JPH1033188A - 多重核酸増幅によるミコバクテリアの検出 - Google Patents

多重核酸増幅によるミコバクテリアの検出

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JPH1033188A
JPH1033188A JP9112677A JP11267797A JPH1033188A JP H1033188 A JPH1033188 A JP H1033188A JP 9112677 A JP9112677 A JP 9112677A JP 11267797 A JP11267797 A JP 11267797A JP H1033188 A JPH1033188 A JP H1033188A
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Cheryl H Dean
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ジェームズ・エル・シュラム
Deborah R Howard
デボラ・アール・ハワード
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マーガレット・エス・デイ
David J Wright
デービッド・ジェイ・ライト
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 【解決手段】 ヒト型結核菌（Mycobacterium tubercul
osis）（Ｍ．ｔｂ）複合体のＩＳ６１１０挿入要素およ
びほとんど全てのミコバクテリアに共通の１６ＳｒＤＮ
Ａ標的のアダプターに媒介された多重らせん増幅のため
のプライマーおよび方法を記載する。いくつかの実施態
様において、プライマーを、好熱性ＳＤＡにおいて有効
な多重らせん増幅に対して最適化する。本発明の多重ら
せん鎖置換増幅法は、単一増幅反応において、ヒト型結
核菌を同時に識別し且つミコバクテリアの臨床的に関連
した種のほとんど全部についてスクリーニングすること
ができる。更に、二つの標的との同時増幅のために設計
された内部対照配列を開示し、標的の増幅効率および／
または定量の評価を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸増幅を用いる
微生物の検出および／または識別を含めた、核酸増幅に
関する。
【０００２】
【従来の技術】ミコバクテリアは、抗酸性、非自動性、
グラム陽性の桿状体である細菌の属である。該属は、限
定されるものではないが、ミコバクテリウム・アフリカ
ヌム（Mycobacterium africanum)、鳥型結核菌（M.aviu
m)、ウシ型結核菌（M.bovis)、ウシ型結核菌−ＢＣＧ、
Ｍ．ケロネエ（chelonae）、Ｍ．フォルツイツム（fort
uitum)、Ｍ．ゴルドネエ（gordonae）、Ｍ．イントラセ
ルレア（intracellulare)、Ｍ．カンサシイ（Kansasi
i）、Ｍ．ミクロティ（Microti)、Ｍ．スクロフラセウ
ム（scrofulaceum）、パラ結核菌（M.paratuberculosi
s）およびヒト型結核菌（M.tuberculosis）を含むいく
つかの種を含む。これらの微生物のいくつかは、疾患の
原因物質である。最初の１９５３年以来、ミコバクテリ
ア感染の症例は米国において増加している。特に問題な
のは結核であり、その病因物質はヒト型結核菌である。
多数のこれら新規の症例はエイズ流行に関係しており、
それは、ミコバクテリアによる感染に対して特に感受性
である免疫無防備状態の集団を与える。他のミコバクテ
リア感染もまた、得られる免疫無防備状態の増加の結果
として増加している。鳥型結核菌、ミコバクテリウム・
カンサシイおよび他の非結核ミコバクテリアは、ＨＩＶ
感染および他の免疫無防備状態の患者において日和見病
原体として見出される。
【０００３】現在、ミコバクテリア感染の診断は、主
に、抗酸性染色および微生物の培養に続く生化学的検定
にたよっている。これらの手順は時間がかかり、しかも
慣用的な培養法を用いる典型的な診断は６週間程度かか
ることがある。BACTECTM システム（ベクトン・ディキ
ンソン・ミクロバイオロジー・システムズ（Becton Dic
kinson Microbiology Systems)，スパークス，ＭＤ）の
ような自動培養システムは、診断のための時間を１〜２
週間まで減らすことができる。しかしながら、ミコバク
テリア感染を診断するのに必要な時間を１週間未満に、
好ましくは、ほぼ１日に短縮する必要がなおある。サザ
ンハイブリダイゼーションまたはドットブロットなどの
オリゴヌクレオチドプローブに基く検定は、迅速な結果
（すなわち、１日またはそれ未満で）を回復することが
できる。核酸の増幅に基く検定は、しばしば、何時間か
以内のより一層迅速な結果を提供しうる。ミコバクテリ
ア感染の診断に対して、このような方法は、微生物の具
体的な同定が望まれる場合、ミコバクテリウム属に特異
的なまたは特定の種のミコバクテリアに特異的なオリゴ
ヌクレオチドプローブまたはプライマーの開発を必要と
する。
【０００４】しかしながら、核酸増幅技術を用いる特定
の核酸の診断およびスクリーニングは、概して、一つの
標的配列を一度に増幅する必要によって制限されてき
た。多数の可能な核酸配列のいずれかが存在しうる場合
（例えば、伝染病診断）、この手順によって多数の別々
の検定を行うことは厄介であり且つ多くの時間を必要と
する。報告によると多数の標的配列の同時増幅を可能に
するＰＣＲの改良は、公開された欧州特許出願第036425
5号明細書で記載されている。これは多重らせんＤＮＡ
増幅と称される。この方法では、多数のプライマー対
を、標的配列含有核酸に対して加える。それぞれのプラ
イマー対は種々の選択された標的配列に対してハイブリ
ッド形成し、それは引き続き、ＰＣＲと同様の温度循環
反応で増幅される。多重らせん増幅は、ＳＤＡに対して
も開発された。この方法は、アダプターに媒介された多
重らせん形成と称され、ここにおいて、アダプター配列
は、一連の伸長および鎖置換工程においてアダプタープ
ライマーによって標的配列の末端に付加される。これら
の過程は、米国特許第5,422,252号明細書および米国特
許第5,470,723号明細書（両方とも援用される）で記載
されている。一つの実施態様において、増幅される二つ
の標的配列の一方はＭ．ｔｂ複合体特異的であり（例え
ば、ＩＳ６１１０）且つもう一方の標的配列は、ミコバ
クテリアのほとんど全部の種に共通している（例えば、
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、「１６Ｓ ｒＤＮＡ」）。そ
れぞれの標的鎖の一端は、それに対して、もう一方の標
的の末端セグメントと実質的に同一の配列を付加するこ
とによって修飾される。それぞれの標的鎖のもう一端
は、加えられたアダプター配列を持っていないし、そし
て増幅プライマー対の一方のメンバーに対するその元の
相補性を保持している。得られたアダプター修飾標的は
両方とも、１対の増幅プライマーによって増幅されるこ
とができ、その対の一方のメンバーは二つの元の標的配
列の一方に対して相補的であり且つその対のもう一方の
メンバーは、二つの元の標的配列のもう一方に対して相
補的である。それぞれのアダプター修飾標的上の増幅プ
ライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長は、それ
れの末端にニッキング酵素認識部位を含むフラグメント
を生じる。両方のフラグメントは、１対の増幅プライマ
ーを用いてＳＤＡによって増幅可能である。
【０００５】多くの場合、核酸増幅技術は、診断用検定
において定性的結果を生じるのに用いられてきた。しか
しながら、標的配列の存在または不存在を検出できるの
みならず、最初に存在する標的配列の量を定量すること
もできる核酸増幅の方法を開発することに大いに関心が
持たれてきた。内部対照配列は、このような定量的結果
