JPH0588A - 新規核酸断片およびこれらを用いたマイコプラズマの検出法 - Google Patents
新規核酸断片およびこれらを用いたマイコプラズマの検出法Info
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- JPH0588A JPH0588A JP3153541A JP15354191A JPH0588A JP H0588 A JPH0588 A JP H0588A JP 3153541 A JP3153541 A JP 3153541A JP 15354191 A JP15354191 A JP 15354191A JP H0588 A JPH0588 A JP H0588A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 煩雑な操作を必要とせずにマイコプラズマを
属特異的または種特異的にしかも感度よく測定できる技
術を提供する。 【構成】 種々のマイコプラズマのrRNA遺伝子の新
規な特異的配列および共通配列を含む核酸断片およびそ
の構成塩基配列の部分配列からなる核酸断片、ならびに
これを利用したプライマーおよびプロ−ブであって標識
物または(および)固相担体と結合可能な部位が導入さ
れていることもあるプライマ−およびプロ−ブ。上記プ
ライマー、好ましくはこれを含むマイコプラズマ属に共
通性のある特定の2種の組み合わせからなるプライマ−
を用いた遺伝子増幅反応によって得られる合成核酸鎖を
検出するか、上記プローブを用いることにより、目的の
マイコプラズマ遺伝子を検出する。これにより、マイコ
プラズマが属特異的または種特異的に検出される。
属特異的または種特異的にしかも感度よく測定できる技
術を提供する。 【構成】 種々のマイコプラズマのrRNA遺伝子の新
規な特異的配列および共通配列を含む核酸断片およびそ
の構成塩基配列の部分配列からなる核酸断片、ならびに
これを利用したプライマーおよびプロ−ブであって標識
物または(および)固相担体と結合可能な部位が導入さ
れていることもあるプライマ−およびプロ−ブ。上記プ
ライマー、好ましくはこれを含むマイコプラズマ属に共
通性のある特定の2種の組み合わせからなるプライマ−
を用いた遺伝子増幅反応によって得られる合成核酸鎖を
検出するか、上記プローブを用いることにより、目的の
マイコプラズマ遺伝子を検出する。これにより、マイコ
プラズマが属特異的または種特異的に検出される。
Description
【0001】〔発明の背景〕
【産業上の利用分野】本発明は、新規核酸断片およびそ
の用途に関する。さらに詳しくは、本発明は、一種以上
のマイコプラズマを検出するためのプライマーまたはプ
ローブとして利用可能な核酸断片およびその構成塩基配
列の部分配列、およびこれらを用いた一種以上のマイコ
プラズマの検出法に関するものである。
の用途に関する。さらに詳しくは、本発明は、一種以上
のマイコプラズマを検出するためのプライマーまたはプ
ローブとして利用可能な核酸断片およびその構成塩基配
列の部分配列、およびこれらを用いた一種以上のマイコ
プラズマの検出法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】マイコプラズマの検出法としては、分離
培養法、DNA蛍光染色法、6MPDR法およびDNA
プローブ法などが知られている。分離培養法、DNA蛍
光染色法および6MPDR法は、いずれも培養操作が必
要で測定時間が長い等の問題があった。一方、DNAプ
ローブ法は、培養操作は不要であるが操作が煩雑で、か
つ測定感度に限界がある等の欠点があった〔In Vitro,1
20, 404(1984)、Science,1226, 1211(1984)〕。その
後、検出操作が簡略化された「プローブ法によるマイコ
プラズマ検出用キット〔MYCOPLASMA T.C.(Gen-Probe社
製)〕」が販売されているが、これはマイコプラズマ類
のrRNAをコードする遺伝子の共通部分に対応する塩
基配列であり、マイコプラズマを属レベルで検出するこ
とができる。しかしながら、それらの塩基配列はマイコ
プラズマ以外の原核生物のrRNAとも相同性があるた
め、必ずしも他の原核生物と区別できるというものでは
ない。また、該キットは存在するマイコプラズマのrR
NAそれ自体を直接検出するプローブに関するものであ
るため、検出感度にも問題が残されている。そこで、こ
のような問題を解決するために、2種のプライマーを用
いて検体中の目的核酸を増幅するPCR法(Polymerase
Chain Reaction Method)の利用も検討されている(特
願平2−301308号明細書)。しかし、DNAプロ
ーブ法あるいはPCR法のいずれの方法においても、特
定のマイコプラズマあるいはグループとしてのマイコプ
ラズマを検出するためのプローブまたはプライマーをい
かに選択するかが最も困難な課題になっている。従来、
マイコプラズマのrRNA遺伝子の塩基配列に関して
は、いくつかの株のある領域について決定されている
〔特開昭63−7800、Frydenberg, J.ら、DNA 4, 1
27-137(1980)、Weisburg, W.G.ら、J. Bacteriol. 171,
6455-6467(1989)〕が、これらの塩基配列の中からマイ
コプラズマと他の原核生物を厳密に区別することのでき
る配列を見いだすことはできない。 〔発明の概要〕
培養法、DNA蛍光染色法、6MPDR法およびDNA
プローブ法などが知られている。分離培養法、DNA蛍
光染色法および6MPDR法は、いずれも培養操作が必
要で測定時間が長い等の問題があった。一方、DNAプ
ローブ法は、培養操作は不要であるが操作が煩雑で、か
つ測定感度に限界がある等の欠点があった〔In Vitro,1
20, 404(1984)、Science,1226, 1211(1984)〕。その
後、検出操作が簡略化された「プローブ法によるマイコ
プラズマ検出用キット〔MYCOPLASMA T.C.(Gen-Probe社
製)〕」が販売されているが、これはマイコプラズマ類
のrRNAをコードする遺伝子の共通部分に対応する塩
基配列であり、マイコプラズマを属レベルで検出するこ
とができる。しかしながら、それらの塩基配列はマイコ
プラズマ以外の原核生物のrRNAとも相同性があるた
め、必ずしも他の原核生物と区別できるというものでは
ない。また、該キットは存在するマイコプラズマのrR
NAそれ自体を直接検出するプローブに関するものであ
るため、検出感度にも問題が残されている。そこで、こ
のような問題を解決するために、2種のプライマーを用
いて検体中の目的核酸を増幅するPCR法(Polymerase
Chain Reaction Method)の利用も検討されている(特
願平2−301308号明細書)。しかし、DNAプロ
ーブ法あるいはPCR法のいずれの方法においても、特
定のマイコプラズマあるいはグループとしてのマイコプ
ラズマを検出するためのプローブまたはプライマーをい
かに選択するかが最も困難な課題になっている。従来、
マイコプラズマのrRNA遺伝子の塩基配列に関して
は、いくつかの株のある領域について決定されている
〔特開昭63−7800、Frydenberg, J.ら、DNA 4, 1
27-137(1980)、Weisburg, W.G.ら、J. Bacteriol. 171,
6455-6467(1989)〕が、これらの塩基配列の中からマイ
コプラズマと他の原核生物を厳密に区別することのでき
る配列を見いだすことはできない。 〔発明の概要〕
【0003】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点
を解決し、煩雑な操作を必要とせずにマイコプラズマを
属特異的または種特異的にしかも感度よく測定できる技
術を提供することを目的とするものである。
を解決し、煩雑な操作を必要とせずにマイコプラズマを
属特異的または種特異的にしかも感度よく測定できる技
術を提供することを目的とするものである。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、種々検討
した結果、種々のマイコプラズマのrRNA遺伝子の特
異的配列および共通配列を見出すことにより、個々の種
のマイコプラズマあるいはグループとしてのマイコプラ
ズマの検出に用いるプローブまたはプライマーに利用可
能な核酸断片またはその構成塩基配列の部分配列等の創
製に成功し、この知見をもとに本発明を完成するに至っ
た。すなわち、本発明は、配列番号1〜5の配列式で示
される核酸、これらと相補的な核酸およびこれらの変異
配列で示される核酸から選ばれる核酸断片に関するもの
である。
した結果、種々のマイコプラズマのrRNA遺伝子の特
異的配列および共通配列を見出すことにより、個々の種
のマイコプラズマあるいはグループとしてのマイコプラ
ズマの検出に用いるプローブまたはプライマーに利用可
能な核酸断片またはその構成塩基配列の部分配列等の創
製に成功し、この知見をもとに本発明を完成するに至っ
た。すなわち、本発明は、配列番号1〜5の配列式で示
される核酸、これらと相補的な核酸およびこれらの変異
配列で示される核酸から選ばれる核酸断片に関するもの
である。
【0005】本発明は、また、上記のいずれかの核酸中
の部分配列であってプライマーまたはプローブとして利
用可能な核酸からなる核酸断片に関する。この具体的な
態様は、プライマーとして利用可能な核酸が10〜10
0塩基の長さであり、プローブとして利用可能な核酸が
7塩基の長さ〜各核酸の全塩基数よりも少ない長さの核
酸断片であり、更にこの具体的な好ましい態様は、プラ
イマーとして利用可能な核酸が配列番号6の配列式で示
される核酸およびその変異配列で示される核酸から選ば
れる核酸断片であり、プローブとして利用可能な核酸が
下式(1)、(2)および配列番号8の配列式で示され
る核酸、これらと相補的な核酸およびこれらの変異配列
で示される核酸から選ばれる核酸断片である。 5′ TCCCTAC (1) 5′ GGGATGGA (2) 本発明は、また、上記の核酸断片を利用したプライマー
に関する。すなわち、本発明によるプライマーは、上記
したような核酸断片であって標識物または(および)固
相担体と結合可能な部位が導入されていることもある核
酸断片からなるプライマーであり、この好ましい態様は
核酸断片が上記配列番号6の塩基配列で示される核酸ま
たはその変異配列で示される核酸からなるものである。
本発明による別のプライマーは、プライマーとして利用
可能な2種の核酸断片の組み合わせからなるプライマー
であって、少なくとも一方が上記したような本発明によ
る核酸断片から選ばれ、かつそれぞれの核酸断片に標識
物または(および)固相担体と結合可能な部位が導入さ
れていることもあるプライマーであり、この好ましい態
様は、2種の核酸断片の組み合わせが配列番号6の配列
式で示される核酸またはその変異配列からなる核酸断片
と配列番号7の配列式で示される核酸またはその変異配
列で示される核酸断片であるものである。本発明は、ま
た、前記の核酸断片を利用したプローブに関する。すな
わち、本発明によるプローブは、前記したような核酸断
片の塩基配列を有する核酸断片であって標識物または
(および)固相担体と結合可能な部位が導入されている
こともある核酸断片からなるプローブであり、この好ま
しい態様は、核酸断片が前記配列式(1)、(2)およ
び配列番号8で示される核酸、これらと相補的な核酸ま
たはこれらの変異配列で示される核酸からなるものであ
る。本発明は、また、上記したプライマーまたはプロー
ブを使用したマイコプラズマの検出法に関する。
の部分配列であってプライマーまたはプローブとして利
用可能な核酸からなる核酸断片に関する。この具体的な
態様は、プライマーとして利用可能な核酸が10〜10
0塩基の長さであり、プローブとして利用可能な核酸が
7塩基の長さ〜各核酸の全塩基数よりも少ない長さの核
酸断片であり、更にこの具体的な好ましい態様は、プラ
イマーとして利用可能な核酸が配列番号6の配列式で示
される核酸およびその変異配列で示される核酸から選ば
れる核酸断片であり、プローブとして利用可能な核酸が
下式(1)、(2)および配列番号8の配列式で示され
る核酸、これらと相補的な核酸およびこれらの変異配列
で示される核酸から選ばれる核酸断片である。 5′ TCCCTAC (1) 5′ GGGATGGA (2) 本発明は、また、上記の核酸断片を利用したプライマー
に関する。すなわち、本発明によるプライマーは、上記
したような核酸断片であって標識物または(および)固
相担体と結合可能な部位が導入されていることもある核
酸断片からなるプライマーであり、この好ましい態様は
核酸断片が上記配列番号6の塩基配列で示される核酸ま
たはその変異配列で示される核酸からなるものである。
本発明による別のプライマーは、プライマーとして利用
可能な2種の核酸断片の組み合わせからなるプライマー
であって、少なくとも一方が上記したような本発明によ
る核酸断片から選ばれ、かつそれぞれの核酸断片に標識
物または(および)固相担体と結合可能な部位が導入さ
れていることもあるプライマーであり、この好ましい態
様は、2種の核酸断片の組み合わせが配列番号6の配列
式で示される核酸またはその変異配列からなる核酸断片
と配列番号7の配列式で示される核酸またはその変異配
列で示される核酸断片であるものである。本発明は、ま
た、前記の核酸断片を利用したプローブに関する。すな
わち、本発明によるプローブは、前記したような核酸断
片の塩基配列を有する核酸断片であって標識物または
(および)固相担体と結合可能な部位が導入されている
こともある核酸断片からなるプローブであり、この好ま
しい態様は、核酸断片が前記配列式(1)、(2)およ
び配列番号8で示される核酸、これらと相補的な核酸ま
たはこれらの変異配列で示される核酸からなるものであ
る。本発明は、また、上記したプライマーまたはプロー
ブを使用したマイコプラズマの検出法に関する。
【0006】すなわち、プライマーを使用した本発明に
よるマイコプラズマの検出法は、上記したような本発明
によるプライマー、好ましくは2種の組み合わせからな
るプライマーを用い、下記(a)〜(d)の工程を実施
すること、を特徴とするものである。 (a) マイコプラズマの存在の有無を検出するための
検体を用意する。 (b) 必要に応じて、検体について細胞破砕処理を行
う。 (c) 検体中に上記プライマーを加えてプライマーの
伸長反応を行う。 (d) 工程(c)によって得られる伸張反応物につい
て、合成核酸鎖検出のための検出操作を行う。 また、プローブを使用した本発明によるマイコプラズマ
の検出法は、前記したようなプローブの少なくとも1種
を用いること、を特徴とするものである。また、本発明
によるもう一つのマイコプラズマの検出法は、前記した
ような核酸断片またはその部分配列であってマイコプラ
ズマの各種に特異的な核酸断片をプライマーまたはプロ
ーブとして用いること、を特徴とするものである。
よるマイコプラズマの検出法は、上記したような本発明
によるプライマー、好ましくは2種の組み合わせからな
るプライマーを用い、下記(a)〜(d)の工程を実施
すること、を特徴とするものである。 (a) マイコプラズマの存在の有無を検出するための
