JP2001510688A - 核酸分子、キットおよび使用 - Google Patents
核酸分子、キットおよび使用Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明はブドウ球菌属、特に黄色ブドウ球菌の細菌を検出するための核酸分子もしくは分子群ならびに方法に関する。さらに本発明の目的は、前記検出方法を実施するためのテストキットもしくは複数のテストキットである。
Description
【０００１】 （発明の一般的背景） 臨床的に重要性が高い細菌はグラム陽性菌の黄色ブドウ球菌である。この細菌
は院内（病院内で伝染した）感染に最も頻繁に現われる病原菌の１つであり、こ
の感染の蔓延は様ざまな抗生物質耐性菌（たとえばメチシリンおよびバンコマイ
シンに対する耐性）の出現により管理することが困難である。そのうえ黄色ブド
ウ球菌はその多くが腸毒素により引起こされる食品中毒で最も頻繁に現われる病
原菌に属している。従って食品の中の黄色ブドウ球菌の頻繁な出現では潜在的に
汚染されている製品を規則的に検査する必要がある。黄色ブドウ球菌を検出する
ための常套的な微生物学の方法は非常に時間がかかる（少なくとも４日）。従っ
て黄色ブドウ球菌の存在を生産工程（原料から仕上製品まで）の経過中に迅速か
つ確実に診断できる代替方法には大きな需要がある。
は院内（病院内で伝染した）感染に最も頻繁に現われる病原菌の１つであり、こ
の感染の蔓延は様ざまな抗生物質耐性菌（たとえばメチシリンおよびバンコマイ
シンに対する耐性）の出現により管理することが困難である。そのうえ黄色ブド
ウ球菌はその多くが腸毒素により引起こされる食品中毒で最も頻繁に現われる病
原菌に属している。従って食品の中の黄色ブドウ球菌の頻繁な出現では潜在的に
汚染されている製品を規則的に検査する必要がある。黄色ブドウ球菌を検出する
ための常套的な微生物学の方法は非常に時間がかかる（少なくとも４日）。従っ
て黄色ブドウ球菌の存在を生産工程（原料から仕上製品まで）の経過中に迅速か
つ確実に診断できる代替方法には大きな需要がある。
【０００２】 微生物を検出するための定期的な導入に向けて近年一連の新たな方法が開発さ
れてきた。これには、多価または単クローン抗体の導入に基づく免疫学的な方法
と、病原菌に特異的な核酸へのハイブリダイゼーションを利用して検出するため
の核酸プローブが使用される方法とが含まれる。その他の方法として、核酸ハイ
ブリダイゼーションによる確認反応がある、またはそれに適合する確認反応がな
い、特有の核酸増幅に基づく方法が記述されている。核酸を増幅するために導入
された方法は、たとえばポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、P
CR）［米国特許第４６８３１９５号、第４６８３２０２号および第４９６５１８
８号］、リガーゼ連鎖反応［ＷＯ公開第８９／０９８３５号］、‘自己維持配列
複製’［欧州特許出願ＥＰ-３２９８２２号］、‘増幅系に基づく転写’［欧州 特許出願ＥＰ-３１０２２９号］およびＱβ ＲＮＡレプリカーゼ系［米国特許第
４９５７８５８号］がある。
れてきた。これには、多価または単クローン抗体の導入に基づく免疫学的な方法
と、病原菌に特異的な核酸へのハイブリダイゼーションを利用して検出するため
の核酸プローブが使用される方法とが含まれる。その他の方法として、核酸ハイ
ブリダイゼーションによる確認反応がある、またはそれに適合する確認反応がな
い、特有の核酸増幅に基づく方法が記述されている。核酸を増幅するために導入
された方法は、たとえばポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、P
CR）［米国特許第４６８３１９５号、第４６８３２０２号および第４９６５１８
８号］、リガーゼ連鎖反応［ＷＯ公開第８９／０９８３５号］、‘自己維持配列
複製’［欧州特許出願ＥＰ-３２９８２２号］、‘増幅系に基づく転写’［欧州 特許出願ＥＰ-３１０２２９号］およびＱβ ＲＮＡレプリカーゼ系［米国特許第
４９５７８５８号］がある。
【０００３】 上述の核酸に基づく方法は、常套的な微生物学の方法と異なり、被検試料から
検出すべき微生物の時間のかかる増殖が必要なくなるほど敏感である。従って各
々の微生物の存在または非在の検査は、上述の核酸に基づく方法を適用すると通
常１日以内の作業日で終了してしまう。特に常套的な方法を利用した検出におい
て数日ないし数週間が必要になる場合でも、それにより時間が著しく短縮される
。
検出すべき微生物の時間のかかる増殖が必要なくなるほど敏感である。従って各
々の微生物の存在または非在の検査は、上述の核酸に基づく方法を適用すると通
常１日以内の作業日で終了してしまう。特に常套的な方法を利用した検出におい
て数日ないし数週間が必要になる場合でも、それにより時間が著しく短縮される
。
【０００４】 近年、黄色ブドウ球菌の検出を明らかに短縮できる一連の高速テストが開発さ
れた。これらには、凝固酵素テスト、様ざまな凝集テスト、ＴＮａｓｅテスト（
酵素活性、単クローン抗体）、ＤＮＡハイブリダイゼーションテストおよびＰＣ
Ｒテストが含まれる［一覧のためにＢＲＡＫＳＴＡＤおよびＭＡＥＬＡＮＤ、（
１９９５）、ＡＰＭＩＳ １０３、２０９−２１８頁参照］。迅速性および特異 性に関してはＰＣＲテストが他の方法よりも優れている。黄色ブドウ球菌種を特
異的に検出するために従来記述されているＰＣＲテストは、熱安定のヌクレアー
ゼ［ｎｕｃ、Ｂｒａｋｓｔａｄら、（１９９２）、臨床微生物学誌、第３０号、
１６５４−１６６０頁］もしくは特に黄色ブドウ球菌専用のメチシリン耐性に本
質的な調節遺伝子（ｆｅｍＡ）［Ｕｎａｌら、（１９９２）、臨床微生物学誌、
第３０号、１６８５−１６９１頁、Ｖａｎｎｕｆｆｅｌら（１９９５）、臨床微
生物学誌、第３３号、２８６４−２８６７頁］に基づいている。これらのＰＣＲ
テスト系を利用して調査された全ての黄色ブドウ球菌種が検出された。ただし、
これらのＰＣＲ系により黄色ブドウ球菌種の凝固酵素陰性の菌株の検出も可能で
あるかどうかの問題は未解決である。
れた。これらには、凝固酵素テスト、様ざまな凝集テスト、ＴＮａｓｅテスト（
酵素活性、単クローン抗体）、ＤＮＡハイブリダイゼーションテストおよびＰＣ
Ｒテストが含まれる［一覧のためにＢＲＡＫＳＴＡＤおよびＭＡＥＬＡＮＤ、（
１９９５）、ＡＰＭＩＳ １０３、２０９−２１８頁参照］。迅速性および特異 性に関してはＰＣＲテストが他の方法よりも優れている。黄色ブドウ球菌種を特
異的に検出するために従来記述されているＰＣＲテストは、熱安定のヌクレアー
ゼ［ｎｕｃ、Ｂｒａｋｓｔａｄら、（１９９２）、臨床微生物学誌、第３０号、
１６５４−１６６０頁］もしくは特に黄色ブドウ球菌専用のメチシリン耐性に本
質的な調節遺伝子（ｆｅｍＡ）［Ｕｎａｌら、（１９９２）、臨床微生物学誌、
第３０号、１６８５−１６９１頁、Ｖａｎｎｕｆｆｅｌら（１９９５）、臨床微
生物学誌、第３３号、２８６４−２８６７頁］に基づいている。これらのＰＣＲ