を生じ且つ増幅の阻害（すなわち、偽陰性）を検出する
試みにおいて、ＰＣＲで用いられてきた。例えば、ＷＯ
93/02215号明細書およびＷＯ92/11273号明細書を参照さ
れたい。ＰＣＲにおいて、増幅された標的および対照配
列は、ＰＣＲの速度が標的の長さによって比較的影響さ
れないことが知られているので、種々のフラグメント長
さによって区別されうる。ＳＤＡおよび他の等温増幅反
応のための内部対照配列は、米国特許第5,457,027号明
細書（本明細 書に援用される）で記載されている。
【０００６】下記の用語を、本明細書中において以下の
ように定義する。
【０００７】増幅プライマーは、標的配列に対するハイ
ブリダイゼーション後のプライマーの伸長による標的配
列の増幅のためのプライマーである。ＳＤＡ増幅プライ
マーの３′末端（標的結合配列）は、標的配列の３′末
端でハイブリッド形成する。標的結合配列は約１０〜２
５ヌクレオチド長さであり且つ増幅プライマーに対して
ハイブリダイゼーション特異性を与える。ＳＤＡ増幅プ
ライマーは、更に、標的結合配列に対して５′に制限エ
ンドヌクレアーゼの認識部位を含む。その認識部位は、
Ｇ．ウォーカーら（1992年，PNAS 89:392-396 および 1
992年，Nucl.Acids Res.20:1691-1696）によって記載さ
れたように、認識部位が半修飾されている場合にＤＮＡ
二重らせんの一方の鎖にニックを入れるであろう制限エ
ンドヌクレアーゼに対する。制限エンドヌクレアーゼ認
識部位に対して５′の約１０〜２５ヌクレオチド（「尾
部」）は、増幅プライマーの残りの部分がＳＤＡの際に
ニックを入れられ且つ置換される場合、ポリメラーゼリ
プライミング部位として機能する。尾部ヌクレオチドの
リプライミング機能は、ＳＤＡ反応を持続し且つ単一標
的分子からの多数のアンプリコンの合成を可能にする。
尾部の配列は、概して、臨界的ではなく、そして常套手
段によって選択され且つ修飾されて、ハイブリダイゼー
ションに望ましいＴmを得ることができる。標的結合配
列は、その標的特異性を決定するプライマーの一部分で
あるので、標的の末端に特殊な配列を必要としない増幅
法に対して、増幅プライマーは、概して、本質的に標的
結合配列だけから成る。標的に対して付加された特殊な
配列（例えば、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡまたは転写に基く増
幅のためのＲＮＡポリメラーゼプロモーター）を必要と
するＳＤＡ以外の増幅法に対して、必要とされる特殊な
配列は、プライマーのハイブリダイゼーション特異性を
変更することなく、オリゴヌクレオチドの製造のための
常套法を用いて標的結合配列に対して結合させることが
できる。
【０００８】アダプタープライマーは、標的配列に対し
てハイブリッド形成する約１０〜２５ヌクレオチドの配
列をその３′末端（標的結合配列）に有するオリゴヌク
レオチドである。標的結合配列はまた、アダプタープラ
イマーに対して標的特異性を与える。アダプタープライ
マーの５′末端は、やはり約１０〜２５ヌクレオチド長
さのアダプター配列である。アダプター配列は、増幅プ
ライマーの一つの３′末端と実質的に同一である配列で
あってよいしまたはそれは、相補的標的結合配列を含む
増幅プライマーが製造されうる何等かの規定の配列であ
ってよい。アダプタープライマーは、ニッキング可能な
制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含まないので、それ
らはＳＤＡにおいて増幅プライマーとして機能しない。
【０００９】バンパープライマーすなわち外部プライマ
ーは、等温増幅反応においてプライマー伸長生成物を置
換するのに用いられるプライマーである。バンパープラ
イマーは、バンパープライマーの伸長が下流の増幅プラ
イマーおよびその伸長生成物を置換するように、増幅プ
ライマーの上流の標的配列に対してアニーリングする。
【００１０】標的または標的配列という用語は、増幅さ
れる核酸配列を意味する。これらは、増幅される元の核
酸配列およびその相補的第二鎖（アダプター配列を加え
る前の）、本明細書中の記載の元の配列のアダプター修
飾コピーのどちらかの鎖、並びにアダプター配列を元の
配列に対して付加する反応の中間体生成物である元の配
列のコピーのどちらかの鎖を包含する。
【００１１】増幅反応中に生じる標的配列のコピーは、
増幅生成物、アンプリマーまたはアンプリコンと称され
る。
【００１２】伸長生成物という用語は、プライマーのハ
イブリダイゼーションおよび標的配列を鋳型として用い
るポリメラーゼによるプライマーの伸長によって生成さ
れた標的配列のコピーを意味する。
【００１３】検定プローブという用語は、検定の検出ま
たは同定部分で用いられるオリゴヌクレオチドのいずれ
かを意味する。例えば、本発明において、検定プローブ
は、ミコバクテリアの属−または種特異的検出または同
定に用いられる。検出用プローブおよび捕捉プローブ
は、検定プローブの例である。
【００１４】検定範囲または検定範囲配列は、検定プロ
ーブがハイブリッド形成する標的配列の部分または他の
核酸である。
【００１５】種特異的という用語は、同属の他の種また
は異なる属の種における実質的な検出、増幅またはオリ
ゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを含まない、微
生物の種または関連種の属における検出、増幅またはオ
リゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを意味する。
属特異的とは、異なる属の種における実質的な検出、増
幅またはオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを
含まない、ある属の種の大部分の検出、増幅またはオリ
ゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを意味する。
【００１６】同一の配列は、同様の相補的ヌクレオチド
配列に対してハイブリッド形成するであろう。実質的に
同一の配列は、それらもまた同様のヌクレオチド配列に
対してハイブリッド形成するように十分にそれらのヌク
レオチド配列が類似している。アダプタープライマー／
増幅プライマー対中のアダプター配列および増幅プライ
マー標的結合配列は、隣接する標的配列のセグメントで
ある。増幅プライマーの標的結合配列と実質的に同一で
あるアダプター配列含有アダープタープライマーは、増
幅プライマー標的結合配列より多いまたは少ない隣接標
的配列を包含しうるし、またはそれは、一つまたはそれ
以上の単一ヌクレオチド相違を含んでいてよい。しかし
ながら、増幅プライマーの標的結合配列とアダプタープ
ライマーのアダプター配列との間のこれらの僅かな相違
は、アダプター修飾標的中のアダプター配列の補体に対
する増幅プライマーのハイブリダイゼーションを妨げな
いし、したがって、増幅反応をほとんど阻害しない。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒト型結核
菌（Ｍ．ｔｂ）複合体のＩＳ６１１０挿入要素およびミ
コバクテリアの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ
ｒＤＮＡ）のアダプターに媒介された多重らせん増幅
のためのプライマーを提供する。これらのプライマー
は、ヒト型結核菌複合体および他の臨床的に関連したミ
コバクテリアの種を単一核酸増幅反応において検出する
および／または同定するのに有用である。該プライマー
は、好熱性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ）によって用いるのに
特に十分に適している。
【００１８】
【課題を解決するための手段】一つの実施態様におい
て、増幅反応は、更に、内部対照配列を含む。この内部
対照配列は、ＩＳ６１１０、１６Ｓおよび内部対照標的
の同時増幅（三重らせん増幅）のための１対の増幅プラ
