JP3735400B2 - メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出法及びキット - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、感染症対策上重要なメチシリン耐性ブドウ球菌、とりわけメチシリン耐性黄色ブドウ球菌を検出する方法及び検出用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（以下、ＭＲＳＡ）は日本国内における細菌検査で検出されるブドウ球菌の５０％以上を占め、院内感染の原因菌として特に注意が必要とされている。この菌はβ−ラクタム薬をはじめとするほとんど全ての抗生物質に耐性を示し、効果的な薬剤は少ない。一般に感染症が疑われたときに予防的に投与される抗生物質のほとんどはＭＲＳＡに効果がなく、かえってＭＲＳＡ感染を進めることにもなりかねず、検査材料からＭＲＳＡを迅速かつ正確に検出・同定することは、感染症の予防・治療にあたって極めて重要であると考えられている。
【０００３】
ＭＲＳＡの同定は従来、臨床材料から分離された菌について培養試験で薬剤感受性を見ることにより行われている。しかし、培養試験で薬剤感受性を見る場合は、分離培養に１日以上、感受性試験に１日以上を必要とする。加えて、ＭＲＳＡの薬剤耐性の発現は複雑な制御を受けており、培養試験ではＭＲＳＡを見逃すこともある。
【０００４】
そこで、ＭＲＳＡの耐性の本体であるＰＢＰ−２′という新たな細胞壁合成酵素の設計遺伝子であるｍｅｃＡ遺伝子を検出することによって感受性試験の結果を待たずに、かつ培養のぶれに関係なくＭＲＳＡの判定を行える方法がポリメラーゼ増幅反応（以下、ＰＣＲ；特開昭６０−２８１号公報参照）を応用して開発され〔生方ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０，Ｐ．１７２８−１７３３（１９９２）〕、すでに実用化もされている。
【０００５】
しかし、ｍｅｃＡ遺伝子は黄色ブドウ球菌だけでなく他のブドウ球菌（コアグラーゼ陰性ブドウ球菌：以下、ＣＮＳ）も有していることがあり、薬剤感受性に配慮した感染症対策という立場からはメチシリン耐性ＣＮＳ（以下、ＭＲ−ＣＮＳ）とＭＲＳＡとを区別することが重要となってきた。特に、黄色ブドウ球菌はブドウ球菌の中でも毒性が高くＣＮＳに比べて臨床的重要度が高いと考えられていることから、検出されたブドウ球菌が黄色ブドウ球菌であるか否かが依然重要な情報として必要と考えられており、ｍｅｃＡ遺伝子を検出及び同定すると同時にＭＲＳＡとＭＲ−ＣＮＳを区別することが要望されていた。
【０００６】
ＰＣＲは遺伝子の検出と同定を迅速かつ高感度に行う手段として有用であり、これを用いて黄色ブドウ球菌特異的な遺伝子とｍｅｃＡ遺伝子を同一反応で増幅することは理論的には可能であるが、これを同一反応容器中で実施しようとするとき、別々の遺伝子を増幅するプライマーを単純に４種組み合わせただけでは満足のいく特異的な遺伝子増幅が得られるとは限らないのが実状である。すなわち、ＰＣＲにおいて２つ以上の遺伝子を一度に増幅する場合（多重ＰＣＲ）においては、プライマー同士の増幅反応を含む目的以外の遺伝子の非特異的増幅反応の頻度が高くなるのが一般的である。たとえば４つのプライマーを用いて同時にＰＣＲ反応を行うとき、４つのプライマーの解離温度（Ｔｍ）を合わせること、また４つのプライマーがとりうる組み合わせにおいてそれぞれの配列が相補的とならないように設計することなどは当然のことであるが、これらを十分に考慮して設計した場合においても予期せぬ反応効率の低下や、非特異的増幅物の生成などが見られることがあり〔Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄＲｅｓ．１６，Ｐ．１１１４１−１１１５６（１９８８）；Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｐ．２７２−２８１，Ｉｎｎｉｓ他編集，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；Ｅｄｗａｒｄｓら，ＰＣＲＭｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ３，Ｐ．Ｓ６５−Ｓ７５（１９９４）〕、特異的なプライマーの組み合わせを得ることは容易ではなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的は、ＰＣＲを利用し、ＭＲＳＡとＭＲ−ＣＮＳを区別して検出する、迅速かつ簡便な方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
かかる実情において、本発明者らはＭＲＳＡとＭＲ−ＣＮＳとをＰＣＲ法にて区別して検出するためのプライマーの設計について種々の検討を行い、メチシリン耐性を示すｍｅｃＡ遺伝子を増幅するプライマー２種と、黄色ブドウ球菌を他のブドウ球菌群から識別するマーカーとして知られているプロテインＡ〔Ｆｏｒｓｇｒｅｎ，Ａｃｔａ Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．７５，Ｐ．４８１−４９０（１９６９）；Ｈｊｏｌｍら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ．２８，Ｐ．７３−７６〕の遺伝子であるｓｐａ遺伝子を増幅するプライマー２種とを組み合わせることを考案した。しかし、検査を迅速かつ簡便なものとすることを考慮するとＰＣＲの反応時間が長すぎずかつ高感度を保つことが必要であり、そのためにはＰＣＲによる遺伝子増幅で得られるＤＮＡの長さが４０塩基対から３００塩基対の範囲であるプライマーの組み合わせ中から選択することが望ましく、加えて、その中から非特異的増幅反応をともなわず双方の遺伝子を増幅し得るプライマーの組み合わせを得ることは容易ではなかった。
【０００９】
そこで本発明者らは上記の条件を満足させるべく更に検討を重ねた結果、ｍｅｃＡ遺伝子特異的なＰＣＲプライマーとして下記（１）及び（２）で示される配列のオリゴヌクレオチドを用い、ｓｐａ遺伝子特異的なＰＣＲプライマーとして下記（３）及び（４）で示されるオリゴヌクレオチドを用いれば、ＭＲＳＡがＭＲ−ＮＣＳと明確に区別して検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は下記の塩基配列（１）、（２）、（３）及び（４）；
（１）5′AGAAATGACTGAACGTCCG 3′