テスト系を利用して調査された全ての黄色ブドウ球菌種が検出された。ただし、
これらのＰＣＲ系により黄色ブドウ球菌種の凝固酵素陰性の菌株の検出も可能で
あるかどうかの問題は未解決である。
【０００５】 ここに提示した発明の目的は、プライマーおよび／またはプローブとしてのＰ
ＣＲ系の導入が黄色ブドウ球菌種の全ての代表株を可能な限り完全に把握するこ
とを保証するＰＣＲ系を確立することであった。
ＣＲ系の導入が黄色ブドウ球菌種の全ての代表株を可能な限り完全に把握するこ
とを保証するＰＣＲ系を確立することであった。
【０００６】 それぞれ検出するべき微生物群および区別する（把握しない）微生物の進化論
的親縁性の度合に応じて、差異的なＤＮＡ配列に基づく検出は、それぞれ所望の
特異性を有する適切なＤＮＡ配列を見出すために、非常に広範囲な前作業を必要
とする。ここに提示した発明は、ブドウ球菌属、特に黄色ブドウ球菌の細菌の高
速検出が可能になるようなＤＮＡ配列に関する。
的親縁性の度合に応じて、差異的なＤＮＡ配列に基づく検出は、それぞれ所望の
特異性を有する適切なＤＮＡ配列を見出すために、非常に広範囲な前作業を必要
とする。ここに提示した発明は、ブドウ球菌属、特に黄色ブドウ球菌の細菌の高
速検出が可能になるようなＤＮＡ配列に関する。
【０００７】 （発明の開示） 核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅を利用して特定の微生物を検出するた
めに、病原菌に特異的なオリゴヌクレオチドが使用される。病原菌に特異的なオ
リゴヌクレオチドは、１０個ないし２５０個の塩基（好ましくは１５個ないし３
０個の塩基）長さの核酸であり、この核酸の塩基配列が特定の微生物または微生
物群の特徴である。上述の方法により前記病原菌に特異的なオリゴヌクレオチド
を（たとえばプライマーまたはプローブとして）導入する際のＤＮＡへのハイブ
リダイゼーションもしくはＤＮＡの増幅は、適切な反応条件下で、それぞれ検出
すべき微生物のＤＮＡが存在する場合にのみ行なうことができる。
めに、病原菌に特異的なオリゴヌクレオチドが使用される。病原菌に特異的なオ
リゴヌクレオチドは、１０個ないし２５０個の塩基（好ましくは１５個ないし３
０個の塩基）長さの核酸であり、この核酸の塩基配列が特定の微生物または微生
物群の特徴である。上述の方法により前記病原菌に特異的なオリゴヌクレオチド
を（たとえばプライマーまたはプローブとして）導入する際のＤＮＡへのハイブ
リダイゼーションもしくはＤＮＡの増幅は、適切な反応条件下で、それぞれ検出
すべき微生物のＤＮＡが存在する場合にのみ行なうことができる。
【０００８】 原核リボソームは通常３つの別種の核酸構成要素を含むが、これらの構成要素
は一般に５Ｓ、１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）として知ら れている。これらのリボ核酸（ｒＤＮＡ）のための遺伝情報は、ゲノムの中に典
型的に縦列の形で配置されている。このような代表的な構成単位は１６Ｓ-２３ Ｓ-５Ｓであり、その際３つの遺伝子が遺伝子間の短い超可変部により互いに分 離されている。これらの単位はゲノムの中に多数存在し、種々の細菌の中で反復
される単位数は変化し得る。全細菌界にわたる１６Ｓ ｒＤＮＡ、２３Ｓ ｒＤＮ
Ａおよび５Ｓ ｒＤＮＡの領域におけるＤＮＡ配列の高い保存性は、検査すべき 微生物のＤＮＡ配列の正確な知識がなくても非特異的なオリゴヌクレオチドのデ
ザインを可能にする。このような非特異的なオリゴヌクレオチドは、より大きな
、通常系統発生的な微生物の親縁群を特徴とする。専門家には、この非特異的な
オリゴヌクレオチドの導入により、たとえばＰＣＲを利用したＤＮＡ増幅による
適切な前実験後、たとえば任意の微生物の２３Ｓ／５Ｓ遺伝子間の部位のｒＤＮ
Ａ断片の単離が可能になる。次にＤＮＡ配列により、該当する微生物の遺伝子間
の超可変部の配列を同定することができる。
は一般に５Ｓ、１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）として知ら れている。これらのリボ核酸（ｒＤＮＡ）のための遺伝情報は、ゲノムの中に典
型的に縦列の形で配置されている。このような代表的な構成単位は１６Ｓ-２３ Ｓ-５Ｓであり、その際３つの遺伝子が遺伝子間の短い超可変部により互いに分 離されている。これらの単位はゲノムの中に多数存在し、種々の細菌の中で反復
される単位数は変化し得る。全細菌界にわたる１６Ｓ ｒＤＮＡ、２３Ｓ ｒＤＮ
Ａおよび５Ｓ ｒＤＮＡの領域におけるＤＮＡ配列の高い保存性は、検査すべき 微生物のＤＮＡ配列の正確な知識がなくても非特異的なオリゴヌクレオチドのデ
ザインを可能にする。このような非特異的なオリゴヌクレオチドは、より大きな
、通常系統発生的な微生物の親縁群を特徴とする。専門家には、この非特異的な
オリゴヌクレオチドの導入により、たとえばＰＣＲを利用したＤＮＡ増幅による
適切な前実験後、たとえば任意の微生物の２３Ｓ／５Ｓ遺伝子間の部位のｒＤＮ
Ａ断片の単離が可能になる。次にＤＮＡ配列により、該当する微生物の遺伝子間
の超可変部の配列を同定することができる。
【０００９】 一方で可能な限り多数の検出すべき細菌（たとえば種々のブドウ球菌種）の２
３Ｓ／５Ｓ遺伝子間の部位のＤＮＡ配列と、他方で続いて行われるこれらのＤＮ
Ａ配列の比較は、調査した群（たとえば全てのブドウ球菌種）の中で変化してい
ない、または非本質的にのみ変化しているＤＮＡ領域の検出を可能にする。
３Ｓ／５Ｓ遺伝子間の部位のＤＮＡ配列と、他方で続いて行われるこれらのＤＮ
Ａ配列の比較は、調査した群（たとえば全てのブドウ球菌種）の中で変化してい
ない、または非本質的にのみ変化しているＤＮＡ領域の検出を可能にする。
【００１０】 一方で可能な限り多数の検出しない細菌（たとえばブドウ球菌属には含まれな
い全ての細菌）の２３Ｓ／５Ｓ遺伝子間の部位のＤＮＡ配列と、他方で続いて行
われる検出すべき細菌（たとえば種々のブドウ球菌種）の配列を有するこれらの
ＤＮＡ配列の比較は、調査すべき細菌（たとえば全てのブドウ球菌種）に特徴的
なＤＮＡ配列の検出を可能にする。さらにこれらのＤＮＡ配列からは、それぞれ
の細菌群（たとえばブドウ球菌属の全ての種）を特異的に検出する目的で、プラ
イマーおよび／またはプローブとして核酸に基づく方法に導入可能のオリゴヌク
レオチドを導くことができる。
い全ての細菌）の２３Ｓ／５Ｓ遺伝子間の部位のＤＮＡ配列と、他方で続いて行
われる検出すべき細菌（たとえば種々のブドウ球菌種）の配列を有するこれらの
ＤＮＡ配列の比較は、調査すべき細菌（たとえば全てのブドウ球菌種）に特徴的
なＤＮＡ配列の検出を可能にする。さらにこれらのＤＮＡ配列からは、それぞれ
の細菌群（たとえばブドウ球菌属の全ての種）を特異的に検出する目的で、プラ
イマーおよび／またはプローブとして核酸に基づく方法に導入可能のオリゴヌク
レオチドを導くことができる。
【００１１】 ブドウ球菌属の細菌、特に黄色ブドウ球菌種の細菌を検出するために本発明に
