CN109355409B - 一种高通量可视化快速检测立克次体的芯片及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域，具体公开了一种高通量可视化快速检测立克次体的芯片及应用。本发明旨在通过设计立克次体属特异性和种特异性探针，实现高通量的种、属特异性检测。并通过人工合成生物素标记的引物与探针，利用链青霉素‑辣根过氧化物酶与标记生物素结合，进一步与沉淀型TMB进行显色反应获得可视化的检测结果。本发明可用于以下10种立克次体的快速诊断：普氏立克次体、莫氏立克次体、康氏立克次体、黑龙江立克次体、立氏立克次体、西伯利亚立克次体、查菲埃立克体、犬埃立克体、恙虫病东方体和贝氏柯克斯体。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体地说，涉及一种高通量可视化快速检测立克次体的芯片及应用。
背景技术
立克次体(rickettsiae)是一类除极少数外专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌，其引起的立克次体病是一类重要的人畜共患的自然疫源性疾病，在世界范围内呈散发性和季节性流行。许多节肢动物如虱、蚤、蜱、螨等均可作为立克次体感染的传播媒介。随着国际旅游业的发展，立克次体病被认为是威胁旅游健康的重要传染病之一。近些年来，斑点热新种的不断出现，埃立克体等新发立克次体的流行，都在提醒我们立克次体病大规模流行和突然暴发的可能性。因此，加强立克次体的监测与防治具有重要的现实意义。
目前世界范围内已发现具有致病性的立克次体有20余种，病人分离出的病原体以及基因检测证据表明我国至少存在10种立克次体病。立克次体病早期症状多以发热，流感样症状出现，无明显特异性临床特征，临床误诊率极高，并且通过血清学及现有基因检测手段通常局限于感染中后期才能检测发现，往往延误病情，最后导致严重的并发症，甚至死亡。因此快速、准确的早期诊断是防控立克次体病的关键。
传统的立克次体检测方法主要有分离培养、PCR和免疫学诊断。但分离培养耗时长，操作复杂；PCR和免疫学方法只能检测一种或几种病原体，不能完全满足检测种类多样的立克次体的需要。
目前，国内外针对立克次体的分子生物学检测方法主要有聚合酶链反应和限制性片段多态性分析，普通PCR检测立克次体的特定序列，但特异性和敏感性均达不到良好的效果。随后改良的套式PCR(nested PCR，nPCR)明显提高了检测的灵敏度，但存在假阳性率过高的问题。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)虽可很好地克服了这一缺陷，还可以利用荧光标记进行定量检测，但这一方法的检测效率低，荧光物质成本过高，达不到临床快速、高通量检测的推广效果。研究者进一步采用限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)，即通过比对被限制性内切酶处理过的样本基因片段长度来鉴别不同立克次体及鉴定位置未知立克次体的种属。该方法可以对立克次体分型诊断，但仅通过酶切后的基因长度进行分析，仍无法为亲缘性较近的立克次体分型。
随着生物信息学技术的发展，多位点序列分型(multi-locus sequence typing，MLST或MST)成为立克次体基因诊断与分型较为可靠的新方法。Fournier利用立克次体OmpA的编码基因序列与GenBank中的已知序列不对进行半点热群立克次体的种间鉴别，随后同时比对了rrs、gltA、ompA、ompB和sca4这5个不同基因，综合比对结果进行分型，结果发现MLST大大提高了立克次体检测的敏感性和分型的可靠性，但检测周期较长，成本较高，无法对大量样品同时进行快速检测。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种高通量可视化快速检测立克次体的芯片及应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明首先提供了一种高通量可视化快速检测立克次体的探针组，包括：
(1)4条属特异性探针：1条立克次体属通用探针(如SEQ ID NO.9所示)；1条埃里克体属通用探针(如SEQ ID NO.10所示)；1条恙虫属通用探针(如SEQ ID NO.11所示)；1条贝氏柯克斯体属通用探针(如SEQ ID NO.12所示)；