検体を用意する。 (b) 必要に応じて、検体について細胞破砕処理を行
う。 (c) 検体中に上記プライマーを加えてプライマーの
伸長反応を行う。 (d) 工程(c)によって得られる伸張反応物につい
て、合成核酸鎖検出のための検出操作を行う。 また、プローブを使用した本発明によるマイコプラズマ
の検出法は、前記したようなプローブの少なくとも1種
を用いること、を特徴とするものである。また、本発明
によるもう一つのマイコプラズマの検出法は、前記した
ような核酸断片またはその部分配列であってマイコプラ
ズマの各種に特異的な核酸断片をプライマーまたはプロ
ーブとして用いること、を特徴とするものである。
【0007】〔発明の具体的説明〕本発明において検出
の対象となるマイコプラズマは、マイコプラズマ類の総
称であり、具体的にはマイコプラズマ目(Mycoplasmata
les)およびアコレプラズマ目(Acholeplasmatales)に属
するマイコプラズマ類およびその突然変異株を包含する
ものである。
の対象となるマイコプラズマは、マイコプラズマ類の総
称であり、具体的にはマイコプラズマ目(Mycoplasmata
les)およびアコレプラズマ目(Acholeplasmatales)に属
するマイコプラズマ類およびその突然変異株を包含する
ものである。
【0008】核酸断片
本発明による核酸断片は、配列番号1〜5の配列式で示
される核酸、これらと相補的な核酸およびこれらの変異
配列で示される核酸から選ばれるもの、およびこれらの
核酸断片の構成塩基配列の部分配列(以後、部分塩基配
列ともいう)であってプライマーまたはプローブとして
利用可能な核酸からなるものであることは前記したとこ
ろである。上記配列番号1〜5の配列式で示される核酸
断片は、具体的にはマイコプラズマ・オラーレ、マイコ
プラズマ・ファーメンタンス、マイコプラズマ・サリバ
リウム、マイコプラズマ・ホミニスおよびマイコプラズ
マ・アルギニーニのそれぞれの16SrRNA遺伝子の
3′末端とそれに続く部分である。
される核酸、これらと相補的な核酸およびこれらの変異
配列で示される核酸から選ばれるもの、およびこれらの
核酸断片の構成塩基配列の部分配列(以後、部分塩基配
列ともいう)であってプライマーまたはプローブとして
利用可能な核酸からなるものであることは前記したとこ
ろである。上記配列番号1〜5の配列式で示される核酸
断片は、具体的にはマイコプラズマ・オラーレ、マイコ
プラズマ・ファーメンタンス、マイコプラズマ・サリバ
リウム、マイコプラズマ・ホミニスおよびマイコプラズ
マ・アルギニーニのそれぞれの16SrRNA遺伝子の
3′末端とそれに続く部分である。
【0009】これらの核酸断片は、特にプローブとし
て、また、部分塩基配列は、マイコプラズマ検出用のプ
ライマーまたはプローブとして使用することができる。
プライマーまたはプローブとして利用可能な核酸は、マ
イコプラズマを検出するためのプライマーまたはプロー
ブとして機能するものであればよい。部分塩基配列を使
用する場合には、マイコプラズマ類または個々のマイコ
プラズマ種に特異的で他の細菌、特に大腸菌、枯草菌、
緑膿菌およびブドウ球菌等に相同性の少ない部分を選択
することが好ましい。このように、これらの核酸断片か
ら各マイコプラズマ種固有あるいはマイコプラズマ類共
通の部分塩基配列を選択することにより、目的に合った
マイコプラズマ検出用のプライマーまたはプローブを調
製することができる。部分塩基配列は具体的には、プラ
イマーの場合には10〜100塩基の長さであり、プロ
ーブの場合には7塩基の長さ〜各核酸の全塩基数よりも
少ない長さのものである。たとえば、マイコプラズマ類
をグループとして検出する場合のプライマーとしては、
配列番号6の配列式で示される核酸もしくはその変異配
列を利用することができる。さらに好ましくは後述する
ように、この配列番号6の配列式および配列番号7の配
列式で示される2種の異なる核酸またはその変異配列で
示される核酸の組み合わせを利用することができる。ま
たプローブの好ましい例としては、たとえば前記式
(1)、(2)および配列番号8の配列式で示される核
酸またはこれらと相補的な核酸あるいはこれらの変異配
列からなる核酸を利用することができる。一方、個々の
マイコプラズマ種をプライマーまたはプローブで検出す
る場合、それぞれのマイコプラズマ間で塩基配列の違い
ができるだけ大きい配列を選べばよい。たとえば、下記
に示すように、配列番号9〜13、好ましくは配列番号
14〜18の配列式から選ばれる核酸またはこれらと相
補的な核酸、もしくはこれらの変異配列で示される核酸
を用いれば、それぞれのマイコプラズマ種間での区別が
可能である。 マイコプラズマ・アルギニーニ特異的:配列番号9およ
び14 マイコプラズマ・オラーレ特異的:配列番号10および
15 マイコプラズマ・サリバリウム特異的:配列番号11お
よび16 マイコプラズマ・ファーメンタンス特異的:配列番号1
2および17 マイコプラズマ・ホミニス特異的:配列番号13および
18
て、また、部分塩基配列は、マイコプラズマ検出用のプ
ライマーまたはプローブとして使用することができる。
プライマーまたはプローブとして利用可能な核酸は、マ
イコプラズマを検出するためのプライマーまたはプロー
ブとして機能するものであればよい。部分塩基配列を使
用する場合には、マイコプラズマ類または個々のマイコ
プラズマ種に特異的で他の細菌、特に大腸菌、枯草菌、
緑膿菌およびブドウ球菌等に相同性の少ない部分を選択
することが好ましい。このように、これらの核酸断片か
ら各マイコプラズマ種固有あるいはマイコプラズマ類共
通の部分塩基配列を選択することにより、目的に合った
マイコプラズマ検出用のプライマーまたはプローブを調
製することができる。部分塩基配列は具体的には、プラ
イマーの場合には10〜100塩基の長さであり、プロ
ーブの場合には7塩基の長さ〜各核酸の全塩基数よりも
少ない長さのものである。たとえば、マイコプラズマ類
をグループとして検出する場合のプライマーとしては、
配列番号6の配列式で示される核酸もしくはその変異配
列を利用することができる。さらに好ましくは後述する
ように、この配列番号6の配列式および配列番号7の配
列式で示される2種の異なる核酸またはその変異配列で
示される核酸の組み合わせを利用することができる。ま
たプローブの好ましい例としては、たとえば前記式
(1)、(2)および配列番号8の配列式で示される核
酸またはこれらと相補的な核酸あるいはこれらの変異配
列からなる核酸を利用することができる。一方、個々の
マイコプラズマ種をプライマーまたはプローブで検出す
る場合、それぞれのマイコプラズマ間で塩基配列の違い
ができるだけ大きい配列を選べばよい。たとえば、下記
に示すように、配列番号9〜13、好ましくは配列番号
14〜18の配列式から選ばれる核酸またはこれらと相
補的な核酸、もしくはこれらの変異配列で示される核酸
を用いれば、それぞれのマイコプラズマ種間での区別が
可能である。 マイコプラズマ・アルギニーニ特異的:配列番号9およ
び14 マイコプラズマ・オラーレ特異的:配列番号10および
15 マイコプラズマ・サリバリウム特異的:配列番号11お
よび16 マイコプラズマ・ファーメンタンス特異的:配列番号1
2および17 マイコプラズマ・ホミニス特異的:配列番号13および
18
【0010】これらの核酸断片あるいはその部分塩基配
列は、合目的的な任意の方法によって調製することがで
き、たとえば後記実施例に記載されたような方法に従っ
てその全部または一部を化学合成してもよいし、また、
例えばマイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・フ
ァーメンタンス、マイコプラズマ・ホミニス、マイコプ
ラズマ・サリバリウムの遺伝子から直接酵素的に切り出
してもよいし、それらの遺伝子を細菌のプラスミドにク
ローニングし、細菌を増殖した後、切り出してもよい。
列は、合目的的な任意の方法によって調製することがで
き、たとえば後記実施例に記載されたような方法に従っ
てその全部または一部を化学合成してもよいし、また、
例えばマイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・フ
ァーメンタンス、マイコプラズマ・ホミニス、マイコプ
ラズマ・サリバリウムの遺伝子から直接酵素的に切り出
してもよいし、それらの遺伝子を細菌のプラスミドにク
ローニングし、細菌を増殖した後、切り出してもよい。
【0011】本発明による上記核酸断片(部分塩基配列
をも包含する)における変異配列としては、例えば、該
核酸断片の一部の塩基もしくは塩基配列を欠失させる
か、または他の塩基もしくは塩基配列で置換させたも
の、もしくは他の塩基もしくは塩基配列を付加させたも
の、さらにはマイコプラズマの突然変異株の同遺伝子に
対応する塩基配列に変換したもの等があげられる。ただ
し、核酸断片をプライマーとして利用する場合、プライ
マーの伸張反応の効率に大きく影響を与えると思われる
プライマーの3′末端付近については、変異がないよう
にするか、あるいはあっても最小限にとどめることが好
ましく、より好適には5′末端付近で変異があるように
する。
をも包含する)における変異配列としては、例えば、該
核酸断片の一部の塩基もしくは塩基配列を欠失させる
か、または他の塩基もしくは塩基配列で置換させたも
の、もしくは他の塩基もしくは塩基配列を付加させたも
の、さらにはマイコプラズマの突然変異株の同遺伝子に
対応する塩基配列に変換したもの等があげられる。ただ
し、核酸断片をプライマーとして利用する場合、プライ
マーの伸張反応の効率に大きく影響を与えると思われる
プライマーの3′末端付近については、変異がないよう
にするか、あるいはあっても最小限にとどめることが好
ましく、より好適には5′末端付近で変異があるように
する。
【0012】このような、プライマーまたはプローブと
して利用可能な核酸断片またはその部分塩基配列は、必
要に応じて後述するように標識物または固相担体と結合
可能な部位が導入されていてもよい。特に、マイコプラ
ズマ検出用プライマーとして2種の異なるプライマーを
利用する場合、標識物または固相担体と結合可能な部位
が導入されるべきプライマーの位置は、プライマーの伸
張反応を妨げない位置であればどこでもよいが、好まし
くは5′末端である。また、プローブとして利用する場
合の標識物または固相担体を結合可能な部位が導入され
る位置は5′末端や3′末端の水酸基部分さらには塩基
部分やリン酸ジエステル部分などが考えられるが、プロ
ーブの塩基配列や長さなどを考慮してハイブリダイゼー
ションの妨げにならないようにすることが望ましい。
して利用可能な核酸断片またはその部分塩基配列は、必
要に応じて後述するように標識物または固相担体と結合
可能な部位が導入されていてもよい。特に、マイコプラ
ズマ検出用プライマーとして2種の異なるプライマーを
利用する場合、標識物または固相担体と結合可能な部位
が導入されるべきプライマーの位置は、プライマーの伸
張反応を妨げない位置であればどこでもよいが、好まし
くは5′末端である。また、プローブとして利用する場
合の標識物または固相担体を結合可能な部位が導入され
る位置は5′末端や3′末端の水酸基部分さらには塩基
部分やリン酸ジエステル部分などが考えられるが、プロ
ーブの塩基配列や長さなどを考慮してハイブリダイゼー
ションの妨げにならないようにすることが望ましい。
【0013】標識物および固相担体と結合可能な部位
上記核酸をプローブまたはプライマーとして利用する場
合、標識物としては、非放射性、放射性物質のどちらを
用いてもよいが、好ましくは非放射性物質である。非放
射性の標識物としては、直接標識可能なものとして蛍光
物質〔例えばフルオレッセイン誘導体(フルオレッセイ
ンイソチオシアネート等)、ローダミンおよびその誘導
体(テトラメチルローダミンイソチオシアネート
等)〕、化学発光物質(例えばアクリジン等)や遅延蛍
光を発する物質(DTTA:ファルマ社製)等があげら
れる。また、標識物と特異的に結合する物質を利用すれ
ば間接的に標識物を検出することができる。こうした場
合の標識物としては、ビオチンあるいはハプテン等があ
げられ、ビオチンの場合には、これに特異的に結合する
アビジンあるいはストレプトアビジンが、ハプテンの場
合は、これに特異的に結合する抗体が利用できる。ハプ
テンとしては2,4‐ジニトロフェニル基を有する化合
物やジゴキシゲニンを使うことができ、さらにはビオチ
ンあるいは蛍光物質などもハプテンとして使用すること
ができる。これらの標識物はいずれも単独または必要が
あれば複数種の組み合わせで公知手段(特開昭59−9
3099号、特開昭59−148798号、特開昭59
−204200号各公報参照)により、プライマーまた
はプローブに導入することができる。
合、標識物としては、非放射性、放射性物質のどちらを
用いてもよいが、好ましくは非放射性物質である。非放
射性の標識物としては、直接標識可能なものとして蛍光
物質〔例えばフルオレッセイン誘導体(フルオレッセイ
ンイソチオシアネート等)、ローダミンおよびその誘導
体(テトラメチルローダミンイソチオシアネート
等)〕、化学発光物質(例えばアクリジン等)や遅延蛍
光を発する物質(DTTA:ファルマ社製)等があげら
れる。また、標識物と特異的に結合する物質を利用すれ
ば間接的に標識物を検出することができる。こうした場
合の標識物としては、ビオチンあるいはハプテン等があ
げられ、ビオチンの場合には、これに特異的に結合する
アビジンあるいはストレプトアビジンが、ハプテンの場
合は、これに特異的に結合する抗体が利用できる。ハプ
テンとしては2,4‐ジニトロフェニル基を有する化合
物やジゴキシゲニンを使うことができ、さらにはビオチ
ンあるいは蛍光物質などもハプテンとして使用すること
ができる。これらの標識物はいずれも単独または必要が
あれば複数種の組み合わせで公知手段(特開昭59−9
3099号、特開昭59−148798号、特開昭59
−204200号各公報参照)により、プライマーまた
はプローブに導入することができる。
【0014】一方、サンドイッチハイブリダイゼーショ
ンや後述するマイコプラズマの検出法においては核酸の
特定の断片を固相担体に特異的に結合する必要がある
が、そのような場合、固相担体と結合可能な部位は、該
担体と選択的に結合可能なものであれば何であってもよ
い。その一例としては、上記非放射性標識物質を利用す
ることもできる。その好ましい具体例としては、ビオチ
ン、あるいはフルオレッセインなどの蛍光物質または
2,4‐ジニトロフェニル基を有する化合物あるいはジ
ゴキシゲニンなどのハプテンがあげられ、これらは単独
または必要があれば複数種の組み合わせであらかじめプ
ライマーまたはプローブに導入しておくことができる。
ンや後述するマイコプラズマの検出法においては核酸の
特定の断片を固相担体に特異的に結合する必要がある
が、そのような場合、固相担体と結合可能な部位は、該
担体と選択的に結合可能なものであれば何であってもよ
い。その一例としては、上記非放射性標識物質を利用す
ることもできる。その好ましい具体例としては、ビオチ
ン、あるいはフルオレッセインなどの蛍光物質または
2,4‐ジニトロフェニル基を有する化合物あるいはジ
ゴキシゲニンなどのハプテンがあげられ、これらは単独