記述された病原菌に特異的なオリゴヌクレオチドは、２３Ｓ／５Ｓ遺伝子間の部
位および直接隣接する２３Ｓ ｒＤＮＡの領域に相当する。この領域内のＤＮＡ 配列が多数の細菌に関して同定された。厳密な配列比較により、病原菌に特異的
な核酸配列が同定され、これらの配列からプライマーおよび／またはプローブを
種／遺伝子特有の検出方法に導入するために導くことができる。
記述された病原菌に特異的なオリゴヌクレオチドは、２３Ｓ／５Ｓ遺伝子間の部
位および直接隣接する２３Ｓ ｒＤＮＡの領域に相当する。この領域内のＤＮＡ 配列が多数の細菌に関して同定された。厳密な配列比較により、病原菌に特異的
な核酸配列が同定され、これらの配列からプライマーおよび／またはプローブを
種／遺伝子特有の検出方法に導入するために導くことができる。
【００１２】 この発明が基礎とする課題は、選択的にブドウ球菌属の細菌群のＲＮＡまたは
ＤＮＡにハイブリダイズする核酸分子による一実施態様に基づき解決され、かつ
この核酸分子はブドウ球菌の分離株の２３Ｓ ｒＤＮＡの３’末端と相対的に− １１３と＋５８の間の領域の少なくとも１０個連続するヌクレオチドまたはこの
ヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを含むこと、を特徴とする。この発明に基
づく選択的なハイブリダイゼーションは、ブドウ球菌属の上述の細菌群の検出に
利用されるものである。
ＤＮＡにハイブリダイズする核酸分子による一実施態様に基づき解決され、かつ
この核酸分子はブドウ球菌の分離株の２３Ｓ ｒＤＮＡの３’末端と相対的に− １１３と＋５８の間の領域の少なくとも１０個連続するヌクレオチドまたはこの
ヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを含むこと、を特徴とする。この発明に基
づく選択的なハイブリダイゼーションは、ブドウ球菌属の上述の細菌群の検出に
利用されるものである。
【００１３】 （発明を実施するための最良の形態） この発明のもう１つ別の実施態様は、選択的にブドウ球菌属の細菌群のＲＮＡ
またはＤＮＡにハイブリダイズする核酸分子に係り、かつこの核酸分子が黄色ブ
ドウ球菌（ＡＴＣＣ ６５３８）の２３Ｓ ｒＤＮＡの３’末端に対して−１１３
と＋５８の間の領域の少なくとも１０個連続するヌクレオチドまたはこのヌクレ
オチドと相補的なヌクレオチドを含むことを特徴とする。
またはＤＮＡにハイブリダイズする核酸分子に係り、かつこの核酸分子が黄色ブ
ドウ球菌（ＡＴＣＣ ６５３８）の２３Ｓ ｒＤＮＡの３’末端に対して−１１３
と＋５８の間の領域の少なくとも１０個連続するヌクレオチドまたはこのヌクレ
オチドと相補的なヌクレオチドを含むことを特徴とする。
【００１４】 この発明のもう１つ別の実施態様は、選択的にブドウ球菌属の細菌群のＲＮＡ
またはＤＮＡにハイブリダイズする核酸分子に係り、かつこの核酸分子が少なく
とも１０個連続する次の領域のヌクレオチド （i）配列番号 １のヌクレオチド位置５４ないし８３、または （ii）配列番号 １のヌクレオチド位置１００ないし１６６、または （iii）（i）もしくは（ii）と相補的な配列 を含むことを特徴とする。
またはＤＮＡにハイブリダイズする核酸分子に係り、かつこの核酸分子が少なく
とも１０個連続する次の領域のヌクレオチド （i）配列番号 １のヌクレオチド位置５４ないし８３、または （ii）配列番号 １のヌクレオチド位置１００ないし１６６、または （iii）（i）もしくは（ii）と相補的な配列 を含むことを特徴とする。
【００１５】 この発明のもう１つ別の実施態様は、ブドウ球菌属の細菌群に属す細菌の存否
を検出するための核酸分子に係り、かつこの核酸分子が検出すべき細菌と検出す
べきでない細菌との区別を適切な反応条件下での核酸ハイブリダイズ法および／
または核酸増幅法により可能とし、かつこの区別が、検出すべきでない細菌に対
する検出すべき細菌のゲノムＤＮＡおよび／またはＲＮＡの異なる核酸配列によ
り配列番号：１またはこれと相補的な配列の領域の少なくとも１つの塩基位置で
可能であり、または容易化されることを特徴とする。
を検出するための核酸分子に係り、かつこの核酸分子が検出すべき細菌と検出す
べきでない細菌との区別を適切な反応条件下での核酸ハイブリダイズ法および／
または核酸増幅法により可能とし、かつこの区別が、検出すべきでない細菌に対
する検出すべき細菌のゲノムＤＮＡおよび／またはＲＮＡの異なる核酸配列によ
り配列番号：１またはこれと相補的な配列の領域の少なくとも１つの塩基位置で
可能であり、または容易化されることを特徴とする。
【００１６】 この発明のもう１つ別の実施態様は、ブドウ球菌属の細菌群に属する細菌の存
否を検出するための核酸分子に係り、かつこの核酸分子が検出すべき細菌と検出
しない細菌の区別を適切なまたは自体公知の反応条件下で核酸ハイブリダイズ法
および／または核酸増幅法により可能とし、かつこの区別が、検出すべきでない
細菌に対する検出すべき細菌のゲノムＤＮＡおよび／またはＲＮＡの異なる核酸
配列により少なくとも１つの次の塩基位置 （i）配列番号 １の領域５４ないし８３、または （ii）配列番号 １の領域１００ないし１６６、または （iii）（i）もしくは（ii）と相補的な配列 で可能であるか、または容易化されることを特徴とする。
否を検出するための核酸分子に係り、かつこの核酸分子が検出すべき細菌と検出
しない細菌の区別を適切なまたは自体公知の反応条件下で核酸ハイブリダイズ法
および／または核酸増幅法により可能とし、かつこの区別が、検出すべきでない
細菌に対する検出すべき細菌のゲノムＤＮＡおよび／またはＲＮＡの異なる核酸
配列により少なくとも１つの次の塩基位置 （i）配列番号 １の領域５４ないし８３、または （ii）配列番号 １の領域１００ないし１６６、または （iii）（i）もしくは（ii）と相補的な配列 で可能であるか、または容易化されることを特徴とする。
【００１７】 この発明のもう１つ別の実施態様は、特に本発明に基づき検出するための、配
列番号 １の核酸分子またはこの核酸分子と相補的な配列に関する。
列番号 １の核酸分子またはこの核酸分子と相補的な配列に関する。
【００１８】 この発明のもう１つ別の実施態様は、配列番号 １に基づく核酸分子よりも短 縮された配列、しかも （i）前記領域またはヌクレオチド位置５４ないし８３の領域の配列、または （ii）前記領域またはヌクレオチド位置１００ないし１６６の領域の配列、また
は （iii）（i）もしくは（ii）記載の配列と相補的である配列 を有する核酸分子に関する。
は （iii）（i）もしくは（ii）記載の配列と相補的である配列 を有する核酸分子に関する。
【００１９】 この発明のもう１つ別の実施態様は、配列番号 １に基づく核酸分子よりも短 縮された配列、すなわち （i）配列番号 ２、または （ii）配列番号 ３、または （iii）配列番号 ４、または （iv）（i）、（ii）および（iii）とそれぞれ相補的な配列 を有する核酸分子に関する。