(2)10条种特异性探针序列(如SEQ ID NO.17-26所示)。
进一步地，本发明提供了一种高通量可视化快速检测立克次体的芯片，包括本领域常规的芯片载体和前述探针组。
更进一步地，本发明提供了一种高通量可视化快速检测立克次体的试剂盒，包括上述芯片。
所述试剂盒除包括上述芯片外，还包括以下4对属特异性引物：立克次体属上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；埃里克体属上游引物序列如SEQ ID No.3所示，下游引物序列如SEQ ID No.4所示；贝氏柯克斯体属上游引物序列如SEQ ID No.5所示，下游引物序列如SEQ ID No.6所示；恙虫属上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示。
进一步地，在合成引物和探针时，每对属特异性引物的下游引物的5’端标记生物素；10条种特异性探针，4条属特异性探针及8条类原体探针的3’端均连接20个多聚碱基T作为连接端的摆动臂，使其具有空间柔性，降低空间位阻，5’端均不修饰。
作为优选，本发明所述试剂盒的芯片上还包括：
10种立克次体的阳性质粒标准品：分别为含有普氏立克次体、莫氏立克次体、康氏立克次体、黑龙江立克次体、立氏立克次体、西伯利亚立克次体、查菲埃立克体、犬埃立克体、恙虫病东方体和贝氏柯克斯体标准菌株的16S rRNA基因的重组质粒；
1条阳性质控探针，如SEQ ID NO.13所示；
1条阳性质控互补寡聚核苷酸链，如SEQ ID NO.14所示；
1条阴性质控探针，如SEQ ID NO.15所示；
1条显色质控探针，如SEQ ID NO.16所示。
进一步地，所述显色质控探针的3’端标记20个多聚碱基T作为连接端的摆动臂，并在其5’端标记生物素；所述阳性质控探针，阳性质控互补寡聚核苷酸链，和阴性质控探针的3’端均连接20个多聚碱基T作为连接端的摆动臂，使其具有空间柔性，降低空间位阻，5’端均不修饰。
所述显色质控探针用于检测芯片显色质量，所述阴性质控探针为与立克次体及类原体无关的基因序列，用于指示探针的特异性。
进一步地，为了确保立克次体基因芯片的特异性，还可增加8条类原体探针序列(如SEQ ID NO.27-34所示)。
进一步地，本发明所述芯片的制备方法为：
将合成后的探针用去离子水稀释成100μM作为储存液，用点样液稀释探针至终浓度为8μM，分装于点样仪中，采用喷射点样的方式将探针点制在正电尼龙膜载体上，点样完成后将芯片置于紫外线下交联15分钟。使探针牢固的固定在芯片载体上，将点制完成的芯片常温干燥保存和检验，检验合格后方可用于检测。
作为优选，探针的点样量均为0.3μL。
更进一步地，所述试剂盒还包括芯片杂交反应的原始试剂M1、M2和M3液，购于上海界源生物技术有限公司。根据说明书(见下表)用M1、M2和M3液配制芯片工作液：杂交液A、洗涤液B和洗涤液C，以及PCR反应试剂和TMB显色液。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的高通量可视化快速检测立克次体的芯片，可同时检测立克次体的4个属及10个种重要的立克次体，包括普氏立克次体，莫氏立克次体，康氏立克次体，黑龙江立克次体，立氏立克次体，西伯利亚立克次体，查菲埃里克体，犬埃里克体，恙虫病立克次体，贝氏柯克斯体。
本发明对引物和探针的设计，避免了多重体系中不同引物之间的非特异性交叉反应，也避免了探针与非目标序列产物DNA的非特异性杂交。所述引物和探针采用特异性保守简并寡核苷酸设计，提高了对目标序列的检测覆盖度。
本发明采用基因芯片检测方法，可实现高通量平行检测多个样本的多个相关指标，为立克次体感染的临床诊断及流行病学调查提供一种新的检测手段。
附图说明
图1为本发明立克次体属特异性检测基因芯片的微阵列示意图。矩阵图中各个字母代表的探针如下：
| A代表立克次体属探针 | SEQ ID NO.9 | G大肠杆菌探针 | SEQ ID NO.29 |
| B代表埃里克体属探针 | SEQ ID NO.10 | H沙门氏菌探针 | SEQ ID NO.31 |
