JPH0588A

JPH0588A - 新規核酸断片およびこれらを用いたマイコプラズマの検出法

Info

Publication number: JPH0588A
Application number: JP3153541A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Nakagami; 上智中; Shintaro Kawai; 井信太郎川; Kunihiro Oka; 訓弘岡
Original assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd; Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd; Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1991-06-25
Filing date: 1991-06-25
Publication date: 1993-01-08

Abstract

(57)【要約】【目的】煩雑な操作を必要とせずにマイコプラズマを
属特異的または種特異的にしかも感度よく測定できる技
術を提供する。【構成】種々のマイコプラズマのｒＲＮＡ遺伝子の新
規な特異的配列および共通配列を含む核酸断片およびそ
の構成塩基配列の部分配列からなる核酸断片、ならびに
これを利用したプライマーおよびプロ−ブであって標識
物または（および）固相担体と結合可能な部位が導入さ
れていることもあるプライマ−およびプロ−ブ。上記プ
ライマー、好ましくはこれを含むマイコプラズマ属に共
通性のある特定の２種の組み合わせからなるプライマ−
を用いた遺伝子増幅反応によって得られる合成核酸鎖を
検出するか、上記プローブを用いることにより、目的の
マイコプラズマ遺伝子を検出する。これにより、マイコ
プラズマが属特異的または種特異的に検出される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】〔発明の背景〕

【産業上の利用分野】本発明は、新規核酸断片およびそ
の用途に関する。さらに詳しくは、本発明は、一種以上
のマイコプラズマを検出するためのプライマーまたはプ
ローブとして利用可能な核酸断片およびその構成塩基配
列の部分配列、およびこれらを用いた一種以上のマイコ
プラズマの検出法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】マイコプラズマの検出法としては、分離
培養法、ＤＮＡ蛍光染色法、６ＭＰＤＲ法およびＤＮＡ
プローブ法などが知られている。分離培養法、ＤＮＡ蛍
光染色法および６ＭＰＤＲ法は、いずれも培養操作が必
要で測定時間が長い等の問題があった。一方、ＤＮＡプ
ローブ法は、培養操作は不要であるが操作が煩雑で、か
つ測定感度に限界がある等の欠点があった〔In Vitro,1
20, 404(1984)、Science,1226, 1211(1984)〕。その
後、検出操作が簡略化された「プローブ法によるマイコ
プラズマ検出用キット〔MYCOPLASMA T.C.(Gen-Probe社
製）〕」が販売されているが、これはマイコプラズマ類
のｒＲＮＡをコードする遺伝子の共通部分に対応する塩
基配列であり、マイコプラズマを属レベルで検出するこ
とができる。しかしながら、それらの塩基配列はマイコ
プラズマ以外の原核生物のｒＲＮＡとも相同性があるた
め、必ずしも他の原核生物と区別できるというものでは
ない。また、該キットは存在するマイコプラズマのｒＲ
ＮＡそれ自体を直接検出するプローブに関するものであ
るため、検出感度にも問題が残されている。そこで、こ
のような問題を解決するために、２種のプライマーを用
いて検体中の目的核酸を増幅するＰＣＲ法（Polymerase
Chain Reaction Method）の利用も検討されている（特
願平２−３０１３０８号明細書）。しかし、ＤＮＡプロ
ーブ法あるいはＰＣＲ法のいずれの方法においても、特
定のマイコプラズマあるいはグループとしてのマイコプ
ラズマを検出するためのプローブまたはプライマーをい
かに選択するかが最も困難な課題になっている。従来、
マイコプラズマのｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に関して
は、いくつかの株のある領域について決定されている
〔特開昭６３−７８００、Frydenberg, J.ら、DNA 4, 1
27-137(1980)、Weisburg, W.G.ら、J. Bacteriol. 171,
6455-6467(1989)〕が、これらの塩基配列の中からマイ
コプラズマと他の原核生物を厳密に区別することのでき
る配列を見いだすことはできない。〔発明の概要〕

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点
を解決し、煩雑な操作を必要とせずにマイコプラズマを
属特異的または種特異的にしかも感度よく測定できる技
術を提供することを目的とするものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、種々検討
した結果、種々のマイコプラズマのｒＲＮＡ遺伝子の特
異的配列および共通配列を見出すことにより、個々の種
のマイコプラズマあるいはグループとしてのマイコプラ
ズマの検出に用いるプローブまたはプライマーに利用可
能な核酸断片またはその構成塩基配列の部分配列等の創
製に成功し、この知見をもとに本発明を完成するに至っ
た。すなわち、本発明は、配列番号１〜５の配列式で示
される核酸、これらと相補的な核酸およびこれらの変異
配列で示される核酸から選ばれる核酸断片に関するもの
である。

【０００５】本発明は、また、上記のいずれかの核酸中
の部分配列であってプライマーまたはプローブとして利
用可能な核酸からなる核酸断片に関する。この具体的な
態様は、プライマーとして利用可能な核酸が１０〜１０
０塩基の長さであり、プローブとして利用可能な核酸が
７塩基の長さ〜各核酸の全塩基数よりも少ない長さの核
酸断片であり、更にこの具体的な好ましい態様は、プラ
イマーとして利用可能な核酸が配列番号６の配列式で示
される核酸およびその変異配列で示される核酸から選ば
れる核酸断片であり、プローブとして利用可能な核酸が
下式（１）、（２）および配列番号８の配列式で示され
る核酸、これらと相補的な核酸およびこれらの変異配列
で示される核酸から選ばれる核酸断片である。５′ ＴＣＣＣＴＡＣ（１）５′ ＧＧＧＡＴＧＧＡ（２）本発明は、また、上記の核酸断片を利用したプライマー
に関する。すなわち、本発明によるプライマーは、上記
したような核酸断片であって標識物または（および）固
相担体と結合可能な部位が導入されていることもある核
酸断片からなるプライマーであり、この好ましい態様は
核酸断片が上記配列番号６の塩基配列で示される核酸ま
たはその変異配列で示される核酸からなるものである。
本発明による別のプライマーは、プライマーとして利用
可能な２種の核酸断片の組み合わせからなるプライマー
であって、少なくとも一方が上記したような本発明によ
る核酸断片から選ばれ、かつそれぞれの核酸断片に標識
物または（および）固相担体と結合可能な部位が導入さ
れていることもあるプライマーであり、この好ましい態
様は、２種の核酸断片の組み合わせが配列番号６の配列
式で示される核酸またはその変異配列からなる核酸断片
と配列番号７の配列式で示される核酸またはその変異配
列で示される核酸断片であるものである。本発明は、ま
た、前記の核酸断片を利用したプローブに関する。すな
わち、本発明によるプローブは、前記したような核酸断
片の塩基配列を有する核酸断片であって標識物または
（および）固相担体と結合可能な部位が導入されている
こともある核酸断片からなるプローブであり、この好ま
しい態様は、核酸断片が前記配列式（１）、（２）およ
び配列番号８で示される核酸、これらと相補的な核酸ま
たはこれらの変異配列で示される核酸からなるものであ
る。本発明は、また、上記したプライマーまたはプロー
ブを使用したマイコプラズマの検出法に関する。

【０００６】すなわち、プライマーを使用した本発明に
よるマイコプラズマの検出法は、上記したような本発明
によるプライマー、好ましくは２種の組み合わせからな
るプライマーを用い、下記（ａ）〜（ｄ）の工程を実施
すること、を特徴とするものである。（ａ）マイコプラズマの存在の有無を検出するための
検体を用意する。（ｂ）必要に応じて、検体について細胞破砕処理を行
う。（ｃ）検体中に上記プライマーを加えてプライマーの
伸長反応を行う。（ｄ）工程（ｃ）によって得られる伸張反応物につい
て、合成核酸鎖検出のための検出操作を行う。また、プローブを使用した本発明によるマイコプラズマ
の検出法は、前記したようなプローブの少なくとも１種
を用いること、を特徴とするものである。また、本発明
によるもう一つのマイコプラズマの検出法は、前記した
ような核酸断片またはその部分配列であってマイコプラ
ズマの各種に特異的な核酸断片をプライマーまたはプロ
ーブとして用いること、を特徴とするものである。

【０００７】〔発明の具体的説明〕本発明において検出
の対象となるマイコプラズマは、マイコプラズマ類の総
称であり、具体的にはマイコプラズマ目（Mycoplasmata
les)およびアコレプラズマ目（Acholeplasmatales)に属
するマイコプラズマ類およびその突然変異株を包含する
ものである。