【００２０】 この発明のもう１つ別の実施態様は、核酸分子の配列に関し少なくとも１０個
連続するヌクレオチド鎖のヌクレオチドにおいて、 （i）上記請求項のいずれか１項記載の核酸分子と同一であるか、または （ii）連続するヌクレオチド１０個のうち９個で上記請求項のいずれか１項記載
の核酸分子と一致するか、または （iii）連続するヌクレオチド１０個のうち８個で上記請求項のいずれか１項記 載の核酸分子と一致するか、または （iv）少なくとも９０％以上が上記請求項のいずれか１項記載の核酸分子と同族
である ことを特徴とする、もう１つのもしくは他の核酸分子に関する。
連続するヌクレオチド鎖のヌクレオチドにおいて、 （i）上記請求項のいずれか１項記載の核酸分子と同一であるか、または （ii）連続するヌクレオチド１０個のうち９個で上記請求項のいずれか１項記載
の核酸分子と一致するか、または （iii）連続するヌクレオチド１０個のうち８個で上記請求項のいずれか１項記 載の核酸分子と一致するか、または （iv）少なくとも９０％以上が上記請求項のいずれか１項記載の核酸分子と同族
である ことを特徴とする、もう１つのもしくは他の核酸分子に関する。
【００２１】 このような核酸分子は、１０個ないし２５０個、好ましくは１５個ないし３０
個のヌクレオチド長さを有することを特徴とすることができる。
個のヌクレオチド長さを有することを特徴とすることができる。
【００２２】 （i）に基づく核酸分子の一例は、配列番号 ５を特徴とする。
【００２３】 本発明に基づく核酸分子は、この核酸分子が一本鎖または二本鎖で存在するこ
とを特徴とすることができる。
とを特徴とすることができる。
【００２４】 本発明に基づく核酸分子は、この核酸分子が （i）ＤＮＡとして、または （ii）（i）に相当するＲＮＡとして、または （iii）ＰＮＡ（以下参照）として存在し、 その際この核酸分子が所望により分析的な検出方法のために、特にハイブリダ
イゼーションおよび／または増幅に基づき、自体公知の方法で修飾されること、
を特徴とすることができる。
イゼーションおよび／または増幅に基づき、自体公知の方法で修飾されること、
を特徴とすることができる。
【００２５】 このような核酸分子は、ヌクレオチドの１０％まで、特に１個または２個のヌ
クレオチドがプローブおよび／またはプライマーのために自体公知の類似の構成
要素により、特に細菌において自然に存在しないヌクレオチドにより置換される
ことで核酸分子が修飾されることを特徴とすることができる。
クレオチドがプローブおよび／またはプライマーのために自体公知の類似の構成
要素により、特に細菌において自然に存在しないヌクレオチドにより置換される
ことで核酸分子が修飾されることを特徴とすることができる。
【００２６】 本発明に基づく核酸分子は、分析的な検出方法のために自体公知の方法で、１
つまたは２以上の放射性群、着色群、蛍光群、固相へ不動化するための群および
／または間接的もしくは直接的な反応、特に酵素反応のための群を、特に抗体、
抗原、酵素および／または酵素もしくは酵素複合体と親和性のある物質を利用し
て、有することにより、またはそのことを追加することにより核酸分子が修飾も
しくは標識されることを特徴とすることができる。
つまたは２以上の放射性群、着色群、蛍光群、固相へ不動化するための群および
／または間接的もしくは直接的な反応、特に酵素反応のための群を、特に抗体、
抗原、酵素および／または酵素もしくは酵素複合体と親和性のある物質を利用し
て、有することにより、またはそのことを追加することにより核酸分子が修飾も
しくは標識されることを特徴とすることができる。
【００２７】 この発明のもう１つ別の実施態様は、１つまたは２以上の本発明に基づく核酸
分子により特徴づけられる、分析的な検出方法、特にブドウ球菌属の細菌を検出
するためのキットに関する。
分子により特徴づけられる、分析的な検出方法、特にブドウ球菌属の細菌を検出
するためのキットに関する。
【００２８】 この発明のもう１つ別の実施態様は、ブドウ球菌属の細菌群に属する細菌の存
否を検出するための、１つまたは２以上の本発明に基づく核酸分子または本発明
に基づくキットの使用に関する。
否を検出するための、１つまたは２以上の本発明に基づく核酸分子または本発明
に基づくキットの使用に関する。
【００２９】 この使用は、ブドウ球菌属の細菌群が黄色ブドウ球菌の種々の菌株を含むこと
を特徴とすることができる。
を特徴とすることができる。
【００３０】 この使用は、ブドウ球菌属の細菌群が専ら黄色ブドウ球菌の菌株であることを
特徴とすることができる。
特徴とすることができる。
【００３１】 この使用は、核酸ハイブリダイゼーションおよび／または核酸増幅が実施され
ることを特徴とすることができる。
ることを特徴とすることができる。
【００３２】 この使用は、ポリメラーゼ連鎖反応が核酸増幅として実施されることを特徴と
することができる。
することができる。
【００３３】 この使用は、ゲノムＤＮＡおよび／またはＲＮＡの区別を利用して、検出すべ
きでない細菌から検出すべき細菌を本発明に基づく核酸分子の領域における少な
くとも１つのヌクレオチド位置で区別することにより検出が実施されることを特
徴とすることができる。
きでない細菌から検出すべき細菌を本発明に基づく核酸分子の領域における少な
くとも１つのヌクレオチド位置で区別することにより検出が実施されることを特
徴とすることができる。
【００３４】 この使用は、配列番号 １の核酸分子の領域における区別を利用して区別する ことを特徴とすることができる。
【００３５】 それぞれの微生物群を検出するために、核酸、好ましくはゲノムＤＮＡがまず
初めに被検試料もしくは細菌培養の中に含まれる細胞から遊離される。次に核酸
ハイブリダイゼーションを利用して、しかもプローブとして本発明に基づく病原
菌に特異的なオリゴヌクレオチドの導入下で、病原菌に特異的な核酸配列の直接
的な検出が被検査試料の中で行なうことができる。そのために、たとえば‘サザ
ンブロット’または‘ドットブロット’のような、専門家に知られている種々の
方法が適している。
初めに被検試料もしくは細菌培養の中に含まれる細胞から遊離される。次に核酸
ハイブリダイゼーションを利用して、しかもプローブとして本発明に基づく病原
菌に特異的なオリゴヌクレオチドの導入下で、病原菌に特異的な核酸配列の直接
的な検出が被検査試料の中で行なうことができる。そのために、たとえば‘サザ
ンブロット’または‘ドットブロット’のような、専門家に知られている種々の
方法が適している。
【００３６】 しかし、特により感度が高いために、求めているＤＮＡ／ＲＮＡ配列がまず初
めに核酸を増幅するための上述の方法、好ましくはＰＣＲを利用して増幅される
間接的な検出方法が好ましい。
めに核酸を増幅するための上述の方法、好ましくはＰＣＲを利用して増幅される
間接的な検出方法が好ましい。
【００３７】 上記方法の使用下で遊離されたＤＮＡ／ＲＮＡの増幅は、プライマーとしての
病原菌に特異的なオリゴヌクレオチドの導入下で行なうことができる。その際、