（２）5′GCGATCAATGTTACCGTAG 3′
（３）5′TACATGTCGTTAAACCTGGTG 3′
（４）5′TACAGTTGTACCGATGAATGG 3′
〔式中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンを示し、任意のＴはウラシル（Ｕ）と置換されていてもよい〕
で表わされる４種のオリゴヌクレオチドを遺伝子増幅反応プライマーとして用いることを特徴とするメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出法を提供するものである。
【００１１】
また、本発明は上記４種のオリゴヌクレオチドを含有することを特徴とするメチシリン耐性黄色ブドウ球菌検出用キットを提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明に用いるプライマーのうち、上記塩基配列（１）及び（２）で表わされるオリゴヌクレオチド〔以下、プライマー（１）、プライマー（２）と称す〕は、松橋らによって報告されているｍｅｃＡ遺伝子の配列〔ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２１，Ｐ．１６７−１７１（１９８７）〕から選択されたものであり、例えばＤＮＡ自動合成機を用いて化学的に合成することができる。一方、上記塩基配列（３）及び（４）で表わされるオリゴヌクレオチド〔以下、プライマー（３）、プライマー（４）と称す〕は、Ｆｉｎｃｋ−Ｂａｒｂａｎｃｏｎらによって報告されているｓｐａ遺伝子の配列〔ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．９１，Ｐ．１−８（１９９２）〕から選択されたものであり、例えばＤＮＡ自動合成機を用いて化学的に合成することができる。
【００１３】
本発明のＭＲＳＡの検出法は、前記４種のプライマーを組み合わせて用いる以外は、通常のＰＣＲ法に従って行われる。すなわち、検体に前記４種のプライマー及びポリメラーゼを用い、１本鎖ＤＮＡへの変性処理、アニーリング及び伸長反応を数十回繰り返した後増幅された遺伝子を検出することにより行われる。
【００１４】
本発明の検出法における検体としては、各種臨床検査材料、血液、膿汁、喀痰、髄液、咽頭拭い液、糞便、尿など、あるいはそれらから得られた細菌培養液、単離・培養された細菌コロニーなどを用いることができる。検査にはこれらの材料からＰＣＲの試料となるブドウ球菌の核酸成分を抽出することが必要であるが、そのための方法としてはアルカリや界面活性剤を用いる方法、プロテイナーゼＫなどの蛋白質分解酵素を用いる方法等が利用できる。また、リゾスタフィンやアクロモペプチダーゼといった、ブドウ球菌に特有な膜の分解を行う酵素の使用は核酸の抽出効率を上げ、検査の感度を上げることができる。
【００１５】
これらの核酸抽出溶液はその一部をそのままＰＣＲに供することもできるが、核酸の精製や濃縮の操作を加えることでＰＣＲの感度を上げることも可能である。精製や濃縮のための方法としては、フェノールなどの有機溶媒を蛋白質の変性剤として用いる方法、その他の特異的な蛋白質変性剤を用いる方法〔Ｂｅｕｔｌｅｒら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ９，Ｐ．１６６（１９９０）〕、捕獲・濃縮用のプローブを固定したラテックス粒子など担体を用いる方法〔特開昭６３−１１７２６２号公報〕などが挙げられる。
【００１６】
ＰＣＲに用いるポリメラーゼとしては、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いるのが好ましい。１本鎖ＤＮＡへの変性処理は熱処理が好ましい。好ましいＰＣＲ条件としては、例えば耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用い、温度サイクル条件は、９０℃〜９６℃で１０秒〜６０秒、より好ましくは９２℃で１５秒の変性工程、５０℃〜６５℃で１０秒〜６０秒、より好ましくは６０℃〜６５℃で１５秒のアニーリング工程、７２℃で０秒〜６０秒、より好ましくは５秒〜１５秒の伸長工程の繰り返しを行う方法が挙げられる。
【００１７】
本発明におけるプライマーを用いたＰＣＲによるＤＮＡ増幅の判定は、生成した増幅ＤＮＡのサイズを電気泳動で確認する方法や、ニトロセルロース膜などに反応物を固定し目的の増幅ＤＮＡの配列に相補的な配列を持つ標識プローブとハイブリダイゼーションを行わせる方法などで可能であるが、より簡便にＤＮＡ増幅の判定を行うには、識別可能な標識を施したプライマーを用いてＰＣＲを行い、標識された増幅ＤＮＡを固相に捕獲して識別する方法が有利である。
【００１８】
増幅ＤＮＡを捕獲して識別する方法としては、標識に特異的に結合する物質をあらかじめ固定した固相を用いる方法〔特開平１−２５２３００号公報〕、目的の増幅ＤＮＡの配列に相補的な配列を持つ捕獲プローブをあらかじめ固相に固定しておき、ハイブリダイゼーションによって特異的な結合を行わせる方法などがあり、そのための固相としては、マイクロタイターウエル、あるいはビーズなどを用いることができるが、一度に多検体を処理するにはマイクロタイターウエルを使用するのが有利である。
【００１９】
ところで、臨床検体を直接の試料として検査を行うときには、試料中にブドウ球菌が存在したとしてもその数が少なくＰＣＲにおいてもＤＮＡ増幅のための温度サイクルを相当数繰り返す必要があることが考えられる。こうした場合には、十分に検討して得たプライマーを用いた場合でさえも、非特異的な増幅ＤＮＡが生じる危険を完全に拭うことはできず、増幅ＤＮＡの捕獲には捕獲プローブとのハイブリダイゼーションを利用することが望ましい。捕獲プローブのマイクロタイターウエルへの固定には川井らの方法〔Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０９，Ｐ．６３−６９〕などを用いることができる。
【００２０】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１（プライマーの選択）
（１）検体の調製
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌ＴＫ７８４株及び大腸菌をそれぞれＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地で培養し、ＳＤＳ−フェノール法でＤＮＡを抽出・調製した。
【００２２】
（２）プライマーの合成と標識