イマーを用いる多重らせん増幅プロトコルにおいて二つ
の標的配列と一緒に同時増幅される。この実施態様にお
いて、単一増幅反応は、標的を定量するまたは増幅反応
の阻害を検出するおよび臨床的に関連したミコバクテリ
アに関係した標的配列を検出するまたは識別するための
手段を提供する。
【００１９】本発明は、プライマーの配列特異的ハイブ
リダイゼーションによる、特に、ｔＳＤＡ（多重らせん
ｔＳＤＡ）による多数の標的配列の同時増幅の方法を提
供する。該方法は、多数の標的配列を同時増幅するのに
１対の増幅プライマーを用いる。これは、標的に対して
規定のアダプター配列を付加し、そして本明細書中で
「アダプターに媒介された多重らせん形成」と称される
方法においてプライマー伸長によって増幅させることに
より達成される。
【００２０】ＩＳ６１１０挿入要素の完全なヌクレオチ
ド配列は、ティリー（Thierry）ら（1990年，Nucleic A
cids Res.18,188）によって記載された。本発明の方法
は、ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｂ）複合体の種（ヒト型結核
菌、ウシ型結核菌、ウシ型結核菌−ＢＣＧ、Ｍ．アフリ
カヌムおよびＭ．ミクロティ）に存在するＩＳ６１１０
挿入要素中の標的配列の増幅のためのプライマーを提供
する。該プライマーは、ヌクレオチド９７０〜１０２５
のＩＳ６１１０のセグメントを増幅する。増幅プライマ
ーの標的結合配列およびＩＳ６１１０標的のアダプター
プライマーは、Ｍ．ｔｂ複合体に対する種特異性を与え
るので、それは、種特異的であるアダプター修飾反応で
ある。ＩＳ６１１０標的の種特異的アダプター修飾後、
それは、アダプター修飾１６ＳｒＤＮＡ（属特異的）標
的と同様の増幅プライマー対によって増幅される。
【００２１】ミコバクテリアの様々な種の１６Ｓリボソ
ーム遺伝子の配列は、ミコバクテリアの臨床的に関連し
た種のほぼ全部に存在するが非ミコバクテリア種には不
存在の標的の増幅のための属特異的プライマーを設計す
るのに用いられた。Ｇ．Ｔ．ウォーカーら（1994年，Nu
cl.Acids Res.22,2670-2677）によって示されたよう
に、ヌクレオチド５０７〜６０３位の選択されたヒト結
核菌配列は、ウシ型結核菌、ウシ型結核菌−ＢＣＧ、鳥
型結核菌、Ｍ．イントラセルレア、Ｍ．カンサシイ、
Ｍ．ガストリ（gastri）、パラ結核 菌、Ｍ．マルモエ
ンス（malmoense）、Ｍ．スズルガイ（szulgai）、Ｍ．
ゴルドネエ、らい菌（M.leprae）、Ｍ．ウルセランス
（ulcerans）、Ｍ．アシアティクム（asiaticum）およ
びＭ．スクロフラセウムにおける配列と同一である。配
列データベース中の若干の種に対して、未決定のヌクレ
オチドは５８７位または５８８位に記録されている。
Ｍ．テレエ（terrae）、Ｍ．ケロネエ、Ｍ．フォルツイ
ツム、およびＭ．マリヌム（marinum）の本発明者の菌
株は、３か所のヌクレオチド位置においてこの共通配列
とは異 なる。Ｍ．マリヌムの本発明者の菌株の配列
は、この微生物の GENBANK 配列が、報告によるとウシ
型結核菌と同一であったがＭ．テレエとは同一でなかっ
たので意外であった。Ｍ．フラベセンス（flavescen
s）、Ｍ．キセノピ（xenopi）およびＭ．ゲナベンス
（genavense）は、より広範な配列可変性を示す。この
標的配列は、他の場合には概してミコバクテリアと同様
である微生物のＭ．ｔｂ配列と有意に異なる。しかしな
がら、ミコバクテリア中の配列可変性にもかかわらず、
ヌクレオチド５３９〜５８７からのセグメントを増幅す
るように設計されたプライマーは、ミコバクテリアの臨
床的に関連した属において標的を特異的に増幅させた
が、近縁の非ミコバクテリア種では増幅させないことが
判った。１６ＳｒＤＮＡ標的の増幅プライマーおよびア
ダプタープライマーの標的結合配列はミコバクテリウム
属特異性を与えるので、それは、属特異的であるアダプ
ター修飾反応である。１６Ｓ ｒＤＮＡ標的の属特異的
アダプター修飾後、それは、アダプター修飾ＩＳ６１１
０（種特異的）標的と同様の増幅プライマー対によって
増幅される。
【００２２】本発明の増幅およびアダプタープライマー
は、多重らせんＳＤＡで用いられて、Ｍ．ｔｂ複合体の
種を示すＩＳ６１１０標的配列およびミコバクテリウム
属の種を示す１６ＳｒＲＮＡ標的配列を同時に増幅す
る。ＩＳ６１１０および１６Ｓアンプリコンの検出は、
試料中のヒト型結核菌複合微生物の存在を示す。１６Ｓ
のみの検出は、非Ｍ．ｔｂ複合ミコバクテリアの存在を
示す。増幅およびアダプタープライマーは、好熱性ＳＤ
Ａにおいて用いることができるが、慣用的な更に低温の
ＳＤＡ反応においても用いることができる。米国特許第
5,422,252号明細書で記載のように、二つの異なる標的
の同時増幅に通常必要とされる４個の増幅プライマーの
内の二つは、多重らせんＳＤＡにおいて、第一標的の一
端を第二標的に一端に付加し且つ逆の場合も同じである
アダプタープライマーによって置換される。種−および
属特異的アダプター修飾反応後、両方の標的は、１対の
増幅プライマー（それぞれ、元の標的のそれぞれの一端
に向けられている）によって増幅され、必要な増幅プラ
イマーの数を４個から２個に減少させることができる。
増幅プライマー数の減少は、基底の増幅を減少させ且つ
増幅された標的の収率を向上させる。増幅が、ｔＳＤＡ
のより高い反応温度で行われる場合、本発明のプライマ
ーは、米国特許第5,470,723号明細書で記載の増幅およ
びアダプタープライマーを用いる従来の多重らせんＳＤ
Ａよりも約４倍速く且つ約１０倍大きい感度で二つの標
的を検出することを可能にする。
【００２３】本発明のプライマーおよびプローブのいく
つかの実施態様を表Ｉに挙げる。増幅プライマーおよび
アダプタープライマーの標的結合配列をイタリック体で
示す。増幅プライマーの制限エンドヌクレアーゼ認識部
位を太字で示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】捕捉および検出用プローブ配列番号：１７
および配列番号：１８は、内部対照配列の検出のための
多重らせん系２において置換することができる。同様
に、配列番号：１４は、多重らせん系２において１６Ｓ
ｒＤＮＡ検出用プローブとして置換することができる
し、そして配列番号：１５および配列番号：１６は、多
重らせん系２においてＩＳ６１１０捕捉および検出用プ
ローブとして置換することができる。更に別の検定プロ
ーブを、種々の標的中のプライマー結合部位間の配列に
基いて常套手段によって設計することができる。これら
の配列は、内部対照について上記に並びにティリーらお
よびウォーカーら（1994）で示されている。
【００２６】表Ｉで示された増幅およびアダプタープラ
イマーの標的結合配列を、ハイブリダイゼーション特異
性を変更することなく逆向きにしうることは当業者にも
明らかであろう（系１および系２プライマー配列を比較
されたい）。すなわち、系１または系２における種々の
ＩＳ６１１０アダプタープライマーの標的結合配列は、
ＩＳ６１１０増幅プライマーの標的結合配列として用い
ることができ、それを次に、その系に示されたＩＳ６１
１０増幅プライマーの標的結合配列を含むアダプタープ
ライマーと対合させる。同様に、１６Ｓ ｒＤＮＡアダ
プターおよび増幅プライマー標的結合配列は、本発明に
よって代わりのアダプター／増幅プライマー対を生じる
ように逆向きにすることができる。内部対照配列が望ま
れる場合、引き続き、その末端は、増幅プライマー結合
を可能にするように適宜に変更されるであろう。例え
ば、プライマー中の標的結合配列が逆の場合、配列番
号：２６は、系１において用いるのに適当な内部対照配
列であろうし、そして配列番号：１２は、系２で用いる
のに適当な内部対照配列であろう。
【００２７】本発明の多重らせん増幅系は、一つの１６
Ｓ ｒＤＮＡアダプタープライマーおよび一つのＩＳ６
１１０アダプタープライマーを用いる。表Ｉは、多重ら