検出すべき微生物のＤＮＡ／ＲＮＡが存在する場合にのみ特有の増幅体が形成さ
れる。プローブとして病原菌に特異的なオリゴヌクレオチドの使用下で後続の検
出反応により検出方法の特異性を高めることができる。この後続の検出反応のた
めに、同様にプローブとして病原菌に非特有のオリゴヌクレオチドの使用も可能
である。
病原菌に特異的なオリゴヌクレオチドの導入下で行なうことができる。その際、
検出すべき微生物のＤＮＡ／ＲＮＡが存在する場合にのみ特有の増幅体が形成さ
れる。プローブとして病原菌に特異的なオリゴヌクレオチドの使用下で後続の検
出反応により検出方法の特異性を高めることができる。この後続の検出反応のた
めに、同様にプローブとして病原菌に非特有のオリゴヌクレオチドの使用も可能
である。
【００３８】 選択肢として、１つまたはそれ以上の非特異的なオリゴヌクレオチドの存在下
でも核酸増幅を実施することができるため、この結果、必要がある場合には他の
検出しない微生物のＤＮＡ／ＲＮＡも増幅することができる。このような増幅方
法の１つは、通常特異性が少ないため、プローブ（群）として１つまたはそれ以
上の病原菌に特異的なオリゴヌクレオチド（群）による後続の検出反応で保証さ
れなければならない。
でも核酸増幅を実施することができるため、この結果、必要がある場合には他の
検出しない微生物のＤＮＡ／ＲＮＡも増幅することができる。このような増幅方
法の１つは、通常特異性が少ないため、プローブ（群）として１つまたはそれ以
上の病原菌に特異的なオリゴヌクレオチド（群）による後続の検出反応で保証さ
れなければならない。
【００３９】 専門家には、間接的な方法で生ずる増幅生成物を検出することができる種々の
方法が知られている。この方法には、特にゲル電気泳動を利用した可視化、不動
化された反応生成物へのプローブのハイブリダイゼーション［ナイロンまたは硝
酸繊維素フィルタ（‘サザンブロット’）またはたとえば‘ビーズ’または微量
定量プレートに結合］および不動化されたプローブへの増幅生成物のハイブリダ
イゼーション（たとえば‘逆ドットブロット’またはプローブと結合された‘ビ
ーズ’または微量定量プレート）が含まれる。
方法が知られている。この方法には、特にゲル電気泳動を利用した可視化、不動
化された反応生成物へのプローブのハイブリダイゼーション［ナイロンまたは硝
酸繊維素フィルタ（‘サザンブロット’）またはたとえば‘ビーズ’または微量
定量プレートに結合］および不動化されたプローブへの増幅生成物のハイブリダ
イゼーション（たとえば‘逆ドットブロット’またはプローブと結合された‘ビ
ーズ’または微量定量プレート）が含まれる。
【００４０】 病原菌に特異的なオリゴヌクレオチド（たとえばプローブおよびプライマー）
を記述された直接的または間接的な検出方法のために標識もしくは修飾すること
のできる多数の異なる変形態様が記載されている。これらは、たとえば放射性の
、着色された、蛍光性のまたは別様に修飾されたもしくは修飾する群、たとえば
抗体、抗原、酵素または酵素もしくは酵素複合体と親和性のあるその他の物質を
含むことができる。プローブもしくはプライマーは、自然に存在するかまたは合
成で製造された二本鎖または一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、もしくはたとえばＰ
ＮＡのようなＤＮＡまたはＲＮＡの修飾された形態とすることができる（これら
の分子では糖単位がアミノ酸またはペプチドで交換されている）。プローブまた
はプライマーの個々のまたは複数のヌクレオチドは、類似の構成要素（たとえば
標的核酸の中に自然に存在しないヌクレオチド）で置換することができる。上述
の間接的な検出方法では、内部標識増幅体を介しても検出することができる。こ
れは、たとえば増幅反応中に修飾（たとえばジゴキシゲニンまたはフルオレセイ
ン結合）されたヌクレオシド三リン酸の取込みを介して行なうことができる。
を記述された直接的または間接的な検出方法のために標識もしくは修飾すること
のできる多数の異なる変形態様が記載されている。これらは、たとえば放射性の
、着色された、蛍光性のまたは別様に修飾されたもしくは修飾する群、たとえば
抗体、抗原、酵素または酵素もしくは酵素複合体と親和性のあるその他の物質を
含むことができる。プローブもしくはプライマーは、自然に存在するかまたは合
成で製造された二本鎖または一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、もしくはたとえばＰ
ＮＡのようなＤＮＡまたはＲＮＡの修飾された形態とすることができる（これら
の分子では糖単位がアミノ酸またはペプチドで交換されている）。プローブまた
はプライマーの個々のまたは複数のヌクレオチドは、類似の構成要素（たとえば
標的核酸の中に自然に存在しないヌクレオチド）で置換することができる。上述
の間接的な検出方法では、内部標識増幅体を介しても検出することができる。こ
れは、たとえば増幅反応中に修飾（たとえばジゴキシゲニンまたはフルオレセイ
ン結合）されたヌクレオシド三リン酸の取込みを介して行なうことができる。
【００４１】 本発明に基づく病原菌に特異的なオリゴヌクレオチドとして適しているのは、
少なくとも１０個の塩基長さの配列で下記の配列１ないし５またはこの配列と相
補的な配列と一致する、好ましくは１０個ないし２５０個および特に１５個ない
し３０個の塩基長さの核酸である。この１０個の塩基長さの配列内のわずかな差
異（１個ないし２個の塩基）は、増幅および／またはハイブリダイゼーション時
にそれぞれ所定の特異性を失わずに可能である。専門家には、このようなわずか
な差異の場合の反応条件がそれに応じて変化させる必要のあることが知られてい
る。
少なくとも１０個の塩基長さの配列で下記の配列１ないし５またはこの配列と相
補的な配列と一致する、好ましくは１０個ないし２５０個および特に１５個ない
し３０個の塩基長さの核酸である。この１０個の塩基長さの配列内のわずかな差
異（１個ないし２個の塩基）は、増幅および／またはハイブリダイゼーション時
にそれぞれ所定の特異性を失わずに可能である。専門家には、このようなわずか
な差異の場合の反応条件がそれに応じて変化させる必要のあることが知られてい
る。
【００４２】 ２３Ｓ ｒＤＮＡ（１−１１３）および２３Ｓ／５Ｓ遺伝子間の部位（１１４ −１７１）の領域における黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ ６５３８）のＤＮＡ配列 は次のとおりである。 （配列１＝配列番号 １）
【外１】
【００４３】 ２３Ｓ／５Ｓ遺伝子間の部位の領域における配列は、８個の黄色ブドウ球菌の
菌株ならびに次の種の少なくとも各々１つの代表株について同定された：スタフ
ィロコッカス アウリクラリス(Staphylococcus auricularis)、スタフィロコッ カス カピティス(Staphylococcus capitis)、スタフィロコッカス コーニイ(Sta