プライマーとするオリゴヌクレオチドは遺伝子の配列から設計したｍｅｃＡ遺伝子増幅用プライマー（Ｍ１〜Ｍ１２）及びｓｐａ遺伝子増幅用プライマー（Ｓ１〜Ｓ４）をアプライドバイオシステム社のＤＮＡ合成装置を用いてホスホアミダイド法にて合成した。５′末端の塩基にはアミノリンクII（商品名：アプライドバイオシステム社）を用いてアミノ基を導入し、その後セファデックスＧ−５０を用いたゲル濾過で精製した。
得られたアミノ化オリゴヌクレオチドは以下のように標識化した。すなわち、１０μg／μl ＤＭＦと１００mM ＮａＨＣＯ3を含む溶液中でアミノ化オリゴヌクレオチドをビオチニル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステルと反応させ、ビオチン標識オリゴヌクレオチドを得た。又は、３３％エタノールと６７mM ＮａＨＣＯ3を含む溶液中でアミノ化オリゴヌクレオチドをジニトロフルオロベンゼンと反応させてジニトロフェニル標識オリゴヌクレオチドを得た。
【００２３】
（３）ＰＣＲ
ＰＣＲは、検体ＤＮＡ（２０ng）と、各プライマー（ｍｅｃＡ遺伝子増幅用プライマー２種類及びｓｐａ遺伝子増幅用プライマー２種類：それぞれ５０ng／５０μl）、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位／５０μl）、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰそれぞれ２００μM、ｄＵＴＰ ４００μM、５０mM ＫＣｌ、５０mM トリス緩衝液（pH８．３）という反応液組成で、パーキンエルマー・シータス社のサーマルサイクラー９６００を用い、９２℃で１５秒の変性工程、６０℃で１５秒のアニーリング工程、７２℃で１５秒の伸長工程という温度サイクルを４０回繰り返して実施した。
【００２４】
プライマーは、表１に示すｍｅｃＡ遺伝子増幅プライマー（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１０、Ｍ１１、Ｍ１２）及びｓｐａ遺伝子増幅用プライマー（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４）を表２の組み合わせで加えた。それぞれ奇数番号は遺伝子のセンス側に対応する配列、偶数番号はアンチセンス側に対応する配列である。なお、増幅効率を見る側の奇数番号にビオチン標識オリゴヌクレオチドプライマーを、偶数番号にジニトロフェニル標識オリゴヌクレオチドプライマーを用い、他方はアミノ化オリゴヌクレオチドプライマーを用いた。
【００２５】
【表１】
【００２６】
（４）増幅結果の判定
ＰＣＲによる遺伝子増幅の判定は、ストレプトアビジン固定マイクロタイターウエルに、それぞれの増幅反応液１０μlを１００μlのアルカリホスファターゼ標識抗ジニトロフェニル抗体溶液とともに加えて２５℃で３０分間インキュベートし、洗浄後、ｐ−ニトロフェニルリン酸溶液（４０μg／ml）１００μlを加え、２５℃で３０分間インキュベート後、４０５nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定することで行った。
【００２７】
（５）結果
表２に示す如く、ＭＲＳＡ ＤＮＡ添加時に１．０以上の強い発色を認め、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ添加時の非特異的発色が０．１を超えない組み合わせとしてＭ９（配列番号１）、Ｍ６（配列番号２）、Ｓ３（配列番号３）、Ｓ４（配列番号４）の組み合わせが得られた。
【００２８】
【表２】
【００２９】
実施例２（ｓｐａ遺伝子の特異性の認識）
（１）検体
臨床分離されたブドウ球菌（黄色ブドウ球菌１８７株、その他のブドウ球菌（ＣＮＳ）２５株）のコロニーを検体とした。
【００３０】
（２）ＰＣＲ
被検コロニーの一部（１０5〜１０7の菌数に相当）を溶菌液１（７μg／３０μl リゾスタフィン、５０mM トリス緩衝液（pH７．５））３０μlに懸濁し、５０℃で５分間インキュベート後、溶菌液２（プロテイナーゼＫ ２μg／１０μl、１１０mM トリス緩衝液（pH８．９）、１．５mM ＭｇＣｌ2、８０mM ＫＣｌ、５０μg／１０μl 牛血清アルブミン）１０μlを加えて６０℃で１０分間、９４℃で５分間インキュベートした。これに増幅用試薬（ｓｐａ遺伝子増幅用プライマーＳ３とＳ４（それぞれ５０ng／１０μl）、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５単位／１０μl、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰそれぞれ１０nmole／１０μl、２５０mM ＫＣｌ、２５０mM トリス緩衝液（pH８．3 ））を加えて実施例１と同様にＰＣＲを行った。
【００３１】
（３）増幅結果の判定
実施例１と同様にして、ストレプトアビジン固定ウエルとアルカリホスファターゼ標識抗ジニトロフェニル抗体溶液を用いて実施した。
【００３２】
（４）結果
ＰＣＲの結果、黄色ブドウ球菌１８７株全株でｓｐａ遺伝子陽性であり、その他のブドウ球菌全株ともｓｐａ遺伝子の増幅を認めなかった。
【００３３】
実施例３（プローブを用いた増幅検出）
（１）ファージプローブ固定マイクロタイターウエルの調製
プローブオリゴヌクレオチドは遺伝子の配列から設計した表３に示すｍｅｃＡ遺伝子用プローブ配列及びｓｐａ遺伝子用プローブ配列に結合用の配列を加えたオリゴヌクレオチド（Ｍ１３、Ｍ１４、Ｍ１７、Ｍ１８、Ｍ１９、Ｍ２０、Ｍ２１、Ｍ２２、Ｓ１３、Ｓ１４、Ｓ１７、Ｓ１８、Ｓ１９、Ｓ２０、Ｓ２１、Ｓ２２、Ｓ２３、Ｓ２４（結合用に付加した配列を小文字のアルファベットで示す。））を、実施例１と同様にアプライドバイオシステム社のＤＮＡ合成機で合成した。合成したそれぞれのオリゴヌクレオチドは相補的な組み合わせ（Ｍ１３とＭ１４、Ｍ１７とＭ１８、Ｍ１９とＭ２０、Ｍ２１とＭ２２、Ｓ１３とＳ１４、Ｓ１７とＳ１８、Ｓ１９とＳ２０、Ｓ２１とＳ２２、Ｓ２３とＳ２４）ごとにＤＮＡリガーゼを用いて１０個を直列に結合させ、これらを更にプラスミドｐＵＣＳｆｉに挿入した。それぞれのプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、形質転換した大腸菌を培養後、ヘルパーファージを加えて、目的のプローブ配列を持つファージの一本鎖ＤＮＡ、ＭＰ１４（Ｍ１４の配列を含む）、ＭＰ１７（Ｍ１７の配列を含む）、ＭＰ１９（Ｍ１９の配列を含む）、ＭＰ２１（Ｍ２１の配列を含む）、ＳＰ１３（Ｓ１３の配列を含む）、ＳＰ２１（Ｓ２１の配列を含む）、ＳＰ２３（Ｓ２３の配列を含む）を得た。得られたそれぞれの一本鎖ＤＮＡ（以下、ファージプローブ）を１０mM トリス緩衝液（pH７．６、１mM ＥＤＴＡを含む）で１００ng／μlの濃度とし、これに４倍容の水と５倍容の固定化緩衝液（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH８．０、０．３ＭＭｇＣｌ2）を加えて混和し、マイクロタイターウエル（グライナー社製）に１ウエルあたり１００μlずつ加えた。これに蓋をして３７℃で１６時間放置し、液を除いた後風乾した。
