JP2022553489A - Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の核酸の検出 - Google Patents
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Abstract
野生型配列、ならびに／またはＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔ（配列番号１７）、ＪＰ－ｎｖＣＴ Ｃ１５２２Ｔ（配列番号１２）、ＵＳ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２６Ａ（配列番号２２）、およびＮＯ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２３Ａ（配列番号２７）として識別された変異体配列を含むＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの核酸を特異的に検出するハイブリダイゼーションプローブ試薬。ある特定のプローブは、望ましい結合特性を増強するためにヌクレオチド類似体を含む。【選択図】図１
Description
関連出願
本出願は、２０１９年９月５日に出願された米国仮出願第６２／８９６，４７２号および２０２０年５月２９日に出願された同第６２／７０４，８３３号の利益を主張する。これらの先行出願の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年９月５日に出願された米国仮出願第６２／８９６，４７２号および２０２０年５月２９日に出願された同第６２／７０４，８３３号の利益を主張する。これらの先行出願の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、概して、バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本開示は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの核酸を検出するための分子診断アッセイに関する。
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの遺伝的変異体が発生し始めており、長年にわたる効果的な核酸ベースの診断スクリーニングの末、検出を逃れている。リボソーム核酸（例えば、１６Ｓまたは２３Ｓ ｒＲＮＡをコードするもの）は、それらの配列が親密な構造－機能関係のため進化的に非常に安定しているため、診断アッセイで使用される一般的な標的である。実際には、ｒＲＮＡの生物学的機能は、安定した状態を保たなければならない正確に折りたたまれた構造を必要とする。その分子の一部の変異または塩基変化は、一般に、その必要とされる二次構造を保持するために、その分子の異なる部分の対応する変化を必要とする。２つの相補的な変異が同時に起こる可能性はほとんどない。
世界の様々な地域で発生しているＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのｒＲＮＡ配列で最近特定された変異体は、いくつかの事例では、いくつかの核酸ベースのアッセイでの検出を逃れることができている。本開示は、これらのエスケープ変異体の検出に対処する。
第１の態様では、本開示は、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の標的核酸を検出するためのプローブ試薬に関する。本プローブ試薬は、概して、（ｉ）骨格と、（ｉｉ）配列番号６６を含む、骨格に結合した塩基配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体と、（ｉｉｉ）非ヌクレオチドリンカーを介して骨格に共有結合した標識と、を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブを含む。標識は、第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号５および配列番号１０からなる群から選択される野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体にハイブリダイズした場合に、検出可能なシグナルを生成する。さらに、標識は、第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２０、配列番号３０、配列番号１５、および配列番号２５からなる群から選択されるＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの配列のうちのいずれかの相補体にハイブリダイズした場合に、検出可能なシグナルを生成する。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブは、最大２４塩基長であり、非ヌクレオチドリンカーは、配列番号６６の１１位の塩基と１２位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した塩基配列は、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号７６、および配列番号７３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した塩基配列は、配列番号８４であり、非ヌクレオチドリンカーは、１２位の塩基と１３位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した塩基配列は、配列番号８５であり、非ヌクレオチドリンカーは、１３位の塩基と１４位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した塩基配列は、配列番号８６であり、非ヌクレオチドリンカーは、１２位の塩基と１３位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した塩基配列は、配列番号８７であり、非ヌクレオチドリンカーは、１１位の塩基と１２位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した塩基配列は、配列番号８８であり、非ヌクレオチドリンカーは、１２位の塩基と１３位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した塩基配列は、配列番号７６であり、非ヌクレオチドリンカーは、１３位の塩基と１４位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した塩基配列は、配列番号７３であり、非ヌクレオチドリンカーは、１３位の塩基と１４位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの標識は、化学発光標識を含む。いくつかの実施形態では、化学発光標識は、アクリジニウムエステルである。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの骨格は、１つ以上の２’－メトキシ化学基を含む。いくつかの実施形態では、本プローブ試薬は、第２のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み、第２のオリゴヌクレオチドプローブは、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３Ｓリボソーム核酸に相補的な塩基配列またはその相補体を含み、それに共有結合した標識をさらに含み、第２のオリゴヌクレオチドプローブの標識は、第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号６を含む野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、検出可能なシグナルを生成し、第２のオリゴヌクレオチドプローブの標識は、第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２１、配列番号３１、配列番号１６、および配列番号２６からなる群から選択される核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体にハイブリダイズした場合に、検出可能なシグナルを生成しない。いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮＡ骨格を含む。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの標識は、第２のオリゴヌクレオチドプローブの標識と同じである。いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列は、配列番号３８である。
別の態様では、本開示は、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の標的核酸を検出するためのプローブ試薬に関する。概して言えば、本プローブ試薬は、（ｉ）骨格と、（ｉｉ）配列番号６６を含む、骨格に結合した塩基配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体と、（ｉｉｉ）非ヌクレオチドリンカーを介して骨格に共有結合した標識と、を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブを含むことができる。標識は、オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、検出可能なシグナルを生成する。標識は、オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号７の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、検出可能なシグナルを生成することができる。標識は、オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１７の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、検出可能なシグナルを生成することができる。標識は、オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２７の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、検出可能なシグナルを生成することができる。標識は、オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１２の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、検出可能なシグナルを生成することができる。さらに、標識は、オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２２の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、検出可能なシグナルを生成することができる。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブは、最大２４塩基長であり、非ヌクレオチドリンカーは、配列番号６６の１１位の塩基と１２位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した塩基配列は、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号７６、および配列番号７３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した塩基配列は、配列番号８４であり、非ヌクレオチドリンカーは、１２位の塩基と１３位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した塩基配列は、配列番号８５であり、非ヌクレオチドリンカーは、１３位の塩基と１４位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した塩基配列は、配列番号８６であり、非ヌクレオチドリンカーは、１２位の塩基と１３位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した塩基配列は、配列番号８７であり、非ヌクレオチドリンカーは、１１位の塩基と１２位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した塩基配列は、配列番号８８であり、非ヌクレオチドリンカーは、１２位の塩基と１３位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した塩基配列は、配列番号７６であり、非ヌクレオチドリンカーは、１３位の塩基と１４位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した塩基配列は、配列番号７３であり、非ヌクレオチドリンカーは、１３位の塩基と１４位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの標識は、化学発光標識を含む。いくつかの実施形態では、化学発光標識は、アクリジニウムエステルである。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの骨格は、１つ以上の２’－メトキシ化学基を含む。いくつかの実施形態では、本プローブ試薬は、第２のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み、第２のオリゴヌクレオチドプローブは、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３Ｓリボソーム核酸に相補的な塩基配列またはその相補体を含み、それに共有結合した標識をさらに含む。第２のオリゴヌクレオチドプローブの標識は、第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号６を含む野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、検出可能なシグナルを生成するように配置され得る。第２のオリゴヌクレオチドプローブの標識は、第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１７、配列番号２７、配列番号１２、もしくは配列番号２２のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体核酸配列のうちのいずれかの核酸、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの配列の相補体にハイブリダイズした場合に、検出可能なシグナルを生成しない。いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮＡ骨格を含む。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの標識は、第２のオリゴヌクレオチドプローブの標識と同じである。いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列は、配列番号３８である。
別の態様では、本開示は、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の２３Ｓリボソーム核酸を検出するためのキットに関する。概して言えば、本キットは、配列番号６の野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズされた場合に検出可能なシグナルを生成するが、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２４、および配列番号２９のうちのいずれかのＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体にハイブリダイズされた場合に検出可能なシグナルを生成しない第１のオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２４、および配列番号２９のうちのいずれかの核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体にハイブリダイズされた場合に検出可能なシグナルを生成する第２のオリゴヌクレオチドプローブと、を含む、１つ以上のバイアルのパッケージングされた組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２６、および配列番号３１のうちのいずれかの配列を含む核酸にハイブリダイズされた場合に、検出可能なシグナルを生成せず、第２のオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２６、および配列番号３１のうちのいずれかの配列を含む核酸にハイブリダイズされた場合に、検出可能なシグナルを生成する。いくつかの実施形態では、本キットは、上流プロモーターおよび下流標的ハイブリダイズ配列を有するプロモーター－プライマーをさらに含み、下流標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２および配列番号７の野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ配列の２３Ｓリボソーム核酸に相補的であり、かつ配列番号１２、配列番号１７、配列番号２２、および配列番号２７のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体配列に相補的であり、配列番号２または配列番号７のいずれかの核酸を鋳型として使用してプロモーター－プライマーを酵素により伸長させることにより、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの各々に相補的な配列を含む伸長産物が産生される。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの各々は、骨格と、非ヌクレオチドリンカーを介して骨格に共有結合した標識と、を含む。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの一方の骨格が少なくとも１つの２’－メトキシ化学基を含む。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの骨格がＤＮＡを含み、第２のオリゴヌクレオチドプローブの骨格が少なくとも１つの２’－メトキシ化学基を含む。いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号６６を含む、その骨格に結合した塩基配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体を含み、非ヌクレオチドリンカーは、配列番号６６の１１位の塩基と１２位の塩基との間で第２のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列は、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号７６、および配列番号７３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した塩基配列は、配列番号８４であり、非ヌクレオチドリンカーは、１２位の塩基と１３位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した塩基配列は、配列番号８５であり、非ヌクレオチドリンカーは、１３位の塩基と１４位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した塩基配列は、配列番号８６であり、非ヌクレオチドリンカーは、１２位の塩基と１３位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した塩基配列は、配列番号８７であり、非ヌクレオチドリンカーは、１１位の塩基と１２位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した塩基配列は、配列番号８８であり、非ヌクレオチドリンカーは、１２位の塩基と１３位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した塩基配列は、配列番号７６であり、非ヌクレオチドリンカーは、１３位の塩基と１４位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した塩基配列は、配列番号７３であり、非ヌクレオチドリンカーは、１３位の塩基と１４位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの各々の標識は、他方と同じである。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの各々の標識は、化学発光標識を含む。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの各々に結合した化学発光標識は、同じ化学発光標識を含む。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの各々に結合した化学発光標識は、アクリジニウムエステルを含む。
別の態様では、本開示は、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の２３Ｓリボソーム核酸を検出するためのキットに関する。概して言えば、本キットは、パッケージングされた組み合わせ中に、第１のオリゴヌクレオチドプローブと、上流プロモーターおよび下流標的ハイブリダイズ配列を含むプロモーター－プライマーと、を含むことができる。第１のオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号７６、配列番号７３からなる群から選択される塩基配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体を含む。第１のオリゴヌクレオチドプローブは、それに共有結合した標識をさらに含むことができる。第１のオリゴヌクレオチドプローブは、（ｉ）ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする配列番号３または配列番号８のいずれかに相補的な野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸、または（ｉｉ）ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする配列番号１８、配列番号２８、配列番号１３、および配列番号２３のうちのいずれかに相補的なＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体配列にハイブリダイズした場合に、標識が検出可能なシグナルを生成することができる。プロモーター－プライマーの下流標的ハイブリダイズ配列は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３Ｓリボソーム核酸に相補的であることができ、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓまたはＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の２３Ｓリボソーム核酸を鋳型として使用してプロモーター－プライマーを酵素により伸長させることにより、第１のオリゴヌクレオチドプローブに相補的な配列を含む伸長産物が産生され得る。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブは、１つ以上の２’－メトキシ化学基を有する骨格を含む。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列は、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号７６、および配列番号７３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本キットは、第２のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み、第２のオリゴヌクレオチドプローブは、それに共有結合した標識を含み、第２のオリゴヌクレオチドプローブの標識は、第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号３もしくは配列番号８の野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体にハイブリダイズした場合に、検出可能なシグナルを生成し、第２のオリゴヌクレオチドプローブの標識は、第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１８、配列番号２８、配列番号１３、および配列番号２３からなる群から選択される核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体にハイブリダイズした場合に、検出可能なシグナルを生成しない。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの各々の標識は、化学発光標識である。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの各々の化学発光標識は、アクリジニウムエステルである。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの化学発光標識は、同じアクリジニウムエステルである。いくつかの実施形態では、本キットは、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの標識は、非ヌクレオチドリンカーを介して骨格に共有結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列は、配列番号８４であり、非ヌクレオチドリンカーは、１２位の塩基と１３位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列は、配列番号８５であり、非ヌクレオチドリンカーは、１３位の塩基と１４位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列は、配列番号８６であり、非ヌクレオチドリンカーは、１２位の塩基と１３位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列は、配列番号８７であり、非ヌクレオチドリンカーは、１１位の塩基と１２位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列は、配列番号８８であり、非ヌクレオチドリンカーは、１２位の塩基と１３位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列は、配列番号７６であり、非ヌクレオチドリンカーは、１３位の塩基と１４位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列は、配列番号７３であり、非ヌクレオチドリンカーは、１３位の塩基と１４位の塩基との間で骨格に結合している。
別の態様では、本開示は、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の２３Ｓリボソーム核酸を検出するためのプローブ試薬に関する。概して言えば、本プローブ試薬は、（ｉ）１つ以上の２’－メトキシ化学基を含む骨格と、（ｉｉ）配列番号５８を含む、骨格に結合した塩基配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体と、（ｉｉｉ）配列番号５８の配列の６位の塩基と７位の塩基との間、８位の塩基と９位の塩基との間、または９位の塩基と１０位の塩基との間のいずれかで非ヌクレオチドリンカーを介して骨格に共有結合した標識と、を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブを含む。第１のオリゴヌクレオチドプローブの標識は、第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号６の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、検出可能なシグナルを生成することができる。第１のオリゴヌクレオチドプローブの標識は、第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２１の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、検出可能なシグナルを生成することができる。第１のオリゴヌクレオチドプローブの標識は、第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号３１の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、検出可能なシグナルを生成することができる。第１のオリゴヌクレオチドプローブの標識は、第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１６の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、検出可能なシグナルを生成することができる。同様に、第１のオリゴヌクレオチドプローブの標識は、第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２６の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、検出可能なシグナルを生成することができる。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した塩基配列は、非ヌクレオチドリンカーが９位の塩基と１０位の塩基との間で結合した配列番号５９、非ヌクレオチドリンカーが１０位の塩基と１１位の塩基との間で結合した配列番号６０、非ヌクレオチドリンカーが８位の塩基と９位の塩基との間で結合した配列番号６１、非ヌクレオチドリンカーが９位の塩基と１０位の塩基との間で結合した配列番号６２、非ヌクレオチドリンカーが１０位の塩基と１１位の塩基との間で結合した配列番号６３、非ヌクレオチドリンカーが１１位の塩基と１２位の塩基との間で結合した配列番号６４、および非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で結合した配列番号６５からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した塩基配列は、配列番号６０である。いくつかの実施形態では、標識は、化学発光標識を含む。いくつかの実施形態では、化学発光標識は、アクリジニウムエステルである。いくつかの実施形態では、本プローブ試薬は、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３Ｓリボソーム核酸を検出する第２のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドプローブの骨格に結合した標識と同じ標識を含む。いくつかの実施形態では、検出され得る野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸は、配列番号２および配列番号７を含み、検出され得るＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体核酸は、配列番号１２、配列番号１７、配列番号２２、および配列番号２７を含む。
別の態様では、本開示は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の核酸を検出するためのプローブ試薬に関する。本プローブ試薬は、（ｉ）骨格と、（ｉｉ）配列番号３９を含む、骨格に結合した塩基配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体と、（ｉｉｉ）配列番号３９の６位の塩基と７位の塩基との間で非ヌクレオチドリンカーを介して骨格に共有結合した標識と、を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブを含むことができる。標識は、第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１８の核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、検出可能なシグナルを生成する。標識は、第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号３もしくは配列番号８のいずれかの核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの配列の相補体にハイブリダイズした場合に、検出可能なシグナルを生成しない。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの骨格は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列は、配列番号３９を含み、標識は、第１のオリゴヌクレオチドプローブが、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする配列番号１８の配列に相補的な核酸にハイブリダイズした場合に、検出可能なシグナルを生成し、標識は、第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号３または配列番号８のいずれかの配列に相補的な核酸配列にハイブリダイズした場合に、検出可能なシグナルを生成しない。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列は、配列番号４３、配列番号５４、および配列番号４５からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本プローブ試薬は、第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号３または配列番号８のいずれかの配列に相補的な野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸配列にハイブリダイズした場合に検出可能なシグナルを生成する第２のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの標識は、化学発光標識を含む。いくつかの実施形態では、化学発光標識は、アクリジニウムエステルである。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列は、配列番号４３であり、非ヌクレオチドリンカーは、７位の塩基と８位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列は、配列番号５４であり、非ヌクレオチドリンカーは、６位の塩基と７位の塩基との間で骨格に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列は、配列番号４５であり、非ヌクレオチドリンカーは、７位の塩基と８位の塩基との間で骨格に結合している。