または必要があれば複数種の組み合わせであらかじめプ
ライマーまたはプローブに導入しておくことができる。
【0015】プローブを用いた検出法
プローブを用いた本発明によるマイコプラズマの検出法
は、前記核酸断片の塩基配列を有する核酸断片であって
標識物または(および)固相担体と結合可能な部位が導
入されていることもある核酸断片からなるプローブの少
なくとも1種を用いることを特徴とするものであり、好
ましい例は核酸断片の塩基配列が式(1)、(2)およ
び配列番号8の配列式で示されるものであることは前記
したところである。一般的にプローブを用いた検出法に
はドットハイブリダイゼーションやサザンハイブリダイ
ゼーションがあり(B. D. Hames およびS. J. Higgins;
Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach,
IRL Rress,1985)、上記標識核酸断片を使用して常法通
りハイブリダイゼーションを行うことができる。一方、
コーンらはハイブリダイゼーションの感度を高めるため
に1細胞あたり多コピー存在するリボソームRNAを検
出する方法を開発しているが(特開昭60−50133
9)、本発明における核酸断片もリボソームRNAをコ
ードする領域を含んでいる遺伝子であり、同様にリボソ
ームRNAの検出に利用することができる。また、ハイ
ブリダイゼーション操作を容易にするためにサンドイッ
チハイブリダイゼーションを基本とする方法が開発され
ているが(Morrissey, D. V.ら、Molecular and Cellul
ar Probes, 13, 189-207(1989))、これらの方法におい
ても本発明における核酸断片を利用してマイコプラズマ
の検出を行うことができる。
は、前記核酸断片の塩基配列を有する核酸断片であって
標識物または(および)固相担体と結合可能な部位が導
入されていることもある核酸断片からなるプローブの少
なくとも1種を用いることを特徴とするものであり、好
ましい例は核酸断片の塩基配列が式(1)、(2)およ
び配列番号8の配列式で示されるものであることは前記
したところである。一般的にプローブを用いた検出法に
はドットハイブリダイゼーションやサザンハイブリダイ
ゼーションがあり(B. D. Hames およびS. J. Higgins;
Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach,
IRL Rress,1985)、上記標識核酸断片を使用して常法通
りハイブリダイゼーションを行うことができる。一方、
コーンらはハイブリダイゼーションの感度を高めるため
に1細胞あたり多コピー存在するリボソームRNAを検
出する方法を開発しているが(特開昭60−50133
9)、本発明における核酸断片もリボソームRNAをコ
ードする領域を含んでいる遺伝子であり、同様にリボソ
ームRNAの検出に利用することができる。また、ハイ
ブリダイゼーション操作を容易にするためにサンドイッ
チハイブリダイゼーションを基本とする方法が開発され
ているが(Morrissey, D. V.ら、Molecular and Cellul
ar Probes, 13, 189-207(1989))、これらの方法におい
ても本発明における核酸断片を利用してマイコプラズマ
の検出を行うことができる。
【0016】プライマーを用いた検出法
プライマーを用いた本発明によるマイコプラズマの検出
法は、前記核酸断片の塩基配列を有する核酸断片であっ
て標識物または(および)固相担体と結合可能な部位が
導入されていることもある核酸断片からなるプライマー
の少なくとも1種を用いることを特徴とするものであ
り、好ましい例は、後述するように2種の異なるプライ
マーによる遺伝子増幅反応(以下、PCR法と略す)を
利用する検出法である。試料中の微量の核酸断片を増幅
するPCR法(Polymerase Chain ReactionMethod)が
開発され(特開昭61−274697号、特開昭63−
102677号)たが、この方法により増幅された核酸
断片の検出には電気泳動、あるいはハイブリダイゼーシ
ョンなどの煩雑な操作を用いることが多い。この点を解
決するために、遺伝子の増幅反応においてそれぞれのプ
ライマーに別々の標識を導入し、増幅反応後生成物を固
相担体に吸着し、生成物を選択的に検出する方法が開発
されている(特開平1−252300号、ケンプら、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2433-2427 (1980))。
また、遺伝子の増幅法にはQβレプリカーゼを用いる方
法〔リザルディーら、Bio/Technology,6,1197(1988)〕
なども考案されている。本発明による核酸断片は、上述
のような遺伝子増幅のプライマーなどに利用するのに十
分な長さおよび塩基配列であり、これを用いて遺伝子増
幅を行うことによりマイコプラズマ類の簡便な検出を行
うことができる。
法は、前記核酸断片の塩基配列を有する核酸断片であっ
て標識物または(および)固相担体と結合可能な部位が
導入されていることもある核酸断片からなるプライマー
の少なくとも1種を用いることを特徴とするものであ
り、好ましい例は、後述するように2種の異なるプライ
マーによる遺伝子増幅反応(以下、PCR法と略す)を
利用する検出法である。試料中の微量の核酸断片を増幅
するPCR法(Polymerase Chain ReactionMethod)が
開発され(特開昭61−274697号、特開昭63−
102677号)たが、この方法により増幅された核酸
断片の検出には電気泳動、あるいはハイブリダイゼーシ
ョンなどの煩雑な操作を用いることが多い。この点を解
決するために、遺伝子の増幅反応においてそれぞれのプ
ライマーに別々の標識を導入し、増幅反応後生成物を固
相担体に吸着し、生成物を選択的に検出する方法が開発
されている(特開平1−252300号、ケンプら、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2433-2427 (1980))。
また、遺伝子の増幅法にはQβレプリカーゼを用いる方
法〔リザルディーら、Bio/Technology,6,1197(1988)〕
なども考案されている。本発明による核酸断片は、上述
のような遺伝子増幅のプライマーなどに利用するのに十
分な長さおよび塩基配列であり、これを用いて遺伝子増
幅を行うことによりマイコプラズマ類の簡便な検出を行
うことができる。
【0017】1)プライマー
本発明によるマイコプラズマ検出用のプライマーは、基
本的には前記したように塩基配列が配列番号1〜5のい
ずれかの核酸の部分配列またはその異変配列もしくはそ
の相補的な配列であり、好ましくは配列番号6で示され
る核酸断片であって、標識物または(および)固相担体
と結合可能な部位が導入されていることもある核酸断片
である。また、本発明による別のプライマーは2種の核
酸断片の組み合わせからなるプライマーであって、一方
の核酸断片は塩基配列が配列番号1〜5のいずれかの核
酸の部分配列またはその変異配列もしくはその相補的な
配列であり好ましくは配列番号6で示される核酸断片で
あって、他方の核酸断片は塩基配列がマイコプラズマ遺
伝子における上記核酸断片に相当する部位とは重ならな
い部位から選ばれる核酸断片である。この2種類の核酸
断片に相当する塩基配列はマイコプラズマ遺伝子のDN
A(二本鎖)上ではそれぞれ別の鎖に位置するものであ
り、さらにお互いの距離はDNAポリメラーゼによる伸
長方向(5´から3´への方向)2000塩基以内であ
ることが望ましい。また、この2種の組み合わせからな
るプライマーは、それぞれの核酸断片に(すなわち(後
述する2種のプライマーの形態の具体例にも示すよう
に)2種の核酸断片のそれぞれに互いに無関係にもしく
は独立した形で)標識物または(および)固相担体と結
合可能な部位が導入されていることもあるオリゴヌクレ
オチドからなるものであり、この好ましい態様は、2種
の組み合わせが上記配列番号6の配列式で示される核酸
またはその変異配列からなる核酸断片と上記配列番号7
の配列式で示される核酸またはその変異配列で示される
核酸断片であるものであることは前記したところである
(以下、塩基配列が配列番号6で示されるプライマーを
プライマー(1´)、また配列番号7で示されるプライ
マーをプライマー(2´)ともいう)。
本的には前記したように塩基配列が配列番号1〜5のい
ずれかの核酸の部分配列またはその異変配列もしくはそ
の相補的な配列であり、好ましくは配列番号6で示され
る核酸断片であって、標識物または(および)固相担体
と結合可能な部位が導入されていることもある核酸断片
である。また、本発明による別のプライマーは2種の核
酸断片の組み合わせからなるプライマーであって、一方
の核酸断片は塩基配列が配列番号1〜5のいずれかの核
酸の部分配列またはその変異配列もしくはその相補的な
配列であり好ましくは配列番号6で示される核酸断片で
あって、他方の核酸断片は塩基配列がマイコプラズマ遺
伝子における上記核酸断片に相当する部位とは重ならな
い部位から選ばれる核酸断片である。この2種類の核酸
断片に相当する塩基配列はマイコプラズマ遺伝子のDN
A(二本鎖)上ではそれぞれ別の鎖に位置するものであ
り、さらにお互いの距離はDNAポリメラーゼによる伸
長方向(5´から3´への方向)2000塩基以内であ
ることが望ましい。また、この2種の組み合わせからな
るプライマーは、それぞれの核酸断片に(すなわち(後
述する2種のプライマーの形態の具体例にも示すよう
に)2種の核酸断片のそれぞれに互いに無関係にもしく
は独立した形で)標識物または(および)固相担体と結
合可能な部位が導入されていることもあるオリゴヌクレ
オチドからなるものであり、この好ましい態様は、2種
の組み合わせが上記配列番号6の配列式で示される核酸
またはその変異配列からなる核酸断片と上記配列番号7
の配列式で示される核酸またはその変異配列で示される
核酸断片であるものであることは前記したところである
(以下、塩基配列が配列番号6で示されるプライマーを
プライマー(1´)、また配列番号7で示されるプライ
マーをプライマー(2´)ともいう)。
【0018】プライマー(1′)は、本発明による核酸
断片から選ばれたもので、マイコプラズマの16SrR
NAをコードする遺伝子(16S rRNA遺伝子)の
マイナス鎖の一部に相当し、マイコプラズマ・オラーレ
(Mycoplasma(M.) orale)、マイコプラズマ・アルギニ
ーニ(M. arginini)、マイコプラズマ・ホミニス(M.ho
minis)、マイコプラズマ・サリバリウム(M. salivari
um)およびマイコプラズマ・ファーメンタンス(M. ferm
entans)の種では完全に共通であり、アコレプラズマ・
ライドラウィー(Acholeplasma laidlawii)とは1塩基
のみが異なる。(図1および2の塩基配列(配列番号1
9〜26)参照))。また、プライマー(2′)は、1
6SrRNA遺伝子において上記プライマー(1′)に
相当する部分より上流で、この遺伝子のプラス鎖の一部
に相当し、マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ
・アルギニーニ、マイコプラズマ・ホミニスの種では完
全に共通であり、マイコプラズマ・ファーメンタンスお
よびアコレプラズマ・ライドラウィーの種では1塩基異
なるのみの配列である。さらに、プライマー(1′)は
大腸菌(E. coli)および枯草菌(B. subtilis)の相当す
る部分とは3′末端の1塩基の違いも含めて3塩基ある
いは4塩基の違いがあり、プライマー(2′)は大腸菌
あるいは枯草菌の相当する部分と3′末端の1塩基の違
いも含めて3塩基あるいは2塩基の違いがある(図1お
よび2の塩基配列(配列番号19〜26参照)。
断片から選ばれたもので、マイコプラズマの16SrR
NAをコードする遺伝子(16S rRNA遺伝子)の
マイナス鎖の一部に相当し、マイコプラズマ・オラーレ
(Mycoplasma(M.) orale)、マイコプラズマ・アルギニ
ーニ(M. arginini)、マイコプラズマ・ホミニス(M.ho
minis)、マイコプラズマ・サリバリウム(M. salivari
um)およびマイコプラズマ・ファーメンタンス(M. ferm
entans)の種では完全に共通であり、アコレプラズマ・
ライドラウィー(Acholeplasma laidlawii)とは1塩基
のみが異なる。(図1および2の塩基配列(配列番号1
9〜26)参照))。また、プライマー(2′)は、1
6SrRNA遺伝子において上記プライマー(1′)に
相当する部分より上流で、この遺伝子のプラス鎖の一部
に相当し、マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ
・アルギニーニ、マイコプラズマ・ホミニスの種では完
全に共通であり、マイコプラズマ・ファーメンタンスお
よびアコレプラズマ・ライドラウィーの種では1塩基異
なるのみの配列である。さらに、プライマー(1′)は
大腸菌(E. coli)および枯草菌(B. subtilis)の相当す
る部分とは3′末端の1塩基の違いも含めて3塩基ある
いは4塩基の違いがあり、プライマー(2′)は大腸菌
あるいは枯草菌の相当する部分と3′末端の1塩基の違
いも含めて3塩基あるいは2塩基の違いがある(図1お
よび2の塩基配列(配列番号19〜26参照)。
【0019】このような上記プライマーの組み合わせを
用いることによって、特にマイコプラズマを群特異的に
検出することが可能になる。このような基本的な2種の
プライマーの形態の具体例としては、例えば、(i) 2
種のプライマーとも何も修飾されていないもの、(ii)
2種のプライマーのうち少なくとも一方に検出可能な標
識または固相担体と結合可能な部分が導入されたもの、
(iii) 2種のプライマーのうち、少なくとも一方に検
出可能な標識および固相担体と結合可能な部位が導入さ
れたもの、(iv) 2種のプライマーのうちの一方が固相
担体と結合可能な部位を有し、他方に標識物が導入され
たもの、などがあげられ、前記核酸断片の項で記述した
ような標識あるいは固相担体と結合可能な部位を導入す
ればよい。
用いることによって、特にマイコプラズマを群特異的に
検出することが可能になる。このような基本的な2種の
プライマーの形態の具体例としては、例えば、(i) 2
種のプライマーとも何も修飾されていないもの、(ii)
2種のプライマーのうち少なくとも一方に検出可能な標
識または固相担体と結合可能な部分が導入されたもの、
(iii) 2種のプライマーのうち、少なくとも一方に検
出可能な標識および固相担体と結合可能な部位が導入さ
れたもの、(iv) 2種のプライマーのうちの一方が固相
担体と結合可能な部位を有し、他方に標識物が導入され
たもの、などがあげられ、前記核酸断片の項で記述した
ような標識あるいは固相担体と結合可能な部位を導入す
ればよい。
【0020】2)固相担体
ここでいう固相担体は、反応に使用する溶媒およびすべ
ての試薬に対して不活性でかつ何らかの方法で該試薬溶
液と分離でき、なおかつ上記部位と選択的に結合可能な
ものである。このようなものとしては、ミクロタイター