| C代表贝氏柯克斯体属探针 | SEQ ID NO.11 | I芽孢杆菌探针 | SEQ ID NO.27 |
| D代表恙虫属探针 | SEQ ID NO.12 | J肺炎链球菌探针 | SEQ ID NO.34 |
| E肺炎支原体探针 | SEQ ID NO.33 | K金黄色葡萄球菌探针 | SEQ ID NO.28 |
| F鹦鹉热衣原体探针 | SEQ ID NO.32 | L霍乱弧菌探针 | SEQ ID NO.30 |
| SC代表显色质控探针 | SEQ ID NO.16 | NC代表阴性质控探针 | SEQ ID NO.15 |
| PC代表阳性质控探针 | SEQ ID NO.13 |
图2为本发明立克次体种特异性检测基因芯片的微阵列示意图。矩阵图中各个数字代表的探针如下：
| 1代表普氏立克次体探针 | SEQ ID NO.17 | 6黑龙江立克次体探针 | SEQ ID NO.22 |
| 2代表莫氏立克次体 | SEQ ID NO.18 | 7犬埃立克体探针 | SEQ ID NO.23 |
| 3代表立氏立克次体 | SEQ ID NO.19 | 8查非埃立克体探针 | SEQ ID NO.24 |
| 4代表康氏立克次体 | SEQ ID NO.20 | 9贝氏柯克斯体探针 | SEQ ID NO.25 |
| 5代表西伯利亚立克次体 | SEQ ID NO.21 | 10东方恙虫体探针 | SEQ ID NO.26 |
| SC代表显色质控探针 | SEQ ID NO.16 | PC代表阳性质控探针 | SEQ ID NO.13 |
| NC代表阴性质控探针 | SEQ ID NO.15 |
图3为实施例3的属特异性检测结果。
图4为实施例3的种特异性检测结果。
图5为实施例4的灵敏度检测。
图6为实施例5的芯片片内重复性结果。
图7为实施例5的芯片片间重复性结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1立克次体种属特异性微阵列基因芯片的制备
1、材料
立克次体探针和引物：委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
正点尼龙膜：(Nylon Membranes,positively charged,Roche公司)：购自Sigma-Aldrich公司。
沉淀型TMB显色液：购自北京奥博龙免疫技术有限公司。
杂交液：购自中国科学院苏州纳米研究所。
辣根过氧化物酶标记链酶亲和素(streptavidin－HRP)：购自Thermo FisherScientific公司；
血液和组织样本DNA提取试剂盒(DNeasy 96Blood&Tissue Kit)：购自德国Qiagen公司；
杂交反应原液M1、M2和M3：购自上海界源生物技术有限公司。根据配比说明书(见上文)配置芯片工作液：杂交液A、洗涤液B和洗涤液C。
2、方法：
2.1核酸探针的设计及筛选：
表1立克次体多重PCR扩增引物
| 引物名称 | 序列(5’-3’) | 序列号 |
| Rickettsia F | CTCAGAACGAACGCTATCGGTATG | SEQ ID No.1 |
| Rickettsia R | Biotin-GTATTGCTGGATCAGGCTTTCG | SEQ ID No.2 |
| Ehrlichia-F | GGCAAGCCTAACACATGCAAG | SEQ ID No.3 |
| Ehrlichia-R | Biotin-CTTCTTCACTCACGCGGCATA | SEQ ID No.4 |
| Coxiella-F | CCTTGTAGTGGGGGATAACCTGG | SEQ ID No.5 |
| Coxiella-R | Biotin-TACCCTTGAGAATTTCTTCCCCACC | SEQ ID No.6 |
| Tsutsugamushi-F | GCATGCGGTTTAATTCGATGATC | SEQ ID No.7 |
| Tsutsugamushi-R | Biotin-GTACCACTGACTCCCATGGTGC | SEQ ID No.8 |
2.2基因芯片的制备方法包括下面具体步骤：