【０００８】核酸断片本発明による核酸断片は、配列番号１〜５の配列式で示
される核酸、これらと相補的な核酸およびこれらの変異
配列で示される核酸から選ばれるもの、およびこれらの
核酸断片の構成塩基配列の部分配列（以後、部分塩基配
列ともいう）であってプライマーまたはプローブとして
利用可能な核酸からなるものであることは前記したとこ
ろである。上記配列番号１〜５の配列式で示される核酸
断片は、具体的にはマイコプラズマ・オラーレ、マイコ
プラズマ・ファーメンタンス、マイコプラズマ・サリバ
リウム、マイコプラズマ・ホミニスおよびマイコプラズ
マ・アルギニーニのそれぞれの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の
３′末端とそれに続く部分である。

【０００９】これらの核酸断片は、特にプローブとし
て、また、部分塩基配列は、マイコプラズマ検出用のプ
ライマーまたはプローブとして使用することができる。
プライマーまたはプローブとして利用可能な核酸は、マ
イコプラズマを検出するためのプライマーまたはプロー
ブとして機能するものであればよい。部分塩基配列を使
用する場合には、マイコプラズマ類または個々のマイコ
プラズマ種に特異的で他の細菌、特に大腸菌、枯草菌、
緑膿菌およびブドウ球菌等に相同性の少ない部分を選択
することが好ましい。このように、これらの核酸断片か
ら各マイコプラズマ種固有あるいはマイコプラズマ類共
通の部分塩基配列を選択することにより、目的に合った
マイコプラズマ検出用のプライマーまたはプローブを調
製することができる。部分塩基配列は具体的には、プラ
イマーの場合には１０〜１００塩基の長さであり、プロ
ーブの場合には７塩基の長さ〜各核酸の全塩基数よりも
少ない長さのものである。たとえば、マイコプラズマ類
をグループとして検出する場合のプライマーとしては、
配列番号６の配列式で示される核酸もしくはその変異配
列を利用することができる。さらに好ましくは後述する
ように、この配列番号６の配列式および配列番号７の配
列式で示される２種の異なる核酸またはその変異配列で
示される核酸の組み合わせを利用することができる。ま
たプローブの好ましい例としては、たとえば前記式
（１）、（２）および配列番号８の配列式で示される核
酸またはこれらと相補的な核酸あるいはこれらの変異配
列からなる核酸を利用することができる。一方、個々の
マイコプラズマ種をプライマーまたはプローブで検出す
る場合、それぞれのマイコプラズマ間で塩基配列の違い
ができるだけ大きい配列を選べばよい。たとえば、下記
に示すように、配列番号９〜１３、好ましくは配列番号
１４〜１８の配列式から選ばれる核酸またはこれらと相
補的な核酸、もしくはこれらの変異配列で示される核酸
を用いれば、それぞれのマイコプラズマ種間での区別が
可能である。マイコプラズマ・アルギニーニ特異的：配列番号９およ
び１４マイコプラズマ・オラーレ特異的：配列番号１０および
１５マイコプラズマ・サリバリウム特異的：配列番号１１お
よび１６マイコプラズマ・ファーメンタンス特異的：配列番号１
２および１７マイコプラズマ・ホミニス特異的：配列番号１３および
１８

【００１０】これらの核酸断片あるいはその部分塩基配
列は、合目的的な任意の方法によって調製することがで
き、たとえば後記実施例に記載されたような方法に従っ
てその全部または一部を化学合成してもよいし、また、
例えばマイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・フ
ァーメンタンス、マイコプラズマ・ホミニス、マイコプ
ラズマ・サリバリウムの遺伝子から直接酵素的に切り出
してもよいし、それらの遺伝子を細菌のプラスミドにク
ローニングし、細菌を増殖した後、切り出してもよい。

【００１１】本発明による上記核酸断片（部分塩基配列
をも包含する）における変異配列としては、例えば、該
核酸断片の一部の塩基もしくは塩基配列を欠失させる
か、または他の塩基もしくは塩基配列で置換させたも
の、もしくは他の塩基もしくは塩基配列を付加させたも
の、さらにはマイコプラズマの突然変異株の同遺伝子に
対応する塩基配列に変換したもの等があげられる。ただ
し、核酸断片をプライマーとして利用する場合、プライ
マーの伸張反応の効率に大きく影響を与えると思われる
プライマーの３′末端付近については、変異がないよう
にするか、あるいはあっても最小限にとどめることが好
ましく、より好適には５′末端付近で変異があるように
する。

【００１２】このような、プライマーまたはプローブと
して利用可能な核酸断片またはその部分塩基配列は、必
要に応じて後述するように標識物または固相担体と結合
可能な部位が導入されていてもよい。特に、マイコプラ
ズマ検出用プライマーとして２種の異なるプライマーを
利用する場合、標識物または固相担体と結合可能な部位
が導入されるべきプライマーの位置は、プライマーの伸
張反応を妨げない位置であればどこでもよいが、好まし
くは５′末端である。また、プローブとして利用する場
合の標識物または固相担体を結合可能な部位が導入され
る位置は５′末端や３′末端の水酸基部分さらには塩基
部分やリン酸ジエステル部分などが考えられるが、プロ
ーブの塩基配列や長さなどを考慮してハイブリダイゼー
ションの妨げにならないようにすることが望ましい。

【００１３】標識物および固相担体と結合可能な部位上記核酸をプローブまたはプライマーとして利用する場
合、標識物としては、非放射性、放射性物質のどちらを
用いてもよいが、好ましくは非放射性物質である。非放
射性の標識物としては、直接標識可能なものとして蛍光
物質〔例えばフルオレッセイン誘導体（フルオレッセイ
ンイソチオシアネート等）、ローダミンおよびその誘導
体（テトラメチルローダミンイソチオシアネート
等）〕、化学発光物質（例えばアクリジン等）や遅延蛍
光を発する物質（ＤＴＴＡ：ファルマ社製）等があげら
れる。また、標識物と特異的に結合する物質を利用すれ
ば間接的に標識物を検出することができる。こうした場
合の標識物としては、ビオチンあるいはハプテン等があ
げられ、ビオチンの場合には、これに特異的に結合する
アビジンあるいはストレプトアビジンが、ハプテンの場
合は、これに特異的に結合する抗体が利用できる。ハプ
テンとしては２，４‐ジニトロフェニル基を有する化合
物やジゴキシゲニンを使うことができ、さらにはビオチ
ンあるいは蛍光物質などもハプテンとして使用すること
ができる。これらの標識物はいずれも単独または必要が
あれば複数種の組み合わせで公知手段（特開昭５９−９
３０９９号、特開昭５９−１４８７９８号、特開昭５９
−２０４２００号各公報参照）により、プライマーまた
はプローブに導入することができる。

【００１４】一方、サンドイッチハイブリダイゼーショ
ンや後述するマイコプラズマの検出法においては核酸の
特定の断片を固相担体に特異的に結合する必要がある
が、そのような場合、固相担体と結合可能な部位は、該
担体と選択的に結合可能なものであれば何であってもよ
い。その一例としては、上記非放射性標識物質を利用す
ることもできる。その好ましい具体例としては、ビオチ
ン、あるいはフルオレッセインなどの蛍光物質または
２，４‐ジニトロフェニル基を有する化合物あるいはジ
ゴキシゲニンなどのハプテンがあげられ、これらは単独
または必要があれば複数種の組み合わせであらかじめプ
ライマーまたはプローブに導入しておくことができる。

【００１５】プローブを用いた検出法プローブを用いた本発明によるマイコプラズマの検出法
は、前記核酸断片の塩基配列を有する核酸断片であって
標識物または（および）固相担体と結合可能な部位が導
入されていることもある核酸断片からなるプローブの少
なくとも１種を用いることを特徴とするものであり、好
ましい例は核酸断片の塩基配列が式（１）、（２）およ
び配列番号８の配列式で示されるものであることは前記
したところである。一般的にプローブを用いた検出法に
はドットハイブリダイゼーションやサザンハイブリダイ
ゼーションがあり（B. D. Hames およびS. J. Higgins;
Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach,
IRL Rress,1985)、上記標識核酸断片を使用して常法通
りハイブリダイゼーションを行うことができる。一方、
コーンらはハイブリダイゼーションの感度を高めるため
に１細胞あたり多コピー存在するリボソームＲＮＡを検
出する方法を開発しているが（特開昭６０−５０１３３
９）、本発明における核酸断片もリボソームＲＮＡをコ
ードする領域を含んでいる遺伝子であり、同様にリボソ
ームＲＮＡの検出に利用することができる。また、ハイ
ブリダイゼーション操作を容易にするためにサンドイッ
チハイブリダイゼーションを基本とする方法が開発され
ているが（Morrissey, D. V.ら、Molecular and Cellul
ar Probes, 13, 189-207(1989)）、これらの方法におい
ても本発明における核酸断片を利用してマイコプラズマ
の検出を行うことができる。