【００３４】
【表３】
【００３５】
（２）ファージプローブ固定マイクロタイターウエルを用いた検出
ＰＣＲ
実施例１と同様にしてＭＲＳＡのＤＮＡを検体とし、プライマーはビオチンで標識したＭ９、Ｍ６、Ｓ３及びＳ４を用いて実施した。
遺伝子増幅反応を終えた反応液５０μlに５０μlの０．４Ｎ ＮａＯＨ溶液を加えＤＮＡを変性させた後、５０μlの０．４Ｎ ＨＣｌを加えて中和した。その３０μlをあらかじめハイブリダイゼーション緩衝液（５００mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．５、１００mM ＮａＣｌ、１３％ グアニジンチオシアン酸）１００μlを加えたファージプローブ固定マイクロタイターウエルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。液を除いた後、洗浄液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．５、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２mM ＭｇＣｌ2、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）で２回洗浄、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジン溶液１００μl を加えて３７℃で１５分間インキュベートした。洗浄液で２回洗浄した後、ｐ−ニトロフェニルリン酸溶液（４０μg／ml）１００μlを加え、３７℃で３０分間インキュベート後、４０５nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。
【００３６】
（３）結果
表４に示す如く、いずれのファージプローブ固定ウエルも増幅遺伝子の捕獲に使用可能であった。
【００３７】
【表４】
【００３８】
実施例４（特異性の確認）
（１）検体の調製
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＴＫ７８４（ＭＲＳＡ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ１９６３６（ＭＳＳＡ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ Ｎｏ．８６（メチシリン耐性株：ＭＲＳＥ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ＴＫ３３４４Ｎ（メチシリン感性：ＭＳＳＥ）、Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｒｅｔｔｇｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓの各菌について実施例１と同様にして培養し、ＤＮＡを調製した。
【００３９】
（２）検出
ＰＣＲは、プライマーとして実施例１のＭ９（配列番号１）、Ｍ６（配列番号２）、Ｓ３（配列番号３）、Ｓ４（配列番号４）の組み合わせをそれぞれビオチン標識して用い、後は実施例１と同様に操作した。
検出は実施例３に示した１本鎖ＤＮＡ ＭＰ２１と１本鎖ＤＮＡ ＳＰ２３をそれぞれ固定したマイクロタイターウエルを用い、実施例３と同様にハイブリダイゼーション、発色検出を行った。
【００４０】
（３）結果
表５に示す如く、ｍｅｃＡ遺伝子とｓｐａ遺伝子のそれぞれを保存する株に特異的に発色が認められ、非保有株では認められず、本発明の検査法でＭＲＳＡを特異的に検出できることが確認された。
【００４１】
【表５】
【００４２】
【発明の効果】
本発明の検出法によればＭＲＳＡをＭＲ−ＣＮＳと区別して正確かつ迅速に検出でき、ＭＲＳＡ感染症に対する適切な治療及び予防が可能となる。
【００４３】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖上
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：
他の特徴：ブドウ球菌の配列と相補的な配列を有する。
配列：5′AGAAATGACTGAACGTCCG 3′
【００４４】
配列番号：２
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖上
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：
他の特徴：ブドウ球菌の配列と相補的な配列を有する。
配列：5′GCGATCAATGTTACCGTAG 3′
【００４５】
配列番号：３
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖上
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：
他の特徴：ブドウ球菌の配列と相補的な配列を有する。
配列：5′TACATGTCGTTAAACCTGGTG 3′
【００４６】
配列番号：４
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖上
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：
他の特徴：ブドウ球菌の配列と相補的な配列を有する。
配列：5′TACAGTTGTACCGATGAATGG 3′
【発明の属する技術分野】
