μL，首先分别与转入空载体pET-32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液10μL在25℃共孵育2h，以15000g离心10min，取上清液，为中和后的感染小鼠血清和中和后的正常小鼠血清。

2、血清样本的检测

①将实施例2制备得到的蛋白芯片滴加封闭液，25℃封闭1h。

②然后用PBS缓冲液将中和后的感染小鼠血清和中和后的正常小鼠血清稀释100倍，取稀释后的中和后血清加入到蛋白芯片上，25℃作用1h。

③PBST缓冲液漂洗芯片5次。

④用PBS缓冲液将Cy5标记的羊抗鼠IgG稀释500倍至终浓度2ug/mL，取稀释后的羊抗鼠IgG按50ul/孔加入到芯片上，25℃作用1h。

⑤PBST缓冲液漂洗芯片5次。

⑥用去离子水漂洗芯片，避光晾干。

⑦用芯片扫描仪进行扫描。

扫描结果通过GenePieX Pro6.0软件进行图像处理与数据分析，以样品荧光平均值减去背景荧光平均值作为每个检测点的反应荧光值，每种蛋白所有重复点的反应荧光值的平均值作为该种蛋白的荧光信号值。

3、斑疹伤寒病样本判断标准

计算中和后的正常小鼠血清样本与每种蛋白点的反应荧光值的平均值（即荧光信号值）和标准差(SD)。设定中和后的正常小鼠血清蛋白点对应的荧光信号平均值与2倍SD之和为cut-off值。

中和后的感染小鼠血清蛋白点对应的荧光信号值大于中和后的正常小鼠血清蛋白点对应的荧光信号平均值与2倍SD之和，则认为中和后的感染小鼠血清蛋白与检测点的蛋白反应为阳性。4种蛋白中3个以上显示阳性时，诊断确定所检测的小鼠血清样本为斑疹伤寒病样本，或候选为斑疹伤寒病样本。试剂盒的诊断准确率计算公式如下：

诊断准确率=（真阳性样品数+真阴性样品数）/总样品数×100%

蛋白阳性率：对于每份血清样本来说，4个蛋白中呈阳性的蛋白种类数目占蛋白总数（即4）的百分比。

4、样本检测结果

20份中和后的正常小鼠血清的检测结果见表3，中和后的正常小鼠血清与全部4种蛋白反应阳性数为0，全部确诊为非感染血清，确诊率为20/20×100%=100%。

20份中和后的感染普氏立克次体（Rickettsia prowazekii）Madrid E株的小鼠血清的检测结果见表4，20份中和后的普氏立克次体感染血清样本均被检测为阳性，确诊率达到20/20×100%=100%。

15份中和后的感染莫氏立克次体（Rickettsia typhi）Wilmington株的小鼠血清的检测结果见表5，其中14份中和后的莫氏立克次体感染血清样本被检测为阳性，确诊率达到14/15×100%=93.3%。

因此，此试剂盒的诊断准确率（真阳性样品数34+真阴性样品数20）/总样品数55可达98.2%。

表3 20份中和后的正常小鼠血清与蛋白芯片反应荧光信号平均值

表4 20份中和后的普氏立克次体感染小鼠血清与蛋白芯片反应荧光信号平均值

表5 15份中和后的莫氏立克次体感染小鼠血清与蛋白芯片反应荧光信号平均值

（二）蛋白芯片的质控

为检测蛋白芯片的点样效果，将鼠抗His标签（一抗）用PBS缓冲液稀释100倍，按50μL/孔加入到封闭好的蛋白芯片上，后续步骤同（一）中的血清样本检测方法。由于4种抗原蛋白均带His标签，所以均能与鼠抗His标签抗体反应，再加入Cy5标记的羊抗鼠IgG，即可显示有荧光。

（三）诊断特异性的检测

1、血清样本的制备

感染小鼠血清为15份贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）新桥株感染小鼠血清，15份立氏立克次体（Rickettsia rickettsii）Smith株感染小鼠血清，15份恙虫病东方体（Orientia tsutsugamushi）Karp株感染小鼠血清。

上述感染血清的制备方法与普氏立克次体（Rickettsia prowazekii）Madrid E株和莫氏立克次体（Rickettsia typhi）Wilmington株感染小鼠血清的制备方法相同。

取20只正常BALB/c小鼠的尾静脉血血清作为对照。

取感染小鼠及正常小鼠的尾静脉血血清100μL，首先分别与转入空载体pET-32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液10μL在25℃共孵育2h，以15000g离心10min，取上清液，为中和后的感染小鼠血清和中和后的正常小鼠血清。