(1)探针和引物的设计：首先从NCBI基因数据库中下载立克次体基因序列，序列下载完成后，使用DNAstar软件包中的Alignment程序按照默认的参数设置对各病原体基因序列进行全局比对。
根据比对结果针对所有基因序列的高保守片段设计属特异性引物，并在所述高保守片段的保守区间间隔中筛选高变序列、针对其设计种特异性探针。
(2)引物的合成，在每对属特异性引物的下游引物的5’端标记生物素标记；
(3)探针的合成，在显色质控探针在3’端标记20个多聚碱基T作为连接端的摆动臂，5’端标记生物素；10条种特异性探针，8条类原体探针；4条属特异性探针，1条阳性质控探针，1条阳性质控互补寡聚核苷酸链，1条阴性质控探针的3’端均连接20个多聚碱基T作为连接端的摆动臂，使其具有空间柔性，降低空间位阻，5’端均不修饰。
(4)芯片的制备：将合成后的探针用去离子水稀释成100μM作为储存液，用点样液稀释探针至终浓度为8μM，分装于点样仪中，采用喷射点样的方式将探针点制在正电尼龙膜载体上，点样完成后将芯片置于紫外线下交联15分钟。使探针牢固固定在芯片载体上，将点制完成的芯片常温干燥保存。
立克次体检测基因芯片的阵列示意图见图1和图2，立克次体种属基因芯片的具体排布情况：两张芯片上的每一个方格代表探针的一次点样，水平方向的2个方格为同一条探针的重复点样。
作为优选，第一张和第二张中各个寡核苷酸探针在点样时，用商业化基因芯片点样仪(136微阵列芯片点样仪，北京博奥晶典生物技术有限公司)点到空白的正电尼龙膜芯片上，探针的点样量均为0.3μL。
2.3立克次体基因芯片使用：
(1)立克次体基因组DNA的提取：按照试剂盒说明书提取样本的DNA物质。
(2)多重不对称PCR扩增：扩增使用TRANS试剂，使用一个扩增体系30μL，上游引物与下游引物的比例为1:9，扩增按以下循环参数进行扩增：96℃预变性5min；94℃30s，61℃30s，72℃，45s，共40个循环；72℃延伸5min；4℃保存或进行下一步实验；
(3)杂交液的配制：
杂交反应原液M1、M2和M3：购自上海界源生物技术有限公司。根据配比说明书(见上文)配置芯片工作液：杂交液A、洗涤液B和洗涤液C。
(4)芯片杂交：将步骤二得到的扩增产物与A液以1:10的比例混合；将阳性质控互补寡聚核苷酸链稀释与上述杂交液以1:100的比例混合。将混合好的杂交液置于杂交盒中，使其均匀覆盖与芯片表面。在60℃金属浴中杂交1h。
(5)孵育：使用辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(Streptavidin-HRP)与A液1:2000混匀，制成HRP孵育液备用；芯片杂交完成后，用47℃预热好的B液清洗芯片3次，每次2ml。将HRP孵育液均匀覆盖于清洗完成后的芯片，37℃孵育10min。
(6)芯片洗涤：取出孵育好的芯片，用A液清洗3遍，每次2ml；再用C液清洗3遍，每次2mL，离心干燥。
(7)芯片显色：向芯片加入200μL沉淀型TMB直接显色，肉眼观测检测结果。
实施例2立克次体阳性质粒标准品的构建
1、材料：
(1)构建的10种标准阳性立克次体包括：
普氏立克次体(Rickettsia Prowazeki)、莫氏立克次体(Rickettsia mooseri)、康氏立克次体(Rickettsia Conorii)、黑龙江立克次体(Rickettsia Heilongjiangii)、立氏立克次体(Rickettsia Rickettsii)、西伯利亚立克次体(Rickettsia Sibirica)、查菲埃立克体(Ehrlichia Chaffeensis)、犬埃立克体(Ehrlichia Canis)、恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)和贝氏柯克斯体(Coxiella Burnetii)。
(2)pMD18-T Vector试剂盒，购自TAKARA，货号：D101A
(3)胶回收试剂盒：Gel Extraction Kit，购自OMEGA，货号：D2500。
2、立克次体阳性质粒标准品的制备：