【００１６】プライマーを用いた検出法プライマーを用いた本発明によるマイコプラズマの検出
法は、前記核酸断片の塩基配列を有する核酸断片であっ
て標識物または（および）固相担体と結合可能な部位が
導入されていることもある核酸断片からなるプライマー
の少なくとも１種を用いることを特徴とするものであ
り、好ましい例は、後述するように２種の異なるプライ
マーによる遺伝子増幅反応（以下、ＰＣＲ法と略す）を
利用する検出法である。試料中の微量の核酸断片を増幅
するＰＣＲ法（Polymerase Chain ReactionMethod）が
開発され（特開昭６１−２７４６９７号、特開昭６３−
１０２６７７号）たが、この方法により増幅された核酸
断片の検出には電気泳動、あるいはハイブリダイゼーシ
ョンなどの煩雑な操作を用いることが多い。この点を解
決するために、遺伝子の増幅反応においてそれぞれのプ
ライマーに別々の標識を導入し、増幅反応後生成物を固
相担体に吸着し、生成物を選択的に検出する方法が開発
されている（特開平１−２５２３００号、ケンプら、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2433-2427 (1980)）。
また、遺伝子の増幅法にはＱβレプリカーゼを用いる方
法〔リザルディーら、Bio/Technology,6,1197(1988）〕
なども考案されている。本発明による核酸断片は、上述
のような遺伝子増幅のプライマーなどに利用するのに十
分な長さおよび塩基配列であり、これを用いて遺伝子増
幅を行うことによりマイコプラズマ類の簡便な検出を行
うことができる。

【００１７】１）プライマー本発明によるマイコプラズマ検出用のプライマーは、基
本的には前記したように塩基配列が配列番号１〜５のい
ずれかの核酸の部分配列またはその異変配列もしくはそ
の相補的な配列であり、好ましくは配列番号６で示され
る核酸断片であって、標識物または（および）固相担体
と結合可能な部位が導入されていることもある核酸断片
である。また、本発明による別のプライマーは２種の核
酸断片の組み合わせからなるプライマーであって、一方
の核酸断片は塩基配列が配列番号１〜５のいずれかの核
酸の部分配列またはその変異配列もしくはその相補的な
配列であり好ましくは配列番号６で示される核酸断片で
あって、他方の核酸断片は塩基配列がマイコプラズマ遺
伝子における上記核酸断片に相当する部位とは重ならな
い部位から選ばれる核酸断片である。この２種類の核酸
断片に相当する塩基配列はマイコプラズマ遺伝子のＤＮ
Ａ（二本鎖）上ではそれぞれ別の鎖に位置するものであ
り、さらにお互いの距離はＤＮＡポリメラーゼによる伸
長方向（５´から３´への方向）２０００塩基以内であ
ることが望ましい。また、この２種の組み合わせからな
るプライマーは、それぞれの核酸断片に（すなわち（後
述する２種のプライマーの形態の具体例にも示すよう
に）２種の核酸断片のそれぞれに互いに無関係にもしく
は独立した形で）標識物または（および）固相担体と結
合可能な部位が導入されていることもあるオリゴヌクレ
オチドからなるものであり、この好ましい態様は、２種
の組み合わせが上記配列番号６の配列式で示される核酸
またはその変異配列からなる核酸断片と上記配列番号７
の配列式で示される核酸またはその変異配列で示される
核酸断片であるものであることは前記したところである
（以下、塩基配列が配列番号６で示されるプライマーを
プライマー（１´）、また配列番号７で示されるプライ
マーをプライマー（２´）ともいう）。

【００１８】プライマー（１′）は、本発明による核酸
断片から選ばれたもので、マイコプラズマの１６ＳｒＲ
ＮＡをコードする遺伝子（１６ＳｒＲＮＡ遺伝子）の
マイナス鎖の一部に相当し、マイコプラズマ・オラーレ
（Mycoplasma(M.) orale）、マイコプラズマ・アルギニ
ーニ（M. arginini)、マイコプラズマ・ホミニス（M.ho
minis）、マイコプラズマ・サリバリウム（M. salivari
um)およびマイコプラズマ・ファーメンタンス（M. ferm
entans)の種では完全に共通であり、アコレプラズマ・
ライドラウィー（Acholeplasma laidlawii）とは１塩基
のみが異なる。（図１および２の塩基配列（配列番号１
９〜２６）参照））。また、プライマー（２′）は、１
６ＳｒＲＮＡ遺伝子において上記プライマー（１′）に
相当する部分より上流で、この遺伝子のプラス鎖の一部
に相当し、マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ
・アルギニーニ、マイコプラズマ・ホミニスの種では完
全に共通であり、マイコプラズマ・ファーメンタンスお
よびアコレプラズマ・ライドラウィーの種では１塩基異
なるのみの配列である。さらに、プライマー（１′）は
大腸菌（E. coli)および枯草菌（B. subtilis)の相当す
る部分とは３′末端の１塩基の違いも含めて３塩基ある
いは４塩基の違いがあり、プライマー（２′）は大腸菌
あるいは枯草菌の相当する部分と３′末端の１塩基の違
いも含めて３塩基あるいは２塩基の違いがある（図１お
よび２の塩基配列（配列番号１９〜２６参照）。

【００１９】このような上記プライマーの組み合わせを
用いることによって、特にマイコプラズマを群特異的に
検出することが可能になる。このような基本的な２種の
プライマーの形態の具体例としては、例えば、(i) ２
種のプライマーとも何も修飾されていないもの、(ii)
２種のプライマーのうち少なくとも一方に検出可能な標
識または固相担体と結合可能な部分が導入されたもの、
(iii) ２種のプライマーのうち、少なくとも一方に検
出可能な標識および固相担体と結合可能な部位が導入さ
れたもの、(iv) ２種のプライマーのうちの一方が固相
担体と結合可能な部位を有し、他方に標識物が導入され
たもの、などがあげられ、前記核酸断片の項で記述した
ような標識あるいは固相担体と結合可能な部位を導入す
ればよい。

【００２０】２）固相担体ここでいう固相担体は、反応に使用する溶媒およびすべ
ての試薬に対して不活性でかつ何らかの方法で該試薬溶
液と分離でき、なおかつ上記部位と選択的に結合可能な
ものである。このようなものとしては、ミクロタイター
ウェル、ポリスチレンボール、アガロースビーズ、ポリ
アクリルビーズなどの固相材料に、上記部位を捕捉可能
なストレプトアビジンまたは抗体などを導入したものが
あげられる。例えば、ビオチンが導入されたプライマー
からのＰＣＲ生成物を捕捉するには、ストレプトアビジ
ンを固相に結合した担体を、また、フルオレッセイン残
基や、２，４‐ジニトロフェニル基が導入されたプライ
マーからのＰＣＲ生成物に対しては、それぞれに対する
抗体を固相に結合した担体を用いることができる。

【００２１】３）検出法本発明によるマイコプラズマの検出法は、前記したよう
な本発明によるプライマー、好ましくは上記２種の組み
合わせからなるプライマーを用いて、基本的には、
（ａ）マイコプラズマの存在の有無を検出するための
検体を用意する、（ｂ）必要に応じて、検体について
細胞破壊処理を行う、（ｃ）検体中に上記プライマー
を加えてプライマーの伸張反応を行う、（ｄ）工程
（ｃ）によって得られる伸張反応物について、合成核酸
鎖検出のための検出操作を行う、ことにより実施でき、
伸張反応によって目的とするマイコプラズマの遺伝子を
増幅し、この増幅された伸張反応物（合成核酸鎖）を公
知の合成核酸鎖検出法によって検出し、もってマイコプ
ラズマ類の存在を確認することを基本原理とするもので
ある。

【００２２】（１）検体の準備および前処理まず、目的のマイコプラズマの存在の有無を検知しよう
とする検体を用意する。検体としては、たとえば動物細
胞培養液、培養細胞などがあげられる。検体は、必要に
応じて、遠心分離操作等により沈渣として濃縮した後、
例えば、酵素処理、熱処理、界面活性剤処理、超音波処
理、あるいはこれらの組合せ等による細胞破壊処理をあ
らかじめ施したものを使用することができる。この細胞
破壊処理は、マイコプラズマが動物細胞などから遊離し
ている場合、あるいは動物細胞などに取り込まれている
場合のいずれについても、マイコプラズマＤＮＡを顕在
化せしめる目的で行われる。その具体的な方法について
は一般的な文献、たとえばPCR PROTOCOLS, Academic Pr
ess Inc., P14, P352(1989) などを参照されたい。