せん系１においてこれらのアダプタープライマーのそれ
ぞれに対していくつか有用な代替物を挙げる。配列番
号：３および配列番号：４は、ＳＤＡに対する多重らせ
ん系１で最も効率よく働くことが判った。対照的に、配
列番号：５を用いる多重らせん系１は、配列番号：３ま
たは配列番号：４が１６Ｓ ｒＤＮＡアダプタープライ
マーである場合よりも約１０倍低い増幅生成物収率を生
じる。配列番号：５は、ただ一つのヌクレオチド（表Ｉ
で下線を施されている）だけが配列番号：３および配列
番号：４と異なる。しかしながら、配列番号：５におけ
る配列の相違は、このプライマーが１６Ｓ ｒＤＮＡ標
的に対してハイブリッド形成する場合に完全な対合を生
じるが、配列番号：３および配列番号：４の配列は、標
的との一つの誤対合をこの位置に含む。これらのアダプ
タープライマーの３種類全部が本発明の方法で機能する
が、標的に対して完全な相補性を有するアダプタープラ
イマーが、相補性がより少ない二つよりもあまり有効で
なかったことは意外であった。
【００２８】場合により、アダプターに媒介された多重
らせんＳＤＡ反応は、米国特許第5,457,027号明細書で
記載のように内部対照配列を含むことができる。内部対
照配列の各末端は、増幅プライマーの一つ（すなわち、
二つの標的のそれぞれを表す一端）に対してハイブリッ
ド形成するように設計されるので、内部対照配列は、二
つのアダプター修飾標的配列を増幅する同様の二つの増
幅プライマーを用いて同時増幅することができる。配列
番号：１２は、多重らせん系１の増幅プライマーと一緒
に用いるために設計され、そして配列番号：２６は、多
重らせん系２の増幅プライマーと一緒に、すなわち、選
択された増幅プライマーの標的結合配列に対してハイブ
リッド形成する末端と一緒に用いるために設計される。
表Ｉで挙げた具体的な捕捉および検出用プローブは、概
して、臨界的ではなく、内部対照配列並びに１６Ｓ ｒ
ＤＮＡおよびＩＳ６１１０標的の検出に適当な別の検定
プローブ（例えば、捕捉および検出用プローブ）を、検
出される配列の情報を用いて常套手段によって設計する
ことができる。
【００２９】増幅プライマーおよびアダプタープライマ
ーの標的結合配列は、属または種にハイブリダイゼーシ
ョン特異性を与え、したがって、検定に対する種−およ
び属特異性を提供する。標的結合標的は、本発明の種特
異的／属特異的多重らせん増幅を得るのに不可欠であ
る。例として、上記に挙げられたＩＳ６１１０および１
６ＳｒＤＮＡ増幅プライマーは、ＳＤＡ反応中にニック
を入れられる制限エンドヌクレアーゼの認識部位Ｂｏｓ
ＢＩを含む。制限するものではないが欧州特許第068431
5号明細書で開示された認識部位 を含めた他のニッキン
グ可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を、ＢｓｏＢ
Ｉ認識部位の代わりに置換しうることは当業者に明らか
であろう。好ましくは、認識部位は好熱性制限エンドヌ
クレアーゼに対するので、増幅反応は最適条件下で行う
ことができる。同様に、増幅プライマーの尾部配列（制
限エンドヌクレアーゼ認識部位に対して５′）は、概し
て、臨界的ではないが、ＳＤＡに用いられる制限部位の
包含を避けることおよびそれら自体の標的結合配列に対
してかまたは他のプライマーに対してハイブリッド形成
するであろう配列を避けることは重要である。したがっ
て、本発明の増幅プライマーは、表Ｉで示された３′標
的結合配列、該標的結合配列に対して５′のニッキング
可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位、および該制限
エンドヌクレアーゼ認識部位に対して５′の約１０〜２
５ヌクレオチド長さの尾部配列から成る。尾部の長さ
は、選択された配列のＴm に依り、そして十分なハイブ
リダイゼーションを得るように当業者によって容易に調
整されうる。
【００３０】ＩＳ６１１０、１６Ｓ ｒＤＮＡおよび内
部対照標的配列の増幅生成物は、検出可能な標識によっ
て標識されたオリゴヌクレオチドプローブに対するハイ
ブリダイゼーションによって検出されることができ、そ
れぞれの標的は、別個に検出可能なプローブに対して特
異的ハイブリッド形成する。標的特異的および対照特異
的プローブを増幅生成物に対して同時にハイブリッド形
成させる場合、標識は、それぞれの標的の区別を容易に
するように別個に識別可能であるべきである。さもなけ
れば、増幅反応の別のアリコートを、同様の標識によっ
て標識された標的特異的プローブに対してハイブリッド
形成させることができる。検出可能な標識は、それが合
成された後にプローブに対して結合させることができる
しまたはそれを、例えば、標識で誘導体化されたヌクレ
オチドの形で合成の際にプローブ中に包含させることが
できる。このような標識は当該技術分野において知られ
ており、直接的に且つ間接的に検出可能な標識を包含す
る。直接的に検出可能な標識は、更に化学反応を伴うこ
となくシグナルを生じ、蛍光色素、放射性同位体および
染料のような標識を包含する。間接的に検出可能な標識
は、検出可能なシグナルを生じる更に別の化学反応また
は試薬の添加を必要とする。これらには、例えば、西洋
ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファター
ゼなどの酵素、標識に結合したアビジンに対して結合す
ることによって検出されるビオチンなどのリガンド、お
よび化学発光分子が含まれる。プローブは、それらのそ
れぞれの増幅生成物に対して溶液中で、ゲル上でまたは
固体支持体上でハイブリッド形成することができる。ハ
イブリダイゼーション後、結合した標識からシグナルを
生じさせ、検出し、そして場合により、選択された標識
およびハイブリダイゼーションプロトコルに適当な方法
を用いて定量する。それぞれの増幅生成物に対して検出
されたシグナルの量は、存在するそれぞれの増幅生成物
の相対量を示す。
【００３１】増幅生成物を検出する別の方法は、標的配
列に対して特異的にハイブリッド形成したプライマーの
ポリメラーゼ伸長による。そのプライマーは、上記のよ
うに、例えば、放射性同位体によって標識され、その結
果、プライマーの標識は、伸長された反応生成物中に包
含される。この方法は、ウォーカーら（1992年）Nuc.Ac
ids Res.および PNAS、上記によって更に詳細に記載さ
れている。増幅した標的および対照配列を検出するもう
一つの方法は、米国特許第5,470,723号明細書で記載の
ように、ビオチニル化された捕捉オリゴヌクレオチドプ
ローブおよび酵素結合した検出用オリゴヌクレオチドプ
ローブを用いて増幅生成物を検出する化学発光法であ
る。標的配列の検定範囲中の異なる部位に対するこれら
二つの検定プローブのハイブリダイゼーション後、複合
体を、ストレプトアビジンで被覆した微量滴定プレート
上に捕捉し、そして化学発光シグナルを生じさせ且つル
ミノメーターで読み取る。増幅生成物の検出のためのも
う一つの別のものとして、欧州特許第0678582号明細書
で記載のシグナルプライマーをＳＤＡ反応中に包含させ
ることができる。この実施態様において、標識された第
二増幅生成物を、標的増幅に依存した方式でＳＤＡ中に
生じさせ、そして標的増幅を示すものとして検出するこ
とができる。
【００３２】本発明のプライマーを用いるＳＤＡ反応
は、ウォーカーら、上記によって教示されたように、チ
ミンを包含することができるし、またはそれらは、欧州
特許第0624643号明細書で教示されたように、引き続き
のＳＤＡ反応の交差汚染を減少させる手段として、反応
（本実施例で示される）中においてＴＴＰの代わりに
２′−デオキシウリジン５′−三リン酸を全体的に若し
くは部分的に置換しうる。ｄＵ（ウリジン）は、標的お
よび対照配列双方の増幅生成物中に包含され、そしてウ
ラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）による処理によ
って切除されうる。これらの非塩基部位は、引き続きの
ＳＤＡ反応において増幅生成物を増幅不能にする。最初