ウェル、ポリスチレンボール、アガロースビーズ、ポリ
アクリルビーズなどの固相材料に、上記部位を捕捉可能
なストレプトアビジンまたは抗体などを導入したものが
あげられる。例えば、ビオチンが導入されたプライマー
からのPCR生成物を捕捉するには、ストレプトアビジ
ンを固相に結合した担体を、また、フルオレッセイン残
基や、2,4‐ジニトロフェニル基が導入されたプライ
マーからのPCR生成物に対しては、それぞれに対する
抗体を固相に結合した担体を用いることができる。
ての試薬に対して不活性でかつ何らかの方法で該試薬溶
液と分離でき、なおかつ上記部位と選択的に結合可能な
ものである。このようなものとしては、ミクロタイター
ウェル、ポリスチレンボール、アガロースビーズ、ポリ
アクリルビーズなどの固相材料に、上記部位を捕捉可能
なストレプトアビジンまたは抗体などを導入したものが
あげられる。例えば、ビオチンが導入されたプライマー
からのPCR生成物を捕捉するには、ストレプトアビジ
ンを固相に結合した担体を、また、フルオレッセイン残
基や、2,4‐ジニトロフェニル基が導入されたプライ
マーからのPCR生成物に対しては、それぞれに対する
抗体を固相に結合した担体を用いることができる。
【0021】3)検出法
本発明によるマイコプラズマの検出法は、前記したよう
な本発明によるプライマー、好ましくは上記2種の組み
合わせからなるプライマーを用いて、基本的には、
(a) マイコプラズマの存在の有無を検出するための
検体を用意する、(b) 必要に応じて、検体について
細胞破壊処理を行う、(c) 検体中に上記プライマー
を加えてプライマーの伸張反応を行う、(d) 工程
(c)によって得られる伸張反応物について、合成核酸
鎖検出のための検出操作を行う、ことにより実施でき、
伸張反応によって目的とするマイコプラズマの遺伝子を
増幅し、この増幅された伸張反応物(合成核酸鎖)を公
知の合成核酸鎖検出法によって検出し、もってマイコプ
ラズマ類の存在を確認することを基本原理とするもので
ある。
な本発明によるプライマー、好ましくは上記2種の組み
合わせからなるプライマーを用いて、基本的には、
(a) マイコプラズマの存在の有無を検出するための
検体を用意する、(b) 必要に応じて、検体について
細胞破壊処理を行う、(c) 検体中に上記プライマー
を加えてプライマーの伸張反応を行う、(d) 工程
(c)によって得られる伸張反応物について、合成核酸
鎖検出のための検出操作を行う、ことにより実施でき、
伸張反応によって目的とするマイコプラズマの遺伝子を
増幅し、この増幅された伸張反応物(合成核酸鎖)を公
知の合成核酸鎖検出法によって検出し、もってマイコプ
ラズマ類の存在を確認することを基本原理とするもので
ある。
【0022】(1)検体の準備および前処理
まず、目的のマイコプラズマの存在の有無を検知しよう
とする検体を用意する。検体としては、たとえば動物細
胞培養液、培養細胞などがあげられる。検体は、必要に
応じて、遠心分離操作等により沈渣として濃縮した後、
例えば、酵素処理、熱処理、界面活性剤処理、超音波処
理、あるいはこれらの組合せ等による細胞破壊処理をあ
らかじめ施したものを使用することができる。この細胞
破壊処理は、マイコプラズマが動物細胞などから遊離し
ている場合、あるいは動物細胞などに取り込まれている
場合のいずれについても、マイコプラズマDNAを顕在
化せしめる目的で行われる。その具体的な方法について
は一般的な文献、たとえばPCR PROTOCOLS, Academic Pr
ess Inc., P14, P352(1989) などを参照されたい。
とする検体を用意する。検体としては、たとえば動物細
胞培養液、培養細胞などがあげられる。検体は、必要に
応じて、遠心分離操作等により沈渣として濃縮した後、
例えば、酵素処理、熱処理、界面活性剤処理、超音波処
理、あるいはこれらの組合せ等による細胞破壊処理をあ
らかじめ施したものを使用することができる。この細胞
破壊処理は、マイコプラズマが動物細胞などから遊離し
ている場合、あるいは動物細胞などに取り込まれている
場合のいずれについても、マイコプラズマDNAを顕在
化せしめる目的で行われる。その具体的な方法について
は一般的な文献、たとえばPCR PROTOCOLS, Academic Pr
ess Inc., P14, P352(1989) などを参照されたい。
【0023】(2)プライマーの伸長反応
上記検体に本発明のプライマーを加えることにより、検
体中にマイコプラズマが存在すれば(すなわち前記rR
NA遺伝子、またはrRNAが存在すれば)、プライマ
ーの伸張反応を行うことができる。プライマーの伸張反
応は、4種類のヌクレオチド三リン酸(デオキシアデノ
シン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシ
シチジン三リン酸およびチミジン三リン酸(これらの混
合物をdNTPということもある)を基質として該プラ
イマーに取り込ませることにより実施できる。この伸張
反応にはE.coliDNAポリメラーゼI、E.coliDN
AポリメラーゼIのクレノウ断片、T4DNAポリメラ
ーゼ、などが使用される。特に、Taqポリメラーゼの
ような高温で伸張反応を行える耐熱酵素を用いればプラ
イマーによる標的配列認識の特異性を高めることもでき
る(詳細は特開平1−314965および1−2523
00号参照)。本発明による2種類のプライマーを用い
て伸張反応をくり返すこと(増幅反応)により、目的と
するマイコプラズマ遺伝子を効率的に増幅させることが
できる。伸張反応の更に具体的な方法については、実験
医学、羊土社、8.No.9(1990)、あるいはPCR Technolo
gy, Stockton press(1989)を参照されたい。
体中にマイコプラズマが存在すれば(すなわち前記rR
NA遺伝子、またはrRNAが存在すれば)、プライマ
ーの伸張反応を行うことができる。プライマーの伸張反
応は、4種類のヌクレオチド三リン酸(デオキシアデノ
シン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシ
シチジン三リン酸およびチミジン三リン酸(これらの混
合物をdNTPということもある)を基質として該プラ
イマーに取り込ませることにより実施できる。この伸張
反応にはE.coliDNAポリメラーゼI、E.coliDN
AポリメラーゼIのクレノウ断片、T4DNAポリメラ
ーゼ、などが使用される。特に、Taqポリメラーゼの
ような高温で伸張反応を行える耐熱酵素を用いればプラ
イマーによる標的配列認識の特異性を高めることもでき
る(詳細は特開平1−314965および1−2523
00号参照)。本発明による2種類のプライマーを用い
て伸張反応をくり返すこと(増幅反応)により、目的と
するマイコプラズマ遺伝子を効率的に増幅させることが
できる。伸張反応の更に具体的な方法については、実験
医学、羊土社、8.No.9(1990)、あるいはPCR Technolo
gy, Stockton press(1989)を参照されたい。
【0024】(3)検 出
PCR法等により増幅された核酸の好ましい検出方法
は、上記プライマーの伸張反応物、すなわち合成核酸鎖
の種類もしくは形態により異なる。一般的には、二重鎖
となる合成核酸鎖を検出する電気泳動法(Saiki, R. K.
et al., Science,230,1350-1354(1985))、あるいは標識
プローブを用いるドットハイブリダイゼーション法(Sa
iki, R. K.et al., Nature, 324, 163-166(1986))等に
より検出することができる。
は、上記プライマーの伸張反応物、すなわち合成核酸鎖
の種類もしくは形態により異なる。一般的には、二重鎖
となる合成核酸鎖を検出する電気泳動法(Saiki, R. K.
et al., Science,230,1350-1354(1985))、あるいは標識
プローブを用いるドットハイブリダイゼーション法(Sa
iki, R. K.et al., Nature, 324, 163-166(1986))等に
より検出することができる。
【0025】合成核酸鎖に標識物質が導入されている場
合は、固相担体に固定したプローブと該標識合成核酸鎖
をハイブリダズさせるリバースドットハイブリダイゼー
ション法(Saiki, R. K.et al., Proc. Natl. Acad.Sc
i.USA,86,6230-6234(1989)、特願平2−170684号
参照)、あるいは固体吸着剤を用いたカラム法(特開平
1−314965号参照)等によっても、核酸を検出す
ることができる。また、双方のプライマーに固相担体と
結合可能な部位が導入されているものを用いて、PCR
法により増幅反応を行った場合には、増幅された核酸の
好ましい検出方法としては、固相担体の代わりに固相単
体と結合可能な部位と特異的に結合可能な微粒子(たと
えば、蛋白質、ラテックス等)を該増幅反応液中に加え
る方法があげられるが、この方法を用いることにより目
的とする核酸を凝集あるいは沈殿の有無により判定する
こともできる。また、特開平1−252300号記載の
方法によれば、さらに容易に核酸を検出することもでき
る。すなわち、一方のプライマーに固相担体と結合可能
な部位を、他方のプライマーに標識物を導入したものを
用い、伸張反応を行った反応物を固相担体と接触させた
後、不純物を適当な溶媒で洗浄除去する方法がある。こ
の方法では該固相担体と結合可能な部位を持つプライマ
ーから伸張した合成核酸鎖は、もう一方の標識物が導入
されたプライマーから伸張された合成核酸鎖と二重鎖を
組んでおり、目的核酸は標識物を持つ形で該固相担体に
固定され、特異的に検出されることになる。
合は、固相担体に固定したプローブと該標識合成核酸鎖
をハイブリダズさせるリバースドットハイブリダイゼー
ション法(Saiki, R. K.et al., Proc. Natl. Acad.Sc
i.USA,86,6230-6234(1989)、特願平2−170684号
参照)、あるいは固体吸着剤を用いたカラム法(特開平
1−314965号参照)等によっても、核酸を検出す
ることができる。また、双方のプライマーに固相担体と
結合可能な部位が導入されているものを用いて、PCR
法により増幅反応を行った場合には、増幅された核酸の
好ましい検出方法としては、固相担体の代わりに固相単
体と結合可能な部位と特異的に結合可能な微粒子(たと
えば、蛋白質、ラテックス等)を該増幅反応液中に加え
る方法があげられるが、この方法を用いることにより目
的とする核酸を凝集あるいは沈殿の有無により判定する
こともできる。また、特開平1−252300号記載の
方法によれば、さらに容易に核酸を検出することもでき
る。すなわち、一方のプライマーに固相担体と結合可能
な部位を、他方のプライマーに標識物を導入したものを
用い、伸張反応を行った反応物を固相担体と接触させた
後、不純物を適当な溶媒で洗浄除去する方法がある。こ
の方法では該固相担体と結合可能な部位を持つプライマ
ーから伸張した合成核酸鎖は、もう一方の標識物が導入
されたプライマーから伸張された合成核酸鎖と二重鎖を
組んでおり、目的核酸は標識物を持つ形で該固相担体に
固定され、特異的に検出されることになる。
【0026】標識物質の実際の検出は、使用する標識物
質に応じて一般的手法を用いればよい。たとえば、標識
物質がラジオアイソトープであればそのまま活性を測定
すれば良いし、たとえばビオチンであればアビジン(も
しくはストレプトアビジン)‐酵素結合体、また、ハプ
テンであれば抗体‐酵素結合体を用いて基質と反応さ
せ、色的又は蛍光的手段により検出可能な成分を得るこ
とができる。また、たとえば、標識物質が蛍光であれ
ば、そのまま蛍光光度計を用いて強度を測定すればよ
い。
質に応じて一般的手法を用いればよい。たとえば、標識
物質がラジオアイソトープであればそのまま活性を測定
すれば良いし、たとえばビオチンであればアビジン(も
しくはストレプトアビジン)‐酵素結合体、また、ハプ
テンであれば抗体‐酵素結合体を用いて基質と反応さ
せ、色的又は蛍光的手段により検出可能な成分を得るこ
とができる。また、たとえば、標識物質が蛍光であれ
ば、そのまま蛍光光度計を用いて強度を測定すればよ
い。
【0027】本発明によるもう一つのマイコプラズマの
検出法は、前記したよううな核酸断片またはその部分配
列であってマイコプラズマの各種に特異的な塩基配列の
核酸断片をプライマーまたはプローブとして用いるこ
と、を特徴とするものであることは前記したところであ
り、特に、配列番号9〜13または14〜18の配列式
で示される核酸断片を使用して伸長反応、増幅反応を行
うことにより、目的とする個々のマイコプラズマ種を検
出することができる。
検出法は、前記したよううな核酸断片またはその部分配
列であってマイコプラズマの各種に特異的な塩基配列の
核酸断片をプライマーまたはプローブとして用いるこ
と、を特徴とするものであることは前記したところであ
り、特に、配列番号9〜13または14〜18の配列式
で示される核酸断片を使用して伸長反応、増幅反応を行
うことにより、目的とする個々のマイコプラズマ種を検
出することができる。
【0028】
実施例1:プライマーの調製
本発明において標識物あるいは部位が導入されているプ
ライマーまたは導入されていないプライマーは以下に示
す方法で化学合成した。まず、標識物あるいは部位のい
ずれも導入されていないものは、Caruthers らのホスホ
アミダイト法[Tetrahedron Lett. 22,1859(1981)]に
基づいてアプライドバイオシステム社のDNA自動合成
機モデル381Aを用いて0.2マイクロモルのスケー
ルで行った。また、標識物または部位が導入されたもの
は、まずそれぞれの5′末端にアミノ基を導入したオリ
ゴヌクレオチドとして合成し、そののち適当な試薬を用
いて標識物あるいは部位を導入した。その例を以下に示
す。まず、5′末端にアミノ基を導入したオリゴヌクレ
オチド(5′GCTGCGGTGAATACGTTC
T)の合成は、アプライドバイオシステム社のDNA自
動合成機モデル381Aを用いて行った。0.2マイク
ロモルの支持体に順次保護モノヌクレオチドホスホアミ
ダイトを付加し、5′末端の塩基を付加したのちアミノ
リンクIITM(アプライドバイオシステム社)をさらに付
加した。次に濃アンモニア処理により支持体からの脱離
および保護基の除去を行った。脱保護後は、セファデッ
クスG−50を用いてゲルロ過し、最初に溶出したピー
クのフラクションを集めて濃縮した。次に、この試料を
逆相のHPLCで精製した(カラム:μ−Bondapak C1
8、溶離液:5−20%アセトニトリル‐50mMトリエ
チルアンモニウム酢酸、pH7.0)。次に、アミノ化オ
リゴヌクレオチドの水溶液(1O.D.:10μl)に1M
NaHCO3水溶液(10μl)、H2O(30μl)
およびビオチニル‐N‐ヒドロキシサクシニミドエステ
ル(BRL社)のDMF溶液(20μg/μl、50μ
l)を加え、混和後室温で放置した(ビオチン化反
応)。4時間後、ゲルロ過カラム(セファデックスG−
50)にかけ、50mMTEABバッファー(重炭酸トリ
エチルアンモニウム緩衝液pH7.5)で溶離し、最初に
溶出したピークを集めて乾固した(収量:0.7 O.