(1)用针对立克次体16S rRNA基因的特异性多重引物做PCR靶序列扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。将目的条带琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，纯化，将纯化后的PCR产物提交生工生物工程(上海)股份有限公司测序比对验证。为满足实验需求，本研究委托生工生物工程(上海)股份有限公司根据NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上已经公布的立克次体16S rRNA脱氧核糖核酸序列，包括(查菲埃立克体GenBank:NR_074500，犬埃立克体GenBank:KR920044，普氏立克次体GenBank:M21789，莫氏立克次体GenBank:L36221，康氏立克次体GenBank:L36107，黑龙江立克次体GenBank:NR_074469，立氏立克次体GenBank:U11021，西伯利亚立克次体GenBank:L36218，贝氏柯克斯体GenBank:D89799，恙虫东方体GenBank:AF478127)。合成以上所述10个立克次体种的标准菌株的16S rRNA基因序列样品。
(2)克隆质粒的构建和制备：
应用pMD18-T Vector kit试剂盒进行克隆载体的构建。
连接体系如下：
16℃连接60min，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布Amp抗性平板后37℃过夜培养；随机挑取过夜培养平板上长出的单菌落，每板分别挑取6个单菌落，与LB培养基中过夜培养。过夜培养物进行菌液PCR鉴定。用Plasmid Mini Extraction Kit分别将PCR鉴定为阳性的重组菌质粒送上海生工测序。以上10种重组质粒菌测序序列与NCBI数据库中基因序列进行BLAST比对分析，匹配序列均为所需合成的立克次体，无其他种属序列出现。将测序正确的重组质粒转化DH5α，冻存甘油菌-80℃保存。
实施例3立克次体高通量可视化基因芯片特异性检测
1、材料：
质粒提取试剂盒：OMEGAbio-tek E.Z.N.A.Plasmid DNAMini Kit(货号：D6943-01)。
立克次体引物：委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
本实验所制备的立克次体属特异性芯片；立克次体种特异性芯片。
沉淀型TMB显色液：购自北京奥博龙免疫技术有限公司。
辣根过氧化物酶标记链酶亲和素(streptavidin－HRP)：购自Thermo FisherScientific公司。
杂交反应原液M1、M2和M3：购自上海界源生物技术有限公司。根据配比说明书(见上文)配置芯片工作液：杂交液A、洗涤液B和洗涤液C。
辣根过氧化物酶标记链霉亲和素：英国Abcam公司。
立克次体阳性质粒标准品：包括普氏立克次体(PS-pMD18-T)、莫氏立克次体(SH-pMD18-T)、贝氏柯克斯体属(GritaGE-pMD18-T)、康氏立克次体(KS-pMD18-T)、黑龙江立克次体(HLJ-pMD18-T)，立氏立克次体(LS-pMD18-T)，西伯利亚立克次体(XBLY-pMD18-T)，查菲埃立克体(CF-pMD18-T)，犬埃立克体(CA-pMD18-T)，东方恙虫体(OT-pMD18-T)。
2、方法：
2.1阳性质粒样本的提取：
使用OMEGA bio-tek E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit按照操作说明书抽提质粒全基因组DNA，-80℃冻存。
2.2多重不对称PCR扩增
反应体系如下：
反应条件如下：
将上一步得到的扩增产物与A液以1:10的比例混合；将阳性质控互补寡聚核苷酸链稀释与上述杂交液以1:100的比例混合。将混合好的杂交液置于杂交盒中，使其均匀覆盖与芯片表面。在60℃金属浴中杂交1h。
HRP孵育：辣根过氧化物酶标记链霉亲和素试剂与A液1:2000混匀，制成HRP孵育液备用；芯片杂交完成后，用47℃预热好的B液清洗芯片3次，每次2mL。将HRP孵育液均匀覆盖于清洗完成后的芯片，37℃孵育10min。
芯片洗涤：取出孵育好的芯片，用A液清洗3遍，每次2mL；再用C液清洗3遍，每次2mL，离心干燥。
3、结果
芯片显色：向芯片加入200μL沉淀型过氧化酶底物TMB直接显色，肉眼观测检测结果，芯片结果如图3，图4所示。
4、结论