本発明は、感染症対策上重要なメチシリン耐性ブドウ球菌、とりわけメチシリン耐性黄色ブドウ球菌を検出する方法及び検出用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（以下、ＭＲＳＡ）は日本国内における細菌検査で検出されるブドウ球菌の５０％以上を占め、院内感染の原因菌として特に注意が必要とされている。この菌はβ−ラクタム薬をはじめとするほとんど全ての抗生物質に耐性を示し、効果的な薬剤は少ない。一般に感染症が疑われたときに予防的に投与される抗生物質のほとんどはＭＲＳＡに効果がなく、かえってＭＲＳＡ感染を進めることにもなりかねず、検査材料からＭＲＳＡを迅速かつ正確に検出・同定することは、感染症の予防・治療にあたって極めて重要であると考えられている。
【０００３】
ＭＲＳＡの同定は従来、臨床材料から分離された菌について培養試験で薬剤感受性を見ることにより行われている。しかし、培養試験で薬剤感受性を見る場合は、分離培養に１日以上、感受性試験に１日以上を必要とする。加えて、ＭＲＳＡの薬剤耐性の発現は複雑な制御を受けており、培養試験ではＭＲＳＡを見逃すこともある。
【０００４】
そこで、ＭＲＳＡの耐性の本体であるＰＢＰ−２′という新たな細胞壁合成酵素の設計遺伝子であるｍｅｃＡ遺伝子を検出することによって感受性試験の結果を待たずに、かつ培養のぶれに関係なくＭＲＳＡの判定を行える方法がポリメラーゼ増幅反応（以下、ＰＣＲ；特開昭６０−２８１号公報参照）を応用して開発され〔生方ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０，Ｐ．１７２８−１７３３（１９９２）〕、すでに実用化もされている。
【０００５】
しかし、ｍｅｃＡ遺伝子は黄色ブドウ球菌だけでなく他のブドウ球菌（コアグラーゼ陰性ブドウ球菌：以下、ＣＮＳ）も有していることがあり、薬剤感受性に配慮した感染症対策という立場からはメチシリン耐性ＣＮＳ（以下、ＭＲ−ＣＮＳ）とＭＲＳＡとを区別することが重要となってきた。特に、黄色ブドウ球菌はブドウ球菌の中でも毒性が高くＣＮＳに比べて臨床的重要度が高いと考えられていることから、検出されたブドウ球菌が黄色ブドウ球菌であるか否かが依然重要な情報として必要と考えられており、ｍｅｃＡ遺伝子を検出及び同定すると同時にＭＲＳＡとＭＲ−ＣＮＳを区別することが要望されていた。
【０００６】
ＰＣＲは遺伝子の検出と同定を迅速かつ高感度に行う手段として有用であり、これを用いて黄色ブドウ球菌特異的な遺伝子とｍｅｃＡ遺伝子を同一反応で増幅することは理論的には可能であるが、これを同一反応容器中で実施しようとするとき、別々の遺伝子を増幅するプライマーを単純に４種組み合わせただけでは満足のいく特異的な遺伝子増幅が得られるとは限らないのが実状である。すなわち、ＰＣＲにおいて２つ以上の遺伝子を一度に増幅する場合（多重ＰＣＲ）においては、プライマー同士の増幅反応を含む目的以外の遺伝子の非特異的増幅反応の頻度が高くなるのが一般的である。たとえば４つのプライマーを用いて同時にＰＣＲ反応を行うとき、４つのプライマーの解離温度（Ｔｍ）を合わせること、また４つのプライマーがとりうる組み合わせにおいてそれぞれの配列が相補的とならないように設計することなどは当然のことであるが、これらを十分に考慮して設計した場合においても予期せぬ反応効率の低下や、非特異的増幅物の生成などが見られることがあり〔Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄＲｅｓ．１６，Ｐ．１１１４１−１１１５６（１９８８）；Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｐ．２７２−２８１，Ｉｎｎｉｓ他編集，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；Ｅｄｗａｒｄｓら，ＰＣＲＭｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ３，Ｐ．Ｓ６５−Ｓ７５（１９９４）〕、特異的なプライマーの組み合わせを得ることは容易ではなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的は、ＰＣＲを利用し、ＭＲＳＡとＭＲ−ＣＮＳを区別して検出する、迅速かつ簡便な方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
かかる実情において、本発明者らはＭＲＳＡとＭＲ−ＣＮＳとをＰＣＲ法にて区別して検出するためのプライマーの設計について種々の検討を行い、メチシリン耐性を示すｍｅｃＡ遺伝子を増幅するプライマー２種と、黄色ブドウ球菌を他のブドウ球菌群から識別するマーカーとして知られているプロテインＡ〔Ｆｏｒｓｇｒｅｎ，Ａｃｔａ Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．７５，Ｐ．４８１−４９０（１９６９）；Ｈｊｏｌｍら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ．２８，Ｐ．７３−７６〕の遺伝子であるｓｐａ遺伝子を増幅するプライマー２種とを組み合わせることを考案した。しかし、検査を迅速かつ簡便なものとすることを考慮するとＰＣＲの反応時間が長すぎずかつ高感度を保つことが必要であり、そのためにはＰＣＲによる遺伝子増幅で得られるＤＮＡの長さが４０塩基対から３００塩基対の範囲であるプライマーの組み合わせ中から選択することが望ましく、加えて、その中から非特異的増幅反応をともなわず双方の遺伝子を増幅し得るプライマーの組み合わせを得ることは容易ではなかった。
【０００９】
そこで本発明者らは上記の条件を満足させるべく更に検討を重ねた結果、ｍｅｃＡ遺伝子特異的なＰＣＲプライマーとして下記（１）及び（２）で示される配列のオリゴヌクレオチドを用い、ｓｐａ遺伝子特異的なＰＣＲプライマーとして下記（３）及び（４）で示されるオリゴヌクレオチドを用いれば、ＭＲＳＡがＭＲ−ＮＣＳと明確に区別して検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は下記の塩基配列（１）、（２）、（３）及び（４）；
（１）5′AGAAATGACTGAACGTCCG 3′
（２）5′GCGATCAATGTTACCGTAG 3′
（３）5′TACATGTCGTTAAACCTGGTG 3′
（４）5′TACAGTTGTACCGATGAATGG 3′
〔式中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンを示し、任意のＴはウラシル（Ｕ）と置換されていてもよい〕
で表わされる４種のオリゴヌクレオチドを遺伝子増幅反応プライマーとして用いることを特徴とするメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出法を提供するものである。
【００１１】