別の態様では、本開示は、試験試料中に存在し得るＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの核酸を検出するための反応混合物に関する。概して言えば、本反応混合物は、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓまたはＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の２３Ｓリボソーム核酸鋳型から産生された核酸増幅産物と、１つ以上の検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブであって、検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブの各々が核酸増幅産物にハイブリダイズし、検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも１つが２’－メトキシヌクレオチド類似体を含み、核酸増幅産物にハイブリダイズした後に検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも１つが検出可能なシグナルを生成する、１つ以上の検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブと、を含むことができる。いくつかの実施形態では、検出可能なＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体核酸は、配列番号１７、配列番号１２、配列番号２２、および配列番号２７の配列を含む。
序文および概要
生体試料中のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの核酸を選択的に検出するための組成物、方法、およびキットが本明細書に開示される。本開示によるプローブは、診断用途またはこの細菌を含む可能性のある試料のスクリーニングのいずれかで使用することができる。いくつかの実施形態では、開示されるプローブは、野生型と比較して２３Ｓ ｒＲＮＡをコードする配列に遺伝的差異を有する特定のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体を検出するために使用することができる。他の実施形態では、開示されるプローブは、２３Ｓ ｒＲＮＡをコードする野生型配列および変異体配列を検出するために使用することができる。
生体試料中のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの核酸を選択的に検出するための組成物、方法、およびキットが本明細書に開示される。本開示によるプローブは、診断用途またはこの細菌を含む可能性のある試料のスクリーニングのいずれかで使用することができる。いくつかの実施形態では、開示されるプローブは、野生型と比較して２３Ｓ ｒＲＮＡをコードする配列に遺伝的差異を有する特定のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体を検出するために使用することができる。他の実施形態では、開示されるプローブは、２３Ｓ ｒＲＮＡをコードする野生型配列および変異体配列を検出するために使用することができる。
当業者であれば、標準化されたワークフローがＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸を増幅および検出するために使用される試薬および方法にしばしば制約を課すことを理解するであろう。例えば、事前選択されたハイブリダイゼーション温度は、有用なプローブの長さおよび融解温度（すなわち、「Ｔｍ」）プロファイルを決定し得る。以下に詳述されるように、標識プローブの構造は、増幅された核酸産物の遺伝的差異を検出する能力に大きく影響した。
野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの核酸、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの１つ以上の変異体の核酸、または野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓとＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの１つ以上の変異体との組み合わせの核酸を検出するために使用され得る異なるアプローチが以下に記載される。
定義
以下の用語は、異なる意味を有することが明示的に示されない限り、本明細書で指定された意味を有する。
以下の用語は、異なる意味を有することが明示的に示されない限り、本明細書で指定された意味を有する。
「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、本明細書で使用される「核酸」は、１つ以上の核酸を表すと理解される。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上の」、および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書で互換的に使用され得る。
「試料」または「試験試料」とは、標的生物または標的生物に由来する核酸を含む疑いのある任意の物質を意味する。この物質は、例えば、痰または尿道検体などの未処理の臨床検体、その検体を含む緩衝媒体、その検体および標的生物に属する核酸を放出するための溶解剤を含む媒体、あるいは反応容器中または反応材料もしくは装置上で単離および／または精製された標的生物に由来する核酸を含む媒体であり得る。特許請求の範囲では、「試料」および「試験試料」という用語は、その未加工形態の検体、または検体中の標的生物に由来する核酸を放出、単離、および精製するための任意の処理段階を指し得る。
「標的核酸」または「標的」とは、標的核酸配列を含む核酸を意味する。
「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」、「標的配列」、または「標的領域」とは、一本鎖核酸分子のヌクレオチド配列の全てまたは一部を含む特定のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列、およびそれらに相補的なデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を意味する。しかしながら、特許請求の範囲は、標的配列を列挙された配列の特定の意味に限定し得るが、但し、その相補配列を除外することを条件とする。
「核酸」および「ポリヌクレオチド」とは、従来のＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ＲＮＡ－ＤＮＡ、およびそれらの類似体であるポリマーを含む、ポリヌクレオチドを形成するために一緒に結合された窒素含有複素環式塩基または塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含む多量体化合物を指す。核酸「骨格」は、糖－ホスホジエステル結合、ペプチド－核酸結合（「ペプチド核酸」またはＰＮＡ、ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む様々な結合で構成され得る。核酸の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または置換（例えば、２’メトキシもしくは２’ハロゲン化物置換）を有する同様の化合物であり得る。窒素含有塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、それらの類似体（例えば、イノシンまたは他のもの、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５－３６，Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，１１ｔｈ ｅｄ．，１９９２を参照されたい）、プリンまたはピリミジン誘導体（例えば、Ｎ４－メチルデオキシグアノシン、デアザまたはアザプリン、デアザまたはアザピリミジン、５位または６位に置換基を有するピリミジン塩基、２位、６位、または８位に置換基を有するプリン塩基、２－アミノ－６－メチルアミノプリン、Ｏ６－メチルグアニン、４－チオ－ピリミジン、４－アミノ－ピリミジン、４－ジメチルヒドラジン－ピリミジン、およびＯ４－アルキル－ピリミジン、米国特許第５，３７８，８２５号およびＰＣＴ公開第ＷＯ９３／１３１２１号）であり得る。核酸は、骨格がポリマーの位置に窒素含有塩基を含まない１つ以上の「非塩基性」残基を含み得る（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、従来のＲＮＡもしくはＤＮＡ糖、塩基、および結合のみを含み得るか、または従来の成分および置換の両方（例えば、２’メトキシ骨格を有する従来の塩基、または従来の塩基および１つ以上の塩基類似体の両方を含むポリマー）を含み得る。核酸は、「ロックド核酸」（ＬＮＡ）（二環式フラノース単位がＲＮＡ模倣糖立体構造にロックされた１つ以上のＬＮＡヌクレオチド単量体を含む類似体）を含み、これにより、相補的ＲＮＡおよびＤＮＡ配列に対するハイブリダイゼーション親和性が増強される（Ｖｅｓｔｅｒ ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３（４２）：１３２３３－４１）。ハイブリダイゼーション複合体の安定性に影響を及ぼし得るオリゴマーの実施形態には、ＰＮＡオリゴマー、２’－メトキシもしくは２’－フルオロ置換ＲＮＡを含むオリゴマー、または荷電結合（例えば、ホスホロチオエート）もしくは中性基（例えば、メチルホスホネート）を含むオリゴマーを含む、ハイブリダイゼーション複合体の全電荷、電荷密度、もしくは立体会合に影響を及ぼすオリゴマーが含まれる。別途指示さない限り、５－メチルシトシンは、ＲＮＡ骨格またはＤＮＡ骨格（またはそれらの混合物）を含む前述の骨格／糖／結合のうちのいずれかとともに使用され得る。オリゴヌクレオチド、アンプリコン、または他の核酸の長さの範囲について言及する場合、その範囲が全ての整数を含む（例えば、１９～２５の連続するヌクレオチド長には、１９、２０、２１、２２、２３、２４、および２５が含まれる）ことが理解される。
本明細書で使用される「ヌクレオチド」とは、リン酸基、５炭素糖、および窒素含有塩基（本明細書では「核酸塩基」とも称される）からなる核酸のサブユニットである。ＲＮＡに見られる５炭素糖は、リボースである。ＤＮＡでは、５炭素糖は、２’－デオキシリボースである。この用語は、リボースの２’位にあるメトキシ基（本明細書では代替的に「２’－Ｏ－メチル」または「２’－Ｏ－Ｍｅ」または「２’－メトキシ」または「２’－ＯＭｅ」とも称される）などのかかるサブユニットの類似体も含む。
「オリゴマー」、「オリゴヌクレオチド」、または「オリゴ」とは、一般に、１，０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満の核酸を指し、約２～５ヌクレオチドの下限および約５００～９００ヌクレオチドの上限を有するサイズ範囲のものを含む。いくつかの特定の実施形態は、約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５ヌクレオチドの下限および約５０～６０ヌクレオチドの上限を有するサイズ範囲のオリゴマーであり、他の特定の実施形態は、約１０～２０ヌクレオチドの下限および約２２～１００ヌクレオチドの上限を有するサイズ範囲である。オリゴマーは、天然に存在する源から精製されてもよいが、任意の周知の酵素的または化学的方法を使用して合成されてもよい。オリゴヌクレオチドという用語は、試薬の任意の特定の機能を意味せず、むしろ、本明細書に記載の全てのかかる試薬を網羅するために一般的に使用される。オリゴヌクレオチドは、様々な異なる機能を果たし得る。例えば、オリゴヌクレオチドが相補鎖に特異的であり、それにハイブリダイズすることができ、かつ核酸ポリメラーゼの存在下でさらに伸長され得る場合、プライマーとして機能し得、オリゴヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼによって認識される配列を含み、かつ転写を可能にする場合、プライマーとして機能し、プロモーターを提供し得（例えば、Ｔ７プライマー）、オリゴヌクレオチドが標的核酸またはそのアンプリコンにハイブリダイズすることができ、かつ検出可能な部分（例えば、アクリジニウム－エステル化合物）をさらに提供する場合、標的核酸を検出するように機能し得る。オリゴマーは、機能名（例えば、捕捉プローブ、プライマー、またはプロモータープライマー）で呼ばれ得るが、当業者であれば、かかる用語がオリゴマーを指すことを理解するであろう。
定義された配列のオリゴヌクレオチドは、当業者に既知の技法によって、例えば、化学合成または生化学合成によって、かつ組換え核酸分子（例えば、細菌またはレトロウイルスベクター）からのインビトロまたはインビボ発現によって産生され得る。本開示によって意図されるように、オリゴヌクレオチドは、野生型染色体ＤＮＡまたはそのインビボ転写産物からならない場合がある。例えば、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブは、天然に存在する核酸には見られない非ヌクレオチドリンカーおよび／または検出可能な標識を含むことができる。
「検出プローブオリゴマー」、「検出プローブ」、または「プローブ」とは、標的核酸の検出のために、核酸ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、増幅配列を含む標的配列に特異的にハイブリダイズするオリゴマーを指す。検出は、直接的（すなわち、標的に直接ハイブリダイズされるプローブ）または間接的（すなわち、プローブを標的に結合する中間構造体にハイブリダイズされるプローブ）のいずれかであり得る。検出プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの類似体、またはそれらの組み合わせ（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ）であってもよく、それらは、標識または非標識であってもよい。検出プローブは、代替の骨格結合（例えば、２’－Ｏ－メチル結合）をさらに含み得る。プローブの標的配列は、一般に、プローブが特異的にハイブリダイズするより大きい配列内の特異的な配列を指す。検出プローブは、標的特異的配列および非標的特異的配列を含み得る。かかる非標的特異的配列には、検出および／または増幅を容易にするために使用することができるヘアピン構造などの所望の二次または三次構造を付与するであろう配列が含まれ得る（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，３１２，７２８号、同第６，８３５，５４２号、および同第６，８４９，４１２号を参照されたい）。定義された配列のプローブは、当業者に既知の技術によって、例えば、化学合成によって、かつ組換え核酸分子からのインビトロまたはインビボ発現などによる当業者に既知の技術によって産生され得る。
本明細書で使用される場合、「プローブ試薬」とは、１つ以上のプローブを含む組成物である。いくつかの実施形態では、試薬のプローブは、任意選択的に検出可能な標識（例えば、ルミノメーターまたは蛍光光度計などの光学的手段を使用して検出することができる標識）を含むオリゴヌクレオチドプローブである。プローブ試薬の例は、１つ以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む。
「標識」または「検出可能な標識」とは、検出されるか、または検出可能なシグナルをもたらすプローブに直接的または間接的に結合した部分または化合物を指す。直接的結合が、共有結合または非共有相互作用（例えば、水素結合、疎水性またはイオン性相互作用、およびキレートまたは配位錯体形成）を使用し得る一方で、間接的結合は、架橋部分またはリンカーを（例えば、抗体または追加のオリゴヌクレオチドを介して）使用し得る。放射性核種、リガンド、例えば、ビオチンもしくはアビジン、またはさらにはポリヌクレオチド配列、酵素、酵素基質、反応性基、発色団、例えば、検出可能な色を付与する色素または粒子（例えば、ラテックスまたは金属ビーズ）、発光化合物（例えば、生物発光、リン光、または化学発光化合物）、および蛍光化合物または部分（すなわち、フルオロフォア）を含む、任意の検出可能な部分が使用され得る。フルオロフォアの実施形態には、約４９５～６５０ｎｍの範囲の光を吸収し、約５２０～６７０ｎｍの範囲の光を放出するものが含まれ、これらには、ＦＡＭ（商標）、ＴＥＴ（商標）、ＣＡＬ ＦＬＵＯＲ（商標）（ＯｒａｎｇｅまたはＲｅｄ）、およびＱＵＡＳＡＲ（商標）化合物として既知のものが含まれる。フルオロフォアは、フルオロフォアに近接したときに光を吸収してバックグラウンド蛍光を減少させるクエンチャー分子と組み合わせて使用され得る。かかるクエンチャーは、当該技術分野で周知であり、例えば、ＢＬＡＣＫ ＨＯＬＥ ＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）（もしくはＢＨＱ（商標））化合物またはＴＡＭＲＡ（商標）化合物を含む。特定の実施形態には、混合物中の結合標識プローブが非結合標識プローブと比較して検出可能な変化を呈する均一系で検出可能な「均一な検出可能な標識」が含まれ、これは、ハイブリダイズされていない標識プローブからハイブリダイズされたものを物理的に除去することなく標識を検出することを可能にする（例えば、米国特許第５，２８３，１７４号、同第５，６５６，２０７号、および同第５，６５８，７３７号）。特定の均一な検出可能な標識には、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物、例えば、周知の標準ＡＥまたはＡＥ誘導体を含む、化学発光化合物が含まれる（米国特許第５，６５６，２０７号、同第５，６５８，７３７号、および同第５，６３９，６０４号）。標識を合成する方法、標識を核酸に結合する方法、および標識からのシグナルを検出する方法が周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）第１０章、および米国特許第５，６５８，７３７号、同第５，６５６，２０７号、同第５，５４７，８４２号、同第５，２８３，１７４号、および同第４，５８１，３３３号、ならびに欧州特許出願第０ ７４７ ７０６号）。ＡＥ化合物を核酸に結合する特定の方法が既知である（例えば、米国特許第Ｎｏ．５，５８５，４８１号および米国特許第５，６３９，６０４号、第１０列第６行～第１１列第３行、および実施例８を参照されたい）。特定のＡＥ標識位置は、プローブの中央領域およびＡ／Ｔ塩基対の領域付近、プローブの３’もしくは５’末端、または所望の標的配列と比較したプローブが検出すべきではない既知の配列とのミスマッチ部位もしくはその付近である。他の検出可能に標識されたプローブには、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、分子トーチ、および分子ビーコンが含まれる。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、ドナーおよびアクセプター標識を含み、そこで、クエンチャーの存在からフルオロフォアを放出するために増幅中にプローブを酵素的に分解したときに蛍光が検出される。分子トーチおよびビーコンは、開放配置および閉鎖配置で存在し、閉鎖配置は、フルオロフォアを消光し、開放位置は、フルオロフォアをクエンチャーから分離して蛍光を可能にする。標的核酸へのハイブリダイゼーションは、さもなければ閉鎖されているプローブを開放する。
「安定して」、「安定した」、または「検出のために安定した」とは、反応混合物の温度が核酸二本鎖の融解温度よりも少なくとも２℃低いことを意味する。反応混合物の温度は、より好ましくは、二本鎖核酸の融解温度よりも少なくとも５℃低く、さらにより好ましくは、反応混合物の融解温度よりも少なくとも１０℃低い。
「実質的に相同である」、「実質的に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」、または「実質的に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ）」とは、対象オリゴヌクレオチドが、参照塩基配列（ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物を除く）に存在する少なくとも１０個の連続する塩基領域と少なくとも約８０％相同である、好ましくは少なくとも約９０％相同である、最も好ましくは１００％相同である、少なくとも１０個の連続する塩基領域を含む塩基配列を有することを意味する。（当業者であれば、非特異的ハイブリダイゼーションレベルが標的核酸の検出を妨害するのに十分なレベルになるのを防止する一方で、標的配列へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするために様々な相同性パーセンテージでハイブリダイゼーションアッセイ条件に行うことができる適切な修飾を容易に理解するであろう。）類似性の程度は、２つの配列を構成する核酸塩基の順序を比較することによって決定され、それらの２つの配列間に存在し得る他の構造差を考慮しないが、但し、その構造差が相補塩基との水素結合を防止しないことを条件とする。２つの配列間の相同性の程度は、比較される少なくとも１０個の連続する塩基の各セット間の塩基差の数を用いて表すこともでき、これは、０、１、または２つの塩基差であり得る。
「実質的に相補的な」とは、対象オリゴヌクレオチドが、標的核酸配列（ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物を除く）に存在する少なくとも１０個の連続する塩基領域に少なくとも８０％相補的である、好ましくは少なくとも９０％相補的である、最も好ましくは１００％相補的である少なくとも１０個の連続する塩基領域を含む塩基配列を有することを意味する。当業者であれば、非特異的ハイブリダイゼーションレベルが標的核酸の検出を妨害するのに十分なレベルになるのを防止する一方で、標的配列へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするために様々な相補性パーセンテージでハイブリダイゼーションアッセイ条件に行うことができる適切な修飾を容易に理解するであろう。相補性の程度は、２つの配列を構成する核酸塩基の順序を比較することによって決定され、それらの２つの配列間に存在し得る他の構造差を考慮しないが、但し、その構造差が相補塩基との水素結合を防止しないことを条件とする。２つの配列間の相補性の程度は、比較される少なくとも１０個の連続する塩基の各セットに存在する塩基ミスマッチの数を用いて表すこともでき、これは、０、１、または２つの塩基ミスマッチであり得る。
本開示で論じられる温度、濃度、および時間の前に暗黙の「約」が存在し、これにより、ごくわずかな偏差が本教示の範囲内に収まるようになることが理解されるであろう。一般に、「約」という用語は、組成物の活性または安定性に有意な影響を及ぼさない組成物の成分の量のごくわずかな変動を示す。全ての範囲は、「端点を含まない」などの明示的除外がない場合に端点を包含すると解釈されるべきであり、それ故に、例えば、「１０～１５以内」には、１０および１５の値が含まれる。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定的であることを意図しない。前述の概要および発明を実施するための形態の両方が例示および説明にすぎず、本教示を限定するものではないことを理解されたい。参照により組み込まれるいずれの資料も本開示の明示的内容と矛盾する限りにおいて、明示的内容が優先されるものとする。
「ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物」とは、本質的に同じ相補的塩基対ハイブリダイゼーション特性を有するＲＮＡおよびＤＮＡ分子を意味する。ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物は、異なる糖部分（すなわち、リボースに対してデオキシリボース）を有し、ＲＮＡにはウラシルが存在し、ＤＮＡにはチミンが存在するという点で異なり得る。ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物が特定の配列に対して同程度の相補性を有するため、ＲＮＡ等価物とＤＮＡ等価物との間の差異は相同性の差異には寄与しない。
「ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基」とは、ＲＮＡおよびＤＮＡに同じ相補的塩基対ハイブリダイゼーション特性を有するヌクレオチド塩基を意味する。ここでは、塩基チミンの代わりに塩基ウラシルを使用することができ、またはその逆も可能であり、それ故に、ウラシルおよびチミンがＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基である。ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするポリヌクレオチド塩基配列５’－ＡＧＣＴ－３’は、配列５’－ＡＧＣＵ－３’も説明するであろう。ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物が特定の配列に対して同程度の相補性を有するため、ＲＮＡ等価塩基とＤＮＡ等価塩基との間の差異は相同性の差異には寄与しない。
「相補体」という用語は、別の核酸分子の連続する核酸配列に相補的な連続する核酸配列を含む核酸分子（標準ヌクレオチドの場合、Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｃ：Ｇ）を指す。例えば、５’－ＡＡＣＴＧＵＣ－３’は、５’－ＧＡＣＡＧＴＴ－３’の相補体である。
本明細書で使用される「標的核酸」とは、増幅される標的配列を含む核酸である。標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい。標的核酸は、増幅されない場合がある標的配列以外の他の配列を含んでもよい。
本明細書で使用される「標的配列」という用語は、増幅および／または検出される標的核酸の特定のヌクレオチド配列を指す。「標的配列」には、増幅プロセス（例えば、ＰＣＲ、ＴＭＡ）中にオリゴヌクレオチド（例えば、プライミングオリゴヌクレオチドおよび／またはプロモーターオリゴヌクレオチド）が複合体化する複合体化配列が含まれる。標的核酸が元来一本鎖である場合、「標的配列」という用語は、標的核酸中に存在する「標的配列」に相補的な配列も指すであろう。標的核酸が元来二本鎖である場合、「標的配列」という用語は、センス（＋）鎖およびアンチセンス（－）鎖の両方を指す。
「塩基の標的ハイブリダイズ配列」または「標的ハイブリダイズ配列」または「標的特異的配列」は、標的核酸配列とハイブリダイズするように構成されたオリゴマーの一部分を指すために本明細書で使用される。好ましくは、標的ハイブリダイズ配列は、標的核酸配列と特異的にハイブリダイズするように構成される。標的ハイブリダイズ配列は、それらがハイブリダイズするように構成された標的配列の一部分に１００％相補的であってもよいが、必ずしもそうでなくてもよい。標的ハイブリダイズ配列は、標的配列と比較して挿入された、欠失した、および／または置換されたヌクレオチド残基も含み得る。標的配列に対する標的ハイブリダイズ配列の１００％未満の相補性は、例えば、配列バリアントにハイブリダイズするように構成されたオリゴマーの場合のように、標的核酸がある種内の複数の株である場合に生じ得る。標的核酸に対して１００％未満の相補性を有するように標的ハイブリダイズ配列を構成する他の理由が存在することが理解される。
「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」とは、平行配向または逆平行配向で指定されたハイブリダイゼーションアッセイ条件下で一緒になって二本鎖領域を有する安定した構造を形成する２つの完全にまたは部分的に相補的な核酸鎖の能力を意味する。ハイブリッドと呼ばれることもあるこの二本鎖構造の２つの構成鎖は、水素結合によって一緒に保持される。これらの水素結合は、最も一般的には、単一核酸鎖上に塩基アデニンおよびチミンもしくはウラシル（ＡおよびＴもしくはＵ）またはシトシンおよびグアニン（ＣおよびＧ）を含むヌクレオチド間に形成されるが、塩基対合は、これらの「カノニカル」対のメンバーではない塩基間に形成される可能性もある。非カノニカル塩基対合は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｒ．Ｌ．Ｐ．Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（１１ｔｈ ｅｄ．１９９２）を参照されたい。
「優先的にハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、ハイブリダイゼーションアッセイプローブがそれらの標的核酸にハイブリダイズして、目的とする少なくとも１つの生物の存在を示す安定したプローブ：標的ハイブリッド（「検出可能なハイブリッド」）を形成することができ、非標的生物（「検出不能なハイブリッド」）、特に系統発生学的に密接に関連する生物の存在を示すのに十分な数の検出可能な安定したプローブ：非標的ハイブリッドが形成されないことを意味する。したがって、プローブは、非標的核酸よりも十分に大きい程度に標的核酸にハイブリダイズして、当業者が、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の核酸の存在（または不在）を正確に検出し、その存在を試験試料中の系統発生学的に密接に関連する生物の存在と区別することを可能にする。概して、オリゴヌクレオチド配列とその標的配列との間の相補性の程度を低下させることにより、その標的領域へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの程度または速度が低下するであろう。しかしながら、１つ以上の非相補的塩基の包含により、非標的生物を区別するオリゴヌクレオチドの能力が促進され得る。
優先的ハイブリダイゼーションは、発光、質量変化、および伝導度または濁度の変化に基づくものを含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の様々な技法のうちのいずれかを使用して測定することができる。いくつかの検出手段が本明細書に記載されており、特にそのうちの１つが以下に提供される実施例で使用される。好ましくは、試験試料中の標的ハイブリダイゼーションシグナルと非標的ハイブリダイゼーションシグナルとの間に少なくとも１０倍の差、より好ましくは少なくとも１００倍の差、最も好ましくは少なくとも５００倍の差がある。好ましくは、試験試料中の非標的ハイブリダイゼーションシグナルは、バックグラウンドシグナルレベル以下である。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件」、「ハイブリダイゼーションアッセイ条件」、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」、または「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブが、密接に関連する非標的微生物に由来する核酸よりもＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに由来する標的核酸（好ましくは、ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ）に優先的にハイブリダイズすることを可能にする条件を意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件は、プローブのＧＣ含有量および長さ、プローブ配列と試験試料中に存在し得る非標的配列の配列との間類似性の程度、およびプローブ配列と標的配列との間の類似性の程度を含む因子によって変化し得る。ハイブリダイゼーション条件には、温度およびハイブリダイゼーション試薬または溶液の組成が含まれる。以下の実施例の節には、本開示のプローブを使用してＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに由来する標的核酸を検出するための好ましいハイブリダイゼーションアッセイ条件が提供されているが、他のストリンジェントな条件も当業者によって容易に確認され得る。
「アッセイ条件」とは、標的核酸へのオリゴヌクレオチドの安定したハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。アッセイ条件は、標的核酸へのオリゴヌクレオチドの優先的ハイブリダイゼーションを必要としない。
「均一な検出可能な標識」とは、標識が標的配列にハイブリダイズされたプローブ上にあるかを決定することによって均一様式で検出することができる標識を指す。すなわち、均一な検出可能な標識は、ハイブリダイズされていない形態の標識または標識プローブからハイブリダイズされたものを物理的に除去することなく検出することができる。増幅された核酸を検出するために標識プローブを使用する場合、均一な検出可能な標識が好ましい。均一な標識の例は、Ａｒｎｏｌｄらの米国特許第５，２８３，１７４号、Ｗｏｏｄｈｅａｄらの米国特許第５，６５６，２０７号、およびＮｅｌｓｏｎらの米国特許第５，６５８，７３７号に詳細に記載されている。均一なアッセイに使用するための好ましい標識には、化学発光化合物が含まれる（例えば、Ｗｏｏｄｈｅａｄらの米国特許第５，６５６，２０７号、Ｎｅｌｓｏｎらの米国特許第５，６５８，７３７号、およびＡｒｎｏｌｄ，Ｊｒ．らの米国特許第５，６３９，６０４号を参照されたい）。好ましい化学発光標識は、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物、例えば、標準ＡＥまたはその誘導体（例えば、ナフチル－ＡＥ、オルト－ＡＥ、１－または３－メチル－ＡＥ、２，７－ジメチル－ＡＥ、４，５－ジメチル－ＡＥ、オルト－ジブロモ－ＡＥ、オルト－ジメチル－ＡＥ、メタ－ジメチル－ＡＥ、オルト－メトキシ－ＡＥ、オルト－メトキシ（シンナミル）－ＡＥ、オルト－メチル－ＡＥ、オルト－フルオロ－ＡＥ、１－または３－メチル－オルト－フルオロ－ＡＥ、１－または３－メチル－メタ－ジフルオロ－ＡＥ、および２－メチル－ＡＥ）である。