本发明筛选了立克次体4个属及10种立克次体，由图3可以看出，立克次体属基因芯片中，类原体检测结果都呈立克次体阴性，特异性良好。由图4可以看出立克次体种基因芯片特异性良好。
实施例4立克次体高通量可视化基因芯片的灵敏度评价
1、材料：
立克次体引物：委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
本实验所制备的立克次体属特异性芯片；立克次体种特异性芯片
沉淀型TMB显色液：购自北京奥博龙免疫技术有限公司
辣根过氧化物酶标记链酶亲和素(streptavidin－HRP)：购自Thermo FisherScientific公司；
杂交反应原液M1、M2和M3：购自上海界源生物技术有限公司。根据配比说明书(见上文)配置芯片工作液：杂交液A、洗涤液B和洗涤液C。
辣根过氧化物酶标记链霉亲和素：英国Abcam公司。
2、方法
2.1制备芯片
将探针稀释为6个梯度，1×107copies；1×106copies；1×105copies；1×104copies；1×103copies；1×102copies按照第二张芯片的矩阵进行点样。
2.2多重不对称PCR
实验材料：康氏立克次体阳性质粒DNA模板；DNA聚合酶混合液，上游引物，下游引物，去离子水，dUTP。
反应体系与反应条件与实施例3相同。
2.3芯片杂交
将上一步得到的扩增产物与A液以1:10的比例混合；将阳性质控互补寡聚核苷酸链稀释与上述杂交液以1:100的比例混合。将混合好的杂交液置于杂交盒中，使其均匀覆盖与芯片表面。在60℃金属浴中杂交1h。
HRP孵育：使用辣根过氧化物酶标记链霉亲和素试剂与A液1:2000混匀，制成HRP孵育液备用；芯片杂交完成后，用47℃预热好的B液清洗芯片3次，每次2mL。将HRP孵育液均匀覆盖于清洗完成后的芯片，37℃孵育10min。
芯片洗涤：取出孵育好的芯片，用A液清洗3遍，每次2mL；再用C液清洗3遍，每次2mL，离心干燥。
芯片显色：向芯片加入200μL沉淀型TMB直接显色，肉眼观测检测结果。
3、结果
如图5所示。稀释至1×102copies/μL的探针，其显色效果不佳，而1×103copies/μL，1×104copies/μL，1×105copies/μL，1×106copies/μL均显色良好，而1×107copies/μL的显色效果不佳，所以本立克次体基因芯片探针的最佳检测浓度范围为：1×103copies/μL～1×106copies/μL。
4、结论
构建10种立克次体质粒DNA作为检测参考品，从1×107copies/μL梯度稀释至1×102copies/μL，进行芯片检测，确定本芯片的检测限为1×103copies/μL。
实施例5立克次体高通量可视化快速检测基因芯片重复性的测定
1、材料：
立克次体引物：委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
本实验所制备的立克次体属特异性芯片；立克次体种特异性芯片
沉淀型TMB显色液：购自北京奥博龙免疫技术有限公司；
辣根过氧化物酶标记链酶亲和素(streptavidin－HRP)：购自Thermo FisherScientific公司；
杂交反应原液M1、M2和M3：购自上海界源生物技术有限公司。根据配比说明书(见上文)配置芯片工作液：杂交液A、洗涤液B和洗涤液C。
辣根过氧化物酶标记链霉亲和素：英国Abcam公司。
2、方法
2.1制备芯片：
将探针稀释至1×104copies，按照第二张芯片的矩阵进行点样。
2.2多重PCR:
康氏立克次体阳性质粒DNA模板；DNA聚合酶混合液，上游引物，下游引物，去离子水，dUTP。
反应体系与反应条件与实施例3相同。
2.3芯片杂交
将上一步得到的扩增产物与A液以1:10的比例混合；将阳性质控互补寡聚核苷酸链稀释与上述杂交液以1:100的比例混合。将混合好的杂交液置于杂交盒中，使其均匀覆盖与芯片表面。在60℃金属浴中杂交1h。
HRP孵育：使用辣根过氧化物酶标记链霉亲和素试剂与A液1:2000混匀，制成HRP孵育液备用；芯片杂交完成后，用47℃预热好的B液清洗芯片3次，每次2mL。将HRP孵育液均匀覆盖于清洗完成后的芯片，37℃孵育10min。
芯片洗涤：取出孵育好的芯片，用A液清洗3遍，每次2mL；再用C液清洗3遍，每次2mL，离心干燥。