また、本発明は上記４種のオリゴヌクレオチドを含有することを特徴とするメチシリン耐性黄色ブドウ球菌検出用キットを提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明に用いるプライマーのうち、上記塩基配列（１）及び（２）で表わされるオリゴヌクレオチド〔以下、プライマー（１）、プライマー（２）と称す〕は、松橋らによって報告されているｍｅｃＡ遺伝子の配列〔ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２１，Ｐ．１６７−１７１（１９８７）〕から選択されたものであり、例えばＤＮＡ自動合成機を用いて化学的に合成することができる。一方、上記塩基配列（３）及び（４）で表わされるオリゴヌクレオチド〔以下、プライマー（３）、プライマー（４）と称す〕は、Ｆｉｎｃｋ−Ｂａｒｂａｎｃｏｎらによって報告されているｓｐａ遺伝子の配列〔ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．９１，Ｐ．１−８（１９９２）〕から選択されたものであり、例えばＤＮＡ自動合成機を用いて化学的に合成することができる。
【００１３】
本発明のＭＲＳＡの検出法は、前記４種のプライマーを組み合わせて用いる以外は、通常のＰＣＲ法に従って行われる。すなわち、検体に前記４種のプライマー及びポリメラーゼを用い、１本鎖ＤＮＡへの変性処理、アニーリング及び伸長反応を数十回繰り返した後増幅された遺伝子を検出することにより行われる。
【００１４】
本発明の検出法における検体としては、各種臨床検査材料、血液、膿汁、喀痰、髄液、咽頭拭い液、糞便、尿など、あるいはそれらから得られた細菌培養液、単離・培養された細菌コロニーなどを用いることができる。検査にはこれらの材料からＰＣＲの試料となるブドウ球菌の核酸成分を抽出することが必要であるが、そのための方法としてはアルカリや界面活性剤を用いる方法、プロテイナーゼＫなどの蛋白質分解酵素を用いる方法等が利用できる。また、リゾスタフィンやアクロモペプチダーゼといった、ブドウ球菌に特有な膜の分解を行う酵素の使用は核酸の抽出効率を上げ、検査の感度を上げることができる。
【００１５】
これらの核酸抽出溶液はその一部をそのままＰＣＲに供することもできるが、核酸の精製や濃縮の操作を加えることでＰＣＲの感度を上げることも可能である。精製や濃縮のための方法としては、フェノールなどの有機溶媒を蛋白質の変性剤として用いる方法、その他の特異的な蛋白質変性剤を用いる方法〔Ｂｅｕｔｌｅｒら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ９，Ｐ．１６６（１９９０）〕、捕獲・濃縮用のプローブを固定したラテックス粒子など担体を用いる方法〔特開昭６３−１１７２６２号公報〕などが挙げられる。
【００１６】
ＰＣＲに用いるポリメラーゼとしては、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いるのが好ましい。１本鎖ＤＮＡへの変性処理は熱処理が好ましい。好ましいＰＣＲ条件としては、例えば耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用い、温度サイクル条件は、９０℃〜９６℃で１０秒〜６０秒、より好ましくは９２℃で１５秒の変性工程、５０℃〜６５℃で１０秒〜６０秒、より好ましくは６０℃〜６５℃で１５秒のアニーリング工程、７２℃で０秒〜６０秒、より好ましくは５秒〜１５秒の伸長工程の繰り返しを行う方法が挙げられる。
【００１７】
本発明におけるプライマーを用いたＰＣＲによるＤＮＡ増幅の判定は、生成した増幅ＤＮＡのサイズを電気泳動で確認する方法や、ニトロセルロース膜などに反応物を固定し目的の増幅ＤＮＡの配列に相補的な配列を持つ標識プローブとハイブリダイゼーションを行わせる方法などで可能であるが、より簡便にＤＮＡ増幅の判定を行うには、識別可能な標識を施したプライマーを用いてＰＣＲを行い、標識された増幅ＤＮＡを固相に捕獲して識別する方法が有利である。
【００１８】
増幅ＤＮＡを捕獲して識別する方法としては、標識に特異的に結合する物質をあらかじめ固定した固相を用いる方法〔特開平１−２５２３００号公報〕、目的の増幅ＤＮＡの配列に相補的な配列を持つ捕獲プローブをあらかじめ固相に固定しておき、ハイブリダイゼーションによって特異的な結合を行わせる方法などがあり、そのための固相としては、マイクロタイターウエル、あるいはビーズなどを用いることができるが、一度に多検体を処理するにはマイクロタイターウエルを使用するのが有利である。
【００１９】
ところで、臨床検体を直接の試料として検査を行うときには、試料中にブドウ球菌が存在したとしてもその数が少なくＰＣＲにおいてもＤＮＡ増幅のための温度サイクルを相当数繰り返す必要があることが考えられる。こうした場合には、十分に検討して得たプライマーを用いた場合でさえも、非特異的な増幅ＤＮＡが生じる危険を完全に拭うことはできず、増幅ＤＮＡの捕獲には捕獲プローブとのハイブリダイゼーションを利用することが望ましい。捕獲プローブのマイクロタイターウエルへの固定には川井らの方法〔Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０９，Ｐ．６３−６９〕などを用いることができる。
【００２０】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１（プライマーの選択）
（１）検体の調製
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌ＴＫ７８４株及び大腸菌をそれぞれＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地で培養し、ＳＤＳ−フェノール法でＤＮＡを抽出・調製した。
【００２２】
（２）プライマーの合成と標識
プライマーとするオリゴヌクレオチドは遺伝子の配列から設計したｍｅｃＡ遺伝子増幅用プライマー（Ｍ１〜Ｍ１２）及びｓｐａ遺伝子増幅用プライマー（Ｓ１〜Ｓ４）をアプライドバイオシステム社のＤＮＡ合成装置を用いてホスホアミダイド法にて合成した。５′末端の塩基にはアミノリンクII（商品名：アプライドバイオシステム社）を用いてアミノ基を導入し、その後セファデックスＧ−５０を用いたゲル濾過で精製した。