D.)。なお、原料のアミノ化オリゴヌクレオチドが純粋
でない場合あるいはビオチン化反応が定量的でなかった
場合、ゲルロ過後の試料を逆相のHPLC(カラム:μ
−Bondapak-C18、溶離液:10−20%アセトニトリル
−50mMトリエチルアンモニウム酢酸、pH7.0)で精
製した。その場合、目的物のビオチン化オリゴヌクレオ
チドは原料およびその他の不純物より遅れて溶出するた
め容易に精製することができる。5′末端にジニトロフ
ェニル基(DNP)を導入したオリゴヌクレオチド
(5′CCCACGTTCTCGTAGGGA)は、ま
ずビオチン化オリゴヌクレオチドと同様にアミノ基を導
入したものとして合成した。このようにして得たアミノ
化オリゴヌクレオチドの水溶液(2 O.D.:180μ
l)に1M NaHCO3(20μl)を加え、これに
5%(v/v)ジニトロフルオンベンゼンのエタノール溶液
(100μl)を加え37℃で2時間加温した。反応後
はビオチン化オリゴヌクレオチドと同様にしてゲルロ過
によって試薬を除き精製した(収量:1.2 O.D.)。
ライマーまたは導入されていないプライマーは以下に示
す方法で化学合成した。まず、標識物あるいは部位のい
ずれも導入されていないものは、Caruthers らのホスホ
アミダイト法[Tetrahedron Lett. 22,1859(1981)]に
基づいてアプライドバイオシステム社のDNA自動合成
機モデル381Aを用いて0.2マイクロモルのスケー
ルで行った。また、標識物または部位が導入されたもの
は、まずそれぞれの5′末端にアミノ基を導入したオリ
ゴヌクレオチドとして合成し、そののち適当な試薬を用
いて標識物あるいは部位を導入した。その例を以下に示
す。まず、5′末端にアミノ基を導入したオリゴヌクレ
オチド(5′GCTGCGGTGAATACGTTC
T)の合成は、アプライドバイオシステム社のDNA自
動合成機モデル381Aを用いて行った。0.2マイク
ロモルの支持体に順次保護モノヌクレオチドホスホアミ
ダイトを付加し、5′末端の塩基を付加したのちアミノ
リンクIITM(アプライドバイオシステム社)をさらに付
加した。次に濃アンモニア処理により支持体からの脱離
および保護基の除去を行った。脱保護後は、セファデッ
クスG−50を用いてゲルロ過し、最初に溶出したピー
クのフラクションを集めて濃縮した。次に、この試料を
逆相のHPLCで精製した(カラム:μ−Bondapak C1
8、溶離液:5−20%アセトニトリル‐50mMトリエ
チルアンモニウム酢酸、pH7.0)。次に、アミノ化オ
リゴヌクレオチドの水溶液(1O.D.:10μl)に1M
NaHCO3水溶液(10μl)、H2O(30μl)
およびビオチニル‐N‐ヒドロキシサクシニミドエステ
ル(BRL社)のDMF溶液(20μg/μl、50μ
l)を加え、混和後室温で放置した(ビオチン化反
応)。4時間後、ゲルロ過カラム(セファデックスG−
50)にかけ、50mMTEABバッファー(重炭酸トリ
エチルアンモニウム緩衝液pH7.5)で溶離し、最初に
溶出したピークを集めて乾固した(収量:0.7 O.
D.)。なお、原料のアミノ化オリゴヌクレオチドが純粋
でない場合あるいはビオチン化反応が定量的でなかった
場合、ゲルロ過後の試料を逆相のHPLC(カラム:μ
−Bondapak-C18、溶離液:10−20%アセトニトリル
−50mMトリエチルアンモニウム酢酸、pH7.0)で精
製した。その場合、目的物のビオチン化オリゴヌクレオ
チドは原料およびその他の不純物より遅れて溶出するた
め容易に精製することができる。5′末端にジニトロフ
ェニル基(DNP)を導入したオリゴヌクレオチド
(5′CCCACGTTCTCGTAGGGA)は、ま
ずビオチン化オリゴヌクレオチドと同様にアミノ基を導
入したものとして合成した。このようにして得たアミノ
化オリゴヌクレオチドの水溶液(2 O.D.:180μ
l)に1M NaHCO3(20μl)を加え、これに
5%(v/v)ジニトロフルオンベンゼンのエタノール溶液
(100μl)を加え37℃で2時間加温した。反応後
はビオチン化オリゴヌクレオチドと同様にしてゲルロ過
によって試薬を除き精製した(収量:1.2 O.D.)。
【0029】実施例2:プローブの調製
実施例1と同様にビオチン標識したオリゴヌクレオチド
(5′CGAGAACGTGGGGAT)を調製した。
【0030】実施例3:前記2種の標識フラグメント
(プライマー)の特異性 マイコプラズマ・オラーレ(M.orale )、マイコプラズ
マ・アルギニーニ(M.arginini)、マイコプラズマ・ホ
ミニス(M.hominis )、マイコプラズマ・サリバリウム
(M.salivarium)、マイコプラズマ・ファーメンタンス
(M.fermentans)、アコレプラズマ・ライドラウィー
(A.laidlawii )、野生型の枯草菌(B.subtilis)、大
腸菌(E.coli)、緑膿菌(Pseudomonous aeruginosa )
および黄色ブドウ球菌(Staphlococcus aureus)より常
法に従って調製したDNAを試料とし、PCR法を用い
た遺伝子増幅反応を行った。実施例1で調製した2種の
プライマー(Biotin-GCTGCGGTGAATACGTTCT、DNP-CCCACG
TTCTCGTAGGGA)それぞれ100ng、dATP、dGT
P、dCTP、dTTPそれぞれ200μM、10mMT
ris−HCl(pH8.3)、50mM KCl、1.5
mM MgC12、0.01%ゼラチンを含む反応混液1
00μlに、試料DNAを100ng加え、94℃で5分
間加熱した後、50℃に5分間保った。続いて耐熱性D
NAポリメラーゼ(シータス社製)2.5単位を加え、
72℃・60秒、94℃・30秒、50℃・30秒を1
サイクルとして30サイクルの反応を行った。反応後の
混合液5μlをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジ
ウムブロミド染色により増幅核酸鎖の検出を行った。そ
の結果、試料としてマイコプラズマ類のDNAを用いた
場合には、期待される増幅核酸鎖126塩基長に対応す
るバンドを確認することができた。一方、試料として枯
草菌、大腸菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌のDNAを用い
た場合にはそれに対応するバンドは検出されなかった。
(プライマー)の特異性 マイコプラズマ・オラーレ(M.orale )、マイコプラズ
マ・アルギニーニ(M.arginini)、マイコプラズマ・ホ
ミニス(M.hominis )、マイコプラズマ・サリバリウム
(M.salivarium)、マイコプラズマ・ファーメンタンス
(M.fermentans)、アコレプラズマ・ライドラウィー
(A.laidlawii )、野生型の枯草菌(B.subtilis)、大
腸菌(E.coli)、緑膿菌(Pseudomonous aeruginosa )
および黄色ブドウ球菌(Staphlococcus aureus)より常
法に従って調製したDNAを試料とし、PCR法を用い
た遺伝子増幅反応を行った。実施例1で調製した2種の
プライマー(Biotin-GCTGCGGTGAATACGTTCT、DNP-CCCACG
TTCTCGTAGGGA)それぞれ100ng、dATP、dGT
P、dCTP、dTTPそれぞれ200μM、10mMT
ris−HCl(pH8.3)、50mM KCl、1.5
mM MgC12、0.01%ゼラチンを含む反応混液1
00μlに、試料DNAを100ng加え、94℃で5分
間加熱した後、50℃に5分間保った。続いて耐熱性D
NAポリメラーゼ(シータス社製)2.5単位を加え、
72℃・60秒、94℃・30秒、50℃・30秒を1
サイクルとして30サイクルの反応を行った。反応後の
混合液5μlをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジ
ウムブロミド染色により増幅核酸鎖の検出を行った。そ
の結果、試料としてマイコプラズマ類のDNAを用いた
場合には、期待される増幅核酸鎖126塩基長に対応す
るバンドを確認することができた。一方、試料として枯
草菌、大腸菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌のDNAを用い
た場合にはそれに対応するバンドは検出されなかった。
【0031】実施例4:マイコプラズマDNAの検出
マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・アルギニ
ーニ、マイコプラズマ・ホミニス、マイコプラズマ・サ
リバリウム、マイコプラズマ・ファーメンタンス、アコ
レプラズマ・ライドラウィーより常法に従って調製した
DNAそれぞれ1ng、野生型の枯草菌、大腸菌、緑膿菌
または黄色ブドウ球菌より常法に従って調製したDNA
それぞれ10ng、または市販ヒト胎盤DNA100ngを
含む試料10μlに、遺伝子増幅用反応混液40μl
(実施例1で調製した2種のプライマー(Biotin-GCTGC
GGTGAATACGTTCT、DNP-CCCACGTTCTCGTAGGGA)それぞれ5
0ng、dATP、dGTP、dCTP、dTTPそれぞ
れ200μM、10mM Tris−HCl(pH8.
3)、50mM KCl、1.5mM MgC12、0.0
1%ゼラチンおよび耐熱性DNAポリメラーゼ(シータ
ス社製)1.5単位を含む)を加え、94℃で5分間加
熱した後、50℃に5分間保った。続いて72℃・60
秒、94℃・30秒、50℃・30秒を1サイクルとし
て30サイクルの反応を行った。反応後の混合液5μl
を、あらかじめ100μlの緩衝液(100mMTris
−HCl(pH7.5)、0.15M NaCl、0.0
5% Tween20を含む)を加えたストレプトアビ
ジン固定化マイクロプレートに加え、30分間おいた
後、上述の緩衝液約400μlで洗浄した。この洗浄操
作をさらに2回行った。これに、アルカリ性フォスファ
ターゼ標識抗DNP抗体を上述の緩衝液で希釈したもの
を加え(100μl)、室温で30分間おいた後緩衝液
(400μl)で洗浄した。この洗浄操作をさらに2回
行い、100μlのp‐ニトロフェニルリン酸溶液(4
mg/ml、1Mジエタノールアミン緩衝液に溶解)を加
え、室温で30分間おいた後マイクロプレートリーダー
(TOSO製)で405nmの吸光度を測定した。マイコ
プラズマ群のDNAを用いた場合のみ陽性と判断できる
発色が得られた(表1)。 表 1 試 料 吸光度(O.D.) A. laidlawii DNA 0.162 M. orale DNA 0.277 M. fermentans DNA 0.270 M. hominis DNA 0.514 M. salivalium DNA 0.407 M. arginini DNA 0.287 B. subtilis DNA 0.002 E. coli DNA 0.005 P. aeruginosa DNA 0.005 S. aureus DNA 0.002 Human placental DNA 0.000
ーニ、マイコプラズマ・ホミニス、マイコプラズマ・サ
リバリウム、マイコプラズマ・ファーメンタンス、アコ
レプラズマ・ライドラウィーより常法に従って調製した
DNAそれぞれ1ng、野生型の枯草菌、大腸菌、緑膿菌
または黄色ブドウ球菌より常法に従って調製したDNA
それぞれ10ng、または市販ヒト胎盤DNA100ngを
含む試料10μlに、遺伝子増幅用反応混液40μl
(実施例1で調製した2種のプライマー(Biotin-GCTGC
GGTGAATACGTTCT、DNP-CCCACGTTCTCGTAGGGA)それぞれ5
0ng、dATP、dGTP、dCTP、dTTPそれぞ
れ200μM、10mM Tris−HCl(pH8.