「均一なアッセイ」とは、特定のプローブハイブリダイゼーションの程度を決定する前に、ハイブリダイズされていないプローブからハイブリダイズされたプローブを物理的に分離することを必要としない検出手順を指す。例示的な均一なアッセイ、例えば、本明細書に記載のものは、適切な標的にハイブリダイズされたときに蛍光シグナルを放出する分子ビーコンまたは他の自己報告プローブ、ハイブリッド二本鎖に存在しない場合に化学的手段によって選択的に破壊され得る化学発光アクリジニウムエステル標識、および当業者によく知られているであろう他の均一に検出可能な標識を用いることができる。
「から本質的になる」とは、本発明の基本的な特徴および新規の特徴を実質的に（ｍａｔｅｒｉａｌｌｙ）変化させない追加の成分、組成物、または方法ステップが、本発明の組成物またはキットまたは方法に含まれ得ることを意味する。本発明の基本的な特徴および新規の特徴に実質的な影響を及ぼすいずれの成分、組成物、または方法ステップも、この用語に入らないであろう。例えば、オリゴヌクレオチドへの付加または欠失は、オリゴヌクレオチドがその特許請求される特性を有することを防止しない（すなわち、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、非標的核酸よりも標的核酸に優先的にハイブリダイズする）非物質的な変化であり得る。オリゴヌクレオチドは、標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーションに関与せず、かつかかるハイブリダイゼーションに影響を及ぼさない他の核酸分子を含み得る。
「核酸二本鎖」、「二本鎖」、「核酸ハイブリッド」、または「ハイブリッド」とは、二本鎖水素結合領域を含む安定した核酸構造を意味する。かかるハイブリッドには、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、およびＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖分子、ならびにそれらの類似体が含まれる。構造は、任意の既知の手段によって検出可能になるように十分に安定している。
「増幅オリゴヌクレオチド」または「増幅オリゴマー」とは、標的核酸またはその相補体にハイブリダイズし、核酸増幅反応に関与する（例えば、プライマーまたはプロモーター－プライマーとして機能する）オリゴヌクレオチドである。特定の増幅オリゴマーは、標的核酸配列またはその相補鎖の領域に相補的な少なくとも約１０個の連続する塩基、任意選択的に、少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、または２３個の連続する塩基を含む。連続する塩基は、増幅オリゴマーが結合する標的配列に少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または完全に相補的であり得る。当業者であれば、列挙された範囲がその範囲内の全ての整数および有理数（例えば、９２％または９８．３７７％）を含むことを理解するであろう。特定の増幅オリゴマーは、約１０～約６０塩基長、またはより好ましくは約１８～約２６塩基長であり、任意選択的に、修飾されたヌクレオチドを含み得る。
「プライマー」とは、鋳型核酸にハイブリダイズし、ポリメラーゼ酵素によって伸長される３’末端を有するオリゴマーである。プライマーは、例えば、標的配列に非相補的な５’領域を含めることによって、任意選択的に修飾され得る。かかる修飾には、プライマーもしくは標的オリゴヌクレオチドを操作もしくは増幅するために使用されるまたはそれを操作もしくは増幅するのに有用なタグ、プロモーター、または他の非標的特異的配列などの機能的付加が含まれ得る。
転写媒介増幅の文脈内で、５’プロモーター配列で修飾されたプライマーは、本明細書で「プロモーター－プライマー」と称される。分子生物学または生化学の技術分野の当業者であれば、プライマーとして機能することができるオリゴマーが、５’プロモーター配列を含むように修飾され、その後、プロモーター－プライマーとして機能することができ、同様に、任意のプロモーター－プライマーが、その５’プロモーター配列の有無にかかわらずプライマーとしての役割を果たすことができることを理解するであろう。３’ブロック末端を組み込むように修飾されたプロモーター－プライマーは、本明細書で「プロモータープロバイダー」と称され、これは、標的核酸にハイブリダイズし、転写を開始する役割を果たす上流プロモーター配列を提供することができるが、オリゴ伸長のためのプライマーを提供しない。
「核酸増幅」または「標的増幅」または単に「増幅」とは、標的核酸配列、またはその相補配列、またはその断片の複数のコピー（すなわち、完全標的核酸よりも少なく含む増幅配列）を生成する任意のインビトロ手順を指す。核酸増幅手順の例には、転写関連方法、例えば、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）および他のもの（例えば、米国特許第５，３９９，４９１号、同第５，５５４，５１６号、同第５，４３７，９９０号、同第５，１３０，２３８号、同第４，８６８，１０５号、および同第５，１２４，２４６号）、レプリカーゼ媒介増幅（例えば、米国特許第４，７８６，６００号）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、欧州特許第０３２０３０８号）、ヘリカーゼ依存性増幅（例えば、米国特許第７，２８２，３２８号）、ならびに鎖置換増幅（ＳＤＡ）（例えば、米国特許第５，４２２，２５２号）が挙げられる。増幅は、線形または指数関数的であり得る。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、および熱サイクリングステップを使用して、ＤＮＡまたはｃＤＮＡの２つの相補鎖の複数のコピーを合成する。ＬＣＲ増幅は、少なくとも４つの別個のオリゴヌクレオチドを使用して、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、および変性の複数のサイクルを使用することによって標的およびその相補鎖を増幅する。ヘリカーゼ依存性増幅は、ヘリカーゼを使用して、ＤＮＡ二本鎖の２つの鎖を分離して一本鎖鋳型を生成し、続いて、鋳型にハイブリダイズする配列特異的プライマーのハイブリダイゼーションおよびＤＮＡポリメラーゼによる伸長を行い、標的配列を増幅する。ＳＤＡは、標的配列を含む半修飾ＤＮＡ二本鎖の一方の鎖にニック形成する制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むプライマーを使用し、続いて、一連のプライマー伸長ステップおよび鎖置換ステップで増幅を行う。レプリカーゼ媒介増幅は、自己複製ＲＮＡ分子、およびＱＢレプリカーゼなどのレプリカーゼを使用する。特定の実施形態はＰＣＲまたはＴＭＡを使用するが、本明細書に開示されるオリゴマーが他の増幅法でプライマーとして容易に使用され得ることは当業者に明らかであろう。
転写関連増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、プロモーター含有オリゴヌクレオチドを使用し、任意選択的に、他のオリゴヌクレオチドを含んで、最終的に核酸鋳型から複数のＲＮＡ転写物を産生し得る（例えば、Ｋａｃｉａｎらの米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，５５４，５１６号、Ｂｕｒｇらの米国特許第５，４３７，９９０号、ＰＣＴ公開第ＷＯ８８／０１３０２号および同第ＷＯ８８／１０３１５号（Ｇｉｎｇｅｒａｓら）、Ｍａｌｅｋらの米国特許第５，１３０，２３８号、Ｕｒｄｅａらの米国特許第４，８６８，１０５号および同第５，１２４，２４６号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０３４７２号（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら）、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９５／０３４３０号（Ｒｙｄｅｒら）に詳細に記載されている）。ＴＭＡを使用する方法は、以前に詳細に説明されている（例えば、米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，５５４，５１６号）。
「増幅条件」とは、核酸増幅を可能にする条件を意味する。以下の実施例の節には、転写媒介増幅法で本開示のプライマーを使用してクラミジア生物に由来する標的核酸配列を増幅するための好ましい増幅条件が提供されているが、所望の特定の増幅法に応じて、他の許容される増幅条件も当業者によって容易に決定され得る。
「逆センス」または「逆鎖」とは、参照またはセンス核酸鎖に完全に相補的な核酸分子を意味する。
「センス」、「同センス」、または「プラスセンス」とは、参照核酸分子と完全に相同の核酸分子を意味する。
「アンプリコン」とは、標的核酸に由来する、核酸増幅反応で生成される核酸分子を意味する。アンプリコンは、標的核酸と同センスまたは逆センスのものであり得る標的核酸配列を含む。
ハイブリダイゼーション条件およびプローブ設計
ハイブリダイゼーション反応条件、最も重要なことに、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション溶液中の塩の濃度は、本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブがＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに由来する標的核酸配列を有する核酸に優先的にハイブリダイズすることを可能にするように選択することができる。減少した塩濃度および／または上昇した温度（ストリンジェンシーが増加した条件）で、二本鎖ハイブリッド分子中の対合ヌクレオチド塩基間の水素結合が破壊されると、核酸ハイブリダイゼーションの程度が低下する。このプロセスは、「融解」として知られている。
ハイブリダイゼーション反応条件、最も重要なことに、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション溶液中の塩の濃度は、本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブがＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに由来する標的核酸配列を有する核酸に優先的にハイブリダイズすることを可能にするように選択することができる。減少した塩濃度および／または上昇した温度（ストリンジェンシーが増加した条件）で、二本鎖ハイブリッド分子中の対合ヌクレオチド塩基間の水素結合が破壊されると、核酸ハイブリダイゼーションの程度が低下する。このプロセスは、「融解」として知られている。
概して言えば、最も安定したハイブリッドは、最多数の連続する完全に一致した（すなわち、水素結合した）ヌクレオチド塩基対を有するものである。かかるハイブリッドは、通常、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーが増加すると最後に融解すると予想される。しかしながら、１つ以上のミスマッチ、「非カノニカル」、または不完全な塩基対を含む（核酸のヌクレオチド配列にその位置でより弱いまたは存在しない塩基対合をもたらす）二本鎖核酸領域は、比較的高ストリンジェンシー条件下で依然として十分に安定している場合があり、試験試料中に存在し得る他の選択されていない核酸と交差反応することなく核酸ハイブリッドがハイブリダイゼーションアッセイで形成および検出されることを可能にし得る。
したがって、一方では、標的核酸のヌクレオチド配列と、系統発生学的に異なるが密接に関連する生物に属する非標的核酸のヌクレオチド配列との間の類似性の程度、および他方では、特定のプローブのヌクレオチド配列と、標的および非標的核酸のヌクレオチド配列との間の相補性の程度に応じて、１つ以上のミスマッチが、非標的核酸ではなく標的核酸にハイブリダイズするプローブまたはプライマーに含まれるオリゴヌクレオチドの能力を必ずしも打ち負かすわけではないであろう。
本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、プローブ：標的ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）（Ｔｍは、所与の反応混合物中の潜在的に二本鎖の分子の半分が一本鎖の変性状態にある温度として定義される）と、プローブと、検出されることを求められていないが、試験試料中に存在することが予想される系統発生学的に最も密接に関連する生物のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡとの間に形成されるミスマッチハイブリッドのＴｍとの間の差を最大化するように選ばれた、選択された、および／または設計された。非標識増幅プライマーおよび捕捉プローブが本開示において有用になるようにハイブリダイゼーションアッセイプローブとして非常に高度な特異性を有する必要はないが、それらは、指定された増幅またはハイブリダイゼーションアッセイ条件下で他の核酸よりも１つ以上の標的核酸に優先的にハイブリダイズするように同様の様式で設計されている。
ｒＲＮＡ分子内で、二次構造（分子内水素結合によって部分的に引き起こされる）と機能との間に密接な関係がある。この事実は、一次ヌクレオチド配列の進化的変化に制限を課し、二次構造を維持させる。例えば、二重ヘリックスの一方の「鎖」（分子内水素結合により、両方の「鎖」が同じｒＲＮＡ分子の一部である）で塩基が変化する場合、補償置換が、通常、相補性（共分散と称される）、ひいては必要な二次構造を保存するために他方の「鎖」の一次配列に起こる。これにより、保存された一次配列およびまた保存された二次構造要素の両方に基づいて、２つの非常に異なるｒＲＮＡ配列が整列することを可能になる。本明細書に記載のハイブリダイゼーションアッセイプローブの潜在的標的配列は、整列した配列の相同性の変化に注目することによって特定された。
可変領域の各々での配列進化は、ほとんどが分岐である。この分岐の結果として、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのより遠い系統発生学的近縁種の対応するｒＲＮＡ可変領域は、系統発生学的により近い近縁種のｒＲＮＡよりも大きいこれらの生物のｒＲＮＡとの差を示す。
推定上固有の潜在的標的ヌクレオチド配列を単に特定するだけでは、機能的に種特異的なハイブリダイゼーションアッセイプローブが、その配列を含むＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡにハイブリダイズするように作製され得ることは保証されない。様々な他の因子が種特異的プローブの標的部位としての核酸遺伝子座の適合性を決定するであろう。ハイブリダイゼーション反応の程度および特異性、例えば、本明細書に記載のものがいくつかの因子に影響されるため、それらの因子のうちの１つ以上の操作により、その標的に完全に相補的であるか否かにかかわらず、特定のオリゴヌクレオチドの正確な感度および特異性が決定されるであろう。様々なアッセイ条件の重要性および影響は、当業者に既知であり、Ｋｏｈｎｅ，“Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎ－Ｖｉｒａｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ”（米国特許第４，８５１，３３０号）、Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｔｏ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｏｒｄｏｎａｅ”（米国特許第５，２１６，１４３号）、およびＨｏｇａｎ，“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ／ｏｒ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎ－Ｖｉｒａｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ”（米国特許第５，８４０，４８８号）に開示されている。
ハイブリダイゼーションの所望の温度およびハイブリダイゼーション溶液組成（塩濃度、界面活性剤、および他の溶質など）も二本鎖ハイブリッドの安定性に影響を及ぼし得る。イオン強度およびプローブが標的にハイブリダイズすることを可能にするであろう温度などの条件は、種特異的プローブの構築時に考慮されなければならない。ハイブリッド核酸の熱安定性は、一般に、反応混合物のイオン強度とともに増加する。他方で、ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシド、およびアルコールなどの水素結合を破壊する化学試薬は、ハイブリッドの熱安定性を大幅に低下させる可能性がある。
その標的に対するプローブの特異性を最大化するために、本開示のプローブは、高ストリンジェンシー条件下でそれらの標的にハイブリダイズするように設計された。かかる条件下で、高度の相補性を有する単一の核酸鎖（または領域）のみが互いにハイブリダイズするであろう。かかる高度の相補性を有しない単一の核酸鎖は、ハイブリッドを形成しないであろう。したがって、アッセイ条件のストリンジェンシーにより、ハイブリッドを形成するために２つの核酸鎖間に存在すべき相補性の量が決定される。ストリンジェンシーは、プローブと標的核酸との間に形成されるハイブリッドと、プローブと試験試料中に存在する任意の非標的核酸との間の潜在的なハイブリッドとの間の安定性の差を最大化するように選ばれる。
適切な特異性は、非標的生物の配列に対して完全な相補性を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブの長さを最小限に抑えることによって、非標的核酸に相補性のＧおよびＣ豊富な領域を避けることによって、かつ非標的配列に対して可能な限り多くの不安定化ミスマッチを含むようにプローブを構築することによって達成され得る。プローブが特定のタイプの生物のみの検出に適しているかは、プローブ：標的ハイブリッドとプローブ：非標的ハイブリッドとの間の熱安定性の差に大きく依存する。プローブを設計する際に、これらのＴｍ値の差は、可能な限り大きくすべきである（好ましくは２～５℃以上）。Ｔｍの操作は、ＧＣ含有量対ＡＴ含有量、またはヌクレオチド類似体（例えば、リボフラノシル部分に対する２’－Ｏ－メチル置換を有するリボヌクレオチド）の包含などのプローブの長さおよびプローブの組成を変化させることによって達成することができる。
一般に、オリゴヌクレオチドプローブの最適なハイブリダイゼーション温度は、所与の二本鎖の融解温度よりも約５℃低い。最適温度よりも低い温度でのインキュベーションは、ミスマッチ塩基配列がハイブリダイズすることを可能にする場合があり、それ故に、特異性を低下させる可能性がある。プローブが長いほど、かつ塩基対間の水素結合が多いほど、一般に、Ｔｍが高くなる。Ｇ－Ｃ塩基対が追加の水素結合を呈し、ひいてはＡ－Ｔ塩基対よりも高い熱安定性を呈するため、ＧおよびＣのパーセンテージを増加させることも、Ｔｍを増加させる。かかる考慮すべき事項は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｊ．ＳＡＭＢＲＯＯＫ ＥＴ ＡＬ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＣＨ．１１（２ｄ ｅｄ．１９８９）を参照されたい。
Ｔｍを決定するための好ましい方法は、Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ”（米国特許第５，２８３，１７４号）に開示される周知のハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）を使用してハイブリダイゼーションを測定する。Ｔｍは、以下の様式でＨＰＡを使用して測定することができる。プローブ分子をアクリジニウムエステルで標識し、過剰量の標的を使用してコハク酸リチウム緩衝液（０．１Ｍコハク酸リチウム緩衝液、ｐＨ４．７、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１５ｍＭアルドリチオール－２、１．２Ｍ ＬｉＣｌ、３％（体積／体積）絶対エタノール、２％（重量／体積）ラウリル硫酸リチウム）中でプローブ：標的ハイブリッドを形成させる。その後、プローブ：標的ハイブリッドを含む溶液のアリコートをコハク酸リチウム緩衝溶液で希釈し、予想されるＴｍ（典型的には５５℃）よりも低い温度で開始し、２～５℃増分で増加する様々な温度で５分間インキュベートする。その後、この溶液を弱アルカリ性ホウ酸緩衝液（６００ｍＭホウ酸、２４０ｍＭ ＮａＯＨ、１％（体積／体積）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ８．５）で希釈し、同等の温度またはより低い温度（例えば、５０℃）で１０分間インキュベートする。
これらの条件下で、一本鎖プローブに結合したアクリジニウムエステルが加水分解する一方で、ハイブリダイズされたプローブに結合したアクリジニウムエステルは、加水分解から比較的保護される。したがって、加水分解処理後に残っているアクリジニウムエステルの量は、ハイブリッド分子の数に比例する。残りのアクリジニウムエステルを、過酸化水素およびアルカリを溶液に加えることによって残りのアクリジニウムエステルから生成される化学発光を監視することによって測定することができる。化学発光を、ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）４５０ｉルミノメーター（Ｇｅｎ－Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などのルミノメーターで測定することができる。結果として得られたデータを、温度に対する（通常は最低温度からの）最大シグナルのパーセントとしてプロットすることができる。Ｔｍは、最大シグナルの５０％が残る温度として定義される。上記の方法に加えて、Ｔｍは、当業者に既知の同位体的方法によって決定され得る（例えば、米国特許第５，８４０，４８８号を参照されたい）。
所与のハイブリッドのＴｍが使用されるハイブリダイゼーション溶液の性質に応じて変化することに留意されたい。塩濃度、界面活性剤、および他の溶質などの因子が熱変性中にハイブリッド安定性に影響を及ぼし得る（例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ＥＴ ＡＬ．（上記）第１１章を参照されたい）。イオン強度およびプローブが標的にハイブリダイズすることを可能にするであろう温度などの条件は、プローブの構築時に考慮されるべきである。概して言えば、ハイブリッド核酸の熱安定性は、反応混合物のイオン強度とともに増加する。他方で、ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシド、およびアルコールなどの水素結合を破壊する化学試薬は、ハイブリッドの熱安定性を大幅に低減させる可能性がある。
その標的に対するハイブリダイゼーションアッセイプローブの特異性を確実にするために、高ストリンジェンシー条件下で標的核酸にのみハイブリダイズするプローブを設計することが好ましい。高度に相補的な配列のみが高ストリンジェンシー条件下でハイブリッドを形成するであろう。したがって、アッセイ条件のストリンジェンシーは、安定したハイブリッドを形成するために２つの配列間に必要な相補性の量を決定する。ストリンジェンシーは、プローブ：標的ハイブリッドと潜在的なプローブ：非標的ハイブリッドとの間の安定性の差を最大化するように選ばれるべきである。
特定のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例が本明細書に提供される。言うまでもなく、代替のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が本開示に基づいて当業者によって決定され得る。（例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ＥＴ ＡＬ．（上記）第１１章を参照されたい。）
標的核酸配列領域の長さ、ひいてはプローブ配列の長さも重要であり得る。いくつかの事例では、特定の領域由来の配列がいくつか存在する場合があり、位置および長さが異なり、これを使用して、所望のハイブリダイゼーション特性を有するプローブを設計することができる。他の事例では、あるプローブは、単一の塩基のみが異なる別のプローブよりも特異性に関して有意に良好であり得る。完全に相補的ではない核酸がハイブリダイズすることが可能であるが、完全に相補的な塩基の最長ストレッチ、ならびに塩基組成物が、一般に、ハイブリッド安定性を決定するであろう。
ハイブリダイゼーションに阻害性の強力な内部構造を形成することで知られているｒＲＮＡの領域は、あまり好ましくない標的領域である。同様に、広範な自己相補性を有するプローブも一般に避けられている。しかしながら、以下で論じられる分子ビーコンおよび分子トーチなどのヘアピンプローブのように、プローブにある程度の自己相補性が望ましい場合がある。鎖が分子内または分子間ハイブリッドに完全にまたは部分的に含まれる場合、反応条件の変化なしに新たな分子間プローブ：標的ハイブリッドの形成に関与する可能性は低くなるであろう。リボソームＲＮＡ分子は、水素結合によって非常に安定した分子内ヘリックスおよび二次構造を形成することで知られている。ハイブリダイゼーション条件下で実質的に一本鎖のままである標的核酸の領域に対するプローブを設計することにより、プローブと標的との間のハイブリダイゼーションの速度および程度が増加され得る。
ゲノムリボソーム核酸（ｒＤＮＡ）標的は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の産物と同様に、二本鎖形態で自然発生する。これらの二本鎖標的は、プローブとのハイブリダイゼーションに生来阻害性であり、ハイブリダイゼーション前に変性を必要とする。適切な変性およびハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３（１９７５）を参照されたい）。
それらの標的核酸に完全に一致したオリゴヌクレオチドの融解温度の推定値を提供するであろういくつかの式が利用可能である。かかる式の１つは、Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（分率Ｇ＋Ｃ）－（６００／Ｎ）であり
（式中、Ｎがヌクレオチドの数でのオリゴヌクレオチドの長さである）、１４ヌクレオチド長と６０～７０個ヌクレオチド長との間のオリゴヌクレオチドのＴｍの良好な推定値を提供する。かかる計算から、Ｔｍのその後の経験的検証または「微調整」が、当該技術分野で周知のスクリーニング技法を使用して行われ得る。ハイブリダイゼーションおよびオリゴヌクレオチドプローブに関するさらなる情報については、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ＥＴ ＡＬ．（上記）第１１章を参照することができる。この参考文献は、当該技術分野で周知のものの中でもとりわけ、ハイブリッドのＴｍに対するミスマッチの影響の推定値を提供する。したがって、２つ以上の生物のリボソームＲＮＡ（またはｒＤＮＡ）の所与の領域の既知のヌクレオチド配列から、これらの生物を互いに区別するであろうオリゴヌクレオチドが設計され得る。
（式中、Ｎがヌクレオチドの数でのオリゴヌクレオチドの長さである）、１４ヌクレオチド長と６０～７０個ヌクレオチド長との間のオリゴヌクレオチドのＴｍの良好な推定値を提供する。かかる計算から、Ｔｍのその後の経験的検証または「微調整」が、当該技術分野で周知のスクリーニング技法を使用して行われ得る。ハイブリダイゼーションおよびオリゴヌクレオチドプローブに関するさらなる情報については、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ＥＴ ＡＬ．（上記）第１１章を参照することができる。この参考文献は、当該技術分野で周知のものの中でもとりわけ、ハイブリッドのＴｍに対するミスマッチの影響の推定値を提供する。したがって、２つ以上の生物のリボソームＲＮＡ（またはｒＤＮＡ）の所与の領域の既知のヌクレオチド配列から、これらの生物を互いに区別するであろうオリゴヌクレオチドが設計され得る。
オリゴヌクレオチドの調製
本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、増幅プライマー、および捕捉プローブは、当該技術分野で既知の方法によって容易に調製することができる。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、固相法を使用して合成される。ホスホジエステル結合によってヌクレオチドを結合するための標準のホスホルアミダイト固相化学は、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ Ｍｅｔｈｏｄ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：２８７（１９８７）に開示されている。シアノエチルホスホルアミダイト前駆体を使用した自動固相化学合成がＢａｒｏｎｅによって説明されている。Ｂａｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓ－ｄｉａｌｋｙｌａｍｉｎｅｐｈｏｓｐｈｉｎｅｓ－－ａ Ｎｅｗ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ Ｄｅｏｘｙｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２（１０）：４０５１（１９８４）を参照されたい。Ｂａｔｔは、「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」という表題の米国特許第５，４４９，７６９号で、ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドを合成するための手順を開示している。加えて、Ｒｉｌｅｙらは、「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ」という表題の米国特許第５，８１１，５３８号で、メチルホスホネート結合を含む異なる結合を有するオリゴヌクレオチドの合成を開示している。さらに、オリゴヌクレオチドの有機合成のための方法は、当業者に既知であり、例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ＥＴ ＡＬ．（上記）第１０章に記載されている。
本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、増幅プライマー、および捕捉プローブは、当該技術分野で既知の方法によって容易に調製することができる。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、固相法を使用して合成される。ホスホジエステル結合によってヌクレオチドを結合するための標準のホスホルアミダイト固相化学は、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ Ｍｅｔｈｏｄ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：２８７（１９８７）に開示されている。シアノエチルホスホルアミダイト前駆体を使用した自動固相化学合成がＢａｒｏｎｅによって説明されている。Ｂａｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓ－ｄｉａｌｋｙｌａｍｉｎｅｐｈｏｓｐｈｉｎｅｓ－－ａ Ｎｅｗ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ Ｄｅｏｘｙｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２（１０）：４０５１（１９８４）を参照されたい。Ｂａｔｔは、「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」という表題の米国特許第５，４４９，７６９号で、ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドを合成するための手順を開示している。加えて、Ｒｉｌｅｙらは、「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ」という表題の米国特許第５，８１１，５３８号で、メチルホスホネート結合を含む異なる結合を有するオリゴヌクレオチドの合成を開示している。さらに、オリゴヌクレオチドの有機合成のための方法は、当業者に既知であり、例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ＥＴ ＡＬ．（上記）第１０章に記載されている。
特定のオリゴヌクレオチドの合成および精製後、いくつかの異なる手順を利用して、そのオリゴヌクレオチドを精製し、その品質を制御することができる。好適な手順は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高圧液体クロマトグラフィーを含む。これらの手順はいずれも、当業者に周知である。
本開示のオリゴヌクレオチドは全て、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、増幅プライマー、または捕捉プローブであるかにかかわらず、それらの性能を増強するために、または増幅産物の特徴付けを容易にするために化学基で修飾され得る。例えば、オリゴヌクレオチドをある特定のポリメラーゼの核酸分解活性またはヌクレアーゼ酵素に対して耐性にする骨格修飾オリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、２’－Ｏ－アルキル、またはペプチド基を有するオリゴヌクレオチドは、増幅または他の反応でのかかる酵素の使用を可能にし得る。修飾の別の例は、プローブまたはプライマーの核酸鎖内のヌクレオチド間に組み込まれ、かつプローブのハイブリダイゼーションまたはプライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長を防止しない非ヌクレオチドリンカーを使用することを含む。Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｏｎ－Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｉｎｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ”（米国特許第６，０３１，０９１号）を参照されたい。本開示のオリゴヌクレオチドは、所望の修飾および天然ヌクレオチドの混合物も含み得る。