2、按照实验（一）中的血清样本检测方法检测各样本。

3、斑疹伤寒病样本判断标准同实验（一）中设定的标准。

试剂盒的诊断特异性计算公式如下：

诊断特异性=真阴性样品数/（真阴性样品数+假阳性样品数）×100%。

4、样本检测结果

15份中和后的贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）新桥株感染小鼠血清样本检测结果见表6，结果均判定为阴性。该试剂盒在检测贝氏柯克斯体感染小鼠血清样本的特异性为100%。

15份中和后的立氏立克次体（Rickettsia rickettsii）Smith株感染小鼠血清样本检测结果见表7，结果均判定为阴性。该试剂盒在检测立氏立克次体感染小鼠血清样本的特异性为100%。

15份中和后的恙虫病东方体（Orientia tsutsugamushi）Karp株感染小鼠血清样本的检测结果见表8，其中14份判定为阴性，1份判定为阳性（即蛋白阳性率≥75%），该试剂盒在检测恙虫病东方体感染小鼠血清样本的特异性为93.3%。

综合以上实验结果，共检测正常小鼠血清20份、普氏立克次体感染小鼠血清20份、莫氏立克次体感染小鼠血清15份、贝氏柯克斯体感染小鼠血清15份、立氏立克次体感染小鼠血清15份、恙虫病东方体感染小鼠血清15份，该蛋白芯片在检测斑疹伤寒立克次体的准确性为（20+20+14+15+15+14）/（20+20+15+15+15+15）×100%=98.0%，特异性为（20+15+15+14）/（20+15+15+14+1）×100%=98.5%。

结果表明，利用该试剂盒检测斑疹伤寒血清样本的结果是准确和特异的。

表6 15份中和后的贝氏柯克斯体感染小鼠血清与蛋白芯片反应荧光信号平均值

表7 15份中和后的立氏立克次体感染小鼠血清与蛋白芯片反应荧光信号平均值

表8 15份中和后的恙虫病东方体感染小鼠血清与蛋白芯片反应荧光信号平均值

Claims (10)

1.一组用于诊断斑疹伤寒的蛋白，由如下（1）-（4）种抗原蛋白组成：

（1）Sca5蛋白

Sca5的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

（2）FtsZ蛋白

FtsZ的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

（3）GroEL蛋白

GroEL的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；

（4）Rp828蛋白

Rp828的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下中至少一种：

（1）Sca5编码基因

1）SEQ ID No.5所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述Sca5蛋白的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述Sca5蛋白的DNA分子；

（2）FtsZ编码基因

1）SEQ ID No.6所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述FtsZ蛋白的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述FtsZ蛋白的DNA分子；

（3）GroEL编码基因

1）SEQ ID No.7所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述GroEL蛋白的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述GroEL蛋白的DNA分子；

（4）Rp828编码基因

1）SEQ ID No.8所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述Rp828蛋白的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述Rp828蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述蛋白编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.一种用于诊断斑疹伤寒的蛋白芯片，包括基底和设于基底之上的若干个检测点；每个检测点上设有一种蛋白，所述若干个检测点上共设有如下四种蛋白：权利要求1中所述Sca5蛋白、权利要求1中所述FtsZ蛋白、权利要求1中所述GroEL蛋白和权利要求1中所述Rp828蛋白。

6.根据权利要求5所述的蛋白芯片，其特征在于：每个检测点的蛋白含量为11ng。

7.一种诊断斑疹伤寒的试剂盒，由权利要求5或6所述的蛋白芯片、Cy5标记的能与待测血清相结合的抗体、封闭液和漂洗液组成；

所述的封闭液是将牛血清白蛋白与PBS缓冲液按照1g：100ml的配比混合得到的；

所述漂洗液为PBST缓冲液。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括说明书，所述说明书中记载如下内容：

使用方法：将待测样本的血清与转入空载体pET-32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液在25℃共孵育2h，离心取上清液，得到中和后血清；将中和后血清加入到所述蛋白芯片上，25℃作用1h；再加入Cy5标记的能与待测血清相结合的抗体，25℃作用1h；检测每个蛋白检测点的荧光信号值；

结果判断方法：以样本荧光平均值减去背景荧光平均值作为每个蛋白检测点的反应荧光值，每种蛋白所有重复点的反应荧光值的平均值作为该种蛋白的荧光信号值；以未感染任何病菌的正常血清作为对照，若一种蛋白的荧光信号值大于对照的荧光信号平均值与2倍SD之和，则认为该种蛋白的结果为阳性；若四种蛋白中3个以上显示阳性时，则判定所述待测样本候选为斑疹伤寒病样本。

9.权利要求1所述的4种蛋白、权利要求5或6所述的蛋白芯片、权利要求7或8所述的试剂盒在制备诊断斑疹伤寒的产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述斑疹伤寒由病原菌普氏立克次体（Rickettsia prowazekii）或莫氏立克次体（Rickettsia typhi）感染引起的。

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