3)、50mM KCl、1.5mM MgC12、0.0
1%ゼラチンおよび耐熱性DNAポリメラーゼ(シータ
ス社製)1.5単位を含む)を加え、94℃で5分間加
熱した後、50℃に5分間保った。続いて72℃・60
秒、94℃・30秒、50℃・30秒を1サイクルとし
て30サイクルの反応を行った。反応後の混合液5μl
を、あらかじめ100μlの緩衝液(100mMTris
−HCl(pH7.5)、0.15M NaCl、0.0
5% Tween20を含む)を加えたストレプトアビ
ジン固定化マイクロプレートに加え、30分間おいた
後、上述の緩衝液約400μlで洗浄した。この洗浄操
作をさらに2回行った。これに、アルカリ性フォスファ
ターゼ標識抗DNP抗体を上述の緩衝液で希釈したもの
を加え(100μl)、室温で30分間おいた後緩衝液
(400μl)で洗浄した。この洗浄操作をさらに2回
行い、100μlのp‐ニトロフェニルリン酸溶液(4
mg/ml、1Mジエタノールアミン緩衝液に溶解)を加
え、室温で30分間おいた後マイクロプレートリーダー
(TOSO製)で405nmの吸光度を測定した。マイコ
プラズマ群のDNAを用いた場合のみ陽性と判断できる
発色が得られた(表1)。 表 1 試 料 吸光度(O.D.) A. laidlawii DNA 0.162 M. orale DNA 0.277 M. fermentans DNA 0.270 M. hominis DNA 0.514 M. salivalium DNA 0.407 M. arginini DNA 0.287 B. subtilis DNA 0.002 E. coli DNA 0.005 P. aeruginosa DNA 0.005 S. aureus DNA 0.002 Human placental DNA 0.000
【0032】実施例5:マイコプラズマの検出
マイコプラズマ・オラーレ、アコレプラズマ・ライドラ
ウィー、野生型の枯草菌または大腸菌の各菌体懸濁液5
μlに溶菌液(200μg/mlプロテアーゼK、10mM
Tris−HCl(pH8.3)、50mM KCl、
2.5mM MgC12、0.01%ゼラチン、0.45
%Nonidet P-40、0.45%Tween20を加え、6
0℃で20分間、続いて90℃で10分間保った。その
後、遺伝子増幅用反応試薬10μl(実施例1で調製し
た2種のプライマー(Biotin- GCTGCGGTGAATACGTTCT 、
DNP-CCCACGTTCTCGTAGGGA)それぞれ50ng、dATP、
dGTP、dCTP、dTTPそれぞれ200μM、1
0mM Tris−HCl(pH8.3)、50mM KC
l、1.5mM MgC12、0.01%ゼラチンおよび
耐熱性DNAポリメラーゼ(シータス社製)1.5単位
を含む)を加え、94℃で5分間加熱した後、50℃に
5分間保った。続いて72℃・60秒、94℃・30
秒、50℃・30秒を1サイクルとして30サイクルの
反応を行った。反応後の混合液5μlを、あらかじめ1
00μlの緩衝液(100mM Tris−HCl(pH
7.5)、0.15M NaCl、0.05% Twe
en20を含む)を加えたストレプトアビジン固定化マ
イクロプレートに加え、30分間おいた後、上述の緩衝
液約400μlで洗浄した。この洗浄操作をさらに2回
行った。これに、アルカリ性フォスファターゼ標識抗D
NP抗体を上述の緩衝液で希釈したものを加え、(10
0μl)、室温で30分間おいた後、緩衝液(400μ
l)で洗浄した。この洗浄操作をさらに2回行い、10
0μlのp‐ニトロフェニルリン酸溶液(4mg/ml、1
Mジエタノールアミン緩衝液に溶解)を加え、室温で3
0分間おいた後マイクロプレートリーダー(TOSOH
製)で405nmの吸光度を測定した。マイコプラズマ群
を試料として用いた場合のみ陽性と判断できる発色が得
られた(表2)。 表 2 試 料 菌量 吸光度(O.D.) A. laidlawii 5×104細胞 0.707 A. laidlawii 5×103細胞 0.605 A. laidlawii 5×102細胞 0.327 M. orale 5×104細胞 0.841 M. orale 5×103細胞 0.838 M. orale 5×102細胞 0.707 B. subtilis 105細胞 0.005 E. coli 105細胞 0.008
ウィー、野生型の枯草菌または大腸菌の各菌体懸濁液5
μlに溶菌液(200μg/mlプロテアーゼK、10mM
Tris−HCl(pH8.3)、50mM KCl、
2.5mM MgC12、0.01%ゼラチン、0.45
%Nonidet P-40、0.45%Tween20を加え、6
0℃で20分間、続いて90℃で10分間保った。その
後、遺伝子増幅用反応試薬10μl(実施例1で調製し
た2種のプライマー(Biotin- GCTGCGGTGAATACGTTCT 、
DNP-CCCACGTTCTCGTAGGGA)それぞれ50ng、dATP、
dGTP、dCTP、dTTPそれぞれ200μM、1
0mM Tris−HCl(pH8.3)、50mM KC
l、1.5mM MgC12、0.01%ゼラチンおよび
耐熱性DNAポリメラーゼ(シータス社製)1.5単位
を含む)を加え、94℃で5分間加熱した後、50℃に
5分間保った。続いて72℃・60秒、94℃・30
秒、50℃・30秒を1サイクルとして30サイクルの
反応を行った。反応後の混合液5μlを、あらかじめ1
00μlの緩衝液(100mM Tris−HCl(pH
7.5)、0.15M NaCl、0.05% Twe
en20を含む)を加えたストレプトアビジン固定化マ
イクロプレートに加え、30分間おいた後、上述の緩衝
液約400μlで洗浄した。この洗浄操作をさらに2回
行った。これに、アルカリ性フォスファターゼ標識抗D
NP抗体を上述の緩衝液で希釈したものを加え、(10
0μl)、室温で30分間おいた後、緩衝液(400μ
l)で洗浄した。この洗浄操作をさらに2回行い、10
0μlのp‐ニトロフェニルリン酸溶液(4mg/ml、1
Mジエタノールアミン緩衝液に溶解)を加え、室温で3
0分間おいた後マイクロプレートリーダー(TOSOH
製)で405nmの吸光度を測定した。マイコプラズマ群
を試料として用いた場合のみ陽性と判断できる発色が得
られた(表2)。 表 2 試 料 菌量 吸光度(O.D.) A. laidlawii 5×104細胞 0.707 A. laidlawii 5×103細胞 0.605 A. laidlawii 5×102細胞 0.327 M. orale 5×104細胞 0.841 M. orale 5×103細胞 0.838 M. orale 5×102細胞 0.707 B. subtilis 105細胞 0.005 E. coli 105細胞 0.008
【0033】実施例6:マイコプラズマの迅速検出
マイコプラズマ・オラーレの菌液(250細胞/5μ
l、1000細胞/5μl)に溶菌液(40μl;50
mM KCl、10mM Tris−HCl(pH8.3)、
2.5mM MgC12、0.01%ゼラチン、0.45
% NP40、0.45% Tween20、200μ
g/mlプロテアーゼK)を加えて60℃で20分間反応
した。94℃で10分間処理した後冷却し、PCR反応
液(10μl ;50mM KCl、10mM Tris−H
Cl(pH8.3)、1.5mM MgC12、0.01%
ゼラチン、dATP、dGTP、dCTP、dTTPそ
れぞれ1mM、5ng/μl DNP-CCCACGTTCTCGTAGGGA、5
ng/μl Biotin-GCTGCGGTGAATACGTTCT、0.75単位
のTaq DNAピリメラーゼ)を加え、72℃・60
秒、94℃・30秒、50℃・30秒を1サイクルとし
て30サイクルの反応を行った。アルカリ性フォスファ
ターゼ標識抗DNP抗体を洗浄液(50mM Tris−
HCl pH7.5、150mM NaCl、0.05%
Tween20)で希釈し、ストレプトアビジン固定化
プレートに100μlずつ加えた。これに先の反応液
(5μl)を加え、室温で30分間反応した。反応液を
除き、洗浄液(400μl)で3回洗浄した。これに、
100μlのp‐ニトロフェニルリン酸溶液(4mg/m
l、1Mジエタノールアミン緩衝液に溶解)を加え、室
温で30分間おいた後マイクロプレートリーダー(TO
SOH製)で405nmの吸光度を測定した。 表 3 試 料 菌量 吸光度(O.D.) 陰性コントロール 0.03 M.orale 250細胞 0.60 M.orale 1000細胞 0.83
l、1000細胞/5μl)に溶菌液(40μl;50
mM KCl、10mM Tris−HCl(pH8.3)、
2.5mM MgC12、0.01%ゼラチン、0.45
% NP40、0.45% Tween20、200μ
g/mlプロテアーゼK)を加えて60℃で20分間反応
した。94℃で10分間処理した後冷却し、PCR反応
液(10μl ;50mM KCl、10mM Tris−H
Cl(pH8.3)、1.5mM MgC12、0.01%
ゼラチン、dATP、dGTP、dCTP、dTTPそ
れぞれ1mM、5ng/μl DNP-CCCACGTTCTCGTAGGGA、5
ng/μl Biotin-GCTGCGGTGAATACGTTCT、0.75単位
のTaq DNAピリメラーゼ)を加え、72℃・60
秒、94℃・30秒、50℃・30秒を1サイクルとし
て30サイクルの反応を行った。アルカリ性フォスファ
ターゼ標識抗DNP抗体を洗浄液(50mM Tris−
HCl pH7.5、150mM NaCl、0.05%
Tween20)で希釈し、ストレプトアビジン固定化
プレートに100μlずつ加えた。これに先の反応液
(5μl)を加え、室温で30分間反応した。反応液を
除き、洗浄液(400μl)で3回洗浄した。これに、
100μlのp‐ニトロフェニルリン酸溶液(4mg/m
l、1Mジエタノールアミン緩衝液に溶解)を加え、室
温で30分間おいた後マイクロプレートリーダー(TO
SOH製)で405nmの吸光度を測定した。 表 3 試 料 菌量 吸光度(O.D.) 陰性コントロール 0.03 M.orale 250細胞 0.60 M.orale 1000細胞 0.83
【0034】実施例7:プローブによるマイコプラズマ
の検出 マイコプラズマ・オラーレ、アコレプラズマ・ライドラ
ウィー、野生型の枯草菌および大腸菌から常法に従って
DNAを抽出した。それぞれのDNAをアルカリ変性し
た後、ドットブロット装置(BRL社製)を用いて各ド
ット1μgずつニトロセルロース膜にドットした。ニト
ロセルロース膜を真空下80℃で2時間乾燥し固定化し
た。次にニトロセルロース膜をビニールバッグに入れ、
6×SSC、5×デンハルト溶液、0.2%SDS、2
00μg/mlニシンDNA溶液(2ml)を加え、40℃
で1時間プレハイブリダイゼーションを行った。これ
に、実施例2で調製したビチオン標識オリゴヌクレオチ
ドプローブ(40ng)を加え、43℃で2時間ハイブリ
ダイゼーションを行った。ニトロセルロース膜をビニー
ルバックから取り出し、6×SSCを用いて45℃で5
分間2回洗浄した。次に、溶液I(0.3M NaC
l、0.1M Tris−HCl(pH7.5)、2mM
MgC12、0.05%Triton X−100)で
5分間洗浄し、溶液II(3% BSA、0.3M Na
Cl、0.1M Tris−HCl(pH7.5)、2mM
MgC12、0.05%Triton X−100)
を用いて37℃で20分間ブロッキングした。真空下8
0℃で30分間乾燥した。次に、アルカリフォスファタ
ーゼ標識ストレプトアビジン(BRL社製)を溶液Iで
1000倍に希釈して加え、室温で15分間反応した。
反応後溶液Iで3回、溶液III (0.3M NaCl、
0.1M Tris−HCl(pH9.5)、5.5mMMg
C12)で1回洗浄した。さらに、発色基質として5‐
ブロモ‐4‐クロロ‐3‐インドリルりん酸P‐トルイ
ジン塩(BCIP)とニトロブルーテトラゾリウム(N
BT)を溶液III に溶解し(BCIP:1.7mg/ml、
NBT:2.9mg/ml)、ニトロセルロース膜に加えて
発色反応を行った。その結果、マイコプラズマ・オラー
レおよびアコレプラズマ・ライドラウィーのDNAをド
ットしたものではドットが青紫色を呈したが、枯草菌お
よび大腸菌のDNAをドットしたものでは変化が見られ
なかった。
の検出 マイコプラズマ・オラーレ、アコレプラズマ・ライドラ
ウィー、野生型の枯草菌および大腸菌から常法に従って
DNAを抽出した。それぞれのDNAをアルカリ変性し
た後、ドットブロット装置(BRL社製)を用いて各ド
ット1μgずつニトロセルロース膜にドットした。ニト
ロセルロース膜を真空下80℃で2時間乾燥し固定化し
た。次にニトロセルロース膜をビニールバッグに入れ、
6×SSC、5×デンハルト溶液、0.2%SDS、2
00μg/mlニシンDNA溶液(2ml)を加え、40℃
で1時間プレハイブリダイゼーションを行った。これ
に、実施例2で調製したビチオン標識オリゴヌクレオチ
ドプローブ(40ng)を加え、43℃で2時間ハイブリ
ダイゼーションを行った。ニトロセルロース膜をビニー
ルバックから取り出し、6×SSCを用いて45℃で5
分間2回洗浄した。次に、溶液I(0.3M NaC
l、0.1M Tris−HCl(pH7.5)、2mM
MgC12、0.05%Triton X−100)で
5分間洗浄し、溶液II(3% BSA、0.3M Na
Cl、0.1M Tris−HCl(pH7.5)、2mM
MgC12、0.05%Triton X−100)
を用いて37℃で20分間ブロッキングした。真空下8
0℃で30分間乾燥した。次に、アルカリフォスファタ
ーゼ標識ストレプトアビジン(BRL社製)を溶液Iで
1000倍に希釈して加え、室温で15分間反応した。
反応後溶液Iで3回、溶液III (0.3M NaCl、
0.1M Tris−HCl(pH9.5)、5.5mMMg
C12)で1回洗浄した。さらに、発色基質として5‐
ブロモ‐4‐クロロ‐3‐インドリルりん酸P‐トルイ
ジン塩(BCIP)とニトロブルーテトラゾリウム(N
BT)を溶液III に溶解し(BCIP:1.7mg/ml、
NBT:2.9mg/ml)、ニトロセルロース膜に加えて
発色反応を行った。その結果、マイコプラズマ・オラー
レおよびアコレプラズマ・ライドラウィーのDNAをド
ットしたものではドットが青紫色を呈したが、枯草菌お
よび大腸菌のDNAをドットしたものでは変化が見られ
なかった。
【0035】
【発明の効果】本発明の核酸断片は、マイコプラズマの
rRNAをコードする遺伝子あるいはrRNAをコード
する遺伝子の間に存在する領域(スペーサー領域)の塩
基を基本としてなっており、これらの構成塩基またはそ
の一部分の塩基配列をプローブまたはプライマーとして
使用すれば、特定のマイコプラズマあるいは群としての
マイコプラズマの検出を特異的に行うことができる。ま
た、本発明によるマイコプラズマの検出法は、上記の核
酸断片あるいはこれらの一部をプライマーまたはプロー
ブとして使用するものであり、従来法に比べ 1)感度、2)特異性、3)迅速性および4)操作性の
点で優れており、臨床、公衆衛生等の分野において多大
な貢献をなすものである。
rRNAをコードする遺伝子あるいはrRNAをコード
する遺伝子の間に存在する領域(スペーサー領域)の塩
基を基本としてなっており、これらの構成塩基またはそ
の一部分の塩基配列をプローブまたはプライマーとして
使用すれば、特定のマイコプラズマあるいは群としての
マイコプラズマの検出を特異的に行うことができる。ま
た、本発明によるマイコプラズマの検出法は、上記の核
酸断片あるいはこれらの一部をプライマーまたはプロー
ブとして使用するものであり、従来法に比べ 1)感度、2)特異性、3)迅速性および4)操作性の
点で優れており、臨床、公衆衛生等の分野において多大
な貢献をなすものである。
【0036】
【配列表】配列番号:1
配列の長さ:319
配列の型:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
起源
生物名:Mycoplasma orale
配列の特徴
特徴を表す記号:rRNA, 3'clip
存在位置:1..59
特徴を決定した方法:S(他の細菌の情報からの推測に
よる) 特徴を表す記号:rRNA, 5'clip 存在位置:281..319 特徴を決定した方法:S(他の細菌の情報からの推測に
よる) 配列 TGGGGTGAAG TCGTAACAAG GTATCCCTAC GAGAACGTGG GGATGGATTA CCTCCTTTCT 60 ACGGAGTACA ATTGAAGTTA TCCATACTTC ATAAATAGTT AATGGCCAAT ATTCGTATCA 120 GTTTGAGAGA CTATCTCTCA TTATCTTGAA CTGATAGAAC TGAATAATAT ATATCAAATT 180 AGATCAACCT ATAGATATTC AAAATATAGA GACAATACAA AAACAAAACA ATAGGTCAAA 240 AATACTTATA CGTAATTAAA ATATATAACT ATTAAATAAG CAAGAGTTTT TGGTGGATGC 300 CTTGGGTCTG GAAGTCGAT 319
よる) 特徴を表す記号:rRNA, 5'clip 存在位置:281..319 特徴を決定した方法:S(他の細菌の情報からの推測に
よる) 配列 TGGGGTGAAG TCGTAACAAG GTATCCCTAC GAGAACGTGG GGATGGATTA CCTCCTTTCT 60 ACGGAGTACA ATTGAAGTTA TCCATACTTC ATAAATAGTT AATGGCCAAT ATTCGTATCA 120 GTTTGAGAGA CTATCTCTCA TTATCTTGAA CTGATAGAAC TGAATAATAT ATATCAAATT 180 AGATCAACCT ATAGATATTC AAAATATAGA GACAATACAA AAACAAAACA ATAGGTCAAA 240 AATACTTATA CGTAATTAAA ATATATAACT ATTAAATAAG CAAGAGTTTT TGGTGGATGC 300 CTTGGGTCTG GAAGTCGAT 319
【0037】配列番号:2
配列の長さ:273
配列の型:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
起源
生物名:Mycoplasma fermentans
配列の特徴
特徴を表す記号:rRNA, 3'clip
存在位置:1..54
特徴を決定した方法:S(他の細菌の情報からの推測に