得られたアミノ化オリゴヌクレオチドは以下のように標識化した。すなわち、１０μg／μl ＤＭＦと１００mM ＮａＨＣＯ3を含む溶液中でアミノ化オリゴヌクレオチドをビオチニル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステルと反応させ、ビオチン標識オリゴヌクレオチドを得た。又は、３３％エタノールと６７mM ＮａＨＣＯ3を含む溶液中でアミノ化オリゴヌクレオチドをジニトロフルオロベンゼンと反応させてジニトロフェニル標識オリゴヌクレオチドを得た。
【００２３】
（３）ＰＣＲ
ＰＣＲは、検体ＤＮＡ（２０ng）と、各プライマー（ｍｅｃＡ遺伝子増幅用プライマー２種類及びｓｐａ遺伝子増幅用プライマー２種類：それぞれ５０ng／５０μl）、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位／５０μl）、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰそれぞれ２００μM、ｄＵＴＰ ４００μM、５０mM ＫＣｌ、５０mM トリス緩衝液（pH８．３）という反応液組成で、パーキンエルマー・シータス社のサーマルサイクラー９６００を用い、９２℃で１５秒の変性工程、６０℃で１５秒のアニーリング工程、７２℃で１５秒の伸長工程という温度サイクルを４０回繰り返して実施した。
【００２４】
プライマーは、表１に示すｍｅｃＡ遺伝子増幅プライマー（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１０、Ｍ１１、Ｍ１２）及びｓｐａ遺伝子増幅用プライマー（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４）を表２の組み合わせで加えた。それぞれ奇数番号は遺伝子のセンス側に対応する配列、偶数番号はアンチセンス側に対応する配列である。なお、増幅効率を見る側の奇数番号にビオチン標識オリゴヌクレオチドプライマーを、偶数番号にジニトロフェニル標識オリゴヌクレオチドプライマーを用い、他方はアミノ化オリゴヌクレオチドプライマーを用いた。
【００２５】
【表１】
（４）増幅結果の判定
ＰＣＲによる遺伝子増幅の判定は、ストレプトアビジン固定マイクロタイターウエルに、それぞれの増幅反応液１０μlを１００μlのアルカリホスファターゼ標識抗ジニトロフェニル抗体溶液とともに加えて２５℃で３０分間インキュベートし、洗浄後、ｐ−ニトロフェニルリン酸溶液（４０μg／ml）１００μlを加え、２５℃で３０分間インキュベート後、４０５nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定することで行った。
【００２７】
（５）結果
表２に示す如く、ＭＲＳＡ ＤＮＡ添加時に１．０以上の強い発色を認め、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ添加時の非特異的発色が０．１を超えない組み合わせとしてＭ９（配列番号１）、Ｍ６（配列番号２）、Ｓ３（配列番号３）、Ｓ４（配列番号４）の組み合わせが得られた。
【００２８】
【表２】
実施例２（ｓｐａ遺伝子の特異性の認識）
（１）検体
臨床分離されたブドウ球菌（黄色ブドウ球菌１８７株、その他のブドウ球菌（ＣＮＳ）２５株）のコロニーを検体とした。
【００３０】
（２）ＰＣＲ
被検コロニーの一部（１０5〜１０7の菌数に相当）を溶菌液１（７μg／３０μl リゾスタフィン、５０mM トリス緩衝液（pH７．５））３０μlに懸濁し、５０℃で５分間インキュベート後、溶菌液２（プロテイナーゼＫ ２μg／１０μl、１１０mM トリス緩衝液（pH８．９）、１．５mM ＭｇＣｌ2、８０mM ＫＣｌ、５０μg／１０μl 牛血清アルブミン）１０μlを加えて６０℃で１０分間、９４℃で５分間インキュベートした。これに増幅用試薬（ｓｐａ遺伝子増幅用プライマーＳ３とＳ４（それぞれ５０ng／１０μl）、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５単位／１０μl、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰそれぞれ１０nmole／１０μl、２５０mM ＫＣｌ、２５０mM トリス緩衝液（pH８．3 ））を加えて実施例１と同様にＰＣＲを行った。
【００３１】
（３）増幅結果の判定
実施例１と同様にして、ストレプトアビジン固定ウエルとアルカリホスファターゼ標識抗ジニトロフェニル抗体溶液を用いて実施した。
【００３２】
（４）結果
ＰＣＲの結果、黄色ブドウ球菌１８７株全株でｓｐａ遺伝子陽性であり、その他のブドウ球菌全株ともｓｐａ遺伝子の増幅を認めなかった。
【００３３】
実施例３（プローブを用いた増幅検出）
（１）ファージプローブ固定マイクロタイターウエルの調製
プローブオリゴヌクレオチドは遺伝子の配列から設計した表３に示すｍｅｃＡ遺伝子用プローブ配列及びｓｐａ遺伝子用プローブ配列に結合用の配列を加えたオリゴヌクレオチド（Ｍ１３、Ｍ１４、Ｍ１７、Ｍ１８、Ｍ１９、Ｍ２０、Ｍ２１、Ｍ２２、Ｓ１３、Ｓ１４、Ｓ１７、Ｓ１８、Ｓ１９、Ｓ２０、Ｓ２１、Ｓ２２、Ｓ２３、Ｓ２４（結合用に付加した配列を小文字のアルファベットで示す。））を、実施例１と同様にアプライドバイオシステム社のＤＮＡ合成機で合成した。合成したそれぞれのオリゴヌクレオチドは相補的な組み合わせ（Ｍ１３とＭ１４、Ｍ１７とＭ１８、Ｍ１９とＭ２０、Ｍ２１とＭ２２、Ｓ１３とＳ１４、Ｓ１７とＳ１８、Ｓ１９とＳ２０、Ｓ２１とＳ２２、Ｓ２３とＳ２４）ごとにＤＮＡリガーゼを用いて１０個を直列に結合させ、これらを更にプラスミドｐＵＣＳｆｉに挿入した。それぞれのプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、形質転換した大腸菌を培養後、ヘルパーファージを加えて、目的のプローブ配列を持つファージの一本鎖ＤＮＡ、ＭＰ１４（Ｍ１４の配列を含む）、ＭＰ１７（Ｍ１７の配列を含む）、ＭＰ１９（Ｍ１９の配列を含む）、ＭＰ２１（Ｍ２１の配列を含む）、ＳＰ１３（Ｓ１３の配列を含む）、ＳＰ２１（Ｓ２１の配列を含む）、ＳＰ２３（Ｓ２３の配列を含む）を得た。得られたそれぞれの一本鎖ＤＮＡ（以下、ファージプローブ）を１０mM トリス緩衝液（pH７．６、１mM ＥＤＴＡを含む）で１００ng／μlの濃度とし、これに４倍容の水と５倍容の固定化緩衝液（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH８．０、０．３ＭＭｇＣｌ2）を加えて混和し、マイクロタイターウエル（グライナー社製）に１ウエルあたり１００μlずつ加えた。これに蓋をして３７℃で１６時間放置し、液を除いた後風乾した。
【００３４】
【表３】