に合成される内部対照配列もまた、チミンの代わりにｄ
Ｕを包含して、引き続きのＳＤＡにおけるその増幅を妨
げることができる。例えば、配列番号：１２および配列
番号：２６は、添付の配列表においてチミンを含むよう
に示されているが、或いは、チミンがｄＵによって全体
的にまたは部分的に置き換えられている対応する配列か
ら成ることができる。ＵＤＧは、引き続きの増幅を行う
前にウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（Ｕｇｉ）に
よって失活されて、新たに生成された増幅生成物中のｄ
Ｕの切除を妨げることができる。
【００３３】本発明の検定法を行うためのプライマーお
よび／またはプローブは、ミコバクテリアＤＮＡの同時
の属特異的および種特異的増幅のための診断用キットの
形で包装することができる。該キットは、ミコバクテリ
アＤＮＡの属特異的および種特異的増幅のための増幅、
アダプターおよびバンパープライマー、そして場合によ
り、ＳＤＡ反応を行うのに必要な試薬（例えば、デオキ
シヌクレオシド三リン酸、ニッキング制限酵素、緩衝
液、exo-ポリメラーゼ等）を含むことができる。該キッ
トは、場合により、上記のように増幅生成物を検出する
または識別するのに有用なプローブまたはプライマー、
および／またはミコバクテリウム属標的配列と一緒に同
時増幅される内部対照配列を更に含むことができる。
【００３４】
【実施例】
実施例１ この実験実施例は、多重らせん系１のプライマーを用い
る属−および種特異的標的核酸の同時増幅を実証する。
下記のミコバクテリア、すなわち、ヒト型結核菌、ウシ
型結核菌（ＣＤＣ８１）、ウシ型結核菌−ＢＣＧ、Ｍ．
アフリカヌム、鳥型結核菌、Ｍ．イントラセルレア、
Ｍ．カンサシイ、Ｍ．ガストリ、Ｍ．フォルツイツム、
パラ結核菌、Ｍ．ケロネエ、Ｍ．マルモエンス、Ｍ．ス
ズルガイ、Ｍ．フラベセンス、Ｍ．キセノピ、Ｍ．テレ
エ、Ｍ．マリヌム、Ｍ．ゲノベセンス（genovense）、
Ｍ．ヘモフィルム（hemophilum）およびＭ．ゴルドネエ
を試験した。試験された非ミコバクテリア微生物は、ジ
フテリア菌（Corynebacteriadiphtheriae）、ノカルジ
ア・アステロイデス（Nocardia asteroides）、ノカル
ジア・ブラジリエンシス（Nocardia brasiliensis）、
スト レプトコッカス・アルブス（Streptococcus albu
s）、イスラエル放線菌（Actinomyces israelii）、ロ
ドコッカス・エクイ（Rhodococcus equi）およびざ瘡プ
ロピオンバクテリウム（Propionibacterium acnes）で
あった。
【００３５】ＳＤＡは、概して、欧州特許第0684315号
明細書で記載のように行われ、混入したアンプリコンの
除去を可能にするようにＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを代
用した。それぞれ５０μＬ反応中の成分の最終濃度は、
２７．５ｍＭ ＫiＰＯ4、ｐＨ７．５、６ｍＭ ＭｇＯ
Ａｃ、各０．５ｍＭのｄＵＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＡＴ
Ｐ、１．３ｍＭ ｄＣＴＰαＳ、アセチル化ＢＳＡ
０．１ｍｇ／ｍＬ、５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシ
ド、８％（ｖ／ｖ）グリセロール、ヒト胎盤ＤＮＡ １
０ｎｇ／μＬ、Ｂｓｔポリメラーゼ（exo-クレノウフラ
グメント、ニューイングランド・バイオラブズ（New En
gland BioLabs））１．６単位、ＢｓｏＢＩ（ニューイ
ングランド・バイオラブズ，ビバリー，ＭＡ）１６０単
位、並びに試験される微生物０、１、１０、１００また
は１０6ゲノムであった。ヒト型結核菌は、０、１、１
０および１００ゲノムで試験された。他のＭ．ｔｂ複合
種および非Ｍ．ｔｂ複合ミコバクテリアは、１００ゲノ
ムで試験された。非ミコバクテリア微生物は、１０6ゲ
ノムで試験された。反応は、更に、内部増幅対照配列
（ｔＳｉｇ１−配列番号：１２）の２５コピーを含ん
だ。各試料は、８種類のプライマーを以下の通り含ん
だ。すなわち、各０．５μＭの増幅プライマーＧＳ１．
３（配列番号：１）およびＢｉｓＳ１．１（配列番号：
２）；各５０ｎＭのアダプタープライマーＡＧ１Ａ（配
列番号：３）およびＢｓｏ−Ｇ Ａｔｂ１（配列番号：
６）；各２５ｎＭのバンパープライマーＢｓｏ−Ｇ Ｂ
Ｇ１（配列番号：８）、Ｂｓｏ−Ｇ ＢＧ２（配列番
号：９）、Ｍｔｂ３７（配列番号：１０）およびＭｔｂ
４８（配列番号：１１）。この実験で用いられたバンパ
ープライマーは、属／種特異的多重らせん増幅を達成す
るのに臨界的ではない。それらは、増幅およびアダプタ
ープライマーの上流にハイブリッド形成し、そして伸長
された場合、増幅およびアダプタープライマーの伸長生
成物を置換するように機能する。増幅またはアダプター
プライマーに対して、それをバンパープライマーの伸長
によって置換するのに十分に近い位置の上流にハイブリ
ッド形成する他のバンパープライマーは、ＩＳ６１１０
および１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の情報を用いて常套手段に
よって設計されうる。それぞれの反応は、それぞれの試
薬の濃厚原液を用いて、ＢｓｔおよびＢｓｏＢＩを除く
全部の試薬を含むように組み立てられた。次に、試料を
９５℃で２分間加熱してＤＮＡを変性させ、そして５２
℃の水浴に３〜５分間移した。酵素を全試料容量５０μ
Ｌに対して加え、そして試料を５２℃で３０分間インキ
ュベートして増幅を進行させた。増幅は、反応を沸騰水
浴中に２〜３分間入れることによって終結した。
【００３６】増幅生成物は、米国特許第5,470,723号明
細書で記載の化学発光検定を用いて分析され、その検定
の１６Ｓ捕捉プローブの代わりにＴＧ−０１Ｂ３（配列
番号：１３）を代用した。残りの捕捉および検出用プロ
ーブは、米国特許第5,470,723号明細書の実施例３で記
載されたものであった（本明細書中において配列番号：
１４、１５、１６、１７および１８として同定され
た）。１００より大のＲＬＵ値は、標的増幅について陽
性と解釈された。ＩＳ６１１０標的は、ヒト型結核菌複
合体のメンバー（ヒト型結核菌、ウシ型結核菌、Ｍ．ア
フリカヌム、ウシ型結核菌−ＢＣＧ）においてのみ増幅
され、そして増幅は、反応中に僅か１程度のな初期ゲノ
ムコピーが存在した場合に検出された。Ｍ．ミクロティ
は試験されなかったが、それは、他の種と同様のＩＳ６
１１０標的配列を有し、同様の結果を生じると予想され
る。対照的に、陽性１６Ｓ ｒＤＮＡ標的増幅は、Ｍ．
テレエ、Ｍ．ゲノベンスおよびＭ．キセノピを除くミコ
バクテリウム属の全メンバーについて観察された。１６
Ｓ増幅シグナルは、概して、１ゲノムで陽性ではなかっ
たが、しかしながら、シグナル強度は、初期ゲノム数が
１０〜１００ゲノムへと増加するにつれて強く陽性にな
った。二つの標的の増幅の間の明らかな相違は、おそら
く、一つのヒト型結核菌ゲノムはＩＳ６１１０の約１０
コピーを含むが、それぞれのミコバクテリアゲノムは１
６Ｓ ｒＤＮＡ標的の１〜２コピーしか含まないことに
よる。
【００３７】試験された近縁の非ミコバクテリア属の内
で、１６ＳｒＤＮＡに対して１０6ゲノムで弱い陽性シ
グナルを与えた（１２３ＲＬＵ）ノカルジア・アステロ
イデスを除いて、どちらかの標的の増幅に陽性であった
ものはなかった。これは、ヒト型結核菌における１０種
類の１６ＳｒＤＮＡ標的に典型的なＲＬＵ＞２０００と
対照的である。したがって、本発明の属特異的プライマ
ーは、非ミコバクテリアＤＮＡとの感知しうる交差反応
性を示さない。強い内部対照シグナルはまた、全部の増
幅反応において観察され、ＩＳ６１１０および１６Ｓシ
グナル両方が不存在でも増幅有効性を与えた。これらの
実験は、このプライマーセットが、多重らせんｔＳＤＡ
において、最も臨床的に関連したミコバクテリアで見出