よる) 特徴を表す記号:rRNA, 5'clip 存在位置:235..273 特徴を決定した方法:S(他の細菌の情報からの推測に
よる) 配列 TGAAGTCGTA ACAAGGTATC CCTACGAGAA CGTGGGGATG GATCACCTCC TTTCTACGGA 60 GTACAACCTA TGGAAAAAAT ATTTGTATCC AGTTTTGAGA GATTATCTCT CGTCTTGAAC 120 TGAATATCGA CATTGATATA TTAATTAATA TTCAAAGTTT AGATCAACCA TAGAATATTT 180 ATATTTTATA AAGACAAACA ATAGGTCATA CAATTAACAA AACTATTAAA CAAGCAAGAG 240 TTTTTGGTGG ATGCCTTGGG TCTGGAAGTC GAT 273
よる) 特徴を表す記号:rRNA, 5'clip 存在位置:235..273 特徴を決定した方法:S(他の細菌の情報からの推測に
よる) 配列 TGAAGTCGTA ACAAGGTATC CCTACGAGAA CGTGGGGATG GATCACCTCC TTTCTACGGA 60 GTACAACCTA TGGAAAAAAT ATTTGTATCC AGTTTTGAGA GATTATCTCT CGTCTTGAAC 120 TGAATATCGA CATTGATATA TTAATTAATA TTCAAAGTTT AGATCAACCA TAGAATATTT 180 ATATTTTATA AAGACAAACA ATAGGTCATA CAATTAACAA AACTATTAAA CAAGCAAGAG 240 TTTTTGGTGG ATGCCTTGGG TCTGGAAGTC GAT 273
【0038】配列番号:3
配列の長さ:464
配列の型:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
起源
生物名:Mycoplasma salivarium
配列の特徴
特徴を表す記号:rRNA, 3'clip
存在位置:1..143
特徴を決定した方法:S(他の細菌の情報からの推測に
よる) 特徴を表す記号:rRNA, 5'clip 存在位置:369..408 特徴を決定した方法:S(他の細菌の情報からの推測に
よる) 配列 CCGCCCGTCA CACCATGGGA GCTGGTAATA CCCAAAGTCG GTTTGCTAAC CTCGGAGGCG 60 ACTGCCTAAG GTAGGACTGG TGACTGGGGT GAAGTCGTAA CAAGGTATCC CTACGAGAAC 120 GTGGGGATGG ATCACCTCCT TTCTACGGAG TACAAAAGAA GTTATCATAC TTCTATGACT 180 AAAGTTAATG GATTTAATAT TCGTGATCCA GTTTTGAGAG AATTATTTCT GTCTTTTGTT 240 CTTTGAAAAC TGAATTAGAC ATTGAAAAAT TATCAAATCA ATATAATATT TCAAAGTTTA 300 GATCAACCTA TAGAATATTC TAATAGACAA ACAATAGGTC ATACATTATA TTTATACTAT 360 TAAATAAGCA AGAGTTTTTG GTGGATGCCT TGGGTCTGAA AGTCGAAG 408
よる) 特徴を表す記号:rRNA, 5'clip 存在位置:369..408 特徴を決定した方法:S(他の細菌の情報からの推測に
よる) 配列 CCGCCCGTCA CACCATGGGA GCTGGTAATA CCCAAAGTCG GTTTGCTAAC CTCGGAGGCG 60 ACTGCCTAAG GTAGGACTGG TGACTGGGGT GAAGTCGTAA CAAGGTATCC CTACGAGAAC 120 GTGGGGATGG ATCACCTCCT TTCTACGGAG TACAAAAGAA GTTATCATAC TTCTATGACT 180 AAAGTTAATG GATTTAATAT TCGTGATCCA GTTTTGAGAG AATTATTTCT GTCTTTTGTT 240 CTTTGAAAAC TGAATTAGAC ATTGAAAAAT TATCAAATCA ATATAATATT TCAAAGTTTA 300 GATCAACCTA TAGAATATTC TAATAGACAA ACAATAGGTC ATACATTATA TTTATACTAT 360 TAAATAAGCA AGAGTTTTTG GTGGATGCCT TGGGTCTGAA AGTCGAAG 408
【0039】配列番号:4
配列の長さ:393
配列の型:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
起源
生物名:Mycoplasma hominis
配列の特徴
特徴を表す記号:rRNA
存在位置:1..54
特徴を決定した方法:S(他の細菌の情報からの推測に
よる) 特徴を表す記号:rRNA 存在位置:355..393 特徴を決定した方法:S(他の細菌の情報からの推測に
よる) 配列 TGAAGTCTGA ACAAGGTATC CCTACGAGAA CGTGGGGATG GATCACCTCC TTTCTACGGA 60 GTACAAAAGA GTACTTTTAA GTACTATTAA CCTTATTTAC CTAGACCTAT TTATTATATA 120 TTTTGTATGT GCTTTATGGT CTAAGCTTAT ATCTAGTTGA GAGACATATT TTTCTCTCAT 180 TGTCTTGAAA ACTGAATAGT AAATTTTTTG ATATTTACAA CGACATCAAA ATTAAATTAA 240 ATGGTTAATT TGTTTTGATT TCATCGAGAA AATCATATTA ATTATGATTC ATTGAAATGT 300 CTTAAAATAC ACATCATAAC AAACTATAAC AATAGGAAAA TACTTTTAAA TAAGGAAGAG 360 TTTGTGGTGG ATGGCTTGGG TCTGAAAGTC GAT 393
よる) 特徴を表す記号:rRNA 存在位置:355..393 特徴を決定した方法:S(他の細菌の情報からの推測に
よる) 配列 TGAAGTCTGA ACAAGGTATC CCTACGAGAA CGTGGGGATG GATCACCTCC TTTCTACGGA 60 GTACAAAAGA GTACTTTTAA GTACTATTAA CCTTATTTAC CTAGACCTAT TTATTATATA 120 TTTTGTATGT GCTTTATGGT CTAAGCTTAT ATCTAGTTGA GAGACATATT TTTCTCTCAT 180 TGTCTTGAAA ACTGAATAGT AAATTTTTTG ATATTTACAA CGACATCAAA ATTAAATTAA 240 ATGGTTAATT TGTTTTGATT TCATCGAGAA AATCATATTA ATTATGATTC ATTGAAATGT 300 CTTAAAATAC ACATCATAAC AAACTATAAC AATAGGAAAA TACTTTTAAA TAAGGAAGAG 360 TTTGTGGTGG ATGGCTTGGG TCTGAAAGTC GAT 393
【0040】配列番号:5
配列の長さ:387
配列の型:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
起源
生物名:Mycoplasma arginini
配列の特徴
特徴を表す記号:rRNA, 3'clip
存在位置:1..54
特徴を決定した方法:S(他の細菌の情報からの推測に
よる) 特徴を表す記号:rRNA, 5'clip 存在位置:248..387 特徴を決定した方法:S(他の細菌の情報からの推測に
よる) 配列 GTGAAGTCGT AACAAGGTAT CCCTACGAGA ACGTGGGGAT GGATCACCTC CTTTCATACG 60 GAGTACATAA ATGTTATGGA AAAATTATTT GTATCCAGTT TTAGAGACCT ATCTCTCAAT 120 TTGTTCTTTG AAAACTGAAT ATCGACATTG AAAAATTAAA TTTATTAATA TTTCAAAGTT 180 TAGATCAACC TATAGAATAT ATCATACAAT AGACAAACAA TAGGTCTTAT ACTACTATTA 240 AACAAGATAA GAGTTTTTGG TGGATGCCTT GGGTCTGGAA GTCGATT 387
よる) 特徴を表す記号:rRNA, 5'clip 存在位置:248..387 特徴を決定した方法:S(他の細菌の情報からの推測に
よる) 配列 GTGAAGTCGT AACAAGGTAT CCCTACGAGA ACGTGGGGAT GGATCACCTC CTTTCATACG 60 GAGTACATAA ATGTTATGGA AAAATTATTT GTATCCAGTT TTAGAGACCT ATCTCTCAAT 120 TTGTTCTTTG AAAACTGAAT ATCGACATTG AAAAATTAAA TTTATTAATA TTTCAAAGTT 180 TAGATCAACC TATAGAATAT ATCATACAAT AGACAAACAA TAGGTCTTAT ACTACTATTA 240 AACAAGATAA GAGTTTTTGG TGGATGCCTT GGGTCTGGAA GTCGATT 387
【0041】配列番号:6
配列の長さ:18
配列の型:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸 合成DNA
配列
CCCACGTTCT CGTAGGGA 18
【0042】配列番号:7
配列の長さ:19
配列の型:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸 合成DNA
配列
GYTRCGGTGA ATACGTTCT 19
【0043】配列番号:8
配列の長さ:15
配列の型:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸 合成DNA
配列
CGAGAACGTG GGGAT 15
【0044】列番号:9
配列の長さ:196
配列の型:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Cenomic DNA
起源
生物名:Mycoplasma arginini
配列
TTGAAGTTAT CCATACTTCA TAAATAGTTA ATGGCCAATA TTCGTATCAG TTTGAGAGAC 60
TATCTCTCAT TATCTTGAAC TGATAGAACT GAATAATATA TATCAAATTA GATCAACCTA 120
TAGATATTCA AAATATAGAG ACAATACAAA AACAAAACAA TAGGTCAAAA TATCTTATAC 180
GTAATTAAAA TATATA 196
【0045】配列番号:10
配列の長さ:165
配列の型:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Cenomic DNA
起源
生物名:Mycoplasma orale
配列
CCTATGGAAA AAATATTTGT ATCCAGTTTT GAGAGATTAT CTCTCGTCTT GAACTGAATA 60
TCGACATTGA TATATTAATT AATATTCAAA GTTTAGATCA ACCATAGAAT ATTTATATTT 120
TATAAAGACA AACAATAGGT CATACAATTA ACAAAACTAT TAAAC 165
【0046】配列番号:11
配列の長さ:200
配列の型:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Cenomic DNA
起源
生物名:Mycoplasma salivarium
配列
AAGAAGTTAT CATACTTCTA TGACTAAAGT TAATGGATTT AATATTCGTG ATCCAGTTTT 60
GAGAGAATTA TTTCTGTCTT TTGTTCTTTG AAAACTGAAT TAGACATTGA AAAATTATCA 120
AATCAATATA ATATTTCAAA GTTTAGATCA ACCTATAGAA TATTCTAATA GACAAACAAT 180
AGGTCATACA TTATATTTAT 200
【0047】配列番号:12
配列の長さ:361
配列の型:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Cenomic DNA
起源
生物名:Mycoplasma fermentans
配列
AAGAGTACTT TTAAGTACTA TTAACCTTAT TTACCTAGAC CTATTTATTA TATATTTTGT 60
ATGTGCTTTA TGGTCTAAGC TTATATCTAG TTGAGAGACA TATTTTTCTC TCATTGTCTT 120
GAAAACTGAA TAGTAAATTT TTTGATATTT ACAACGACAT CAAAATTAAA TTAAATGGTT 180
AATTTGTTTT GATTTCATCG AGAAAATCAT ATTAATTATG ATTCATTGAA ATGTCTTAAA 240
ATACACATCA TAACAAACTA TAACAATAGG AAAATACTTT TAAATAAGGA AGAGTTTGTG 300
GTGGATGGCT TGGGTCTGAA AGTCGATGAA GGACGTGATT ACCTGCGATA AGAGCTCTAG 360
A 361
【0048】配列番号:13
配列の長さ:193
配列の型:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Cenomic DNA
起源
生物名:Mycoplasma hominis
配列
ATACGGAGTA CATAAATGTT ATGGAAAAAT TATTTGTATC CAGTTTTAGA GACCTATCTC 60
TCAATTTGTT CTTTGAAAAC TCAATATCGA CATTGAAAAA TTAAATTTAT TAATATTTCA 120
AAGTTTAGAT CAACCTATAG AATATATCAT ACAATAGACA AACAATAGGT CTTATACTAC 180
TATTAAACAA GAT 193
【0049】配列番号:14
配列の長さ:17
配列の型:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Cenomic DNA
起源
生物名:Mycoplasma arginini
配列
GACCTATCTC TCAATTT 17
【0050】配列番号:15
配列の長さ:17
配列の型:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Cenomic DNA
起源
生物名:Mycoplasma orale
配列
TAGTTAATGG CCAATAT 17
【0051】配列番号:16
配列の長さ:17
配列の型:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Cenomic DNA
起源
生物名:Mycoplasma salivarium
配列
TAAGTTAAT GGATTTA 17
【0052】配列番号:17
配列の長さ:17
配列の型:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Cenomic DNA
起源
生物名:Mycoplasma fermentans
配列
ATTATCTCTC GTCTTGA 17
【0053】配列番号:18
配列の長さ:17
配列の型:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Cenomic DNA
起源
生物名:Mycoplasma hominis
配列
CCTTATTTAC CTAGACC 17
【0054】配列番号:19
配列の長さ:189
配列の型:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
起源
生物名:Mycoplasma arginini
配列の特徴
特徴を表す記号:rRNA, 3'clip
存在位置:1..189
特徴を決定した方法:S(他の細菌の情報からの推測に
よる) 配列 CAGATCAGCT ACGCTGGCGG TGAATACGTT CTCGGGTCTT GTACACACCG CCCGTCACAC 60 CATGGGAGCT GGTAATACCC AAAGTCGGTT AGCTAACCTC GGAGGCGACC GCCTAAGGTA 120 GGACTGGTGA CTGGGGTGAA GTCGTAACAA GGTATCCCTA CGAGAACGTG GGGATGGATC 180 ACCTCCTTT 189
よる) 配列 CAGATCAGCT ACGCTGGCGG TGAATACGTT CTCGGGTCTT GTACACACCG CCCGTCACAC 60 CATGGGAGCT GGTAATACCC AAAGTCGGTT AGCTAACCTC GGAGGCGACC GCCTAAGGTA 120 GGACTGGTGA CTGGGGTGAA GTCGTAACAA GGTATCCCTA CGAGAACGTG GGGATGGATC 180 ACCTCCTTT 189
【0055】配列番号:20
配列の長さ:187
配列の型:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
起源
生物名:Mycoplasma orale
配列の特徴
特徴を表す記号:rRNA, 3'clip
存在位置:1..187
特徴を決定した方法:S(他の細菌の情報からの推測に
よる) 配列 CAGATCAGTA CGCTGCGGTG AATACGTTCT CGGGTCTTGT ACACACCGCC CGTCACACCA 60 TGGGAGCTGG TAATACCCAA AGTCGGTTTG CCAACCTCGG AGGCGACTGC CTAAGGTAGG 120 ACTGGTGACT GGGGTGAAGT CGTAACAAGG TATCCCTACG AGAACGTGGG GATGGATTAC 180 CTCCTTT 188