【００２３】（２）プライマーの伸長反応上記検体に本発明のプライマーを加えることにより、検
体中にマイコプラズマが存在すれば（すなわち前記ｒＲ
ＮＡ遺伝子、またはｒＲＮＡが存在すれば）、プライマ
ーの伸張反応を行うことができる。プライマーの伸張反
応は、４種類のヌクレオチド三リン酸（デオキシアデノ
シン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシ
シチジン三リン酸およびチミジン三リン酸（これらの混
合物をｄＮＴＰということもある）を基質として該プラ
イマーに取り込ませることにより実施できる。この伸張
反応にはＥ．coliＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．coliＤＮ
ＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラ
ーゼ、などが使用される。特に、Ｔａｑポリメラーゼの
ような高温で伸張反応を行える耐熱酵素を用いればプラ
イマーによる標的配列認識の特異性を高めることもでき
る（詳細は特開平１−３１４９６５および１−２５２３
００号参照）。本発明による２種類のプライマーを用い
て伸張反応をくり返すこと（増幅反応）により、目的と
するマイコプラズマ遺伝子を効率的に増幅させることが
できる。伸張反応の更に具体的な方法については、実験
医学、羊土社、８．No.9(1990)、あるいはPCR Technolo
gy, Stockton press(1989)を参照されたい。

【００２４】（３）検出ＰＣＲ法等により増幅された核酸の好ましい検出方法
は、上記プライマーの伸張反応物、すなわち合成核酸鎖
の種類もしくは形態により異なる。一般的には、二重鎖
となる合成核酸鎖を検出する電気泳動法（Saiki, R. K.
et al., Science,230,1350-1354(1985)）、あるいは標識
プローブを用いるドットハイブリダイゼーション法（Sa
iki, R. K.et al., Nature, 324, 163-166(1986))等に
より検出することができる。

【００２５】合成核酸鎖に標識物質が導入されている場
合は、固相担体に固定したプローブと該標識合成核酸鎖
をハイブリダズさせるリバースドットハイブリダイゼー
ション法（Saiki, R. K.et al., Proc. Natl. Acad.Sc
i.USA,86,6230-6234(1989)、特願平２−１７０６８４号
参照）、あるいは固体吸着剤を用いたカラム法（特開平
１−３１４９６５号参照）等によっても、核酸を検出す
ることができる。また、双方のプライマーに固相担体と
結合可能な部位が導入されているものを用いて、ＰＣＲ
法により増幅反応を行った場合には、増幅された核酸の
好ましい検出方法としては、固相担体の代わりに固相単
体と結合可能な部位と特異的に結合可能な微粒子（たと
えば、蛋白質、ラテックス等）を該増幅反応液中に加え
る方法があげられるが、この方法を用いることにより目
的とする核酸を凝集あるいは沈殿の有無により判定する
こともできる。また、特開平１−２５２３００号記載の
方法によれば、さらに容易に核酸を検出することもでき
る。すなわち、一方のプライマーに固相担体と結合可能
な部位を、他方のプライマーに標識物を導入したものを
用い、伸張反応を行った反応物を固相担体と接触させた
後、不純物を適当な溶媒で洗浄除去する方法がある。こ
の方法では該固相担体と結合可能な部位を持つプライマ
ーから伸張した合成核酸鎖は、もう一方の標識物が導入
されたプライマーから伸張された合成核酸鎖と二重鎖を
組んでおり、目的核酸は標識物を持つ形で該固相担体に
固定され、特異的に検出されることになる。

【００２６】標識物質の実際の検出は、使用する標識物
質に応じて一般的手法を用いればよい。たとえば、標識
物質がラジオアイソトープであればそのまま活性を測定
すれば良いし、たとえばビオチンであればアビジン（も
しくはストレプトアビジン）‐酵素結合体、また、ハプ
テンであれば抗体‐酵素結合体を用いて基質と反応さ
せ、色的又は蛍光的手段により検出可能な成分を得るこ
とができる。また、たとえば、標識物質が蛍光であれ
ば、そのまま蛍光光度計を用いて強度を測定すればよ
い。

【００２７】本発明によるもう一つのマイコプラズマの
検出法は、前記したよううな核酸断片またはその部分配
列であってマイコプラズマの各種に特異的な塩基配列の
核酸断片をプライマーまたはプローブとして用いるこ
と、を特徴とするものであることは前記したところであ
り、特に、配列番号９〜１３または１４〜１８の配列式
で示される核酸断片を使用して伸長反応、増幅反応を行
うことにより、目的とする個々のマイコプラズマ種を検
出することができる。

【００２８】

【実施例】

実施例１：プライマーの調製本発明において標識物あるいは部位が導入されているプ
ライマーまたは導入されていないプライマーは以下に示
す方法で化学合成した。まず、標識物あるいは部位のい
ずれも導入されていないものは、Caruthers らのホスホ
アミダイト法［Tetrahedron Lett. 22,1859(1981）］に
基づいてアプライドバイオシステム社のＤＮＡ自動合成
機モデル３８１Ａを用いて０．２マイクロモルのスケー
ルで行った。また、標識物または部位が導入されたもの
は、まずそれぞれの５′末端にアミノ基を導入したオリ
ゴヌクレオチドとして合成し、そののち適当な試薬を用
いて標識物あるいは部位を導入した。その例を以下に示
す。まず、５′末端にアミノ基を導入したオリゴヌクレ
オチド（５′ＧＣＴＧＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣ
Ｔ）の合成は、アプライドバイオシステム社のＤＮＡ自
動合成機モデル３８１Ａを用いて行った。０．２マイク
ロモルの支持体に順次保護モノヌクレオチドホスホアミ
ダイトを付加し、５′末端の塩基を付加したのちアミノ
リンクII^TM（アプライドバイオシステム社）をさらに付
加した。次に濃アンモニア処理により支持体からの脱離
および保護基の除去を行った。脱保護後は、セファデッ
クスＧ−５０を用いてゲルロ過し、最初に溶出したピー
クのフラクションを集めて濃縮した。次に、この試料を
逆相のＨＰＬＣで精製した（カラム：μ−Bondapak C1
8、溶離液：５−２０％アセトニトリル‐５０mMトリエ
チルアンモニウム酢酸、pH７．０）。次に、アミノ化オ
リゴヌクレオチドの水溶液（１O.D.：１０μｌ）に１Ｍ
ＮａＨＣＯ_３水溶液（１０μｌ）、Ｈ_２Ｏ（３０μｌ）
およびビオチニル‐Ｎ‐ヒドロキシサクシニミドエステ
ル（ＢＲＬ社）のＤＭＦ溶液（２０μｇ／μｌ、５０μ
ｌ）を加え、混和後室温で放置した（ビオチン化反
応）。４時間後、ゲルロ過カラム（セファデックスＧ−
５０）にかけ、５０mMＴＥＡＢバッファー（重炭酸トリ
エチルアンモニウム緩衝液pH７．５）で溶離し、最初に
溶出したピークを集めて乾固した（収量：０．７ O.
D.）。なお、原料のアミノ化オリゴヌクレオチドが純粋
でない場合あるいはビオチン化反応が定量的でなかった
場合、ゲルロ過後の試料を逆相のＨＰＬＣ（カラム：μ
−Bondapak-C18、溶離液：１０−２０％アセトニトリル
−５０mMトリエチルアンモニウム酢酸、pH７．０）で精
製した。その場合、目的物のビオチン化オリゴヌクレオ
チドは原料およびその他の不純物より遅れて溶出するた
め容易に精製することができる。５′末端にジニトロフ
ェニル基（ＤＮＰ）を導入したオリゴヌクレオチド
（５′ＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＣＧＴＡＧＧＧＡ）は、ま
ずビオチン化オリゴヌクレオチドと同様にアミノ基を導
入したものとして合成した。このようにして得たアミノ
化オリゴヌクレオチドの水溶液（２ O.D.：１８０μ
ｌ）に１ＭＮａＨＣＯ_３（２０μｌ）を加え、これに
５％（v/v)ジニトロフルオンベンゼンのエタノール溶液
（１００μｌ）を加え３７℃で２時間加温した。反応後
はビオチン化オリゴヌクレオチドと同様にしてゲルロ過
によって試薬を除き精製した（収量：１．２ O.D.）。