された標的配列およびヒト型結核菌複合体の種を示す標
的配列を同時に増幅させるように行うことを実証してい
る。
【００３８】実施例２ この実験実施例は、多重らせん系２を用いる属および種
特異的標的の同時増幅を実証する。ＩＳ６１１０および
１６Ｓ ｒＤＮＡ標的は、本質的には実施例１で記載の
ように、３０ｍＭリン酸カリウムおよび７ｍＭ酢酸マグ
ネシウム並びに以下のプライマー、すなわち、各０．５
μＭの増幅プライマーＧＳ１．３（配列番号：１）およ
びＢｉｓＳ２．２（配列番号：１９）；各５０ｎＭのア
ダプタープライマーＧ１Ｔ１ＡおよびＴ２Ｇ２Ａ（配列
番号：２０）；各２５ｎＭのバンパープライマーＢｓｏ
−Ｇ ＢＧ１（配列番号：８）、Ｂｓｏ−Ｇ ＢＧ２
（配列番号：９）、Ｍｔｂ３７（配列番号：１０）およ
びＭｔｂ４８（配列番号：１１）の使用を代用して、ヒ
ト型結核菌およびウシ型結核菌−ＢＣＧのゲノムＤＮＡ
から増幅された。これらの実験において内部対照は存在
しなかったが、本明細書中に記載の内部対照配列を加え
且つ同時増幅させることができる。１０または１００初
期標的ゲノムが反応中に存在し、そして標的ＤＮＡを含
まなかった陰性対照を実験した。増幅生成物を実施例１
の場合と同様に分析し、ＧＣＡＰ−２（配列番号：２
２）を捕捉プローブとして代用した。
【００３９】両方の種において、陽性シグナルは、ＩＳ
６１１０および１６Ｓ ｒＤＮＡ標的について、ゲノム
ＤＮＡの１０程度の初期コピーによって得られた。それ
は、プライマーに対して標的特異性を与える標的結合配
列であるので、この実験で用いられたプライマーの属−
および種特異性は、標的結合配列が同様であるように、
実施例１のプライマーと同様であろうと予想される。
【００４０】
【配列表】
【００４１】(2) 配列情報 配列番号:1: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 43 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:1: CGATTCCGCT CCACACTTCT CGGGAGAGTT TGTCGCGTTG TTC 43
【００４２】(2) 配列情報 配列番号:2: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 40 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:2: ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGTAAGGC GTACTCGACC 40
【００４３】(2) 配列情報 配列番号:3: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 29 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:3: AAGGCGTACT CGACCGCATG CTCACAGTT 29
【００４４】(2) 配列情報 配列番号:4: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 30 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:4: AAGGCGTACT CGACCGCATG CTCACAGTTA 30
【００４５】(2) 配列情報 配列番号:5: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 30 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:5: AAGGCGTACT CGACCGCACG CTCACAGTTA 30
【００４６】(2) 配列情報 配列番号:6: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 30 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:6: TTTGTCGCGT TGTTCGTACT GAGATCCCCT 30
【００４７】(2) 配列情報 配列番号:7: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 34 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:7: GTTTGTCGCG TTGTTCTGTG TACTGAGATC CCCT 34
【００４８】(2) 配列情報 配列番号:8: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 16 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:8: CGGAATTACT GGGCGT 16
【００４９】(2) 配列情報 配列番号:9: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 15 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:9: AGTCTGCCCG TATCG 15
【００５０】(2) 配列情報 配列番号:10: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 13 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:10: TGGACCCGCC AAC 13
【００５１】(2) 配列情報 配列番号:11: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 13 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:11: CGCTGAACCG GAT 13
【００５２】(2) 配列情報 配列番号:12: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 62 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:12: AAGGCGTACT CGACCAGCGA CGATGTCTGA GGCAACTAGC AAAGCTGAAC AACGCGACAA 60 AC 62
【００５３】(2) 配列情報 配列番号:13: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 16 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:13: ACTGTGAGCA TGCGGT 16
【００５４】(2) 配列情報 配列番号:14: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 15 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:14: AAATCTCACG GCTTA 15
【００５５】(2) 配列情報 配列番号:15: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 15 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:15: CCTGAAAGAC GTTAT 15
【００５６】(2) 配列情報 配列番号:16: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 16 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:16: CCACCATACG GATAGT 16