増幅プライマーの３’末端は、Ｋａｃｉａｎらによって米国特許第５，５５４，５１６号に開示されるＤＮＡ合成の開始を防止または阻害するように修飾またはブロックすることができる。プライマーの３’末端は、当該技術分野で周知の様々な方法で修飾することができる。例として、プライマーに対する適切な修飾は、リボヌクレオチド、３’デオキシヌクレオチド残基（例えば、コルジセピン）、２’，３’－ジデオキシヌクレオチド残基、修飾ヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエート、および非ヌクレオチド結合、例えば、Ａｒｎｏｌｄらによって米国特許第６，０３１，０９１号に開示されるものまたはアルカン－ジオール修飾（Ｗｉｌｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｃｋｂｏｎｅ－Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ Ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ－１，３ Ｍｏｉｅｔｙ ａｓ ａ‘Ｖｉｃａｒｉｏｕｓ Ｓｅｇｍｅｎｔ’ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｙｌ Ｍｏｉｅｔｙ－－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｔｕｄｉｅｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８（８）：２０６５（１９９０）を参照されたい）の付加を含み得るか、またはその修飾は、単に標的核酸配列に非相補的なプライミング配列の領域３’からなり得る。加えて、異なる３’ブロックプライマーまたは３’ブロックもしくは非ブロックプライマーの混合物は、そこで開示されるように、核酸増幅の効率を増加させ得る。
プライマーの５’末端は、いくつかの核酸ポリメラーゼに存在する５’－エキソヌクレアーゼ活性に耐性を示すように修飾することができる。かかる修飾は、Ａｒｎｏｌｄらによって米国特許第６，０３１，０９１号に開示される技法などの技法を使用して、プライマーの末端５’ヌクレオチドに非ヌクレオチド基を付加することによって行うことができる。鎖置換を容易にするために、５’末端は、Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ，“Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”（米国特許第６，０８７，１３３号）に開示されるように、非相補ヌクレオチドを含むようにも修飾され得る。
合成されると、選択されたオリゴヌクレオチドがいくつかの周知の方法のうちのいずれかによって標識され得る（例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ（上記）第１０章を参照されたい）。有用な標識には、放射性同位体および非放射性レポート基が含まれる。同位体標識には、３Ｈ、３５Ｓ、３２Ｐ、１２５Ｉ、５７Ｃｏ、および１４Ｃが含まれる。同位体標識は、ニック翻訳、末端標識、第二鎖合成、逆転写の使用などの当該技術分野で既知の技法によって、かつ化学的方法によってオリゴヌクレオチドに導入することができる。放射性標識プローブを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、オートラジオグラフィー、シンチレーションカウンティング、またはガンマカウンティングによって検出することができる。選択される検出方法は、標識に使用される特定の放射性同位体に依存するであろう。
非同位体材料も標識に使用することができ、核酸配列の内部にまたは核酸配列の末端に導入され得る。修飾ヌクレオチドは、酵素的または化学的に組み込まれ得る。プローブの化学的修飾は、例えば、Ａｒｎｏｌｄらによって米国特許第６，０３１，０９１号に開示されるように、非ヌクレオチドリンカー基を使用してプローブの合成中または合成後に行われ得る。非同位体標識には、蛍光分子（Ｔｙａｇｉらによって米国特許第５，９２５，５１７号に開示される蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対などの個々の標識または相互作用標識の組み合わせ）、化学発光分子、酵素、補因子、酵素基質、ハプテン、または他のリガンドが含まれる。本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブでは、プローブは、好ましくは、標準アクリジニウムエステル（ＡＥ）などのＡＥを有する非ヌクレオチドリンカーによって標識される。アクリジニウムエステル標識は、Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，”Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ Ｅｓｔｅｒ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ”（米国特許第５，１８５，４３９号）に開示されるように行われ得る。
核酸増幅
好ましくは、本開示の増幅プライマーは、オリゴデオキシヌクレオチドであり、核酸ポリメラーゼによる伸長産物の合成のための基質として使用されるのに十分に長い。最適なプライマーの長さは、反応の温度、プライマーの構造および塩基組成、ならびにプライマーがどのように使用されるべきかを含むいくつかの因子を考慮すべきである。例えば、最適な特異性のために、オリゴヌクレオチドプライマーは、一般に、標的核酸配列の複雑さに応じて、少なくとも１２塩基長であるべきである。かかる特異性が必須でない場合、より短いプライマーが使用され得る。そのような場合、鋳型核酸との安定したハイブリッド複合体を形成するために、より低い温度で反応を行うことが望ましい場合がある。
好ましくは、本開示の増幅プライマーは、オリゴデオキシヌクレオチドであり、核酸ポリメラーゼによる伸長産物の合成のための基質として使用されるのに十分に長い。最適なプライマーの長さは、反応の温度、プライマーの構造および塩基組成、ならびにプライマーがどのように使用されるべきかを含むいくつかの因子を考慮すべきである。例えば、最適な特異性のために、オリゴヌクレオチドプライマーは、一般に、標的核酸配列の複雑さに応じて、少なくとも１２塩基長であるべきである。かかる特異性が必須でない場合、より短いプライマーが使用され得る。そのような場合、鋳型核酸との安定したハイブリッド複合体を形成するために、より低い温度で反応を行うことが望ましい場合がある。
所望の特徴を有する増幅プライマーを設計するための有用なガイドラインは、上記の「オリゴヌクレオチドの調製」という表題の節に記載されている。増幅およびプローブのための最適な部位は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸の少なくとも２つ、好ましくは３つの保存領域を含む。これらの領域は、約１５～３５０塩基、好ましくは約１５～１５０塩基長である。
増幅プライマーのセット（プライマーおよび／またはプロモーター－プライマー）で観察される増幅の程度は、それらの特定の標的配列にハイブリダイズするプライマーの能力および酵素により伸長またはコピーされるそれらの能力を含むいくつかの因子に依存する。異なる長さおよび塩基組成の増幅プライマーが使用され得るが、本開示において好ましい増幅プライマーは、１８～４０個の塩基の標的結合領域を有し、予測されるＴｍは、４２℃超、好ましくは少なくとも約５０℃を目標とする。
標的配列の融解温度、相補性、および二次構造などのプローブハイブリダイゼーションに影響を及ぼすパラメータも、増幅プライマーハイブリダイゼーションに影響を及ぼし、ひいては増幅プライマーの性能に影響を及ぼす。非特異的伸長（プライマー－二量体または非標的コピー）の程度も増幅効率に影響を及ぼし得る。したがって、増幅プライマーは、一般に、特にそれらの配列の３’末端に低い自己相補性または交差相補性を有するように選択される。それにもかかわらず、Ｎａｄｅａｕ ｅｔ ａｌ．，”Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｂｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ”（米国特許第５，９５８，７００号）に開示される自己報告「シグナルプライマー」、およびＮａｚａｒｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｌａｂｅｌｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒｅｏｎ”（米国特許第５，８６６，３３６号）に開示される「ヘアピンプライマー」などの自己相補性領域を含む増幅プライマーが有用であり得る。偽プライマー伸長を減少させるために、長いホモポリマーランおよび高いＧＣ含有量が避けられている。Ｏｌｉｇｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なＯｌｉｇｏ Ｔｅｃｈ（登録商標）分析ソフトウェアを含むその設計のこの態様に役立つコンピュータプログラムが利用可能である。
本開示の増幅プライマーとともに使用される核酸ポリメラーゼとは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれかまたはそれらの両方を核酸ポリマーまたは鎖に鋳型依存的に組み込む化学的、物理的、または生物学的薬剤を指す。核酸ポリメラーゼの例には、ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型依存的な５’から３’の方向の核酸合成をもたらす。二本鎖核酸中のこれらの２つの鎖の典型的な逆平行配向のため、この方向は、鋳型上の３’領域から鋳型上の５’領域である。ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼの例には、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）由来のＤＮＡポリメラーゼＩの大きい断片が含まれる。例えば、Ｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ”（米国特許第６，０６６，４８３号）を参照されたい。ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼの例には、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素またはトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素などの様々なレトロウイルス逆転写酵素が挙げられる。
ほとんどの核酸増幅反応中に、核酸ポリメラーゼは、標的核酸を鋳型として使用してプライマーの３’末端にヌクレオチド残基を付加し、それ故に、標的核酸の領域に部分的または完全に相補的なヌクレオチド配列を有する第２の核酸鎖を合成する。多くの核酸増幅反応では、増幅反応を進行させるために、結果として得られた二本鎖構造を含む２つの鎖が化学的または物理的手段によって分離されなければならない。あるいは、新たに合成された鋳型鎖は、鎖置換または元の標的鎖の一部または全てを消化する核酸分解酵素の使用などの他の手段によって、第２のプライマーまたはプロモーター－プライマーとのハイブリダイゼーションに利用可能になり得る。このようにして、このプロセスは、いくつかのサイクルで繰り返され、標的ヌクレオチド配列を有する核酸分子の数の大幅な増加をもたらし得る。第１の増幅プライマーもしくは第２の増幅プライマーのいずれかまたはそれらの両方がプロモーター－プライマーであり得る。いくつかの用途では、増幅プライマーは、Ｋａｃｉａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｋｉｔ”（米国特許第５，５５４，５１６号）に開示されるように、センス鎖に相補的なプロモーター－プライマーのみからなり得る。プロモーター－プライマーは、通常、標的核酸分子またはプライマー伸長産物に存在するヌクレオチド配列に相補的ではないオリゴヌクレオチドセグメントを含む（例えば、Ｋａｃｉａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ”（米国特許第５，３９９，４９１号）を参照されたい）。これらの非相補配列は、増幅プライマー上の相補配列に対して５’位に位置し得、核酸ポリメラーゼの作用により二本鎖にされたときにＲＮＡ合成の開始のための遺伝子座を提供し得る。そのように提供されたプロモーターは、標的核酸配列の複数のＲＮＡコピーのインビトロ転写を可能にし得る。文脈が別途明確に指示しない限り、本明細書におけるプライマーへの全ての言及がプライマーおよびプロモーター－プライマーを含むことが理解されるであろう。
診断システム
本開示は、キット形態の診断システムも企図する。本開示の診断システムは、少なくとも１つのアッセイに十分な量で、パッケージング材料中に、本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、捕捉プローブ、および／または増幅プライマーのうちのいずれかを含むキットを含み得る。典型的には、本キットは、試験試料中のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの存在または量を決定するための増幅および／または検出アッセイでパッケージングされたプローブおよび／またはプライマーを使用するための有形形態で記録された（例えば、紙面または電子媒体に含まれる）説明書も含むであろう。
本開示は、キット形態の診断システムも企図する。本開示の診断システムは、少なくとも１つのアッセイに十分な量で、パッケージング材料中に、本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、捕捉プローブ、および／または増幅プライマーのうちのいずれかを含むキットを含み得る。典型的には、本キットは、試験試料中のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの存在または量を決定するための増幅および／または検出アッセイでパッケージングされたプローブおよび／またはプライマーを使用するための有形形態で記録された（例えば、紙面または電子媒体に含まれる）説明書も含むであろう。
本診断システムの様々な成分が様々な形態で提供され得る。例えば、必要な酵素、ヌクレオチド三リン酸、プローブ、および／またはプライマーが、凍結乾燥試薬として提供され得る。これらの凍結乾燥試薬は、再構成されると、それらがアッセイですぐに使用できる各々の成分の完全な混合物を適切な比で形成するように、凍結乾燥前に予混合され得る。加えて、本開示の診断システムは、キットの凍結乾燥試薬を再構成するための再構成試薬を含み得る。Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに由来する標的核酸を増幅するための好ましいキットでは、酵素、ヌクレオチド三リン酸、および酵素に必要な補因子が、再構成されると、本増幅法での使用に適切な試薬を形成する単一の凍結乾燥試薬として提供される。これらのキットでは、凍結乾燥プライマー試薬も提供され得る。他の好ましいキットでは、凍結乾燥プローブ試薬が提供される。
典型的なパッケージング材料には、本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブおよび／または増幅プライマーを固定限界内で保持することができる、ガラス、プラスチック、紙、ホイル、微粒子などの固体マトリックスが含まれるであろう。したがって、例えば、パッケージング材料には、ミリグラム未満（例えば、ピコグラムもしくはナノグラム）の量の企図されるプローブもしくはプライマーを含むために使用されるガラスまたはプラスチックバイアルを含まれ得るか、またはそれらは、本開示の増幅法および／または検出法に関与することができるように、本開示のプローブもしくはプライマーが作動可能に取り付けられている、すなわち、結合しているマイクロタイタープレートウェルであり得る。
説明書は、典型的には、試薬および／または試薬の濃度、ならびに少なくとも１つのアッセイ方法パラメータ（例えば、試料量あたりの使用する試薬の相対量であり得る）を表示するであろう。加えて、維持、期間、温度、および緩衝液条件などの詳細も含まれ得る。本開示の診断システムは、個別に提供されるか、または上記の好ましい組み合わせのうちの１つで提供されるかにかかわらず、試験試料中のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの存在または量の増幅および／または決定に使用するための、本明細書に記載のハイブリダイゼーションアッセイプローブのうちのいずれかを有するキットを企図する。
本開示の異なる態様および実施形態を説明する実施例が以下に提供される。当業者であれば、これらの実施例が、本開示をその内部に記載されている特定の実施形態に限定するようには意図されていないことを理解するであろう。
転写媒介増幅
以下の実施例における標的配列の増幅は、例えば、Ｋａｃｉａｎらによって米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，４８０，７８４号に、かつＬＥＥら（上記）第８章に開示される転写媒介増幅（ＴＭＡ）手順であった。ＴＭＡは、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼを使用して標的配列のコピー数を１０億倍超に増加させる等温増幅手順である（以下の酵素試薬を参照されたい）。ＴＭＡ反応は、センスプライマー（本明細書で「第２のプライマー」または「非Ｔ７プライマー」と呼ばれることもある）および５’ＲＮＡポリメラーゼ特異的プロモーター配列を有するアンチセンスプライマー（本明細書で「Ｔ７プロモーター－プライマー」または「第１のプライマー」と呼ばれることもある）の存在下で、逆転写酵素によって一本鎖標的配列を二本鎖ＤＮＡ中間体に変換することを含む。このＤＮＡ中間体には、ＲＮＡポリメラーゼによって認識され、かつ数百コピーのＲＮＡに転写される二本鎖プロモーター配列が含まれる。次いで、これらの転写ＲＮＡ分子は各々、追加のＲＮＡを産生するために使用される二本鎖ＤＮＡ中間体に変換され得る。したがって、ＴＭＡ反応は、指数関数的に進行する。以下の実施例で使用したＴＭＡ反応の詳細を以下に記載する。
以下の実施例における標的配列の増幅は、例えば、Ｋａｃｉａｎらによって米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，４８０，７８４号に、かつＬＥＥら（上記）第８章に開示される転写媒介増幅（ＴＭＡ）手順であった。ＴＭＡは、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼを使用して標的配列のコピー数を１０億倍超に増加させる等温増幅手順である（以下の酵素試薬を参照されたい）。ＴＭＡ反応は、センスプライマー（本明細書で「第２のプライマー」または「非Ｔ７プライマー」と呼ばれることもある）および５’ＲＮＡポリメラーゼ特異的プロモーター配列を有するアンチセンスプライマー（本明細書で「Ｔ７プロモーター－プライマー」または「第１のプライマー」と呼ばれることもある）の存在下で、逆転写酵素によって一本鎖標的配列を二本鎖ＤＮＡ中間体に変換することを含む。このＤＮＡ中間体には、ＲＮＡポリメラーゼによって認識され、かつ数百コピーのＲＮＡに転写される二本鎖プロモーター配列が含まれる。次いで、これらの転写ＲＮＡ分子は各々、追加のＲＮＡを産生するために使用される二本鎖ＤＮＡ中間体に変換され得る。したがって、ＴＭＡ反応は、指数関数的に進行する。以下の実施例で使用したＴＭＡ反応の詳細を以下に記載する。
本明細書に開示される技術を説明するために使用されるプライマーは、定義された配列を有した。「第１の」プライマー（例えば、Ｔ７プロモーター－プライマー）は、Ｔ７プロモーター配列の下流に結合した配列番号３５の標的相補的配列を含んだ。この場合、プロモーター配列が配列番号３６のＴ７プロモーター配列であったため（代替のプロモーター配列で置換することができるが）、完全な第１のプライマーは配列番号３７の配列を有した。Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３Ｓ ｒＲＮＡを鋳型として使用して第１のプライマーをポリメラーゼに依存して伸長させることにより、第２のプライマーに相補的な（例えば、ハイブリダイズ可能な）プライマー伸長産物が得られた。いくつかの好ましい実施形態では、第１のプライマーの酵素による伸長産物は、検出可能に標識されたプローブにハイブリダイズして、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３Ｓ ｒＲＮＡ鋳型の存在を示すことができる。増幅反応に関与した第２のプライマー（すなわち、ＴＭＡ反応に関与した非Ｔ７プライマー）は、配列番号３４の配列を有した。
ハイブリダイゼーションアッセイプローブ
これらの実施例では、定義されたヌクレオチド配列および検出特異性を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブを特色とする。以下に記載されるハイブリダイゼーションプローブを全て、当該技術分野で周知の標準の手順を使用する標準のホスホルアミダイト化学を使用して合成した。例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：２８７（１９８７）を参照されたい。合成を、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（商標）８９０９ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して行った。ハイブリダイゼーションプローブを、Ａｒｎｏｌｄらによって米国特許第６，０３１，０９１号に記載されるように、非ヌクレオチドリンカーを含むようにも合成し、Ａｒｎｏｌｄらによって米国特許第５，１８５，４３９号に記載されるように、化学発光アクリジニウムエステルで標識した。これらのプローブの反応性および特異性を、本質的にはＡｒｎｏｌｄらによって米国特許第５，２８３，１７４号に開示されるように、単相均一アッセイ形式を使用して実証した。全てのプローブハイブリダイゼーション結果を、ルミノメーターによって検出された光子の尺度である相対発光量（ＲＬＵ）で示す。
これらの実施例では、定義されたヌクレオチド配列および検出特異性を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブを特色とする。以下に記載されるハイブリダイゼーションプローブを全て、当該技術分野で周知の標準の手順を使用する標準のホスホルアミダイト化学を使用して合成した。例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：２８７（１９８７）を参照されたい。合成を、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（商標）８９０９ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して行った。ハイブリダイゼーションプローブを、Ａｒｎｏｌｄらによって米国特許第６，０３１，０９１号に記載されるように、非ヌクレオチドリンカーを含むようにも合成し、Ａｒｎｏｌｄらによって米国特許第５，１８５，４３９号に記載されるように、化学発光アクリジニウムエステルで標識した。これらのプローブの反応性および特異性を、本質的にはＡｒｎｏｌｄらによって米国特許第５，２８３，１７４号に開示されるように、単相均一アッセイ形式を使用して実証した。全てのプローブハイブリダイゼーション結果を、ルミノメーターによって検出された光子の尺度である相対発光量（ＲＬＵ）で示す。
核酸：鋳型、アンプリコン、およびプローブ結合配列
プローブ結合アッセイで検出された増幅産物（「アンプリコン」）を調製するために使用した鋳型核酸は、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓまたはＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体のいずれかの２３Ｓリボソーム核酸配列に対応した。Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ Ｅ／Ｂｏｕｒ配列（配列番号１）２３Ｓリボソーム核酸は、野生型のモデルの役割を果たした。検出のために使用したプローブは、適切な標的核酸（例えば、アンプリコン）にハイブリダイズした後に検出可能なシグナル（例えば、検出可能な光シグナル）を生成する標識を有した。
プローブ結合アッセイで検出された増幅産物（「アンプリコン」）を調製するために使用した鋳型核酸は、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓまたはＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体のいずれかの２３Ｓリボソーム核酸配列に対応した。Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ Ｅ／Ｂｏｕｒ配列（配列番号１）２３Ｓリボソーム核酸は、野生型のモデルの役割を果たした。検出のために使用したプローブは、適切な標的核酸（例えば、アンプリコン）にハイブリダイズした後に検出可能なシグナル（例えば、検出可能な光シグナル）を生成する標識を有した。
単一ヌクレオチドの差異により、以下に記載される手順で検出された２つの野生型鋳型配列を区別した。「野生型」は、ある集団で一般的であるか、または普及しており、かつ異なる配列を有する「変異体」と区別することができる配列を指すために本明細書で使用される。生物集団に共通する２つ以上の「野生型」配列が存在する可能性がある。第１の事例では、（配列番号２）の野生型ＷＴ鋳型は、第１のプライマーに対する結合部位を含んだ。ＷＴ鋳型を使用した第１のプライマーの伸長産物は、増幅反応で使用した逆鎖プライマーに対する結合部位を含んだ。プローブハイブリダイゼーション手順で検出されたＷＴのサブ領域は、ＷＴ（０）の配列（配列番号３）、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体を有した。ＴＭＡ反応におけるＷＴ鋳型の使用により生じた例示的なアンプリコンは、ＷＴ（１）のプローブ結合配列（配列番号４）を含んだ。本明細書に開示される「タンデム」プローブのうちの１つを使用して検出可能なＷＴ（２）の配列（配列番号５）を有する第１の領域がこの増幅産物中に含まれた。同様に、ＷＴ（３）（配列番号６）として識別されたＷＴ（１）内に含まれる第２の領域は、例えば、３４６９７８の配列（配列番号３８）または３５０５４７の配列（配列番号６０）を有するプローブを使用して検出可能であった。重要なことに、野生型核酸配列の検出がある状況下では望ましいが、他の状況下では望ましくない。同様に、代替の野生型野生型Ａ（ＷＴ－Ａ）鋳型（配列番号７）は、第１のプライマーに対する結合部位を含んだ。ＷＴ－Ａ鋳型を使用した第１のプライマーの伸長産物は、増幅反応で使用した逆鎖プライマーに対する結合部位を含んだ。プローブハイブリダイゼーション手順で検出されたＷＴ－Ａのサブ領域は、ＷＴ－Ａ（０）の配列（配列番号８）、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体を有した。ＴＭＡ反応における野生型ＷＴ－Ａ鋳型の使用により生じた例示的なアンプリコンは、ＷＴ－Ａ（ｌ）のプローブ結合配列（配列番号９）を含んだ。本明細書に開示される「タンデム」プローブのうちの１つを使用して検出可能なＷＴ－Ａ（２）の配列（配列番号１０）を有する第１の領域がこの増幅産物中に含まれた。同様に、ＷＴ－Ａ（３）（配列番号１１）として識別されたＷＴ－Ａ（１）内に含まれる第２の領域は、例えば、３４６９７８の配列（配列番号３８）または３５０５４７の配列（配列番号６０）を有するプローブを使用して検出可能であった。注目すべきことに、ＷＴ（２）およびＷＴ－Ａ（２）の野生型配列は（およびＷＴ（１）およびＷＴ－Ａ（１）の野生型配列も同様に）、単一の塩基（つまり、ＷＴ（２）およびＷＴ－Ａ（２）の８位）のみ異なった。この場合もやはり、野生型核酸配列の検出は、ある状況下では望ましいが、他の状況下では望ましくない。
ＪＰ－ｎｖＣＴ Ｃ１５２２Ｔとして識別された２３Ｓリボソーム核酸変異体を、第１のプライマーに対する結合部位を含む配列番号１２の配列によって表した。ＪＰ－ｎｖＣＴ Ｃ１５２２Ｔ鋳型を使用した第１のプライマーの伸長産物は、増幅反応で使用した逆鎖プライマーに対する結合部位を含んだ。プローブハイブリダイゼーション手順で検出されたＪＰ－ｎｖＣＴ Ｃ１５２２Ｔのサブ領域は、ＪＰ（０）の配列（配列番号１３）、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体を有した。ＴＭＡ反応におけるＪＰ－ｎｖＣＴ Ｃ１５２２Ｔ鋳型の使用により生じた例示的なアンプリコンは、ＪＰ（１）のプローブ結合配列（配列番号１４）を含んだ。本明細書に開示される「タンデム」プローブのうちの１つを使用して検出可能なＪＰ（２）の配列（配列番号１５）を有する第１の領域がこの増幅産物中に含まれた。本明細書でＪＰ（３）（配列番号１６）として識別されたＪＰ（１）内に含まれる第２の領域は、３４６９７８（配列番号３８）のＤＮＡプローブによって検出されなかった。ＪＰ－ｎｖＣＴ Ｃ１５２２Ｔ変異体を検出した本明細書に開示されるプローブは全て、ＪＰ（１）の増幅産物中に含まれる配列を検出した。実際には、本明細書に開示される「タンデム」プローブを使用して検出可能なＪＰ（２）の配列（配列番号１５）を有する第１の領域がこの増幅産物中に含まれた。同様に、ＪＰ（３）（配列番号１６）として識別されたＪＰ（１）内に含まれる第２の領域も、例えば、３５０５４７の配列（配列番号６０）を有するプローブを使用して検出可能であった。いくつかの実施形態では、ＪＰ（３）の配列（配列番号１６）は、糖部分が２’メトキシ基を有するヌクレオチドを含む検出可能な標識および／または骨格を有するプローブを使用して検出された。概して言えば、本開示による好ましいプローブは、ＪＰ（２）（配列番号１５）およびＪＰ（３）（配列番号１６）の少なくとも一方の配列へのハイブリダイゼーション後に検出可能なシグナルを生成することができる。注目すべきことに、ＪＰ（３）の配列は、ＷＴ（３）およびＷＴ－Ａ（３）の対応する野生型配列と単一の塩基のみ異なった。
ＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔとして識別された２３Ｓリボソーム核酸変異体を、第１のプライマーに対する結合部位を含む配列番号１７の配列によって表した。ＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔ鋳型を使用した第１のプライマーの伸長産物は、増幅反応で使用した逆鎖プライマーに対する結合部位を含んだ。プローブハイブリダイゼーション手順で検出されたＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔのサブ領域は、ＦＩ（０）の配列（配列番号１８）、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体を有した。ＴＭＡ反応におけるＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔの野生型鋳型の使用により生じた例示的なアンプリコンは、ＦＩ（１）のプローブ結合配列（配列番号１９）を含んだ。本明細書に開示される「タンデム」プローブのうちの１つを使用して検出可能なＦＩ（２）の配列（配列番号２０）を有する第１の領域がこの増幅産物中に含まれた。本明細書でＦＩ（３）（配列番号２１）として識別されたＦＩ（１）内に含まれる第２の領域は、３４６９７８（配列番号３８）のＤＮＡプローブによって検出されなかった。ＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔ変異体を検出した本明細書に開示されるプローブは全て、ＦＩ（１）の増幅産物中に含まれる配列を検出した。実際には、本明細書に開示される「タンデム」プローブを使用して検出可能なＦＩ（２）の配列（配列番号２０）を有する第１の領域がこの増幅産物中に含まれた。同様に、ＦＩ（３）（配列番号２１）として識別されたＦＩ（１）内に含まれる第２の領域も、例えば、３５０５４７の配列（配列番号６０）または３５０１１６．１の配列（配列番号５９）を有するプローブを使用して検出可能であった。いくつかの実施形態では、ＦＩ（３）の配列は、糖部分が２’メトキシ基を有するヌクレオチドを含む検出可能な標識および／または骨格を有するプローブを使用して検出された。概して言えば、本開示による好ましいプローブは、ＦＩ（２）およびＦＩ（３）の少なくとも一方の配列へのハイブリダイゼーション後に検出可能なシグナルを生成することができる。注目すべきことに、ＦＩ（３）の配列は、ＷＴ（３）（配列番号６）およびＷＴ－Ａ（３）（配列番号１１）の対応する野生型配列と単一の塩基のみ異なった。
ＵＳ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２６Ａとして識別された２３Ｓリボソーム核酸変異体を、第１のプライマーに対する結合部位を含む配列番号２２の配列によって表した。ＵＳ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２６Ａ鋳型を使用した第１のプライマーの伸長産物は、増幅反応で使用した逆鎖プライマーに対する結合部位を含んだ。プローブハイブリダイゼーション手順で検出されたＵＳ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２６Ａのサブ領域は、ＵＳ（０）の配列（配列番号２３）、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体を有した。ＴＭＡ反応におけるＵＳ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２６Ａの野生型鋳型の使用により生じた例示的なアンプリコンは、ＵＳ（１）のプローブ結合配列（配列番号２４）を含んだ。本明細書に開示される「タンデム」プローブのうちの１つを使用して検出可能なＵＳ（２）の配列（配列番号２５）を有する第１の領域がこの増幅産物中に含まれた。本明細書でＵＳ（３）（配列番号２６）として識別されたＵＳ（１）内に含まれる第２の領域は、３４６９７８（配列番号３８）のＤＮＡプローブによって検出されなかった。ＵＳ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２６Ａ変異体を検出した本明細書に開示されるプローブは全て、ＵＳ（１）の増幅産物中に含まれる配列を検出した。実際には、本明細書に開示される「タンデム」プローブを使用して検出可能なＵＳ（２）の配列（配列番号２５）を有する第１の領域がこの増幅産物中に含まれた。同様に、ＵＳ（３）（配列番号２６）として識別されたＵＳ（１）内に含まれる第２の領域も、例えば、３５０５４７の配列（配列番号６０）または３５０１１６．１の配列（配列番号５９）を有するプローブを使用して検出可能であった。いくつかの実施形態では、ＵＳ（３）の配列は、糖部分が２’メトキシ基を有するヌクレオチドを含む検出可能な標識および／または骨格を有するプローブを使用して検出された。概して言えば、本開示による好ましいプローブは、ＵＳ（２）およびＵＳ（３）の少なくとも一方の配列へのハイブリダイゼーション後に検出可能なシグナルを生成することができる。注目すべきことに、ＵＳ（３）の配列は、ＷＴ（３）（配列番号６）およびＷＴ－Ａ（３）（配列番号１１）の対応する野生型配列と単一の塩基のみ異なった。