【００２９】実施例２：プローブの調製実施例１と同様にビオチン標識したオリゴヌクレオチド（５′ＣＧＡＧＡＡＣＧＴＧＧＧＧＡＴ）を調製した。

【００３０】実施例３：前記２種の標識フラグメント
（プライマー）の特異性マイコプラズマ・オラーレ（M.orale ）、マイコプラズ
マ・アルギニーニ（M.arginini）、マイコプラズマ・ホ
ミニス（M.hominis ）、マイコプラズマ・サリバリウム
（M.salivarium）、マイコプラズマ・ファーメンタンス
（M.fermentans）、アコレプラズマ・ライドラウィー
（A.laidlawii ）、野生型の枯草菌（B.subtilis）、大
腸菌（E.coli）、緑膿菌（Pseudomonous aeruginosa ）
および黄色ブドウ球菌（Staphlococcus aureus）より常
法に従って調製したＤＮＡを試料とし、ＰＣＲ法を用い
た遺伝子増幅反応を行った。実施例１で調製した２種の
プライマー（Biotin-GCTGCGGTGAATACGTTCT、DNP-CCCACG
TTCTCGTAGGGA）それぞれ１００ng、ｄＡＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰそれぞれ２００μＭ、１０mMＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、５０mM ＫＣｌ、１．５
mM ＭｇＣ１_２、０．０１％ゼラチンを含む反応混液１
００μｌに、試料ＤＮＡを１００ng加え、９４℃で５分
間加熱した後、５０℃に５分間保った。続いて耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（シータス社製）２．５単位を加え、
７２℃・６０秒、９４℃・３０秒、５０℃・３０秒を１
サイクルとして３０サイクルの反応を行った。反応後の
混合液５μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジ
ウムブロミド染色により増幅核酸鎖の検出を行った。そ
の結果、試料としてマイコプラズマ類のＤＮＡを用いた
場合には、期待される増幅核酸鎖１２６塩基長に対応す
るバンドを確認することができた。一方、試料として枯
草菌、大腸菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌のＤＮＡを用い
た場合にはそれに対応するバンドは検出されなかった。

【００３１】実施例４：マイコプラズマＤＮＡの検出マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・アルギニ
ーニ、マイコプラズマ・ホミニス、マイコプラズマ・サ
リバリウム、マイコプラズマ・ファーメンタンス、アコ
レプラズマ・ライドラウィーより常法に従って調製した
ＤＮＡそれぞれ１ng、野生型の枯草菌、大腸菌、緑膿菌
または黄色ブドウ球菌より常法に従って調製したＤＮＡ
それぞれ１０ng、または市販ヒト胎盤ＤＮＡ１００ngを
含む試料１０μｌに、遺伝子増幅用反応混液４０μｌ
（実施例１で調製した２種のプライマー（Biotin-GCTGC
GGTGAATACGTTCT、DNP-CCCACGTTCTCGTAGGGA）それぞれ５
０ng、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰそれぞ
れ２００μＭ、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．
３）、５０mM ＫＣｌ、１．５mM ＭｇＣ１_２、０．０
１％ゼラチンおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（シータ
ス社製）１．５単位を含む）を加え、９４℃で５分間加
熱した後、５０℃に５分間保った。続いて７２℃・６０
秒、９４℃・３０秒、５０℃・３０秒を１サイクルとし
て３０サイクルの反応を行った。反応後の混合液５μｌ
を、あらかじめ１００μｌの緩衝液（１００mMＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（pH７．５）、０．１５M ＮａＣｌ、０．０
５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む）を加えたストレプトアビ
ジン固定化マイクロプレートに加え、３０分間おいた
後、上述の緩衝液約４００μｌで洗浄した。この洗浄操
作をさらに２回行った。これに、アルカリ性フォスファ
ターゼ標識抗ＤＮＰ抗体を上述の緩衝液で希釈したもの
を加え（１００μｌ）、室温で３０分間おいた後緩衝液
（４００μｌ）で洗浄した。この洗浄操作をさらに２回
行い、１００μｌのｐ‐ニトロフェニルリン酸溶液（４
mg／ml、１Ｍジエタノールアミン緩衝液に溶解）を加
え、室温で３０分間おいた後マイクロプレートリーダー
（ＴＯＳＯ製）で４０５nmの吸光度を測定した。マイコ
プラズマ群のＤＮＡを用いた場合のみ陽性と判断できる
発色が得られた（表１）。表１試料吸光度（Ｏ．Ｄ．） A. laidlawii DNA ０．１６２ M. orale DNA ０．２７７ M. fermentans DNA ０．２７０ M. hominis DNA ０．５１４ M. salivalium DNA ０．４０７ M. arginini DNA ０．２８７ B. subtilis DNA ０．００２ E. coli DNA ０．００５ P. aeruginosa DNA ０．００５ S. aureus DNA ０．００２ Human placental DNA ０．０００

【００３２】実施例５：マイコプラズマの検出マイコプラズマ・オラーレ、アコレプラズマ・ライドラ
ウィー、野生型の枯草菌または大腸菌の各菌体懸濁液５
μｌに溶菌液（２００μｇ／mlプロテアーゼＫ、１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、５０mM ＫＣｌ、
２．５mM ＭｇＣ１_２、０．０１％ゼラチン、０．４５
％Nonidet P-40、０．４５％Ｔｗｅｅｎ２０を加え、６
０℃で２０分間、続いて９０℃で１０分間保った。その
後、遺伝子増幅用反応試薬１０μｌ（実施例１で調製し
た２種のプライマー（Biotin- GCTGCGGTGAATACGTTCT 、
DNP-CCCACGTTCTCGTAGGGA）それぞれ５０ng、ｄＡＴＰ、
ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰそれぞれ２００μＭ、１
０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、５０mM ＫＣ
ｌ、１．５mM ＭｇＣ１_２、０．０１％ゼラチンおよび
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（シータス社製）１．５単位
を含む）を加え、９４℃で５分間加熱した後、５０℃に
５分間保った。続いて７２℃・６０秒、９４℃・３０
秒、５０℃・３０秒を１サイクルとして３０サイクルの
反応を行った。反応後の混合液５μｌを、あらかじめ１
００μｌの緩衝液（１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
７．５）、０．１５M ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０を含む）を加えたストレプトアビジン固定化マ
イクロプレートに加え、３０分間おいた後、上述の緩衝
液約４００μｌで洗浄した。この洗浄操作をさらに２回
行った。これに、アルカリ性フォスファターゼ標識抗Ｄ
ＮＰ抗体を上述の緩衝液で希釈したものを加え、（１０
０μｌ）、室温で３０分間おいた後、緩衝液（４００μ
ｌ）で洗浄した。この洗浄操作をさらに２回行い、１０
０μｌのｐ‐ニトロフェニルリン酸溶液（４mg／ml、１
Ｍジエタノールアミン緩衝液に溶解）を加え、室温で３
０分間おいた後マイクロプレートリーダー（ＴＯＳＯＨ
製）で４０５nmの吸光度を測定した。マイコプラズマ群
を試料として用いた場合のみ陽性と判断できる発色が得
られた（表２）。表２試料菌量吸光度（Ｏ．Ｄ．） A. laidlawii ５×１０^４細胞０．７０７ A. laidlawii ５×１０^３細胞０．６０５ A. laidlawii ５×１０^２細胞０．３２７ M. orale ５×１０^４細胞０．８４１ M. orale ５×１０^３細胞０．８３８ M. orale ５×１０^２細胞０．７０７ B. subtilis １０^５細胞０．００５ E. coli １０^５細胞０．００８