【００５７】(2) 配列情報 配列番号:17: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 15 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:17: GCTTTGCTAG TTGCC 15
【００５８】(2) 配列情報 配列番号:18: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 15 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:18: TCAGACATCG TCGCT 15
【００５９】(2) 配列情報 配列番号:19: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 40 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:19: CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGTGTACT GAGATCCCCT 40
【００６０】(2) 配列情報 配列番号:20: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 34 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:20: GTGTACGAGA TCCCCTGACG CACGCTCACA GTTA 34
【００６１】(2) 配列情報 配列番号:21: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 33 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:21: GTTTGTCGCG TTGTTCAGAA GGTGTACTCG ACC 33
【００６２】(2) 配列情報 配列番号:22: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 17 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:22: ACTGTGAGCG TGCGTCA 17
【００６３】(2) 配列情報 配列番号:23: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 33 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:23: TTTGTCGCGT TGTTCTGTGT ACTGAGATCC CCT 33
【００６４】(2) 配列情報 配列番号:24: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 36 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:24: GTTTGTCGCG TTGTTCTGTG TACTGAGATC CCCTAT 36
【００６５】(2) 配列情報 配列番号:25: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 34 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:25: GTTTGTCGCG TTGTTCTGTA CTGAGATCCC CTAT 34
【００６６】(2) 配列情報 配列番号:26: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 64 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:26: GTGTACTGAG ATCCCCTAGC GACGATGTCT GAGGCAACTA GCAAAGCTGA ACAACGCGAC 60 AAAC 64
【００６７】(2) 配列情報 配列番号:27: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 33 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:27: AAGGCGTACT CGACCAGCAT GCTCACAGTT AAG 33
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:32） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:325） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:33） (72)発明者 チェリル・エイチ・ディーン アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27614，ローリー，トレイルス・エンド・ コート 205 (72)発明者 ジェームズ・エル・シュラム アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27545，ナイトデイル，ドウェリング・プ レイス 102 (72)発明者 デボラ・アール・ハワード アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27707，ダーラム，アルパイン・ロード 2215 (72)発明者 マーガレット・エス・デイ アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27713，ダーラム，パーク・リッジ・ロー ド 800，アパートメント ビー−２ (72)発明者 デービッド・ジェイ・ライト アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27514，チャペル・ヒル，マウント・カー メル・チャーチ・ロード 1013

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号：１、配列番号：２、配列番
    号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、
    配列番号：７、配列番号：２３、配列番号：２４、配列
    番号：２５、配列番号：２０、配列番号：２１および配
    列番号：２７の標的結合配列から成る群より選択される
    標的結合配列並びに、場合により、増幅反応に必要な配
    列またはアダプター配列を含むオリゴヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 増幅反応に必要な配列が、鎖置換増幅の
    際に制限エンドヌクレアーゼによってニックを入れられ
    る制限エンドヌクレアーゼ認識部位である請求項１に記
    載のオリゴヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 第一および第二標的を同時に増幅する方
    法であって、 （ａ）第一標的に対して第一増幅プライマーをハイブリ
    ッド形成させ、該第一増幅プライマーは、配列番号：１
    の標的結合配列および、制限エンドヌクレアーゼの二本
    鎖半修飾認識部位の一方の鎖にニックを入れる制限エン
    ドヌクレアーゼの認識部位を含み、該第一増幅プライマ
    ーを伸長して第一伸長生成物を生成し、そして第一伸長
    生成物を置換し； （ｂ）第一伸長生成物に対して、配列番号：３、配列番
    号：４、配列番号：５および配列番号：２７の標的結合
    配列から成る群より選択される標的結合配列並びに配列
    番号：２の標的結合配列と実質的に同一の第一アダプタ
    ー配列から成る第一アダプタープライマーをハイブリッ
    ド形成させ、第一アダプタープライマーを伸長して第二
    伸長生成物を生成し、そして第二伸長生成物を置換し； （ｃ）第二標的に対して第二増幅プライマーをハイブリ