ＮＯ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２３Ａとして識別された２３Ｓリボソーム核酸変異体を、第１のプライマーに対する結合部位を含む配列番号２７の配列によって表した。ＮＯ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２３Ａ鋳型を使用した第１のプライマーの伸長産物は、増幅反応で使用した逆鎖プライマーに対する結合部位を含んだ。プローブハイブリダイゼーション手順で検出されたＮＯ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２３Ａのサブ領域は、ＮＯ（０）の配列（配列番号２８）、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体を有した。ＴＭＡ反応におけるＮＯ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２３Ａの野生型鋳型の使用により生じた例示的なアンプリコンは、ＮＯ（１）のプローブ結合配列（配列番号２９）を含んだ。本明細書に開示される「タンデム」プローブのうちの１つを使用して検出可能なＮＯ（２）の配列（配列番号３０）を有する第１の領域がこの増幅産物中に含まれた。本明細書でＮＯ（３）（配列番号３１）として識別されたＮＯ（１）内に含まれる第２の領域は、３４６９７８（配列番号３８）のＤＮＡプローブによって検出されなかった。ＮＯ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２３Ａ変異体を検出した本明細書に開示されるプローブは全て、ＮＯ（１）の増幅産物中に含まれる配列を検出した。実際には、本明細書に開示される「タンデム」プローブを使用して検出可能なＮＯ（２）の配列（配列番号３０）を有する第１の領域がこの増幅産物中に含まれた。同様に、ＮＯ（３）（配列番号３１）として識別されたＮＯ（１）内に含まれる第２の領域も、例えば、３５０５４７の配列（配列番号６０）または３５０１１６．１の配列（配列番号５９）を有するプローブを使用して検出可能であった。いくつかの実施形態では、ＮＯ（３）の配列は、糖部分が２’メトキシ基を有するヌクレオチドを含む検出可能な標識および／または骨格を有するプローブを使用して検出された。概して言えば、本開示による好ましいプローブは、ＮＯ（２）およびＮＯ（３）の少なくとも一方の配列へのハイブリダイゼーション後に検出可能なシグナルを生成することができる。注目すべきことに、ＮＯ（３）の配列は、ＷＴ（３）（配列番号６）およびＷＴ－Ａ（３）（配列番号１１）の対応する野生型配列と単一の塩基のみ異なった。
検出戦略
我々は、化学発光検出形式を使用して、いくつかの密接に関連するＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのｒＲＮＡ標的配列を単独でまたは組み合わせでのいずれかで検出するよう努めた。図１は、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３Ｓ ｒＲＮＡ配列（この図では「Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ Ｅ／Ｂｏｕｒ」と呼ぶ）（配列番号１）と、世界中で天然に存在する４つの異なる変異体とのアラインメントを提示する。これらの変異体を、ＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔ（配列番号１７）、ＮＯ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２３Ａ（配列番号２７）、ＪＰ－ｎｖＣＴ Ｃ１５２２Ｔ（配列番号１２）、およびＵＳ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２６Ａ（配列番号２２）として識別する。この図に提示される２つの代替の野生型配列（ＷＴまたは配列番号２、およびＷＴ－Ａまたは配列番号７）を使用して、インビトロ転写物（ＩＶＴ）を調製した（すなわち、配列内のＴ残基をＩＶＴ内のＵ残基に置き換えた）。
我々は、化学発光検出形式を使用して、いくつかの密接に関連するＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのｒＲＮＡ標的配列を単独でまたは組み合わせでのいずれかで検出するよう努めた。図１は、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３Ｓ ｒＲＮＡ配列（この図では「Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ Ｅ／Ｂｏｕｒ」と呼ぶ）（配列番号１）と、世界中で天然に存在する４つの異なる変異体とのアラインメントを提示する。これらの変異体を、ＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔ（配列番号１７）、ＮＯ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２３Ａ（配列番号２７）、ＪＰ－ｎｖＣＴ Ｃ１５２２Ｔ（配列番号１２）、およびＵＳ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２６Ａ（配列番号２２）として識別する。この図に提示される２つの代替の野生型配列（ＷＴまたは配列番号２、およびＷＴ－Ａまたは配列番号７）を使用して、インビトロ転写物（ＩＶＴ）を調製した（すなわち、配列内のＴ残基をＩＶＴ内のＵ残基に置き換えた）。
各変異体は、野生型配列とは異なり、互いに１つまたは２つの塩基位置のみ異なる。図１に示されるＤＮＡ配列に対応するインビトロ転写物は、本明細書に開示されるプローブの結合パートナーを生成する核酸増幅（例えば、ＴＭＡ）反応における鋳型としての役割を果たした。
（ａ）単一のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体（特定の変異体セットの野生型配列またはいずれの他の配列の検出なしに）、または（ｂ）全ての変異体（野生型配列を含む）のいずれかの検出を容易にするために、３つの異なる戦略を開発した。いくつかの事例では、塩基ミスマッチをプローブの塩基配列に意図的に導入した。これらの異なる戦略は、単一対のプライマーを使用して合成されたＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ増幅産物中での検出に依存した。
実施例１は、野生型配列を検出することなく特定のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体に対して特異性を有するハイブリダイゼーションプローブを特定した手順について説明する。増幅された野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ配列を検出するように設計されたプローブと比較して、この実施例で使用したアプローチは、１５１５位でのＣ塩基からＴ塩基への変化を導入することと、非ヌクレオチドリンカーおよびＡＥ標識の結合を１５１７位から１５１５位に変化させることを同時に含み、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ配列（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６）の検出なしにＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔ変異体配列（配列番号１７）を検出することを容易にした。この実施例における変異体特異的プローブを集団中の対応する変異体種の疫学的監視に使用することができ、それ故に、「監視」プローブと称されることもある。このアプローチを、任意の単一の変異体を検出するように適合させることができる。
実施例１
変異体配列に特異的な監視プローブの特定
当業者によく知られている手順を使用して、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを合成し、アクリジニウムエステルで標識した。監視プローブの調製に使用したオリゴヌクレオチドの塩基配列を表１に提示する。いずれの場合にも、オリゴヌクレオチドをＤＮＡ骨格で合成し、その後、ＲＸＬ非ヌクレオチドリンカーを介してプローブ骨格に結合した標準のアクリジニウムエステル部分で標識した（例えば、米国特許第５，５８５，４８１号を参照されたい）。注目すべきことに、３４６９７８（配列番号３８）のプローブが、増幅された野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ配列を検出することが見出されたが、ＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔ（配列番号１７）、ＮＯ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２３Ａ（配列番号２７）、ＪＰ－ｎｖＣＴ Ｃ１５２２Ｔ（配列番号１２）、またはＵＳ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２６Ａ（配列番号２２）として識別された変異体のうちのいずれも検出しなかった。
変異体配列に特異的な監視プローブの特定
当業者によく知られている手順を使用して、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを合成し、アクリジニウムエステルで標識した。監視プローブの調製に使用したオリゴヌクレオチドの塩基配列を表１に提示する。いずれの場合にも、オリゴヌクレオチドをＤＮＡ骨格で合成し、その後、ＲＸＬ非ヌクレオチドリンカーを介してプローブ骨格に結合した標準のアクリジニウムエステル部分で標識した（例えば、米国特許第５，５８５，４８１号を参照されたい）。注目すべきことに、３４６９７８（配列番号３８）のプローブが、増幅された野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ配列を検出することが見出されたが、ＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔ（配列番号１７）、ＮＯ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２３Ａ（配列番号２７）、ＪＰ－ｎｖＣＴ Ｃ１５２２Ｔ（配列番号１２）、またはＵＳ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２６Ａ（配列番号２２）として識別された変異体のうちのいずれも検出しなかった。
様々なアクリジニウムエステル標識プローブの特異性およびバックグラウンドシグナル生成を含む主要な機能的パラメータを、プローブを核酸増幅産物にハイブリダイズさせることを含む手順によって評価した。野生型（配列番号２）またはＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔ変異体（配列番号１７）Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３Ｓ ｒＲＮＡの配列を有するインビトロ転写物を鋳型として使用して、本質的に米国特許第５，５１４，５５１号（その開示は参照により組み込まれる）に記載されるように転写媒介増幅（ＴＭＡ）反応をプライミングした。増幅反応は、１０３コピー／ｍｌの変異体インビトロ転写物、１０８コピー／ｍｌの野生型インビトロ転写物、または１０３コピー／ｍｌの変異体インビトロ転写物と１０８コピー／ｍｌの野生型インビトロ転写物との組み合わせのいずれかを含んだ。増幅反応に使用したプライマーは、本質的に米国特許第５，５１４，５５１号（その開示は参照により組み込まれる）に記載される通りであった。陰性対照増幅反応には、この反応で鋳型として使用するためのいずれのインビトロ転写物も提供しなかった。増幅手順の最後に、各反応チューブに、１．５×１０６または３×１０６ＲＬＵ／反応の量のＡＥ標識プローブを提供した。反応チューブに、コハク酸、ラウリル硫酸リチウム、水酸化リチウム、アルドリチオール－２、塩化リチウム、ＥＤＴＡ、エチルアルコールを含む１００μｌのハイブリダイゼーション試薬（ｐＨ４．７０）をさらに入れた。チューブを６２℃で２０分間インキュベートした後、周囲温度で５分間冷却することによって、ハイブリダイゼーションを促進した。次に、ホウ酸、水酸化ナトリウム、および１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標） Ｘ－１００（Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ）を含む２５０μｌの選択試薬（ｐＨ８．５）を各チューブに添加した。チューブの内容物を混合し、６２℃で１０分間インキュベートして、ハイブリダイズされていないプローブと会合したアクリジニウムエステル標識を加水分解し、その後、２３℃に冷却した。その後、試料を１ｍＭ硝酸および０．１％（体積／体積）過酸化水素の自動注入のために装備されたＬＥＡＤＥＲ（登録商標）ＨＣ＋ルミノメーター（Ｇｅｎ－Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で分析した後、１Ｎ水酸化ナトリウムを含有する溶液を注入した。化学発光反応の結果を相対発光量（ＲＬＵ）で測定した。全ての反応を１０の複製で行った。
図２に提示される結果は、異なるハイブリダイゼーションプローブが異なる性能特性を呈したことを示す。例えば、この図でＤ（３５０３２０、配列番号４３）、Ｏ（３５０４２０、配列番号５４）、およびＦ（３５０３２２、配列番号４５）として識別されたプローブは、変異体核酸配列（図中「ｍｕｔ」）にハイブリダイズされると強いシグナルを有利に生成し、野生型（「ｗｔ」）核酸配列にハイブリダイズされると実質的により弱いシグナルを生成した。図３は、図２のデータを処理して変異体標的核酸に対する各プローブの相対的特異性を特定した結果を提示する。明らかに、プローブＤ、Ｏ、およびＦは、変異体シグナル特異性の野生型に対する最大比率を呈した。これらの特徴により、これらのプローブがＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔ変異体配列（配列番号１７）の特異的検出に有用になった。プローブＤ、Ｏ、およびＦは各々、集団間または地理的領域内のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の監視モニタリングに望ましい特徴を呈した。標準のプロビット分析を使用して９５％信頼区間での検出限界を決定するためのプローブＤとプローブＯとの比較試験により、プローブＤが恐らく５～１０倍も低い入力標的コピーレベルの検出に有用であることが明らかになった（データ示さず）。増幅反応で鋳型として既知量のインビトロ転写物を使用したプローブＤの９５％検出限界は、尿マトリックス中２１０コピー／ｍｌであり、検体輸送培地（ＳＴＭ）中２３１コピー／ｍｌであった。ＳＴＭはリン酸緩衝界面活性剤溶液であり、これは、細胞の溶解に加えて、試験試料中に存在し得るＲＮａｓｅの活性を阻害することによって放出されたＲＮＡを保護する。
野生型（例えば、ＷＴおよびＷＴ－Ａ）核酸配列の検出もなしにＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔを検出するのに有用なある特定の監視プローブは、配列番号３９で示される標的特異的配列（例えば、「コア」配列）、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体を含むことができる。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、配列番号３９の６位の塩基と７位の塩基との間の位置で非ヌクレオチドリンカーを介して監視プローブの骨格に結合している。いくつかの好ましいプローブは、配列番号３９の配列を含み、非ヌクレオチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、監視プローブは、最大２４塩基長である。
実施例２は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体核酸配列を検出するための「重複」プローブを生成するために使用した２つの異なるアプローチについて説明する。本開示との関連で、「複製」プローブとは、同じ標的配列への結合について異なるプローブと競合するプローブを意味する。第１のアプローチは、単一ヌクレオチドを置換することによって野生型プローブを修飾して、変異体標的配列に対する相補的一致を達成することを含んだ。第２のアプローチは、骨格修飾を含んだ。変異体配列を検出するためにこれらのプローブを独立して使用することができるが、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの核酸を検出する第２のプローブと組み合わせて第１のプローブとして使用することもできる。
実施例２は、独立して使用することができるプローブ、または野生型配列を検出する第２のプローブと組み合わせて使用することができるプローブを調製するために使用される手順について説明する。
実施例２
単独でまたは他のプローブと組み合わせて有用な複製プローブ
本質的に実施例１に記載される増幅および検出手順に従って、野生型配列を検出するプローブまたは変異体配列を検出するプローブをさらに含むプローブ組み合わせのいずれかを使用した増幅された野生型（配列番号２）およびＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔ変異体（配列番号１７）核酸配列の検出を調査した。この事例では、ＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔ変異体の核酸を検出するために使用したプローブは、３５００７８の配列（配列番号５７）を有した（表２を参照されたい）。野生型（配列番号２）またはＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔ変異体（配列番号１７）の鋳型配列を使用して生成されたインビトロ転写物は、０．５ｆｇ／反応の入力レベルでの増幅反応における鋳型としての役割を果たした。増幅反応産物を３４６９７８（配列番号３８）のアクリジニウムエステル標識プローブとハイブリダイズさせて野生型配列を検出し、または３５００７８（配列番号５７）のアクリジニウムエステル標識プローブとハイブリダイズさせてＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔ変異体（配列番号１７）を検出した。反応混合物中の標的配列の存在を示すプローブハイブリダイゼーションシグナルを、実施例１に記載されるように評価した。
単独でまたは他のプローブと組み合わせて有用な複製プローブ
本質的に実施例１に記載される増幅および検出手順に従って、野生型配列を検出するプローブまたは変異体配列を検出するプローブをさらに含むプローブ組み合わせのいずれかを使用した増幅された野生型（配列番号２）およびＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔ変異体（配列番号１７）核酸配列の検出を調査した。この事例では、ＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔ変異体の核酸を検出するために使用したプローブは、３５００７８の配列（配列番号５７）を有した（表２を参照されたい）。野生型（配列番号２）またはＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔ変異体（配列番号１７）の鋳型配列を使用して生成されたインビトロ転写物は、０．５ｆｇ／反応の入力レベルでの増幅反応における鋳型としての役割を果たした。増幅反応産物を３４６９７８（配列番号３８）のアクリジニウムエステル標識プローブとハイブリダイズさせて野生型配列を検出し、または３５００７８（配列番号５７）のアクリジニウムエステル標識プローブとハイブリダイズさせてＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔ変異体（配列番号１７）を検出した。反応混合物中の標的配列の存在を示すプローブハイブリダイゼーションシグナルを、実施例１に記載されるように評価した。
図４に提示される結果は、３４６９７８（配列番号３８）のプローブを３５００７８（配列番号５７）の変異体特異的プローブと組み合わせて、増幅された野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓまたはＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体標的配列のいずれかの存在をシグナル伝達することができるプローブ試薬を生成することができることを示した。より具体的には、３４６９７８（配列番号３８）の標識検出プローブは、野生型配列（配列番号２）に対応するが、ＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔ変異体（配列番号１７）には対応しないＩＶＴを鋳型として用いたＴＭＡ反応で合成された増幅産物にハイブリダイズした後にハイブリダイゼーションシグナルを実質的に生成した。逆に言えば、３４６９７８（配列番号３８）および３５００７８（配列番号５７）の配列を有する標識プローブの組み合わせは、増幅された野生型配列またはＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔ変異体配列のいずれかへのハイブリダイゼーション後に強いハイブリダイゼーションシグナルをもたらした。これにより、これらの２つのプローブ配列が同じ反応混合物中で互いに互換性があることが確認され、この組み合わせにより、野生型配列またはＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔ変異体配列の検出が容易になった。別の言い方をすれば、これらの２つのプローブ配列が非常に密接に関連していたとしても（例えば、競合的結合が可能であったとしても）、いずれかの標的を検出するためにプローブを組み合わせることは不利ではなかった。
異なるアプローチを使用して、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ配列およびＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体配列の両方を検出するための「ユニバーサル」プローブを作製した。このアプローチでは、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ配列を検出するが、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体配列を検出しないプローブの塩基配列を、修飾された骨格類似体と組み合わせて使用した。より具体的には、この手順で試験したユニバーサルオリゴヌクレオチドプローブを、２’－Ｏ－メチル修飾ペントース部分を有するヌクレオチド類似体を使用して合成した。「メトキシ」プローブの塩基配列を表３に提示する。この場合もやはり、野生型標的配列および変異体標的配列を検出するために使用したプローブを、非ヌクレオチドリンカーを介して結合したアクリジニウムエステル部分で標識し、その後、個別にまたは組み合わせで使用した。増幅反応を、ＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔ（配列番号１７）、ＵＳ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２６Ａ（配列番号２２）、または野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（配列番号２）に対応する配列を含むいずれかのＩＶＴを鋳型として使用して行った。特異性を検証するために、１つの増幅反応に、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓと密接に関連する３つの生物から調製された溶解物のプールを含めた。ここで、候補交差反応性生物は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉであった。陰性対照増幅反応は、鋳型核酸を省いた。
図５Ａ～図５Ｂは、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの標的核酸を検出する他のプローブの不在下で１つのメトキシ骨格プローブを使用して得られた代表的な結果を提示する。図５Ａに示される結果は、３５０１１６．１（配列番号５９）のメトキシ骨格プローブを使用して得られたものであり、鋳型核酸を省いた陰性対照反応では実質的にいずれのハイブリダイゼーションシグナルも検出されなかったことを示す。注目すべきことに、３５０１１６．１（配列番号５９）のプローブは、密接に関連するＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓではない種（図中「ＣＴ－Ｃｌｏｓｅ ＸＲ」）の核酸との望ましくない交差反応性ハイブリダイゼーションを呈した。増幅された野生型、ならびにＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５ＴおよびＵＳ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２６Ａ変異体配列を含む試験では、バックグラウンドをはるかに超える化学発光シグナルが観察された。これは、メトキシプローブが複数の試験された標的配列の検出に有用であることを示した。他の試験結果（図示せず）は、メトキシプローブを、野生型配列または変異体配列のいずれかの検出に使用するための３４６９７８（配列番号３８）のＡＥ標識プローブを含むプローブ試薬の成分として使用することができることを示した。図５Ｂに示される結果は、３５０５４７（配列番号６０）のメトキシプローブを使用して得られたものであり、このプローブは、３４６９７８（配列番号３８）に密接に関連するが、異なる標識結合部位を有する塩基配列を有した。３５０５４７（配列番号６０）のプローブは、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ増幅産物を検出するために単独で使用するか、または同じＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓアンプリコンを検出する第２のプローブと組み合わせて使用するための高感度プローブである。表３に列記トされるメトキシ骨格プローブは全て、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体および野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの増幅された核酸を検出した。
全ての野生型（例えば、ＷＴおよびＷＴ－Ａ）および変異体（例えば、ＪＰ－ｎｖＣＴ Ｃ１５２２Ｔ、ＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔ、ＵＳ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２６Ａ、およびＮＯ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２３Ａ）核酸配列の検出に有用なある特定のユニバーサル複製プローブは、配列番号３２で示される配列の少なくとも１８個の連続する塩基に相補的な標的特異的配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体を含むことができる。いくつかの実施形態では、有用なユニバーサル複製プローブは、配列番号５８で示されるコア配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、配列番号５８の６位の塩基と７位の塩基との間、または８位の塩基と９位の塩基との間、または９位の塩基と１０位の塩基との間の位置で非ヌクレオチドリンカーを介してユニバーサル複製プローブの骨格に結合している。いくつかの好ましいプローブは、配列番号５８の配列を含み、非ヌクレオチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ユニバーサル複製プローブは、最大２４塩基長である。
以下の実施例は、増幅されたＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸の異なる重複しない配列にハイブリダイズするプローブ（例えば、対になったプローブセット）を用いる方法によってＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体を検出するために使用される手順について説明する。「重複しない」とは、一方のプローブのハイブリダイゼーションが他方のハイブリダイゼーションを排除しないように、異なる配列のプローブが、同じ増幅された核酸鎖に同時にハイブリダイズすることができることを意味する。これは、本明細書では「タンデム」プローブ配置と称される。有意には、本明細書に開示されるタンデムプローブを単独で使用することができる（例えば、同じアンプリコンにハイブリダイズする第２のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ特異的プローブの不在下で）が、同じ標的核酸（すなわち、アンプリコン）にハイブリダイズする第２のプローブと組み合わせて使用することもできる。好ましい第２のプローブは、野生型鋳型の増幅によって生成されるか、または変異体鋳型、例えば、ＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔ（配列番号１７）、ＮＯ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２３Ａ（配列番号２７）、ＪＰ－ｎｖＣＴ Ｃ１５２２Ｔ（配列番号１２）、ＵＳ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２６Ａ（配列番号２２）、または他の変異体鋳型のうちのいずれかの増幅によって生成されるＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ増幅産物へのハイブリダイゼーション後に検出可能なシグナルを生成する。３４６９７８（配列番号３８）のプローブは、この実証における第２のプローブの例としての役割を果たした。
実施例３は、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓまたはＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体増幅産物を検出するために単独でまたは第２のプローブと組み合わせて使用することができるプローブの開発および試験について説明する。
実施例３
タンデムプローブを使用したＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ配列の検出
３４６９７８（配列番号３８）のプローブによってハイブリダイズされた標的配列とは別個のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ増幅産物の標的配列にハイブリダイズされた検出可能に標識されたプローブを、当業者によく知られている標準手順によって調製した。これらのプローブは、表４に提示される配列を有し、標準手順を使用してアクリジニウムエステル標識を含むように修飾した。検出可能な標識をプローブに結合する非ヌクレオチドリンカーの位置もこの表に示されている。野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（配列番号２）の２３Ｓリボソーム核酸に対応するＩＶＴ、または密接に関連する種の培養細菌由来の溶解物のいずれかでプライミングしたＴＭＡ反応で増幅産物として生成された標的核酸を使用して、初期試験を行った。この手順で使用した密接に関連する種は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉであった。３４６９７８（配列番号３８）のプローブは、この手順における対照としての役割を果たした。この初期試験の目的は、Ｃ．ｐｎｅ鋳型またはＣ．ｐｓｉ鋳型から生成された増幅産物の検出もなしにＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ増幅産物の特異的かつ高感度な検出を呈するプローブを特定することであった。
タンデムプローブを使用したＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ配列の検出
３４６９７８（配列番号３８）のプローブによってハイブリダイズされた標的配列とは別個のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ増幅産物の標的配列にハイブリダイズされた検出可能に標識されたプローブを、当業者によく知られている標準手順によって調製した。これらのプローブは、表４に提示される配列を有し、標準手順を使用してアクリジニウムエステル標識を含むように修飾した。検出可能な標識をプローブに結合する非ヌクレオチドリンカーの位置もこの表に示されている。野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（配列番号２）の２３Ｓリボソーム核酸に対応するＩＶＴ、または密接に関連する種の培養細菌由来の溶解物のいずれかでプライミングしたＴＭＡ反応で増幅産物として生成された標的核酸を使用して、初期試験を行った。この手順で使用した密接に関連する種は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉであった。３４６９７８（配列番号３８）のプローブは、この手順における対照としての役割を果たした。この初期試験の目的は、Ｃ．ｐｎｅ鋳型またはＣ．ｐｓｉ鋳型から生成された増幅産物の検出もなしにＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ増幅産物の特異的かつ高感度な検出を呈するプローブを特定することであった。