phylococcus cohnii)、スタフィロコッカス エピデルミディス(Staphylococcus
epidermidis)、スタフィロコッカス ヘモリティクス(Staphylococcus haemolyti
cus)、スタフィロコッカス ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコ ッカス サッカロリティクス(Staphylococcus saccharolyticus)、スタフィロコ ッカス サプロフィティクス(Staphylococcus saprophyticus)、スタフィロコッ カス シムランス(Staphylococcus simulans)、スタフィロコッカス ワルネリ(St
aphylococcus warneri)、スタフィロコッカス キシロスス(Staphylococcus xylo
sus)。この配列比較は、前記領域において異なる種の配列が高い相同性を有する
ことが明らかになった。ただし高い配列変異性を有する３つの領域を、しかもヌ
クレオチド位置６４と７３の間、１１０と１２１の間、および１２７と１５６の
間で識別することができる。従って、５４〜８３および１００〜１６６の領域に
おいて異なるブドウ球菌種のヌクレオチド配列から、ブドウ球菌属の細菌の検出
に適したオリゴヌクレオチドを導くことができる。たとえば配列１からは、可変
のヌクレオチド位置６４〜７３、１１０〜１２１および１２７〜１５６を全部ま
たは部分的にカバーし、かつプライマーまたはプローブとして黄色ブドウ球菌種
の細菌の選択的な検出に適した複数のオリゴヌクレオチドを導くことができる。
菌株ならびに次の種の少なくとも各々１つの代表株について同定された：スタフ
ィロコッカス アウリクラリス(Staphylococcus auricularis)、スタフィロコッ カス カピティス(Staphylococcus capitis)、スタフィロコッカス コーニイ(Sta
phylococcus cohnii)、スタフィロコッカス エピデルミディス(Staphylococcus
epidermidis)、スタフィロコッカス ヘモリティクス(Staphylococcus haemolyti
cus)、スタフィロコッカス ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコ ッカス サッカロリティクス(Staphylococcus saccharolyticus)、スタフィロコ ッカス サプロフィティクス(Staphylococcus saprophyticus)、スタフィロコッ カス シムランス(Staphylococcus simulans)、スタフィロコッカス ワルネリ(St
aphylococcus warneri)、スタフィロコッカス キシロスス(Staphylococcus xylo
sus)。この配列比較は、前記領域において異なる種の配列が高い相同性を有する
ことが明らかになった。ただし高い配列変異性を有する３つの領域を、しかもヌ
クレオチド位置６４と７３の間、１１０と１２１の間、および１２７と１５６の
間で識別することができる。従って、５４〜８３および１００〜１６６の領域に
おいて異なるブドウ球菌種のヌクレオチド配列から、ブドウ球菌属の細菌の検出
に適したオリゴヌクレオチドを導くことができる。たとえば配列１からは、可変
のヌクレオチド位置６４〜７３、１１０〜１２１および１２７〜１５６を全部ま
たは部分的にカバーし、かつプライマーまたはプローブとして黄色ブドウ球菌種
の細菌の選択的な検出に適した複数のオリゴヌクレオチドを導くことができる。
【００４４】 配列１からＰＣＲのためのプライマー（配列２および配列３）として、もしく
はプローブ（配列４および配列５）として特に適した以下のオリゴヌクレオチド
が導かれた。 オリゴヌクレオチドＳａ１：（配列２＝配列番号 ２）５’-ＧＴＧＧＡＡＧＣＡ
ＴＧＧＴＧＡＣＡＴ-３’ オリゴヌクレオチドＳａ２：（配列３＝配列番号 ３）５’-ＴＡＡＧＴＡＡＡＡ
ＧＴＧＡＴＴＴＴＧＣＴ ＴＣＧ-３’ オリゴヌクレオチドＳａ３：（配列４＝配列番号 ４）５’-ＣＡＴＴＴＡＴＴＴ
ＴＧＡＴＴＡＡＧＴＣＴ-３’ オリゴヌクレオチドＳａ４：（配列５＝配列番号 ５）５’-ＣＡＴＴＴＡＡＡＴ
ＴＴＧＡＴＴＡＡＧＴＣ-３’
はプローブ（配列４および配列５）として特に適した以下のオリゴヌクレオチド
が導かれた。 オリゴヌクレオチドＳａ１：（配列２＝配列番号 ２）５’-ＧＴＧＧＡＡＧＣＡ
ＴＧＧＴＧＡＣＡＴ-３’ オリゴヌクレオチドＳａ２：（配列３＝配列番号 ３）５’-ＴＡＡＧＴＡＡＡＡ
ＧＴＧＡＴＴＴＴＧＣＴ ＴＣＧ-３’ オリゴヌクレオチドＳａ３：（配列４＝配列番号 ４）５’-ＣＡＴＴＴＡＴＴＴ
ＴＧＡＴＴＡＡＧＴＣＴ-３’ オリゴヌクレオチドＳａ４：（配列５＝配列番号 ５）５’-ＣＡＴＴＴＡＡＡＴ
ＴＴＧＡＴＴＡＡＧＴＣ-３’
【００４５】
【例１】 ポリメラーゼ連鎖反応による黄色ブドウ球菌種の細菌の検出
【００４６】 第１表に掲載した細菌の純粋培養から、標準方法を利用してＤＮＡが単離され
た。次にこのＤＮＡ組織標本のそれぞれ約１０ないし１００ｎｇがそれぞれ０．
６μＭオリゴヌクレオチドＳａ１（配列番号 ２）およびＳａ２（配列番号 ３）
、２００μＭ ｄＮＴＰ’ｓ（Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ混合物、ベーリンガー マンハ
イム）２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１６ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、６７ｍＭ トリス／ ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．０１％トウィーン２０および０．０３Ｕ／μｌ Ｔ ａｑポリメラーゼ（バイオマスタ）の存在中でＰＣＲの中に取込まれた。ＰＣＲ
は下記の熱特性を有するパーキン-エルマー９６００サーモサイクラーの中で実 施された。 − 初期変性 ９４℃ ３ｍｉｎ − 増幅（３５サイクル） ９２℃ ３０ｓｅｃ ６０℃ １０ｓｅｃ − 最終合成 ７２℃ ５ｍｉｎ
た。次にこのＤＮＡ組織標本のそれぞれ約１０ないし１００ｎｇがそれぞれ０．
６μＭオリゴヌクレオチドＳａ１（配列番号 ２）およびＳａ２（配列番号 ３）
、２００μＭ ｄＮＴＰ’ｓ（Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ混合物、ベーリンガー マンハ
イム）２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１６ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、６７ｍＭ トリス／ ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．０１％トウィーン２０および０．０３Ｕ／μｌ Ｔ ａｑポリメラーゼ（バイオマスタ）の存在中でＰＣＲの中に取込まれた。ＰＣＲ