【００３３】実施例６：マイコプラズマの迅速検出マイコプラズマ・オラーレの菌液（２５０細胞／５μ
ｌ、１０００細胞／５μｌ）に溶菌液（４０μｌ；５０
mM ＫＣｌ、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、
２．５mM ＭｇＣ１_２、０．０１％ゼラチン、０．４５
％ＮＰ４０、０．４５％Ｔｗｅｅｎ２０、２００μ
ｇ／mlプロテアーゼＫ）を加えて６０℃で２０分間反応
した。９４℃で１０分間処理した後冷却し、ＰＣＲ反応
液（１０μl ；５０mM ＫＣｌ、１０mM Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（pH８．３）、１．５mM ＭｇＣ１_２、０．０１％
ゼラチン、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰそ
れぞれ１mM、５ng／μｌ DNP-CCCACGTTCTCGTAGGGA、５
ng／μｌ Biotin-GCTGCGGTGAATACGTTCT、０．７５単位
のＴａｑＤＮＡピリメラーゼ）を加え、７２℃・６０
秒、９４℃・３０秒、５０℃・３０秒を１サイクルとし
て３０サイクルの反応を行った。アルカリ性フォスファ
ターゼ標識抗ＤＮＰ抗体を洗浄液（５０mM Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ pH７．５、１５０mM ＮａＣｌ、０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０）で希釈し、ストレプトアビジン固定化
プレートに１００μｌずつ加えた。これに先の反応液
（５μｌ）を加え、室温で３０分間反応した。反応液を
除き、洗浄液（４００μｌ）で３回洗浄した。これに、
１００μｌのｐ‐ニトロフェニルリン酸溶液（４mg／m
l、１Ｍジエタノールアミン緩衝液に溶解）を加え、室
温で３０分間おいた後マイクロプレートリーダー（ＴＯ
ＳＯＨ製）で４０５nmの吸光度を測定した。表３試料菌量吸光度（Ｏ．Ｄ．）陰性コントロール０．０３Ｍ．ｏｒａｌｅ２５０細胞０．６０Ｍ．ｏｒａｌｅ１０００細胞０．８３

【００３４】実施例７：プローブによるマイコプラズマ
の検出マイコプラズマ・オラーレ、アコレプラズマ・ライドラ
ウィー、野生型の枯草菌および大腸菌から常法に従って
ＤＮＡを抽出した。それぞれのＤＮＡをアルカリ変性し
た後、ドットブロット装置（ＢＲＬ社製）を用いて各ド
ット１μｇずつニトロセルロース膜にドットした。ニト
ロセルロース膜を真空下８０℃で２時間乾燥し固定化し
た。次にニトロセルロース膜をビニールバッグに入れ、
６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．２％ＳＤＳ、２
００μｇ／mlニシンＤＮＡ溶液（２ml）を加え、４０℃
で１時間プレハイブリダイゼーションを行った。これ
に、実施例２で調製したビチオン標識オリゴヌクレオチ
ドプローブ（４０ng）を加え、４３℃で２時間ハイブリ
ダイゼーションを行った。ニトロセルロース膜をビニー
ルバックから取り出し、６×ＳＳＣを用いて４５℃で５
分間２回洗浄した。次に、溶液Ｉ（０．３M ＮａＣ
ｌ、０．１M Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、２mM
ＭｇＣ１_２、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で
５分間洗浄し、溶液II（３％ＢＳＡ、０．３M Ｎａ
Ｃｌ、０．１M Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、２mM
ＭｇＣ１_２、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）
を用いて３７℃で２０分間ブロッキングした。真空下８
０℃で３０分間乾燥した。次に、アルカリフォスファタ
ーゼ標識ストレプトアビジン（ＢＲＬ社製）を溶液Ｉで
１０００倍に希釈して加え、室温で１５分間反応した。
反応後溶液Ｉで３回、溶液III （０．３M ＮａＣｌ、
０．１M Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH９．５）、５．５mMＭｇ
Ｃ１_２）で１回洗浄した。さらに、発色基質として５‐
ブロモ‐４‐クロロ‐３‐インドリルりん酸Ｐ‐トルイ
ジン塩（ＢＣＩＰ）とニトロブルーテトラゾリウム（Ｎ
ＢＴ）を溶液III に溶解し（ＢＣＩＰ：１．７mg／ml、
ＮＢＴ：２．９mg／ml）、ニトロセルロース膜に加えて
発色反応を行った。その結果、マイコプラズマ・オラー
レおよびアコレプラズマ・ライドラウィーのＤＮＡをド
ットしたものではドットが青紫色を呈したが、枯草菌お
よび大腸菌のＤＮＡをドットしたものでは変化が見られ
なかった。

【００３５】

【発明の効果】本発明の核酸断片は、マイコプラズマの
ｒＲＮＡをコードする遺伝子あるいはｒＲＮＡをコード
する遺伝子の間に存在する領域（スペーサー領域）の塩
基を基本としてなっており、これらの構成塩基またはそ
の一部分の塩基配列をプローブまたはプライマーとして
使用すれば、特定のマイコプラズマあるいは群としての
マイコプラズマの検出を特異的に行うことができる。ま
た、本発明によるマイコプラズマの検出法は、上記の核
酸断片あるいはこれらの一部をプライマーまたはプロー
ブとして使用するものであり、従来法に比べ１）感度、２）特異性、３）迅速性および４）操作性の
点で優れており、臨床、公衆衛生等の分野において多大
な貢献をなすものである。

【００３６】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：３１９配列の型：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：Mycoplasma orale 配列の特徴特徴を表す記号：rRNA, 3'clip 存在位置：1..59 特徴を決定した方法：Ｓ（他の細菌の情報からの推測に
よる）特徴を表す記号：rRNA, 5'clip 存在位置：281..319 特徴を決定した方法：Ｓ（他の細菌の情報からの推測に
よる）配列 TGGGGTGAAG TCGTAACAAG GTATCCCTAC GAGAACGTGG GGATGGATTA CCTCCTTTCT 60 ACGGAGTACA ATTGAAGTTA TCCATACTTC ATAAATAGTT AATGGCCAAT ATTCGTATCA 120 GTTTGAGAGA CTATCTCTCA TTATCTTGAA CTGATAGAAC TGAATAATAT ATATCAAATT 180 AGATCAACCT ATAGATATTC AAAATATAGA GACAATACAA AAACAAAACA ATAGGTCAAA 240 AATACTTATA CGTAATTAAA ATATATAACT ATTAAATAAG CAAGAGTTTT TGGTGGATGC 300 CTTGGGTCTG GAAGTCGAT 319

【００３７】配列番号：２配列の長さ：２７３配列の型：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：Mycoplasma fermentans 配列の特徴特徴を表す記号：rRNA, 3'clip 存在位置：1..54 特徴を決定した方法：Ｓ（他の細菌の情報からの推測に
よる）特徴を表す記号：rRNA, 5'clip 存在位置：235..273 特徴を決定した方法：Ｓ（他の細菌の情報からの推測に
よる）配列 TGAAGTCGTA ACAAGGTATC CCTACGAGAA CGTGGGGATG GATCACCTCC TTTCTACGGA 60 GTACAACCTA TGGAAAAAAT ATTTGTATCC AGTTTTGAGA GATTATCTCT CGTCTTGAAC 120 TGAATATCGA CATTGATATA TTAATTAATA TTCAAAGTTT AGATCAACCA TAGAATATTT 180 ATATTTTATA AAGACAAACA ATAGGTCATA CAATTAACAA AACTATTAAA CAAGCAAGAG 240 TTTTTGGTGG ATGCCTTGGG TCTGGAAGTC GAT 273

【００３８】配列番号：３配列の長さ：４６４配列の型：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：Mycoplasma salivarium 配列の特徴特徴を表す記号：rRNA, 3'clip 存在位置：1..143 特徴を決定した方法：Ｓ（他の細菌の情報からの推測に
よる）特徴を表す記号：rRNA, 5'clip 存在位置：369..408 特徴を決定した方法：Ｓ（他の細菌の情報からの推測に
よる）配列 CCGCCCGTCA CACCATGGGA GCTGGTAATA CCCAAAGTCG GTTTGCTAAC CTCGGAGGCG 60 ACTGCCTAAG GTAGGACTGG TGACTGGGGT GAAGTCGTAA CAAGGTATCC CTACGAGAAC 120 GTGGGGATGG ATCACCTCCT TTCTACGGAG TACAAAAGAA GTTATCATAC TTCTATGACT 180 AAAGTTAATG GATTTAATAT TCGTGATCCA GTTTTGAGAG AATTATTTCT GTCTTTTGTT 240 CTTTGAAAAC TGAATTAGAC ATTGAAAAAT TATCAAATCA ATATAATATT TCAAAGTTTA 300 GATCAACCTA TAGAATATTC TAATAGACAA ACAATAGGTC ATACATTATA TTTATACTAT 360 TAAATAAGCA AGAGTTTTTG GTGGATGCCT TGGGTCTGAA AGTCGAAG 408