注目すべきことに、３５０４４０（配列番号６７）（３５０４４０：ＤＮＡ；ＣＴ、３５０４４１（配列番号６８）、３５０４４２（配列番号６９）、および３５０４４３（配列番号７０）のＤＮＡ骨格プローブは、ハイブリダイゼーションアッセイで許容できないほど低い感度をもたらした（結果示さず）。
図６に提示される結果は、これらのプローブのうちのいくつかが特に有利な特性を呈したことを示す。結果として、我々は、代替物としてメトキシ骨格プローブの使用を調査することにした。３５０５０７（配列番号７３）、３５０５１１（配列番号７６）、３５０６００（配列番号８８）、３５０６０１（配列番号８７）、３５０６０９（配列番号８６）、３５０６１０（配列番号８５）、および３５０６１１（配列番号８４）によって識別されるプローブは全て、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓではない種の増幅産物にハイブリダイズされたときに非常に低いシグナルを呈した。逆に言えば、これらの同じプローブは、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ＩＶＴを使用して生成されたアンプリコンにハイブリダイズされたときに強いシグナルを呈した。これは、この一群のプローブに対して良好な特異性および感度を示した。１×１０３ｃ／ｍｌ、３×１０３ｃ／ｍｌ、または１×１０４ｃ／ｍｌのいずれかの入力レベルを使用して野生型ＩＶＴの増幅で得られた結果を示す図６の一部分に焦点を合わせると、いくつかのプローブが望ましくは狭い範囲を有する（例えば、高精度を反映する）高いシグナルをもたらしたことが明らかであるはずである。例えば、３５０６０９（配列番号８６）のプローブを使用して得られた結果は、密接に関連するＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ標的に有利に低いシグナルをもたらしながら、少なくとも中程度の精度で高いシグナルをもたらした。他のプローブは、野生型標的にハイブリダイズされたときにいくらか低いハイブリダイゼーションシグナルを呈したが、それらのシグナルは有意に高い精度で得られた。同様に、これらのプローブは、有利には、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓではない核酸標的を検出しなかった。より具体的には、３５０６１１（配列番号８４）、３５０６１０（配列番号８５）、３５０６０９（配列番号８６）、３５０６０１（配列番号８７）、３５０６００（配列番号８８）、３５０５１１（配列番号７６）、および３５０５０７（配列番号７３）のプローブは、野生型標的配列にハイブリダイズされたときに非常に良好なシグナル強度をもたらし、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓではない標的核酸にハイブリダイズされたときに非常に低いシグナル強度をもたらした。これらのプローブは、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉの核酸を検出することなく高感度でＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを検出するのに特に好ましかった。注目すべきことに、３５０６１１（配列番号８４）のプローブは、この手順で非常に良好な結果をもたらした。
本明細書に開示される全ての野生型（例えば、ＷＴおよびＷＴ－Ａ）および変異体（例えば、ＪＰ－ｎｖＣＴ Ｃ１５２２Ｔ、ＦＩ－ｎｖＣＴ Ｃ１５１５Ｔ、ＵＳ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２６Ａ、およびＮＯ－ｎｖＣＴ Ｇ１５２３Ａ）核酸配列の検出に有用なある特定のタンデムプローブは、配列番号３３で示される配列の少なくとも１９個の連続する塩基に相補的な標的特異的配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体を含むことができる。いくつかの実施形態では、有用なタンデムプローブは、配列番号６６で示されるコア配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、配列番号６６の１１位の塩基と１２位の塩基との間の位置で非ヌクレオチドリンカーを介してタンデムプローブの骨格に結合している。いくつかの好ましいプローブは、配列番号６６の配列を含み、非ヌクレオチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、タンデムプローブは、最大２７塩基長である。
本開示が、特徴の様々な組み合わせおよび部分組み合わせを含むある特定の説明的実施形態を参照してかなり詳細に説明および図示されているが、当業者であれば、本開示の範囲内に包含される他の実施形態ならびにその変形および修正を容易に理解するであろう。さらに、かかる実施形態、組み合わせ、および部分組み合わせの説明は、本開示が特許請求の範囲に明示的に列挙されるもの以外の特徴または特徴の組み合わせを必要とすることを伝えることを意図するものではない。したがって、本開示は、以下の番号付けされた実施形態の趣旨および範囲内に包含される全ての修正および変形を含むとみなされる。
番号付けされた実施形態
実施形態１は、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の標的核酸を検出するためのプローブ試薬であって、第１のオリゴヌクレオチドプローブを含み、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、
（ｉ）骨格と、
（ｉｉ）配列番号６６を含む、当該骨格に結合した塩基配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体と、
（ｉｉｉ）非ヌクレオチドリンカーを介して当該骨格に共有結合した標識と、を有し、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号５および配列番号１０からなる群から選択される野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体にハイブリダイズした場合に、当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２０、配列番号３０、配列番号１５、および配列番号２５からなる群から選択されるＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの配列のうちのいずれかの相補体にハイブリダイズした場合に、当該標識が検出可能なシグナルを生成する、プローブ試薬である。
実施形態１は、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の標的核酸を検出するためのプローブ試薬であって、第１のオリゴヌクレオチドプローブを含み、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、
（ｉ）骨格と、
（ｉｉ）配列番号６６を含む、当該骨格に結合した塩基配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体と、
（ｉｉｉ）非ヌクレオチドリンカーを介して当該骨格に共有結合した標識と、を有し、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号５および配列番号１０からなる群から選択される野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体にハイブリダイズした場合に、当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２０、配列番号３０、配列番号１５、および配列番号２５からなる群から選択されるＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの配列のうちのいずれかの相補体にハイブリダイズした場合に、当該標識が検出可能なシグナルを生成する、プローブ試薬である。
実施形態２は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが最大２４塩基長であり、当該非ヌクレオチドリンカーが、配列番号６６の１１位の塩基と１２位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態１に記載のプローブ試薬である。
実施形態３は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合した当該塩基配列が、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号７６、および配列番号７３からなる群から選択される、実施形態１または２に記載のプローブ試薬である。
実施形態４は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合した当該塩基配列が配列番号８４であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態２または３に記載のプローブ試薬である。
実施形態５は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合した当該塩基配列が配列番号８５であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１３位の塩基と１４位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態２または３に記載のプローブ試薬である。
実施形態６は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合した当該塩基配列が配列番号８６であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態２または３に記載のプローブ試薬である。
実施形態７は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合した当該塩基配列が配列番号８７であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１１位の塩基と１２位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態２または３に記載のプローブ試薬である。
実施形態８は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合した当該塩基配列が配列番号８８であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態２または３に記載のプローブ試薬である。
実施形態９は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合した当該塩基配列が配列番号７６であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１３位の塩基と１４位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態２または３に記載のプローブ試薬である。
実施形態１０は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合した当該塩基配列が配列番号７３であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１３位の塩基と１４位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態２または３に記載のプローブ試薬である。
実施形態１１は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が化学発光標識を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のプローブ試薬である。
実施形態１２は、当該化学発光標識がアクリジニウムエステルである、実施形態１１に記載のプローブ試薬である。
実施形態１３は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格が１つ以上の２’－メトキシ化学基を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のプローブ試薬である。
実施形態１４は、第２のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み、
当該第２のオリゴヌクレオチドプローブが、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３Ｓリボソーム核酸に相補的な塩基配列またはその相補体を含み、それに共有結合した標識をさらに含み、
当該第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号６を含む野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２１、配列番号３１、配列番号１６、および配列番号２６からなる群から選択される核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体にハイブリダイズした場合に、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が検出可能なシグナルを生成しない、先行実施形態のいずれか１つに記載のプローブ試薬である。
当該第２のオリゴヌクレオチドプローブが、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３Ｓリボソーム核酸に相補的な塩基配列またはその相補体を含み、それに共有結合した標識をさらに含み、
当該第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号６を含む野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２１、配列番号３１、配列番号１６、および配列番号２６からなる群から選択される核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体にハイブリダイズした場合に、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が検出可能なシグナルを生成しない、先行実施形態のいずれか１つに記載のプローブ試薬である。
実施形態１５は、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブがＤＮＡ骨格を含む、実施形態１４に記載のプローブ試薬である。
実施形態１６は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識と同じである、実施形態１４または１５に記載のプローブ試薬である。
実施形態１７は、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該塩基配列が配列番号３８である、実施形態１４～１６のいずれか１つに記載のプローブ試薬である。
実施形態１８は、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の標的核酸を検出するためのプローブ試薬であって、第１のオリゴヌクレオチドプローブを含み、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、
（ｉ）骨格と、
（ｉｉ）配列番号６６を含む、当該骨格に結合した塩基配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体と、
（ｉｉｉ）非ヌクレオチドリンカーを介して当該骨格に共有結合した標識と、を有し、
当該オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号７の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１７の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２７の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１２の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２２の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該標識が検出可能なシグナルを生成する、プローブ試薬である。
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、
（ｉ）骨格と、
（ｉｉ）配列番号６６を含む、当該骨格に結合した塩基配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体と、
（ｉｉｉ）非ヌクレオチドリンカーを介して当該骨格に共有結合した標識と、を有し、
当該オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号７の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１７の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２７の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１２の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２２の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該標識が検出可能なシグナルを生成する、プローブ試薬である。
実施形態１９は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが最大２４塩基長であり、当該非ヌクレオチドリンカーが、配列番号６６の１１位の塩基と１２位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態１８に記載のプローブ試薬である。
実施形態２０は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合した当該塩基配列が、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号７６、および配列番号７３からなる群から選択される、実施形態１８または１９に記載のプローブ試薬である。
実施形態２１は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合した当該塩基配列が配列番号８４であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態１９または２０に記載のプローブ試薬である。
実施形態２２は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合した当該塩基配列が配列番号８５であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１３位の塩基と１４位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態１９または２０に記載のプローブ試薬である。
実施形態２３は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合した当該塩基配列が配列番号８６であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態１９または２０に記載のプローブ試薬である。
実施形態２４は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合した当該塩基配列が配列番号８７であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１１位の塩基と１２位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態１９または２０に記載のプローブ試薬である。
実施形態２５は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合した当該塩基配列が配列番号８８であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態１９または２０に記載のプローブ試薬である。
実施形態２６は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合した当該塩基配列が配列番号７６であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１３位の塩基と１４位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態１９または２０に記載のプローブ試薬である。
実施形態２７は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合した当該塩基配列が配列番号７３であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１３位の塩基と１４位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態１９または２０に記載のプローブ試薬である。
実施形態２８は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が化学発光標識を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のプローブ試薬である。
実施形態２９は、当該化学発光標識がアクリジニウムエステルである、実施形態２８に記載のプローブ試薬である。
実施形態３０は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格が１つ以上の２’－メトキシ化学基を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のプローブ試薬である。
実施形態３１は、第２のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み、
当該第２のオリゴヌクレオチドプローブが、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３Ｓリボソーム核酸に相補的な塩基配列またはその相補体を含み、それに共有結合した標識をさらに含み、
当該第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号６を含む野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が検出可能なシグナルを生成するように配置され、
当該第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１７、配列番号２７、配列番号１２、もしくは配列番号２２のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体核酸配列のうちのいずれかの核酸、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの配列の相補体にハイブリダイズした場合に、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が検出可能なシグナルを生成しない、先行実施形態のいずれか１つに記載のプローブ試薬である。
当該第２のオリゴヌクレオチドプローブが、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３Ｓリボソーム核酸に相補的な塩基配列またはその相補体を含み、それに共有結合した標識をさらに含み、
当該第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号６を含む野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が検出可能なシグナルを生成するように配置され、
当該第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１７、配列番号２７、配列番号１２、もしくは配列番号２２のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体核酸配列のうちのいずれかの核酸、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの配列の相補体にハイブリダイズした場合に、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が検出可能なシグナルを生成しない、先行実施形態のいずれか１つに記載のプローブ試薬である。
実施形態３２は、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブがＤＮＡ骨格を含む、実施形態３０に記載のプローブ試薬である。
実施形態３３は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識と同じである、実施形態３１または３２に記載のプローブ試薬である。
実施形態３４は、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該塩基配列が配列番号３８である、実施形態３１～１８のいずれか１つに記載のプローブ試薬である。
実施形態３５は、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の２３Ｓリボソーム核酸を検出するためのキットであって、
配列番号６の野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズされた場合に検出可能なシグナルを生成するが、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２４、および配列番号２９のうちのいずれかのＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体にハイブリダイズされた場合に検出可能なシグナルを生成しない第１のオリゴヌクレオチドプローブと、
配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２４、および配列番号２９のうちのいずれかの核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体にハイブリダイズされた場合に検出可能なシグナルを生成する第２のオリゴヌクレオチドプローブと、を含む、１つ以上のバイアルのパッケージングされた組み合わせを含む、キットである。
配列番号６の野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズされた場合に検出可能なシグナルを生成するが、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２４、および配列番号２９のうちのいずれかのＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体にハイブリダイズされた場合に検出可能なシグナルを生成しない第１のオリゴヌクレオチドプローブと、
配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２４、および配列番号２９のうちのいずれかの核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体にハイブリダイズされた場合に検出可能なシグナルを生成する第２のオリゴヌクレオチドプローブと、を含む、１つ以上のバイアルのパッケージングされた組み合わせを含む、キットである。
実施形態３６は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２６、および配列番号３１のうちのいずれかの配列を含む核酸にハイブリダイズされた場合に検出可能なシグナルを生成せず、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２６、および配列番号３１のうちのいずれかの配列を含む核酸にハイブリダイズされた場合に検出可能なシグナルを生成する、実施形態３５に記載のキットである。
実施形態３７は、上流プロモーターおよび下流標的ハイブリダイズ配列を有するプロモーター－プライマーをさらに含み、
当該下流標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２および配列番号７の野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ配列の２３Ｓリボソーム核酸に相補的であり、かつ配列番号１２、配列番号１７、配列番号２２、および配列番号２７のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体配列に相補的であり、
配列番号２または配列番号７のいずれかの当該核酸を鋳型として使用して当該プロモーター－プライマーを酵素により伸長させることにより、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの各々に相補的な配列を含む伸長産物が産生される、実施形態３５または３６に記載のキットである。
当該下流標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２および配列番号７の野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ配列の２３Ｓリボソーム核酸に相補的であり、かつ配列番号１２、配列番号１７、配列番号２２、および配列番号２７のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体配列に相補的であり、
配列番号２または配列番号７のいずれかの当該核酸を鋳型として使用して当該プロモーター－プライマーを酵素により伸長させることにより、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの各々に相補的な配列を含む伸長産物が産生される、実施形態３５または３６に記載のキットである。
実施形態３８は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの各々が、骨格と、非ヌクレオチドリンカーを介して当該骨格に共有結合した標識と、を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のキットである。
実施形態３９は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの一方の当該骨格が少なくとも１つの２’－メトキシ化学基を含む、実施形態３８に記載のキットである。
実施形態４０は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格がＤＮＡを含み、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格が少なくとも１つの２’－メトキシ化学基を含む、実施形態３８または３９に記載のキットである。
実施形態４１は、
当該第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号６６を含む、当該骨格に結合した塩基配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体を含み、
当該非ヌクレオチドリンカーが、配列番号６６の１１位の塩基と１２位の塩基との間で当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合している、実施形態３８～４０のいずれか１つに記載のキットである。
当該第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号６６を含む、当該骨格に結合した塩基配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体を含み、
当該非ヌクレオチドリンカーが、配列番号６６の１１位の塩基と１２位の塩基との間で当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合している、実施形態３８～４０のいずれか１つに記載のキットである。
実施形態４２は、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該塩基配列が、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号７６、および配列番号７３からなる群から選択される、実施形態４１に記載のキットである。
実施形態４３は、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合した当該塩基配列が配列番号８４であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態４２に記載のプローブ試薬である。
実施形態４４は、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合した当該塩基配列が配列番号８５であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１３位の塩基と１４位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態４２に記載のプローブ試薬である。
実施形態４５は、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合した当該塩基配列が配列番号８６であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態４２に記載のプローブ試薬である。
実施形態４６は、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合した当該塩基配列が配列番号８７であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１１位の塩基と１２位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態４２に記載のプローブ試薬である。