は下記の熱特性を有するパーキン-エルマー９６００サーモサイクラーの中で実 施された。 − 初期変性 ９４℃ ３ｍｉｎ − 増幅（３５サイクル） ９２℃ ３０ｓｅｃ ６０℃ １０ｓｅｃ − 最終合成 ７２℃ ５ｍｉｎ
【００４７】 ＰＣＲ反応の終了後、増幅生成物はアガロース-ゲル電気泳動を利用して分離 され、かつ臭化エチジウムで着色することにより可視化された。予期されていた
長さ９４ｂｐの生成物は、黄色ブドウ球菌種の菌株のＤＮＡが存在していた場合
で観察された（第１表参照）が、テストされた他の細菌のＤＮＡの存在では観察
されなかった。この経過の終了後、ゲルの中に含まれているＤＮＡが標準方法を
利用してナイロン-フィルタに転写され、かつ特異性を検査するために５’末端 でビオチニル化されたオリゴヌクレオチドＳａ３（配列番号 ４）およびＳａ４ （配列番号 ５）の等モル混合物によりハイブリダイゼーションされた。このハ イブリダイゼーションは、５ｘＳＳＣ、２％阻害試薬、０．１％ラウリルサルコ
シン、０．０２％ＳＤＳおよび２０ｐｍｏｌ／ｍｌプローブの存在下４３℃で４
時間行われた。２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５分間、室温で１回洗浄し、かつ
４３℃で５分間、１回洗浄した。検出は標準方法にしたがってアルカリ性のホス
ファターゼ抱合体（エキストラビジン、シグマ社、＃Ｅ-２６３６）を利用して ５-臭素-４-塩素-３-リン酸インドリルおよび４-ニトロ-ブルー塩化テトラゾリ ウム（ベーリンガー マンハイム社）の存在中で実施された。
長さ９４ｂｐの生成物は、黄色ブドウ球菌種の菌株のＤＮＡが存在していた場合
で観察された（第１表参照）が、テストされた他の細菌のＤＮＡの存在では観察
されなかった。この経過の終了後、ゲルの中に含まれているＤＮＡが標準方法を
利用してナイロン-フィルタに転写され、かつ特異性を検査するために５’末端 でビオチニル化されたオリゴヌクレオチドＳａ３（配列番号 ４）およびＳａ４ （配列番号 ５）の等モル混合物によりハイブリダイゼーションされた。このハ イブリダイゼーションは、５ｘＳＳＣ、２％阻害試薬、０．１％ラウリルサルコ
シン、０．０２％ＳＤＳおよび２０ｐｍｏｌ／ｍｌプローブの存在下４３℃で４
時間行われた。２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５分間、室温で１回洗浄し、かつ
４３℃で５分間、１回洗浄した。検出は標準方法にしたがってアルカリ性のホス
ファターゼ抱合体（エキストラビジン、シグマ社、＃Ｅ-２６３６）を利用して ５-臭素-４-塩素-３-リン酸インドリルおよび４-ニトロ-ブルー塩化テトラゾリ ウム（ベーリンガー マンハイム社）の存在中で実施された。
【００４８】 （産業上の利用可能性） フィルタ上には、先だってアガロース-ゲル上でもバンドが見えた場合のみ、 バンドが観察された（第１表参照）。これによりＰＣＲを利用してもハイブリダ
イゼーションを利用してもテストされた５０の黄色ブドウ球菌の全菌株の存在が
検出された。テストされた５０の黄色ブドウ球菌の全菌株のなかに、２つの凝固
酵素陰性（ＢｉｏｔｅＣｏｎ７０３０およびＢｉｏｔｅＣｏｎ７０４４）があり
、これらは同様にＰＣＲ法で検出される。これに対し、テストされたが、これら
の種に属していない細菌株は、いずれもこの系では検出されなかった。
イゼーションを利用してもテストされた５０の黄色ブドウ球菌の全菌株の存在が
検出された。テストされた５０の黄色ブドウ球菌の全菌株のなかに、２つの凝固
酵素陰性（ＢｉｏｔｅＣｏｎ７０３０およびＢｉｏｔｅＣｏｎ７０４４）があり
、これらは同様にＰＣＲ法で検出される。これに対し、テストされたが、これら
の種に属していない細菌株は、いずれもこの系では検出されなかった。
【００４９】 オリゴヌクレオチドＳａ１およびＳａ２（配列番号 ２および配列番号 ３）に
よるＰＣＲ増幅とそれに続くオリゴヌクレオチドＳａ３／Ｓａ４（配列番号 ４ および配列番号 ５）によるハイブリダイゼーションの結果。
よるＰＣＲ増幅とそれに続くオリゴヌクレオチドＳａ３／Ｓａ４（配列番号 ４ および配列番号 ５）によるハイブリダイゼーションの結果。
【表１】 ｎ．ｄ．：ハイブリダイゼーションは実施されなかった。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１月２１日（２０００．１．２１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】追加
【補正内容】
【図１】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】追加
【補正内容】
【図２】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】追加
【補正内容】
【図３】
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】追加
【補正内容】
【図４】
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】追加
【補正内容】
【図５】
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】追加
【補正内容】
【図６】
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】追加
【補正内容】
【図７】
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】追加
【補正内容】
【図８】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】追加
【補正内容】
【図９】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】追加
【補正内容】
【図１０】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 メイスン−ブラウン， チャールズ ドイツ連邦共和国 Ｄ−10245 ベルリン、 ヴューリッシュシュトラーセ 38 (72)発明者 ヴィルボーン， フライムート ドイツ連邦共和国 Ｄ−14057 ベルリン、 ヌー カントシュトラーセ ９ (72)発明者 ロルフス， アルント ドイツ連邦共和国 Ｄ−18055 ロシュト ック、ゲールシャイマーシュトラーセ 20 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA09 CA11 CA20 HA13 HA14 4B063 QA13 QA18 QQ06 QQ50 QR32 QR35 QR39 QR56 QR62 QS25 QS34 QX01 QX02
Claims (22)
- 【請求項１】 選択的にブドウ球菌属の細菌群のＲＮＡまたはＤＮＡにハイ