【００３９】配列番号：４配列の長さ：３９３配列の型：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：Mycoplasma hominis 配列の特徴特徴を表す記号：rRNA 存在位置：1..54 特徴を決定した方法：Ｓ（他の細菌の情報からの推測に
よる）特徴を表す記号：rRNA 存在位置：355..393 特徴を決定した方法：Ｓ（他の細菌の情報からの推測に
よる）配列 TGAAGTCTGA ACAAGGTATC CCTACGAGAA CGTGGGGATG GATCACCTCC TTTCTACGGA 60 GTACAAAAGA GTACTTTTAA GTACTATTAA CCTTATTTAC CTAGACCTAT TTATTATATA 120 TTTTGTATGT GCTTTATGGT CTAAGCTTAT ATCTAGTTGA GAGACATATT TTTCTCTCAT 180 TGTCTTGAAA ACTGAATAGT AAATTTTTTG ATATTTACAA CGACATCAAA ATTAAATTAA 240 ATGGTTAATT TGTTTTGATT TCATCGAGAA AATCATATTA ATTATGATTC ATTGAAATGT 300 CTTAAAATAC ACATCATAAC AAACTATAAC AATAGGAAAA TACTTTTAAA TAAGGAAGAG 360 TTTGTGGTGG ATGGCTTGGG TCTGAAAGTC GAT 393

【００４０】配列番号：５配列の長さ：３８７配列の型：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：Mycoplasma arginini 配列の特徴特徴を表す記号：rRNA, 3'clip 存在位置：1..54 特徴を決定した方法：Ｓ（他の細菌の情報からの推測に
よる）特徴を表す記号：rRNA, 5'clip 存在位置：248..387 特徴を決定した方法：Ｓ（他の細菌の情報からの推測に
よる）配列 GTGAAGTCGT AACAAGGTAT CCCTACGAGA ACGTGGGGAT GGATCACCTC CTTTCATACG 60 GAGTACATAA ATGTTATGGA AAAATTATTT GTATCCAGTT TTAGAGACCT ATCTCTCAAT 120 TTGTTCTTTG AAAACTGAAT ATCGACATTG AAAAATTAAA TTTATTAATA TTTCAAAGTT 180 TAGATCAACC TATAGAATAT ATCATACAAT AGACAAACAA TAGGTCTTAT ACTACTATTA 240 AACAAGATAA GAGTTTTTGG TGGATGCCTT GGGTCTGGAA GTCGATT 387

【００４１】配列番号：６配列の長さ：１８配列の型：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCCACGTTCT CGTAGGGA 18

【００４２】配列番号：７配列の長さ：１９配列の型：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GYTRCGGTGA ATACGTTCT 19

【００４３】配列番号：８配列の長さ：１５配列の型：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CGAGAACGTG GGGAT 15

【００４４】列番号：９配列の長さ：１９６配列の型：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Cenomic DNA 起源生物名：Mycoplasma arginini 配列 TTGAAGTTAT CCATACTTCA TAAATAGTTA ATGGCCAATA TTCGTATCAG TTTGAGAGAC 60 TATCTCTCAT TATCTTGAAC TGATAGAACT GAATAATATA TATCAAATTA GATCAACCTA 120 TAGATATTCA AAATATAGAG ACAATACAAA AACAAAACAA TAGGTCAAAA TATCTTATAC 180 GTAATTAAAA TATATA 196

【００４５】配列番号：１０配列の長さ：１６５配列の型：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Cenomic DNA 起源生物名：Mycoplasma orale 配列 CCTATGGAAA AAATATTTGT ATCCAGTTTT GAGAGATTAT CTCTCGTCTT GAACTGAATA 60 TCGACATTGA TATATTAATT AATATTCAAA GTTTAGATCA ACCATAGAAT ATTTATATTT 120 TATAAAGACA AACAATAGGT CATACAATTA ACAAAACTAT TAAAC 165

【００４６】配列番号：１１配列の長さ：２００配列の型：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Cenomic DNA 起源生物名：Mycoplasma salivarium 配列 AAGAAGTTAT CATACTTCTA TGACTAAAGT TAATGGATTT AATATTCGTG ATCCAGTTTT 60 GAGAGAATTA TTTCTGTCTT TTGTTCTTTG AAAACTGAAT TAGACATTGA AAAATTATCA 120 AATCAATATA ATATTTCAAA GTTTAGATCA ACCTATAGAA TATTCTAATA GACAAACAAT 180 AGGTCATACA TTATATTTAT 200

【００４７】配列番号：１２配列の長さ：３６１配列の型：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Cenomic DNA 起源生物名：Mycoplasma fermentans 配列 AAGAGTACTT TTAAGTACTA TTAACCTTAT TTACCTAGAC CTATTTATTA TATATTTTGT 60 ATGTGCTTTA TGGTCTAAGC TTATATCTAG TTGAGAGACA TATTTTTCTC TCATTGTCTT 120 GAAAACTGAA TAGTAAATTT TTTGATATTT ACAACGACAT CAAAATTAAA TTAAATGGTT 180 AATTTGTTTT GATTTCATCG AGAAAATCAT ATTAATTATG ATTCATTGAA ATGTCTTAAA 240 ATACACATCA TAACAAACTA TAACAATAGG AAAATACTTT TAAATAAGGA AGAGTTTGTG 300 GTGGATGGCT TGGGTCTGAA AGTCGATGAA GGACGTGATT ACCTGCGATA AGAGCTCTAG 360 A 361

【００４８】配列番号：１３配列の長さ：１９３配列の型：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Cenomic DNA 起源生物名：Mycoplasma hominis 配列 ATACGGAGTA CATAAATGTT ATGGAAAAAT TATTTGTATC CAGTTTTAGA GACCTATCTC 60 TCAATTTGTT CTTTGAAAAC TCAATATCGA CATTGAAAAA TTAAATTTAT TAATATTTCA 120 AAGTTTAGAT CAACCTATAG AATATATCAT ACAATAGACA AACAATAGGT CTTATACTAC 180 TATTAAACAA GAT 193

【００４９】配列番号：１４配列の長さ：１７配列の型：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Cenomic DNA 起源生物名：Mycoplasma arginini 配列 GACCTATCTC TCAATTT 17

【００５０】配列番号：１５配列の長さ：１７配列の型：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Cenomic DNA 起源生物名：Mycoplasma orale 配列 TAGTTAATGG CCAATAT 17

【００５１】配列番号：１６配列の長さ：１７配列の型：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Cenomic DNA 起源生物名：Mycoplasma salivarium 配列 TAAGTTAAT GGATTTA 17

【００５２】配列番号：１７配列の長さ：１７配列の型：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Cenomic DNA 起源生物名：Mycoplasma fermentans 配列 ATTATCTCTC GTCTTGA 17

【００５３】配列番号：１８配列の長さ：１７配列の型：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Cenomic DNA 起源生物名：Mycoplasma hominis 配列 CCTTATTTAC CTAGACC 17

【００５４】配列番号：１９配列の長さ：１８９配列の型：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：Mycoplasma arginini 配列の特徴特徴を表す記号：rRNA, 3'clip 存在位置：1..189 特徴を決定した方法：Ｓ（他の細菌の情報からの推測に
よる）配列 CAGATCAGCT ACGCTGGCGG TGAATACGTT CTCGGGTCTT GTACACACCG CCCGTCACAC 60 CATGGGAGCT GGTAATACCC AAAGTCGGTT AGCTAACCTC GGAGGCGACC GCCTAAGGTA 120 GGACTGGTGA CTGGGGTGAA GTCGTAACAA GGTATCCCTA CGAGAACGTG GGGATGGATC 180 ACCTCCTTT 189

【００５５】配列番号：２０配列の長さ：１８７配列の型：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：Mycoplasma orale 配列の特徴特徴を表す記号：rRNA, 3'clip 存在位置：1..187 特徴を決定した方法：Ｓ（他の細菌の情報からの推測に
よる）配列 CAGATCAGTA CGCTGCGGTG AATACGTTCT CGGGTCTTGT ACACACCGCC CGTCACACCA 60 TGGGAGCTGG TAATACCCAA AGTCGGTTTG CCAACCTCGG AGGCGACTGC CTAAGGTAGG 120 ACTGGTGACT GGGGTGAAGT CGTAACAAGG TATCCCTACG AGAACGTGGG GATGGATTAC 180 CTCCTTT 188

【００５６】配列番号：２１配列の長さ：１４２配列の型：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：Mycoplasma salivarium 配列の特徴特徴を表す記号：rRNA, 3'clip 存在位置：1..142 特徴を決定した方法：Ｓ（他の細菌の情報からの推測に
よる）配列 CCGCCCGTCA CACCATGGGA GCTGGTAATA CCCAAAGTCG GTTTGCTAAC CTCGGAGGCG 60 ACTGCCTAAG GTAGGACTGG TGACTGGGGT GAAGTCGTAA CAAGGTATCC CTACGAGAAC 120 GTGGGGATGG ATCACCTCCT TT 142