芯片显色：向芯片加入200μL沉淀型TMB直接显色，肉眼观测检测结果。
3、实验结果:
如图6和图7所示。实验包括片内重复性和片间重复性。片内重复性时，以质粒菌104copies/μL为模板，重复5次多重不对称PCR，分别与基因芯片进行杂交，同时设立无菌蒸馏水为阴性对照；片间重复性时，确定同一PCR产物在不同批次基因芯片上的杂交效果是一致的。
4、结论：
无论片内重复还是片间重复芯片结果均为阳性，说明基因芯片的重复性好。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种高通量可视化快速检测立克次体的芯片及应用
<141> 2018-09-14
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aggagcttgc ttctccggat gagttgcgaa 30
Claims (7)
1.一种高通量可视化检测立克次体的芯片，其特征在于，所述芯片的载体为正电尼龙膜；正电尼龙膜载体上探针的点样量为0.3μL；
所述探针为4条属特异性探针，如SEQ ID NO.9-12所示；和10条种特异性探针序列，如SEQ ID NO.17-26所示；
与所述探针配合使用的引物为：立克次体属上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；
埃里克体属上游引物序列如SEQ ID No.3所示，下游引物序列如SEQ ID No.4所示；
贝氏柯克斯体属上游引物序列如SEQ ID No.5所示，下游引物序列如SEQ ID No.6所示；
恙虫属上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示。
2.一种高通量可视化检测立克次体的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的芯片。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，每对引物的下游引物的5’端标记生物素；10条种特异性探针和4条属特异性探针的3’端均连接20个多聚碱基T，5’端均不修饰。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述芯片上还包括：
10种立克次体的阳性质粒标准品：分别为含有普氏立克次体、莫氏立克次体、康氏立克次体、黑龙江立克次体、立氏立克次体、西伯利亚立克次体、查菲埃立克体、犬埃立克体、恙虫病东方体和贝氏柯克斯体标准菌株的16S rRNA基因的重组质粒；1条阳性质控探针，如SEQ ID NO.13所示；
1条阳性质控互补寡聚核苷酸链，如SEQ ID NO.14所示；
1条阴性质控探针，如SEQ ID NO.15所示；
1条显色质控探针，如SEQ ID NO.16所示。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述显色质控探针的3’端标记20个多聚碱基T作为连接端的摆动臂，并在其5’端标记生物素；所述阳性质控探针，阳性质控互补寡聚核苷酸链，和阴性质控探针的3’端均连接20个多聚碱基T，5’端均不修饰。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述芯片的制备方法为：将探针用去离子水稀释成100μM作为储存液，用点样液稀释探针至终浓度为8μM，分装于点样仪中，采用喷射点样的方式将探针点制在正电尼龙膜载体上，点样完成后将芯片置于紫外线下交联15分钟。
7.根据权利要求2-6任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应试剂和TMB显色液。
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| 7 种立克次体甄别检测基因芯片方法的建立;李灵云;《军事医学》;20150730;第39卷(第7期);摘要、第509页右栏第3-4段、第510页左栏第1段、510页左栏第2段、第510页右栏第1段、表2 * |
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