実施形態４７は、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合した当該塩基配列が配列番号８８であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態４２に記載のプローブ試薬である。
実施形態４８は、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合した当該塩基配列が配列番号７６であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１３位の塩基と１４位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態４２に記載のプローブ試薬である。
実施形態４９は、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合した当該塩基配列が配列番号７３であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１３位の塩基と１４位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態４２に記載のプローブ試薬である。
実施形態５０は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの各々の当該標識が他方と同じである、実施形態３８～４９のいずれか１つに記載のキットである。
実施形態５１は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの各々の当該標識が化学発光標識を含む、実施形態３８～４２のいずれか１つに記載のキットである。
実施形態５２は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの各々に結合した当該化学発光標識が同じ化学発光標識を含む、実施形態５１に記載のキットである。
実施形態５３は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの各々に結合した当該化学発光標識がアクリジニウムエステルを含む、実施形態５１または５２に記載のキットである。
実施形態５４は、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の２３Ｓリボソーム核酸を検出するためのキットであって、パッケージングされた組み合わせ中に、
第１のオリゴヌクレオチドプローブであって、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号７６、配列番号７３からなる群から選択される塩基配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体を含み、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、それに共有結合した標識をさらに含み、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、（ｉ）ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする配列番号３または配列番号８のいずれかに相補的な野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸、または（ｉｉ）ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする配列番号１８、配列番号２８、配列番号１３、および配列番号２３のうちのいずれかに相補的なＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体配列にハイブリダイズした場合に、当該標識が検出可能なシグナルを生成する、第１のオリゴヌクレオチドプローブと、
上流プロモーターおよび下流標的ハイブリダイズ配列を含むプロモーター－プライマーであって、
当該下流標的ハイブリダイズ配列がＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３Ｓリボソーム核酸に相補的であり、
野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓまたはＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の２３Ｓリボソーム核酸を鋳型として使用して当該プロモーター－プライマーを酵素により伸長させることにより、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブに相補的な配列を含む伸長産物が産生される、プロモーター－プライマーと、を含む、キットである。
第１のオリゴヌクレオチドプローブであって、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号７６、配列番号７３からなる群から選択される塩基配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体を含み、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、それに共有結合した標識をさらに含み、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、（ｉ）ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする配列番号３または配列番号８のいずれかに相補的な野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸、または（ｉｉ）ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする配列番号１８、配列番号２８、配列番号１３、および配列番号２３のうちのいずれかに相補的なＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体配列にハイブリダイズした場合に、当該標識が検出可能なシグナルを生成する、第１のオリゴヌクレオチドプローブと、
上流プロモーターおよび下流標的ハイブリダイズ配列を含むプロモーター－プライマーであって、
当該下流標的ハイブリダイズ配列がＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３Ｓリボソーム核酸に相補的であり、
野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓまたはＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の２３Ｓリボソーム核酸を鋳型として使用して当該プロモーター－プライマーを酵素により伸長させることにより、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブに相補的な配列を含む伸長産物が産生される、プロモーター－プライマーと、を含む、キットである。
実施形態５５は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、１つ以上の２’－メトキシ化学基を有する骨格を含む、実施形態５４に記載のキットである。
実施形態５６は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該塩基配列が、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号７６、および配列番号７３からなる群から選択される、実施形態５４または５５に記載のプローブ試薬である。
実施形態５７は、第２のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み、
当該第２のオリゴヌクレオチドプローブが、それに共有結合した標識を含み、
当該第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号３もしくは配列番号８の野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体にハイブリダイズした場合に、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１８、配列番号２８、配列番号１３、および配列番号２３からなる群から選択される核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体にハイブリダイズした場合に、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が検出可能なシグナルを生成しない、先行実施形態のいずれか１つに記載のキットである。
当該第２のオリゴヌクレオチドプローブが、それに共有結合した標識を含み、
当該第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号３もしくは配列番号８の野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体にハイブリダイズした場合に、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１８、配列番号２８、配列番号１３、および配列番号２３からなる群から選択される核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体にハイブリダイズした場合に、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が検出可能なシグナルを生成しない、先行実施形態のいずれか１つに記載のキットである。
実施形態５８は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの各々の当該標識が化学発光標識である、実施形態５７に記載のキットである。
実施形態５９は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの各々の当該化学発光標識がアクリジニウムエステルである、実施形態５８に記載のキットである。
実施形態６０は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび当該第２のオリゴヌクレオチドプローブの当該化学発光標識が同じアクリジニウムエステルである、実施形態５９に記載のキットである。
実施形態６１は、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼをさらに含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のキットである。
実施形態６２は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が非ヌクレオチドリンカーを介して当該骨格に共有結合している、実施形態５５～６１のいずれか１つに記載のプローブ試薬である。
実施形態６３は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該塩基配列が配列番号８４であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態６２に記載のプローブ試薬である。
実施形態６４は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該塩基配列が配列番号８５であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１３位の塩基と１４位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態６２に記載のプローブ試薬である。
実施形態６５は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該塩基配列が配列番号８６であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態６２に記載のプローブ試薬である。
実施形態６６は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該塩基配列が配列番号８７であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１１位の塩基と１２位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態６２に記載のプローブ試薬である。
実施形態６７は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該塩基配列が配列番号８８であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態６２に記載のプローブ試薬である。
実施形態６８は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該塩基配列が配列番号７６であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１３位の塩基と１４位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態６２に記載のプローブ試薬である。
実施形態６９は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該塩基配列が配列番号７３であり、当該非ヌクレオチドリンカーが１３位の塩基と１４位の塩基との間で当該骨格に結合している、実施形態６２に記載のプローブ試薬である。
実施形態７０は、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の２３Ｓリボソーム核酸を検出するためのプローブ試薬であって、第１のオリゴヌクレオチドプローブを含み、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、
（ｉ）１つ以上の２’－メトキシ化学基を含む骨格と、
（ｉｉ）配列番号５８を含む、当該骨格に結合した塩基配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体と、
（ｉｉｉ）配列番号５８の配列の６位の塩基と７位の塩基との間、８位の塩基と９位の塩基との間、または９位の塩基と１０位の塩基との間のいずれかで非ヌクレオチドリンカーを介して当該骨格に共有結合した標識と、を有し、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号６の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２１の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号３１の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１６の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２６の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が検出可能なシグナルを生成する、プローブ試薬である。
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、
（ｉ）１つ以上の２’－メトキシ化学基を含む骨格と、
（ｉｉ）配列番号５８を含む、当該骨格に結合した塩基配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体と、
（ｉｉｉ）配列番号５８の配列の６位の塩基と７位の塩基との間、８位の塩基と９位の塩基との間、または９位の塩基と１０位の塩基との間のいずれかで非ヌクレオチドリンカーを介して当該骨格に共有結合した標識と、を有し、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号６の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２１の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号３１の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１６の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２６の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が検出可能なシグナルを生成する、プローブ試薬である。
実施形態７１は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合した当該塩基配列が、当該非ヌクレオチドリンカーが９位の塩基と１０位の塩基との間で結合した配列番号５９、当該非ヌクレオチドリンカーが１０位の塩基と１１位の塩基との間で結合した配列番号６０、当該非ヌクレオチドリンカーが８位の塩基と９位の塩基との間で結合した配列番号６１、当該非ヌクレオチドリンカーが９位の塩基と１０位の塩基との間で結合した配列番号６２、当該非ヌクレオチドリンカーが１０位の塩基と１１位の塩基との間で結合した配列番号６３、当該非ヌクレオチドリンカーが１１位の塩基と１２位の塩基との間で結合した配列番号６４、および当該非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で結合した配列番号６５からなる群から選択される、実施形態７０に記載のプローブ試薬である。
実施形態７２は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に結合した当該塩基配列が配列番号６０である、実施形態７１に記載のプローブ試薬である。
実施形態７３は、当該標識が化学発光標識を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のプローブ試薬である。
実施形態７４は、当該化学発光標識がアクリジニウムエステルである、実施形態７３に記載のプローブ試薬である。
実施形態７５は、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３Ｓリボソーム核酸を検出する第２のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のプローブ試薬である。
実施形態７６は、当該第２のオリゴヌクレオチドが、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格に連結した標識と同じ標識を含む、実施形態７５に記載のプローブ試薬である。
実施形態７７は、検出され得る野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸が、配列番号２および配列番号７を含み、検出され得る変異体Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸が、配列番号１２、配列番号１７、配列番号２２、および配列番号２７を含む、実施形態７０～７６のいずれか１つに記載のプローブ試薬である。
実施形態７８は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の核酸を検出するためのプローブ試薬であって、第１のオリゴヌクレオチドプローブを含み、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、
（ｉ）骨格と、
（ｉｉ）配列番号３９を含む、当該骨格に結合した塩基配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体と、
（ｉｉｉ）配列番号３９の６位の塩基と７位の塩基との間で非ヌクレオチドリンカーを介して当該骨格に共有結合した標識と、を有し、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１８の核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号３もしくは配列番号８のいずれかの核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの配列の相補体にハイブリダイズした場合に、当該標識が当該検出可能なシグナルを生成しない、プローブ試薬である。
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、
（ｉ）骨格と、
（ｉｉ）配列番号３９を含む、当該骨格に結合した塩基配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体と、
（ｉｉｉ）配列番号３９の６位の塩基と７位の塩基との間で非ヌクレオチドリンカーを介して当該骨格に共有結合した標識と、を有し、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１８の核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、当該標識が検出可能なシグナルを生成し、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号３もしくは配列番号８のいずれかの核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの配列の相補体にハイブリダイズした場合に、当該標識が当該検出可能なシグナルを生成しない、プローブ試薬である。
実施形態７９は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該骨格がＤＮＡを含む、実施形態７８に記載のプローブ試薬である。
実施形態８０は、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該塩基配列が、配列番号３９を含み、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする配列番号１８の配列に相補的な核酸にハイブリダイズした場合に、当該標識が当該検出可能なシグナルを生成し、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号３または配列番号８のいずれかの配列に相補的な核酸配列にハイブリダイズした場合に、当該標識が当該検出可能なシグナルを生成しない、実施形態７８または７９に記載のプローブ試薬である。
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該塩基配列が、配列番号３９を含み、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする配列番号１８の配列に相補的な核酸にハイブリダイズした場合に、当該標識が当該検出可能なシグナルを生成し、
当該第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号３または配列番号８のいずれかの配列に相補的な核酸配列にハイブリダイズした場合に、当該標識が当該検出可能なシグナルを生成しない、実施形態７８または７９に記載のプローブ試薬である。
実施形態８１は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該塩基配列が、配列番号４３、配列番号５４、および配列番号４５からなる群から選択される、実施形態８０に記載のプローブ試薬である。
実施形態８２は、当該第２のオリゴヌクレオチドプローブが配列番号３または配列番号８のいずれかの配列に相補的な野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸配列にハイブリダイズした場合に検出可能なシグナルを生成する第２のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含む、実施形態７８に記載のプローブ試薬である。
実施形態８３は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該標識が化学発光標識を含む、実施形態７８に記載のプローブ試薬である。
実施形態８４は、当該化学発光標識がアクリジニウムエステルである、実施形態８３に記載のプローブ試薬である。
実施形態８５は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該塩基配列が、当該非ヌクレオチドリンカーが７位の塩基と８位の塩基との間で当該骨格に結合した配列番号４３である、先行実施形態のいずれか１つに記載のプローブ試薬である。
実施形態８６は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該塩基配列が、当該非ヌクレオチドリンカーが６位の塩基と７位の塩基との間で当該骨格に結合した配列番号５４である、実施形態７８～８４のいずれか１つに記載の試薬である。
実施形態８７は、当該第１のオリゴヌクレオチドプローブの当該塩基配列が、当該非ヌクレオチドリンカーが７位の塩基と８位の塩基との間で当該骨格に結合した配列番号４５である、実施形態７８～８４のいずれか１つに記載の試薬である。
実施形態８８は、試験試料中に存在し得るＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの核酸を検出するための反応混合物であって、
野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓまたはＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の２３Ｓリボソーム核酸鋳型から産生された核酸増幅産物と、
１つ以上の検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブであって、当該検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブの各々が当該核酸増幅産物にハイブリダイズし、当該検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも１つが２’－メトキシヌクレオチド類似体を含み、当該核酸増幅産物にハイブリダイズした後に当該検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも１つが検出可能なシグナルを生成する、１つ以上の検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブと、を含む、反応混合物である。
野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓまたはＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の２３Ｓリボソーム核酸鋳型から産生された核酸増幅産物と、
１つ以上の検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブであって、当該検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブの各々が当該核酸増幅産物にハイブリダイズし、当該検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも１つが２’－メトキシヌクレオチド類似体を含み、当該核酸増幅産物にハイブリダイズした後に当該検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも１つが検出可能なシグナルを生成する、１つ以上の検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブと、を含む、反応混合物である。
実施形態８９は、検出可能な当該Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の核酸が、配列番号１７、配列番号１２、配列番号２２、および配列番号２７の配列を含む、実施形態８８に記載の反応混合物である。
本発明は、いくつかの特定の実施例および実施形態を参照して説明されている。言うまでもなく、本発明のいくつかの異なる実施形態は、前述の発明を実施するための形態を再検討したときに当業者に明らかになるであろう。したがって、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲を参照して決定されるべきである。
Claims (89)
- 野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の標的核酸を検出するためのプローブ試薬であって、第１のオリゴヌクレオチドプローブを含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが、
（ｉ）骨格と、
（ｉｉ）配列番号６６を含む、前記骨格に結合した塩基配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体と、
（ｉｉｉ）非ヌクレオチドリンカーを介して前記骨格に共有結合した標識と、を有し、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号５および配列番号１０からなる群から選択される野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体にハイブリダイズした場合に、前記標識が検出可能なシグナルを生成し、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２０、配列番号３０、配列番号１５、および配列番号２５からなる群から選択されるＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの配列のうちのいずれかの相補体にハイブリダイズした場合に、前記標識が検出可能なシグナルを生成する、プローブ試薬。 - 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが最大２４塩基長であり、前記非ヌクレオチドリンカーが、配列番号６６の１１位の塩基と１２位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項１に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合した前記塩基配列が、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号７６、および配列番号７３からなる群から選択される、請求項１または２に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合した前記塩基配列が配列番号８４であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項２または３に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合した前記塩基配列が配列番号８５であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１３位の塩基と１４位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項２または３に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合した前記塩基配列が配列番号８６であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項２または３に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合した前記塩基配列が配列番号８７であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１１位の塩基と１２位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項２または３に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合した前記塩基配列が配列番号８８であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項２または３に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合した前記塩基配列が配列番号７６であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１３位の塩基と１４位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項２または３に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合した前記塩基配列が配列番号７３であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１３位の塩基と１４位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項２または３に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記標識が化学発光標識を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のプローブ試薬。
- 前記化学発光標識がアクリジニウムエステルである、請求項１１に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格が１つ以上の２’－メトキシ化学基を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のプローブ試薬。
- 第２のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドプローブが、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３Ｓリボソーム核酸に相補的な塩基配列またはその相補体を含み、それに共有結合した標識をさらに含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号６を含む野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記標識が検出可能なシグナルを生成し、