【００５７】配列番号：２２配列の長さ：１８８配列の型：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：Mycoplasma fermentans 配列の特徴特徴を表す記号：rRNA 存在位置：1..188 特徴を決定した方法：Ｓ（他の細菌の情報からの推測に
よる）配列 TAGATCNCGT ACGCTACGGT GAATACGTTC TCGGGTCTTG TACACACCGC CCGTCAAACC 60 ATGGGAGCTG GTAATACCCA AAGTCGGTTT GCTAACCTCG GAGGCGACCG CCTAAGGTAG 120 GACTGGTGAC TGGGGTGAAG TCGTAACAAG GTATCCCTAC GAGAACGTGG GGATGGATCA 180 CCTCCTTT 188

【００５８】配列番号：２３配列の長さ：１８０配列の型：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：Mycoplasma hominis 配列の特徴特徴を表す記号：rRNA, 3'clip 存在位置：1..180 特徴を決定した方法：Ｓ（他の細菌の情報からの推測に
よる）配列 CAGATCAGCT ATGCTGCGGT GAATACGTTC TCGGGTCTTG TACACACCGC CCGTCAAACC 60 ATGGGAGCTG GTAATGCCCG AAGTCGGTTT ATAAACAAAC TGCCTAAGGC AGGACTGGTG 120 ACTGGGGTTA AGTCGTAACA AGGTATCCCT ACGAGAACGT GGGGATGGAT CACCTCCTTT 180

【００５９】配列番号：２４配列の長さ：１９１配列の型：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：Acholeplasma laidlawii 配列の特徴特徴を表す記号：rRNA, 3'clip 存在位置：1..191 特徴を決定した方法：Ｓ（他の細菌の情報からの推測に
よる）配列 CAAATCAGCA TGTTGCGGTG AATACGTTCT CGGGGTTTGT ACACACCGCC CGTCAAACCA 60 CGAAAGTGGG CAATACCCAA CGCCGGTGGC CTAACCCGAA AGGGAGGGAG CCGTCTAAGG 120 TAGGGTCCAT GATTGGGGTT AAGTCGTAAC AAGGTATCCC TACGGGAACG TGGGGATGGA 180 TCACCTCCTT T 191

【００６０】配列番号：２５配列の長さ：１８８配列の型：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：Escherichia coli 配列の特徴特徴を表す記号：rRNA, 3'clip 存在位置：1..188 特徴を決定した方法：Ｓ（他の細菌の情報からの推測に
よる）配列 TGGATCAGAA TGCCACGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT ACACACCGCC CGTCACACCA 60 TGGGAGTGGG TTGCAAAAGA AGTAGGTAGC TTAACCTTCG GGAGGGCGCT TACCACTTTG 120 TGATTCATGA CTGGGGGTGA AGTCGTAACA AGGTAACCGT AGGGGAACCT GGTTGGATCA 180 CCTCCTTA 188

【００６１】配列番号：２６配列の長さ：１９０配列の型：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：Bacillus subtilis 配列の特徴特徴を表す記号：rRNA, 3'clip 存在位置：1..190 特徴を決定した方法：Ｓ（他の細菌の情報からの推測に
よる）配列 CGGATCAGCA TGCCGCGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT ACACACCGCC CGTCACACCA 60 CGAGAGTTTG TAACACCCGA AGTCGGTGAG GTAACCTTTT AGGAGCCAGC CGCCGAAGGT 120 GGGACAGATG ATTGGGGTGA AGTCGTAACA AGGTAGCCGT ATCGGAAGGT GCGGCTGGAT 180 CACCTCCTTT 190

【図面の簡単な説明】

【図１】各種マイコプラズマの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子
の一部。遺伝子中におけるプライマーの位置が＊で示さ
れており、各プライマーの塩基配列は配列番号１９〜２
６に示される配列に対応している。

【図２】図１に続く各種マイコプラズマの１６ＳｒＲ
ＮＡ遺伝子の一部。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者岡訓弘広島県高田郡甲田町下甲立1624 湧永製薬株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１〜５の配列式で示される核酸、
これらと相補的な核酸およびこれらの変異配列で示され
る核酸から選ばれる、核酸断片。
【請求項２】請求項１に記載のいずれかの核酸中の部分
配列であってプライマーまたはプローブとして利用可能
な核酸からなる、核酸断片。
【請求項３】プライマーとして利用可能な核酸が１０〜
１００塩基の長さであり、プローブとして利用可能な核
酸が７塩基の長さ〜請求項１に記載の各核酸の全塩基数
よりも少ない長さである、請求項２記載の核酸断片。
【請求項４】プライマーとして利用可能な核酸が配列番
号６の配列式で示される核酸およびその変異配列で示さ
れる核酸から選ばれる、請求項３記載の核酸断片。
【請求項５】プローブとして利用可能な核酸が下式
（１）、（２）および配列番号８の配列式示される核
酸、これらと相補的な核酸およびこれらの変異配列で示
される核酸から選ばれる、請求項３記載の核酸断片。５′ ＴＣＣＣＴＡＣ（１）５′ ＧＧＧＡＴＧＧＡ（２）
【請求項６】変異配列が、核酸の塩基配列の一部を欠失
するかまたは他の塩基もしくは塩基配列で置換もしくは
付加されたものである、請求項１〜５のいずれか１項に
記載の核酸断片。
【請求項７】請求項２〜４および６のいずれか１項に記
載の核酸断片であって標識物または（および）固相担体
と結合可能な部位が導入されていることもある核酸断片
からなるプライマー。
【請求項８】請求項１〜３、５および６のいずれか１項
に記載の核酸の塩基配列を有する核酸断片であって標識
物または（および）固相担体と結合可能な部位が導入さ
れていることもある核酸断片からなる、プローブ。
【請求項９】２種の核酸断片の組み合わせからなるプラ
イマーであって、少なくとも一方の核酸断片が請求項７
に記載の核酸断片から選ばれるものであり、それぞれの
核酸断片に標識物または（および）固相担体と結合可能
な部位が導入されていることもある、プライマー。
【請求項１０】２種の組み合わせが配列番号６および７
の配列式で示される核酸またはその変異配列で示される
核酸からなる核酸断片である、請求項９記載のプライマ
ー。（ただし、配列番号７の配列式中ＹはＣまたはＴで
あり、ＲはＧまたはＡである）
【請求項１１】配列番号７の配列式において、ＹがＣで
ＲがＧである請求項１０記載のプライマー。
【請求項１２】変異配列が核酸断片の塩基配列の一部を
欠失するか、または他の塩基もしくは塩基配列で置換も
しくは付加されたものである、請求項７〜１１のいずれ
か１項に記載のプライマー。
【請求項１３】標識物または部位が核酸断片の５′末端
側に導入されている、請求項７〜１２のいずれか１項に
記載のプライマーまたはプローブ。
【請求項１４】標識物または部位がビオチン残基、２，
４‐ジニトロフェニル基、ジゴキシゲニン残基のいずれ
かである、請求項７〜１３のいずれか１項に記載のプラ
イマーまたはプローブ。
【請求項１５】請求項７または９に記載のプライマーを
用い、下記（ａ）〜（ｄ）の工程を実施することを特徴
とする、マイコプラズマの検出法。（ａ）マイコプラズマの存在の有無を検出するための
検体を用意する。（ｂ）必要に応じて、検体について細胞破砕処理を行
う。（ｃ）検体中に上記プライマーを加えてプライマーの
伸張反応を行う。（ｄ）工程（ｃ）によって得られる伸張反応物につい
て、合成核酸鎖検出のための検出操作を行う。
【請求項１６】請求項９に記載の２種のプライマーを用
いる、請求項１５記載の検出法。
【請求項１７】２種の組み合わせが配列番号６の配列式
で示される核酸またはその変異配列からなる核酸断片と
配列番号７の配列式で示される核酸またはその変異配列
からなる核酸断片である、請求項１６記載の検出法。
（ただし、配列番号７の配列式中ＹはＣまたはＴであ
り、ＲはＧまたはＡである）
【請求項１８】配列番号７の配列式において、ＹがＣで
ＲがＧである、請求項１７記載の検出法。
【請求項１９】請求項１〜３，５または６に記載の核酸
の塩基配列を有する核酸断片の少なくとも１種をプロー
ブとして用いることを特徴とする、マイコプラズマの検
出法。
【請求項２０】請求項５に記載の配列で示される核酸、
これらと相補的な核酸およびこれらの変異配列で示され
る核酸の塩基配列を有する核酸断片の少なくとも１種を
プローブとして用いる、請求項１９記載の検出法。