    ッド形成させ、該第二増幅プライマーは、配列番号：２
    の標的結合配列およぴ該制限エンドヌクレアーゼの認識
    部位を含み、第二増幅プライマーを伸長して第三伸長生
    成物を生成し、そして第三伸長生成物を置換し； （ｄ）第三伸長生成物に対して、配列番号：６、配列番
    号：７、配列番号：２３、配列番号：２４および配列番
    号：２５の標的結合配列から成る群より選択される標的
    結合配列並びに配列番号：１の標的結合配列と実質的に
    同一の第二アダプター配列から成る第二アダプタープラ
    イマーをハイブリッド形成させ、第二アダプタープライ
    マーを伸長して第四伸長生成物を生成し、第四伸長生成
    物を置換し；そして （ｅ）第一および第二増幅プライマーを用いて第二およ
    び第四伸長生成物を同時に増幅させることを含む上記方
    法。
  4. 【請求項４】 （ａ）第一増幅プライマーが配列番号：
    １から成り； （ｂ）第一アダプタープライマーが、配列番号：３、配
    列番号：４、配列番号：５または配列番号：２７から成
    り； （ｃ）第二増幅プライマーが配列番号：２から成り；そ
    して （ｄ）第二アダプタープライマーが、配列番号：６、配
    列番号：７、配列番号：２３、配列番号：２４または配
    列番号：２５から成る請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 配列番号：１２または、チミンがウリジ
    ンによって全体的に若しくは部分的に置換された配列番
    号：１２から成る内部対照配列を同時増幅させ、そして
    増幅された内部対照配列を検出することを更に含む請求
    項３に記載の方法。
  6. 【請求項６】 第一および第二標的を同時に増幅する方
    法であって、 （ａ）第一標的に対して第一増幅プライマーをハイブリ
    ッド形成させ、該第一増幅プライマーは、配列番号：１
    の標的結合配列および、制限エンドヌクレアーゼの二本
    鎖半修飾認識部位の一方の鎖にニックを入れる制限エン
    ドヌクレアーゼの認識部位を含み、該第一増幅プライマ
    ーを伸長して第一伸長生成物を生成し、そして第一伸長
    生成物を置換し； （ｂ）第一伸長生成物に対して、配列番号：２０の標的
    結合配列および配列番号：１９の標的結合配列と実質的
    に同一の第一アダプター配列から成る第一アダプタープ
    ライマーをハイブリッド形成させ、第一アダプタープラ
    イマーを伸長して第二伸長生成物を生成し、そして第二
    伸長生成物を置換し； （ｃ）第二標的に対して第二増幅プライマーをハイブリ
    ッド形成させ、該第二増幅プライマーは、配列番号：１
    ９の標的結合配列およぴ該制限エンドヌクレアーゼの認
    識部位を含み、第二増幅プライマーを伸長して第三伸長
    生成物を生成し、そして第三伸長生成物を置換し； （ｄ）第三伸長生成物に対して、配列番号：２１の標的
    結合配列および配列番号：１の標的結合配列と実質的に
    同一の第二アダプター配列から成る第二アダプタープラ
    イマーをハイブリッド形成させ、第二アダプタープライ
    マーを伸長して第四伸長生成物を生成し、第四伸長生成
    物を置換し；そして （ｅ）第一および第二増幅プライマーを用いて第二およ
    び第四伸長生成物を同時に増幅させることを含む上記方
    法。
  7. 【請求項７】 （ａ）第一増幅プライマーが配列番号：
    １から成り； （ｂ）第一アダプタープライマーが配列番号：２０から
    成り； （ｃ）第二増幅プライマーが配列番号：１９から成り；
    そして （ｄ）第二アダプタープライマーが２１から成る請求項
    ６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 配列番号：２６または、チミンがウリジ
    ンによって全体的に若しくは部分的に置換された配列番
    号：２６から成る内部対照配列を同時増幅させ、そして
    増幅された内部対照配列を検出することを更に含む請求
    項６に記載の方法。
  9. 【請求項９】 第一および第二標的を同時に増幅する方
    法であって、 （ａ）第一標的に対して第一増幅プライマーをハイブリ
    ッド形成させ、該第一増幅プライマーは、配列番号：
    ３、配列番号：４、配列番号：５および配列番号：２７
    の標的結合配列から成る群より選択される標的結合配列
    並びに制限エンドヌクレアーゼの二本鎖半修飾認識部位
    の一方の鎖にニックを入れる制限エンドヌクレアーゼの
    認識部位を含み、該第一増幅プライマーを伸長して第一
    伸長生成物を生成し、そして第一伸長生成物を置換し； （ｂ）第一伸長生成物に対して、配列番号：１の標的結
    合配列および配列番号：２の標的結合配列と実質的に同
    一の第一アダプター配列配列から成る第一アダプタープ
    ライマーをハイブリッド形成させ、第一アダプタープラ
    イマーを伸長して第二伸長生成物を生成し、そして第二
    伸長生成物を置換し； （ｃ）第二標的に対して第二増幅プライマーをハイブリ
    ッド形成させ、該第二増幅プライマーは、配列番号：
    ６、配列番号：７、配列番号：２３、配列番号：２４お
    よび配列番号：２５の標的結合配列から成る群より選択
    される標的結合配列並びに該制限エンドヌクレアーゼの
    認識部位を含み、第二増幅プライマーを伸長して第三伸
    長生成物を生成し、そして第三伸長生成物を置換し； （ｄ）第三伸長生成物に対して、配列番号：２の標的結
    合配列および配列番号：１の標的結合配列と実質的に同
    一の第二アダプター配列から成る第二アダプタープライ
    マーをハイブリッド形成させ、第二アダプタープライマ
    ーを伸長して第四伸長生成物を生成し、第四伸長生成物
    を置換し；そして （ｅ）第一および第二増幅プライマーを用いて第二およ
    び第四伸長生成物を同時に増幅させることを含む上記方
    法。
  10. 【請求項１０】 第一および第二標的を同時に増幅する
    方法であって、 （ａ）第一標的に対して第一増幅プライマーをハイブリ
    ッド形成させ、該第一増幅プライマーは、配列番号：２
    ０の標的結合配列および、制限エンドヌクレアーゼの二
    本鎖半修飾認識部位の一方の鎖にニックを入れる制限エ
    ンドヌクレアーゼの認識部位を含み、該第一増幅プライ
    マーを伸長して第一伸長生成物を生成し、そして第一伸
    長生成物を置換し； （ｂ）第一伸長生成物に対して、配列番号：１の標的結
    合配列および配列番号：１９の標的結合配列と実質的に
    同一の第一アダプター配列から成る第一アダプタープラ
    イマーをハイブリッド形成させ、第一アダプタープライ
    マーを伸長して第二伸長生成物を生成し、そして第二伸
    長生成物を置換し； （ｃ）第二標的に対して第二増幅プライマーをハイブリ
    ッド形成させ、該第二増幅プライマーは、配列番号：２
    １の標的結合配列および該制限エンドヌクレアーゼの認
    識部位を含み、第二増幅プライマーを伸長して第三伸長
    生成物を生成し、そして第三伸長生成物を置換し； （ｄ）第三伸長生成物に対して、配列番号：１９の標的
    結合配列および配列番号：１の標的結合配列と実質的に
    同一の第二アダプター配列から成る第二アダプタープラ
    イマーをハイブリッド形成させ、第二アダプタープライ
    マーを伸長して第四伸長生成物を生成し、第四伸長生成
    物を置換し；そして （ｅ）第一および第二増幅プライマーを用いて第二およ
    び第四伸長生成物を同時に増幅させることを含む上記方
    法。
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