よる) 配列 CAGATCAGTA CGCTGCGGTG AATACGTTCT CGGGTCTTGT ACACACCGCC CGTCACACCA 60 TGGGAGCTGG TAATACCCAA AGTCGGTTTG CCAACCTCGG AGGCGACTGC CTAAGGTAGG 120 ACTGGTGACT GGGGTGAAGT CGTAACAAGG TATCCCTACG AGAACGTGGG GATGGATTAC 180 CTCCTTT 188
【0056】配列番号:21
配列の長さ:142
配列の型:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
起源
生物名:Mycoplasma salivarium
配列の特徴
特徴を表す記号:rRNA, 3'clip
存在位置:1..142
特徴を決定した方法:S(他の細菌の情報からの推測に
よる) 配列 CCGCCCGTCA CACCATGGGA GCTGGTAATA CCCAAAGTCG GTTTGCTAAC CTCGGAGGCG 60 ACTGCCTAAG GTAGGACTGG TGACTGGGGT GAAGTCGTAA CAAGGTATCC CTACGAGAAC 120 GTGGGGATGG ATCACCTCCT TT 142
よる) 配列 CCGCCCGTCA CACCATGGGA GCTGGTAATA CCCAAAGTCG GTTTGCTAAC CTCGGAGGCG 60 ACTGCCTAAG GTAGGACTGG TGACTGGGGT GAAGTCGTAA CAAGGTATCC CTACGAGAAC 120 GTGGGGATGG ATCACCTCCT TT 142
【0057】配列番号:22
配列の長さ:188
配列の型:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
起源
生物名:Mycoplasma fermentans
配列の特徴
特徴を表す記号:rRNA
存在位置:1..188
特徴を決定した方法:S(他の細菌の情報からの推測に
よる) 配列 TAGATCNCGT ACGCTACGGT GAATACGTTC TCGGGTCTTG TACACACCGC CCGTCAAACC 60 ATGGGAGCTG GTAATACCCA AAGTCGGTTT GCTAACCTCG GAGGCGACCG CCTAAGGTAG 120 GACTGGTGAC TGGGGTGAAG TCGTAACAAG GTATCCCTAC GAGAACGTGG GGATGGATCA 180 CCTCCTTT 188
よる) 配列 TAGATCNCGT ACGCTACGGT GAATACGTTC TCGGGTCTTG TACACACCGC CCGTCAAACC 60 ATGGGAGCTG GTAATACCCA AAGTCGGTTT GCTAACCTCG GAGGCGACCG CCTAAGGTAG 120 GACTGGTGAC TGGGGTGAAG TCGTAACAAG GTATCCCTAC GAGAACGTGG GGATGGATCA 180 CCTCCTTT 188
【0058】配列番号:23
配列の長さ:180
配列の型:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
起源
生物名:Mycoplasma hominis
配列の特徴
特徴を表す記号:rRNA, 3'clip
存在位置:1..180
特徴を決定した方法:S(他の細菌の情報からの推測に
よる) 配列 CAGATCAGCT ATGCTGCGGT GAATACGTTC TCGGGTCTTG TACACACCGC CCGTCAAACC 60 ATGGGAGCTG GTAATGCCCG AAGTCGGTTT ATAAACAAAC TGCCTAAGGC AGGACTGGTG 120 ACTGGGGTTA AGTCGTAACA AGGTATCCCT ACGAGAACGT GGGGATGGAT CACCTCCTTT 180
よる) 配列 CAGATCAGCT ATGCTGCGGT GAATACGTTC TCGGGTCTTG TACACACCGC CCGTCAAACC 60 ATGGGAGCTG GTAATGCCCG AAGTCGGTTT ATAAACAAAC TGCCTAAGGC AGGACTGGTG 120 ACTGGGGTTA AGTCGTAACA AGGTATCCCT ACGAGAACGT GGGGATGGAT CACCTCCTTT 180
【0059】配列番号:24
配列の長さ:191
配列の型:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
起源
生物名:Acholeplasma laidlawii
配列の特徴
特徴を表す記号:rRNA, 3'clip
存在位置:1..191
特徴を決定した方法:S(他の細菌の情報からの推測に
よる) 配列 CAAATCAGCA TGTTGCGGTG AATACGTTCT CGGGGTTTGT ACACACCGCC CGTCAAACCA 60 CGAAAGTGGG CAATACCCAA CGCCGGTGGC CTAACCCGAA AGGGAGGGAG CCGTCTAAGG 120 TAGGGTCCAT GATTGGGGTT AAGTCGTAAC AAGGTATCCC TACGGGAACG TGGGGATGGA 180 TCACCTCCTT T 191
よる) 配列 CAAATCAGCA TGTTGCGGTG AATACGTTCT CGGGGTTTGT ACACACCGCC CGTCAAACCA 60 CGAAAGTGGG CAATACCCAA CGCCGGTGGC CTAACCCGAA AGGGAGGGAG CCGTCTAAGG 120 TAGGGTCCAT GATTGGGGTT AAGTCGTAAC AAGGTATCCC TACGGGAACG TGGGGATGGA 180 TCACCTCCTT T 191
【0060】配列番号:25
配列の長さ:188
配列の型:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
起源
生物名:Escherichia coli
配列の特徴
特徴を表す記号:rRNA, 3'clip
存在位置:1..188
特徴を決定した方法:S(他の細菌の情報からの推測に
よる) 配列 TGGATCAGAA TGCCACGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT ACACACCGCC CGTCACACCA 60 TGGGAGTGGG TTGCAAAAGA AGTAGGTAGC TTAACCTTCG GGAGGGCGCT TACCACTTTG 120 TGATTCATGA CTGGGGGTGA AGTCGTAACA AGGTAACCGT AGGGGAACCT GGTTGGATCA 180 CCTCCTTA 188
よる) 配列 TGGATCAGAA TGCCACGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT ACACACCGCC CGTCACACCA 60 TGGGAGTGGG TTGCAAAAGA AGTAGGTAGC TTAACCTTCG GGAGGGCGCT TACCACTTTG 120 TGATTCATGA CTGGGGGTGA AGTCGTAACA AGGTAACCGT AGGGGAACCT GGTTGGATCA 180 CCTCCTTA 188
【0061】配列番号:26
配列の長さ:190
配列の型:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
起源
生物名:Bacillus subtilis
配列の特徴
特徴を表す記号:rRNA, 3'clip
存在位置:1..190
特徴を決定した方法:S(他の細菌の情報からの推測に
よる) 配列 CGGATCAGCA TGCCGCGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT ACACACCGCC CGTCACACCA 60 CGAGAGTTTG TAACACCCGA AGTCGGTGAG GTAACCTTTT AGGAGCCAGC CGCCGAAGGT 120 GGGACAGATG ATTGGGGTGA AGTCGTAACA AGGTAGCCGT ATCGGAAGGT GCGGCTGGAT 180 CACCTCCTTT 190
よる) 配列 CGGATCAGCA TGCCGCGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT ACACACCGCC CGTCACACCA 60 CGAGAGTTTG TAACACCCGA AGTCGGTGAG GTAACCTTTT AGGAGCCAGC CGCCGAAGGT 120 GGGACAGATG ATTGGGGTGA AGTCGTAACA AGGTAGCCGT ATCGGAAGGT GCGGCTGGAT 180 CACCTCCTTT 190
【図面の簡単な説明】
【図1】各種マイコプラズマの16S rRNA遺伝子
の一部。遺伝子中におけるプライマーの位置が*で示さ
れており、各プライマーの塩基配列は配列番号19〜2
6に示される配列に対応している。
の一部。遺伝子中におけるプライマーの位置が*で示さ
れており、各プライマーの塩基配列は配列番号19〜2
6に示される配列に対応している。
【図2】図1に続く各種マイコプラズマの16S rR
NA遺伝子の一部。
NA遺伝子の一部。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 岡 訓 弘
広島県高田郡甲田町下甲立1624 湧永製薬
株式会社内
Claims (20)
- 【請求項1】配列番号1〜5の配列式で示される核酸、
これらと相補的な核酸およびこれらの変異配列で示され
る核酸から選ばれる、核酸断片。 - 【請求項2】請求項1に記載のいずれかの核酸中の部分
配列であってプライマーまたはプローブとして利用可能
な核酸からなる、核酸断片。 - 【請求項3】プライマーとして利用可能な核酸が10〜
100塩基の長さであり、プローブとして利用可能な核
酸が7塩基の長さ〜請求項1に記載の各核酸の全塩基数
よりも少ない長さである、請求項2記載の核酸断片。 - 【請求項4】プライマーとして利用可能な核酸が配列番
号6の配列式で示される核酸およびその変異配列で示さ
れる核酸から選ばれる、請求項3記載の核酸断片。 - 【請求項5】プローブとして利用可能な核酸が下式
(1)、(2)および配列番号8の配列式示される核
酸、これらと相補的な核酸およびこれらの変異配列で示
される核酸から選ばれる、請求項3記載の核酸断片。 5′ TCCCTAC (1) 5′ GGGATGGA (2) - 【請求項6】変異配列が、核酸の塩基配列の一部を欠失
するかまたは他の塩基もしくは塩基配列で置換もしくは
付加されたものである、請求項1〜5のいずれか1項に
記載の核酸断片。 - 【請求項7】請求項2〜4および6のいずれか1項に記
載の核酸断片であって標識物または(および)固相担体
と結合可能な部位が導入されていることもある核酸断片
からなるプライマー。 - 【請求項8】請求項1〜3、5および6のいずれか1項
に記載の核酸の塩基配列を有する核酸断片であって標識
物または(および)固相担体と結合可能な部位が導入さ
れていることもある核酸断片からなる、プローブ。 - 【請求項9】2種の核酸断片の組み合わせからなるプラ
イマーであって、少なくとも一方の核酸断片が請求項7
に記載の核酸断片から選ばれるものであり、それぞれの
核酸断片に標識物または(および)固相担体と結合可能
な部位が導入されていることもある、プライマー。 - 【請求項10】2種の組み合わせが配列番号6および7
の配列式で示される核酸またはその変異配列で示される
核酸からなる核酸断片である、請求項9記載のプライマ
ー。(ただし、配列番号7の配列式中YはCまたはTで
あり、RはGまたはAである) - 【請求項11】配列番号7の配列式において、YがCで
RがGである請求項10記載のプライマー。 - 【請求項12】変異配列が核酸断片の塩基配列の一部を
欠失するか、または他の塩基もしくは塩基配列で置換も
しくは付加されたものである、請求項7〜11のいずれ
か1項に記載のプライマー。 - 【請求項13】標識物または部位が核酸断片の5′末端
側に導入されている、請求項7〜12のいずれか1項に
記載のプライマーまたはプローブ。 - 【請求項14】標識物または部位がビオチン残基、2,
4‐ジニトロフェニル基、ジゴキシゲニン残基のいずれ
かである、請求項7〜13のいずれか1項に記載のプラ
イマーまたはプローブ。 - 【請求項15】請求項7または9に記載のプライマーを
用い、下記(a)〜(d)の工程を実施することを特徴
とする、マイコプラズマの検出法。 (a) マイコプラズマの存在の有無を検出するための
検体を用意する。 (b) 必要に応じて、検体について細胞破砕処理を行
う。 (c) 検体中に上記プライマーを加えてプライマーの
伸張反応を行う。 (d) 工程(c)によって得られる伸張反応物につい
て、合成核酸鎖検出のための検出操作を行う。 - 【請求項16】請求項9に記載の2種のプライマーを用
いる、請求項15記載の検出法。 - 【請求項17】2種の組み合わせが配列番号6の配列式
で示される核酸またはその変異配列からなる核酸断片と
配列番号7の配列式で示される核酸またはその変異配列
からなる核酸断片である、請求項16記載の検出法。
(ただし、配列番号7の配列式中YはCまたはTであ
り、RはGまたはAである) - 【請求項18】配列番号7の配列式において、YがCで
RがGである、請求項17記載の検出法。 - 【請求項19】請求項1〜3,5または6に記載の核酸
の塩基配列を有する核酸断片の少なくとも1種をプロー
ブとして用いることを特徴とする、マイコプラズマの検
出法。 - 【請求項20】請求項5に記載の配列で示される核酸、
これらと相補的な核酸およびこれらの変異配列で示され
る核酸の塩基配列を有する核酸断片の少なくとも1種を
プローブとして用いる、請求項19記載の検出法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3153541A JPH0588A (ja) | 1991-06-25 | 1991-06-25 | 新規核酸断片およびこれらを用いたマイコプラズマの検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3153541A JPH0588A (ja) | 1991-06-25 | 1991-06-25 | 新規核酸断片およびこれらを用いたマイコプラズマの検出法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0588A true JPH0588A (ja) | 1993-01-08 |
Family
ID=15564775
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3153541A Pending JPH0588A (ja) | 1991-06-25 | 1991-06-25 | 新規核酸断片およびこれらを用いたマイコプラズマの検出法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0588A (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5654418A (en) * | 1990-10-19 | 1997-08-05 | Becton Dickinson And Company | Nucleic acid probes useful for detecting microorganisms associated with vaginal infections |
WO2016038877A1 (ja) * | 2014-09-10 | 2016-03-17 | 国立大学法人東京医科歯科大学 | マイコプラズマを検出する方法 |
KR20170041737A (ko) | 2014-08-08 | 2017-04-17 | 도레이 카부시키가이샤 | 내용제성 분리막 |
JPWO2018199113A1 (ja) * | 2017-04-26 | 2020-03-12 | 日水製薬株式会社 | マイコプラズマの集菌方法 |
-
1991
- 1991-06-25 JP JP3153541A patent/JPH0588A/ja active Pending
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5654418A (en) * | 1990-10-19 | 1997-08-05 | Becton Dickinson And Company | Nucleic acid probes useful for detecting microorganisms associated with vaginal infections |
KR20170041737A (ko) | 2014-08-08 | 2017-04-17 | 도레이 카부시키가이샤 | 내용제성 분리막 |
US10099183B2 (en) | 2014-08-08 | 2018-10-16 | Toray Industries, Inc. | Solvent-resistant separation membrane |
WO2016038877A1 (ja) * | 2014-09-10 | 2016-03-17 | 国立大学法人東京医科歯科大学 | マイコプラズマを検出する方法 |
JPWO2016038877A1 (ja) * | 2014-09-10 | 2017-07-06 | 国立大学法人 東京医科歯科大学 | マイコプラズマを検出する方法 |
US10640834B2 (en) | 2014-09-10 | 2020-05-05 | National University Corporation Tokyo Medical And Dental University | Method for detecting mycoplasma |
JPWO2018199113A1 (ja) * | 2017-04-26 | 2020-03-12 | 日水製薬株式会社 | マイコプラズマの集菌方法 |
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