前記第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２１、配列番号３１、配列番号１６、および配列番号２６からなる群から選択される核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体にハイブリダイズした場合に、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記標識が検出可能なシグナルを生成しない、先行請求項のいずれか一項に記載のプローブ試薬。 - 前記第２のオリゴヌクレオチドプローブがＤＮＡ骨格を含む、請求項１４に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記標識が前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記標識と同じである、請求項１４または１５に記載のプローブ試薬。
- 前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記塩基配列が配列番号３８である、請求項１４～１６のいずれか一項に記載のプローブ試薬。
- 野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の標的核酸を検出するためのプローブ試薬であって、第１のオリゴヌクレオチドプローブを含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが、
（ｉ）骨格と、
（ｉｉ）配列番号６６を含む、前記骨格に結合した塩基配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体と、
（ｉｉｉ）非ヌクレオチドリンカーを介して前記骨格に共有結合した標識と、を有し、
前記オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、前記標識が検出可能なシグナルを生成し、
前記オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号７の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、前記標識が検出可能なシグナルを生成し、
前記オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１７の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、前記標識が検出可能なシグナルを生成し、
前記オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２７の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、前記標識が検出可能なシグナルを生成し、
前記オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１２の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、前記標識が検出可能なシグナルを生成し、
前記オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２２の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、前記標識が検出可能なシグナルを生成する、プローブ試薬。 - 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが最大２４塩基長であり、前記非ヌクレオチドリンカーが、配列番号６６の１１位の塩基と１２位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項１８に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合した前記塩基配列が、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号７６、および配列番号７３からなる群から選択される、請求項１８または１９に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合した前記塩基配列が配列番号８４であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項１９または２０に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合した前記塩基配列が配列番号８５であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１３位の塩基と１４位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項１９または２０に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合した前記塩基配列が配列番号８６であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項１９または２０に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合した前記塩基配列が配列番号８７であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１１位の塩基と１２位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項１９または２０に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合した前記塩基配列が配列番号８８であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項１９または２０に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合した前記塩基配列が配列番号７６であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１３位の塩基と１４位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項１９または２０に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合した前記塩基配列が配列番号７３であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１３位の塩基と１４位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項１９または２０に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記標識が化学発光標識を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のプローブ試薬。
- 前記化学発光標識がアクリジニウムエステルである、請求項２８に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格が１つ以上の２’－メトキシ化学基を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のプローブ試薬。
- 第２のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドプローブが、野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３Ｓリボソーム核酸に相補的な塩基配列またはその相補体を含み、それに共有結合した標識をさらに含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号６を含む野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記標識が検出可能なシグナルを生成するように配置され、
前記第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１７、配列番号２７、配列番号１２、もしくは配列番号２２のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体核酸配列のうちのいずれかの核酸、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの配列の相補体にハイブリダイズした場合に、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記標識が検出可能なシグナルを生成しない、先行請求項のいずれか一項に記載のプローブ試薬。 - 前記第２のオリゴヌクレオチドプローブがＤＮＡ骨格を含む、請求項３０に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記標識が前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記標識と同じである、請求項３１または３２に記載のプローブ試薬。
- 前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記塩基配列が配列番号３８である、請求項３１～１８のいずれか一項に記載のプローブ試薬。
- 野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の２３Ｓリボソーム核酸を検出するためのキットであって、
配列番号６の野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズされた場合に検出可能なシグナルを生成するが、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２４、および配列番号２９のうちのいずれかのＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体にハイブリダイズされた場合に検出可能なシグナルを生成しない第１のオリゴヌクレオチドプローブと、
配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２４、および配列番号２９のうちのいずれかの核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体にハイブリダイズされた場合に検出可能なシグナルを生成する第２のオリゴヌクレオチドプローブと、を含む、１つ以上のバイアルのパッケージングされた組み合わせを含む、キット。 - 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２６、および配列番号３１のうちのいずれかの配列を含む核酸にハイブリダイズされた場合に検出可能なシグナルを生成せず、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２６、および配列番号３１のうちのいずれかの配列を含む核酸にハイブリダイズされた場合に検出可能なシグナルを生成する、請求項３５に記載のキット。
- 上流プロモーターおよび下流標的ハイブリダイズ配列を有するプロモーター－プライマーをさらに含み、
前記下流標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２および配列番号７の野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ配列の２３Ｓリボソーム核酸に相補的であり、かつ配列番号１２、配列番号１７、配列番号２２、および配列番号２７のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体配列に相補的であり、
配列番号２または配列番号７のいずれかの前記核酸を鋳型として使用して前記プロモーター－プライマーを酵素により伸長させることにより、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの各々に相補的な配列を含む伸長産物が産生される、請求項３５または３６に記載のキット。 - 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの各々が、骨格と、非ヌクレオチドリンカーを介して前記骨格に共有結合した標識と、を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの一方の前記骨格が少なくとも１つの２’－メトキシ化学基を含む、請求項３８に記載のキット。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格がＤＮＡを含み、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格が少なくとも１つの２’－メトキシ化学基を含む、請求項３８または３９に記載のキット。
- 前記第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号６６を含む、前記骨格に結合した塩基配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体を含み、
前記非ヌクレオチドリンカーが、配列番号６６の１１位の塩基と１２位の塩基との間で前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合している、請求項３８～４０のいずれか一項に記載のキット。 - 前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記塩基配列が、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号７６、および配列番号７３からなる群から選択される、請求項４１に記載のキット。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合した前記塩基配列が配列番号８４であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項４２に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合した前記塩基配列が配列番号８５であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１３位の塩基と１４位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項４２に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合した前記塩基配列が配列番号８６であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項４２に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合した前記塩基配列が配列番号８７であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１１位の塩基と１２位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項４２に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合した前記塩基配列が配列番号８８であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項４２に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合した前記塩基配列が配列番号７６であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１３位の塩基と１４位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項４２に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合した前記塩基配列が配列番号７３であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１３位の塩基と１４位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項４２に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの各々の前記標識が他方と同じである、請求項３８～４９のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの各々の前記標識が化学発光標識を含む、請求項３８～４２のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの各々に結合した前記化学発光標識が同じ化学発光標識を含む、請求項５１に記載のキット。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの各々に結合した前記化学発光標識がアクリジニウムエステルを含む、請求項５１または５２に記載のキット。
- 野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の２３Ｓリボソーム核酸を検出するためのキットであって、パッケージングされた組み合わせ中に、
第１のオリゴヌクレオチドプローブであって、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号７６、配列番号７３からなる群から選択される塩基配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体を含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが、それに共有結合した標識をさらに含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが、（ｉ）ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする配列番号３または配列番号８のいずれかに相補的な野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸、または（ｉｉ）ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする配列番号１８、配列番号２８、配列番号１３、および配列番号２３のうちのいずれかに相補的なＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体配列にハイブリダイズした場合に、前記標識が検出可能なシグナルを生成する、第１のオリゴヌクレオチドプローブと、
上流プロモーターおよび下流標的ハイブリダイズ配列を含むプロモーター－プライマーであって、
前記下流標的ハイブリダイズ配列がＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３Ｓリボソーム核酸に相補的であり、
野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓまたはＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の２３Ｓリボソーム核酸を鋳型として使用して前記プロモーター－プライマーを酵素により伸長させることにより、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブに相補的な配列を含む伸長産物が産生される、プロモーター－プライマーと、を含む、キット。 - 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが、１つ以上の２’－メトキシ化学基を有する骨格を含む、請求項５４に記載のキット。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記塩基配列が、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号７６、および配列番号７３からなる群から選択される、請求項５４または５５に記載のプローブ試薬。
- 第２のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドプローブが、それに共有結合した標識を含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号３もしくは配列番号８の野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体にハイブリダイズした場合に、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記標識が検出可能なシグナルを生成し、
前記第２のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１８、配列番号２８、配列番号１３、および配列番号２３からなる群から選択される核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの相補体にハイブリダイズした場合に、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記標識が検出可能なシグナルを生成しない、先行請求項のいずれか一項に記載のキット。 - 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの各々の前記標識が化学発光標識である、請求項５７に記載のキット。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの各々の前記化学発光標識がアクリジニウムエステルである、請求項５８に記載のキット。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記化学発光標識が同じアクリジニウムエステルである、請求項５９に記載のキット。
- 逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記標識が非ヌクレオチドリンカーを介して前記骨格に共有結合している、請求項５５～６１のいずれか一項に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記塩基配列が配列番号８４であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項６２に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記塩基配列が配列番号８５であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１３位の塩基と１４位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項６２に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記塩基配列が配列番号８６であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項６２に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記塩基配列が配列番号８７であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１１位の塩基と１２位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項６２に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記塩基配列が配列番号８８であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項６２に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記塩基配列が配列番号７６であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１３位の塩基と１４位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項６２に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記塩基配列が配列番号７３であり、前記非ヌクレオチドリンカーが１３位の塩基と１４位の塩基との間で前記骨格に結合している、請求項６２に記載のプローブ試薬。
- 野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の２３Ｓリボソーム核酸を検出するためのプローブ試薬であって、第１のオリゴヌクレオチドプローブを含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが、
（ｉ）１つ以上の２’－メトキシ化学基を含む骨格と、
（ｉｉ）配列番号５８を含む、前記骨格に結合した塩基配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体と、
（ｉｉｉ）配列番号５８の配列の６位の塩基と７位の塩基との間、８位の塩基と９位の塩基との間、または９位の塩基と１０位の塩基との間のいずれかで非ヌクレオチドリンカーを介して前記骨格に共有結合した標識と、を有し、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号６の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記標識が検出可能なシグナルを生成し、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２１の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記標識が検出可能なシグナルを生成し、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号３１の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記標識が検出可能なシグナルを生成し、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１６の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記標識が検出可能なシグナルを生成し、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２６の標的核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記標識が検出可能なシグナルを生成する、プローブ試薬。 - 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合した前記塩基配列が、前記非ヌクレオチドリンカーが９位の塩基と１０位の塩基との間で結合した配列番号５９、前記非ヌクレオチドリンカーが１０位の塩基と１１位の塩基との間で結合した配列番号６０、前記非ヌクレオチドリンカーが８位の塩基と９位の塩基との間で結合した配列番号６１、前記非ヌクレオチドリンカーが９位の塩基と１０位の塩基との間で結合した配列番号６２、前記非ヌクレオチドリンカーが１０位の塩基と１１位の塩基との間で結合した配列番号６３、前記非ヌクレオチドリンカーが１１位の塩基と１２位の塩基との間で結合した配列番号６４、および前記非ヌクレオチドリンカーが１２位の塩基と１３位の塩基との間で結合した配列番号６５からなる群から選択される、請求項７０に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に結合した前記塩基配列が配列番号６０である、請求項７１に記載のプローブ試薬。
- 前記標識が化学発光標識を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のプローブ試薬。
- 前記化学発光標識がアクリジニウムエステルである、請求項７３に記載のプローブ試薬。
- 野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３Ｓリボソーム核酸を検出する第２のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載のプローブ試薬。
- 前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格に連結した標識と同じ標識を含む、請求項７５に記載のプローブ試薬。
- 検出され得る野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸が、配列番号２および配列番号７を含み、検出され得るＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体核酸が、配列番号１２、配列番号１７、配列番号２２、および配列番号２７を含む、請求項７０～７６のいずれか一項に記載のプローブ試薬。
- Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の核酸を検出するためのプローブ試薬であって、第１のオリゴヌクレオチドプローブを含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが、
（ｉ）骨格と、
（ｉｉ）配列番号３９を含む、前記骨格に結合した塩基配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体と、
（ｉｉｉ）配列番号３９の６位の塩基と７位の塩基との間で非ヌクレオチドリンカーを介して前記骨格に共有結合した標識と、を有し、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１８の核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするその相補体にハイブリダイズした場合に、前記標識が検出可能なシグナルを生成し、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号３もしくは配列番号８のいずれかの核酸配列、またはＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするそれらの配列の相補体にハイブリダイズした場合に、前記標識が前記検出可能なシグナルを生成しない、プローブ試薬。 - 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記骨格がＤＮＡを含む、請求項７８に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記塩基配列が、配列番号３９を含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする配列番号１８の配列に相補的な核酸にハイブリダイズした場合に、前記標識が前記検出可能なシグナルを生成し、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号３または配列番号８のいずれかの配列に相補的な核酸配列にハイブリダイズした場合に、前記標識が前記検出可能なシグナルを生成しない、請求項７８または７９に記載のプローブ試薬。 - 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記塩基配列が、配列番号４３、配列番号５４、および配列番号４５からなる群から選択される、請求項８０に記載のプローブ試薬。
- 前記第２のオリゴヌクレオチドプローブが配列番号３または配列番号８のいずれかの配列に相補的な野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸配列にハイブリダイズした場合に検出可能なシグナルを生成する第２のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含む、請求項７８に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記標識が化学発光標識を含む、請求項７８に記載のプローブ試薬。
- 前記化学発光標識がアクリジニウムエステルである、請求項８３に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記塩基配列が、前記非ヌクレオチドリンカーが７位の塩基と８位の塩基との間で前記骨格に結合した配列番号４３である、先行請求項のいずれか一項に記載のプローブ試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記塩基配列が、前記非ヌクレオチドリンカーが６位の塩基と７位の塩基との間で前記骨格に結合した配列番号５４である、請求項７８～８４のいずれか一項に記載の試薬。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記塩基配列が、前記非ヌクレオチドリンカーが７位の塩基と８位の塩基との間で前記骨格に結合した配列番号４５である、請求項７８～８４のいずれか一項に記載の試薬。
- 試験試料中に存在し得るＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの核酸を検出するための反応混合物であって、
野生型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓまたはＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の２３Ｓリボソーム核酸鋳型から産生された核酸増幅産物と、
１つ以上の検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブであって、前記検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブの各々が前記核酸増幅産物にハイブリダイズし、前記検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも１つが２’－メトキシヌクレオチド類似体を含み、前記核酸増幅産物にハイブリダイズした後に前記検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブのうちの少なくとも１つが検出可能なシグナルを生成する、１つ以上の検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブと、を含む、反応混合物。 - 検出可能な前記Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の核酸が、配列番号１７、配列番号１２、配列番号２２、および配列番号２７の配列を含む、請求項８８に記載の反応混合物。
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