（２）ファージプローブ固定マイクロタイターウエルを用いた検出
ＰＣＲ
実施例１と同様にしてＭＲＳＡのＤＮＡを検体とし、プライマーはビオチンで標識したＭ９、Ｍ６、Ｓ３及びＳ４を用いて実施した。
遺伝子増幅反応を終えた反応液５０μlに５０μlの０．４Ｎ ＮａＯＨ溶液を加えＤＮＡを変性させた後、５０μlの０．４Ｎ ＨＣｌを加えて中和した。その３０μlをあらかじめハイブリダイゼーション緩衝液（５００mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．５、１００mM ＮａＣｌ、１３％ グアニジンチオシアン酸）１００μlを加えたファージプローブ固定マイクロタイターウエルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。液を除いた後、洗浄液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．５、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２mM ＭｇＣｌ2、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）で２回洗浄、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジン溶液１００μl を加えて３７℃で１５分間インキュベートした。洗浄液で２回洗浄した後、ｐ−ニトロフェニルリン酸溶液（４０μg／ml）１００μlを加え、３７℃で３０分間インキュベート後、４０５nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。
【００３６】
（３）結果
表４に示す如く、いずれのファージプローブ固定ウエルも増幅遺伝子の捕獲に使用可能であった。
【００３７】
【表４】
実施例４（特異性の確認）
（１）検体の調製
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＴＫ７８４（ＭＲＳＡ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ１９６３６（ＭＳＳＡ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ Ｎｏ．８６（メチシリン耐性株：ＭＲＳＥ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ＴＫ３３４４Ｎ（メチシリン感性：ＭＳＳＥ）、Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｒｅｔｔｇｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓの各菌について実施例１と同様にして培養し、ＤＮＡを調製した。
【００３９】
（２）検出
ＰＣＲは、プライマーとして実施例１のＭ９（配列番号１）、Ｍ６（配列番号２）、Ｓ３（配列番号３）、Ｓ４（配列番号４）の組み合わせをそれぞれビオチン標識して用い、後は実施例１と同様に操作した。
検出は実施例３に示した１本鎖ＤＮＡ ＭＰ２１と１本鎖ＤＮＡ ＳＰ２３をそれぞれ固定したマイクロタイターウエルを用い、実施例３と同様にハイブリダイゼーション、発色検出を行った。
【００４０】
（３）結果
表５に示す如く、ｍｅｃＡ遺伝子とｓｐａ遺伝子のそれぞれを保存する株に特異的に発色が認められ、非保有株では認められず、本発明の検査法でＭＲＳＡを特異的に検出できることが確認された。
【００４１】
【表５】
【発明の効果】
本発明の検出法によればＭＲＳＡをＭＲ−ＣＮＳと区別して正確かつ迅速に検出でき、ＭＲＳＡ感染症に対する適切な治療及び予防が可能となる。
【００４３】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖上
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：
他の特徴：ブドウ球菌の配列と相補的な配列を有する。
配列：5′AGAAATGACTGAACGTCCG 3′
【００４４】
配列番号：２
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖上
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：
他の特徴：ブドウ球菌の配列と相補的な配列を有する。
配列：5′GCGATCAATGTTACCGTAG 3′
【００４５】
配列番号：３
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖上
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：
他の特徴：ブドウ球菌の配列と相補的な配列を有する。
配列：5′TACATGTCGTTAAACCTGGTG 3′
【００４６】
配列番号：４
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖上
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：
他の特徴：ブドウ球菌の配列と相補的な配列を有する。
配列：5′TACAGTTGTACCGATGAATGG 3′
Claims (2)
- 下記の塩基配列（１）、（２）、（３）及び（４）；
（１）5′AGAAATGACTGAACGTCCG 3′
（２）5′GCGATCAATGTTACCGTAG 3′
（３）5′TACATGTCGTTAAACCTGGTG 3′
（４）5′TACAGTTGTACCGATGAATGG 3′
〔式中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンを示し、任意のＴはウラシル（Ｕ）と置換されていてもよい〕
で表わされる４種のオリゴヌクレオチドを遺伝子増幅反応プライマーとして用いることを特徴とするメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出法。 - 請求項１記載の４種のオリゴヌクレオチドを含有することを特徴とするメチシリン耐性黄色ブドウ球菌検出用キット。
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Legal Events
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