ブリダイズする核酸分子であって、 ブドウ球菌の分離株の２３Ｓ ｒＤＮＡの３’末端に対して少なくとも１０個 連続する−１１３と＋５８の間の領域のヌクレオチドまたは該ヌクレオチドと相
補的なヌクレオチドを含むことを特徴とする、前記核酸分子。 - 【請求項２】 選択的にブドウ球菌属の細菌群のＲＮＡまたはＤＮＡにハイ
ブリダイズする核酸分子であって、 黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ ６５３８）の２３Ｓ ｒＤＮＡの３’末端に対して
少なくとも１０個連続する−１１３と＋５８の間の領域のヌクレオチドまたは該
ヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを含むことを特徴とする、前記核酸分子。 - 【請求項３】 選択的にブドウ球菌属の細菌群のＲＮＡまたはＤＮＡにハイ
ブリダイズする核酸分子であって、 少なくとも１０個連続する次の領域のヌクレオチド （i）配列番号１のヌクレオチド位置５４ないし８３、または （ii）配列番号１のヌクレオチド位置１００ないし１６６、または （iii）（i）または（ii）と相補的な配列 を含むことを特徴とする、前記核酸分子。 - 【請求項４】 ブドウ球菌属の細菌群に属す細菌の存否を検出するための核
酸分子であって、 検出すべき細菌と検出すべきでない細菌との区別を適切な反応条件下での核酸
ハイブリダイズ法および／または核酸増幅法により可能とし、かつこの区別が、
検出すべきでない細菌に対する検出すべき細菌のゲノムＤＮＡおよび／またはＲ
ＮＡの異なる核酸配列により配列番号１またはこれと相補的な配列の領域の少な
くとも１つの塩基位置で可能であるか、または容易化されることを特徴とする、
前記核酸分子。 - 【請求項５】 ブドウ球菌属の細菌群に属す細菌の存否を検出するための核
酸分子であって、 検出すべき細菌と検出すべきでない細菌との区別を自体公知の反応条件下で核
酸ハイブリダイズ法および／または核酸増幅法により可能とし、かつこの区別が
、検出すべきでない細菌に対する検出すべき細菌のゲノムＤＮＡおよび／または
ＲＮＡの異なる核酸配列により、次の少なくとも１つの塩基位置 （i）配列番号１の領域５４ないし８３、または （ii）配列番号１の領域１００ないし１６６、または （iii）（i）または（ii）と相補的な配列 で可能であるか、または容易化されることを特徴とする、前記核酸分子。 - 【請求項６】 配列番号１またはそれと相補的な配列の、特に請求項５記載
の核酸分子。 - 【請求項７】 請求項６記載の核酸分子よりも短縮された配列であって、し
かも （i）その領域またはヌクレオチド位置５４ないし８３の領域の配列、または （ii）その領域またはヌクレオチド位置１００ないし１６６の領域の配列、また
は （iii）（i）または（ii）記載の配列と相補的である配列 を有する核酸分子。 - 【請求項８】 請求項６記載の核酸分子よりも短縮された配列、すなわち （i）配列番号２、または （ii）配列番号３、または （iii）配列番号４、または （iv）（i）、（ii）および（iii）とそれぞれ相補的な配列 を有する核酸分子。
- 【請求項９】 配列に関し少なくとも１０個連続するヌクレオチド鎖のヌク
レオチドにおいて （i）請求項1〜8のいずれか１項記載の核酸分子と同一であるか、または （ii）連続するヌクレオチド１０個のうち９個で請求項1〜8のいずれか１項記載
の核酸分子と一致するか、または （iii）連続するヌクレオチド１０個のうち８個で請求項1〜8のいずれか１項記 載の核酸分子と一致するか、または （iv）少なくとも９０％以上が請求項1〜8のいずれか１項記載の核酸分子と同族
である ことを特徴とする、核酸分子。 - 【請求項１０】 １０個ないし２５０個、好ましくは１５個ないし３０個の
ヌクレオチド長さを有することを特徴とする、請求項９記載の核酸分子であって
、特に配列番号５を有する核酸分子であることを特徴とする、前記核酸分子。 - 【請求項１１】 核酸分子が一本鎖または二本鎖で存在することを特徴とす
る、請求項1〜10のいずれか１項記載の核酸分子。 - 【請求項１２】 核酸分子が （i）ＤＮＡとして、または （ii）（i）に相当するＲＮＡとして、または （iii）ＰＮＡとして存在し、 その際この核酸分子が所望により分析的な検出方法のために、特にハイブリダ
イゼーションおよび／または増幅に基づき、自体公知の方法で修飾されることを
特徴とする、請求項1〜11のいずれか１項記載の核酸分子。 - 【請求項１３】 ヌクレオチドの１０％まで、特に１個または２個のヌクレ
オチドがプローブおよび／またはプライマーのために自体公知の類似の構成要素
により、特に細菌において自然に存在しないヌクレオチドにより置換されること
で核酸分子が修飾されることを特徴とする、請求項１２記載の核酸分子。 - 【請求項１４】 核酸分子が分析的な検出方法のために自体公知の方法で、
１つまたは2以上の放射性群、着色群、蛍光群、固相へ不動化するための群およ び／または間接的もしくは直接的な反応、特に酵素反応のための群を、特に抗体
、抗原、酵素および／または酵素もしくは酵素複合体と親和性のある物質を利用
して、有し、または該核酸分子が分析的な検出方法のために自体公知の方法で別
様に修飾された群もしくは修飾する群を有することにより、またはそのことを追
加することにより核酸分子が修飾もしくは標識されることを特徴とする、請求項
１２または１３記載の核酸分子。 - 【請求項１５】 請求項1〜14のいずれか１項記載の、１つまたは2以上の核
酸分子により特徴づけられる、分析的な検出方法、特にブドウ球菌属の細菌を検
出するためのキット。 - 【請求項１６】 ブドウ球菌属の細菌群に属す細菌の存否を検出するための
、請求項１〜１４のいずれか１項記載の１つまたは2以上の核酸分子または請求 項１５記載のキットの使用。 - 【請求項１７】 ブドウ球菌属の細菌群が黄色ブドウ球菌の種々の菌株を含
むことを特徴とする、請求項１６記載の使用。 - 【請求項１８】 ブドウ球菌属の細菌群が専ら黄色ブドウ球菌の菌株である
ことを特徴とする、請求項１７記載の使用。 - 【請求項１９】 核酸ハイブリダイゼーションおよび／または核酸増幅が実
施されることを特徴とする、請求項１６〜１８のいずれか1項記載の使用。 - 【請求項２０】 ポリメラーゼ連鎖反応が核酸増幅として実施されることを
特徴とする、請求項１９記載の使用。 - 【請求項２１】 ゲノムＤＮＡおよび／またはＲＮＡの区別を利用して、検
出すべきでない細菌から検出すべき細菌を請求項１〜１４のいずれか1項記載の 核酸分子の領域における少なくとも１つのヌクレオチド位置で区別することによ
り検出が実施されることを特徴とする、請求項１６〜２０のいずれか１項記載の
使用。 - 【請求項２２】 請求項６記載の核酸分子の領域における区別を利用して区
別することを特徴とする、請求項２１記載の使用。
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