JP2000316590A

JP2000316590A - カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ）およびカンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｃｏｌｉ）の増幅および検出

Info

Publication number: JP2000316590A
Application number: JP2000110098A
Authority: JP
Inventors: Ray A Mcmillian; レイ・エイ・マクミリアン; Thomas L Fort; トーマス・エル・フォート; Qimin You; キミン・ユー
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1999-04-12
Filing date: 2000-04-12
Publication date: 2000-11-21
Also published as: US6166196A; EP1045030B1; CA2302882A1; DE60004122T2; EP1045030A2; US6066461A; EP1045030A3; DE60004122D1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】患者中のカンピロバクター・ジェジュニ(C
ampylobacter jejuni)およびカンピロバクター・コリ(C
ampylobacter coli)の存在の有無を判定する。【解決手段】 C.ジェジュニ（C. jejuni）およびC.コ
リ（C. coli）標的を特異的に増幅し、検出するための
増幅プライマーおよび方法を開示する。プライマー標的
結合配列は、種々の増幅検出反応においてC.ジェジュニ
（C. jejuni）およびC.コリ（C. coli）標的を増幅し
て、検出するのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】技術分野本発明は、患者中のカンピロバクター・ジェジュニ(Cam
pylobacter jejuni)およびカンピロバクター・コリ(Cam
pylobacter coli)の存在の有無を判定するための方法に
関する。本発明の方法は、好ましくは、鎖置換増幅（St
rand Displacement Amplification（SDA））、好熱性鎖
置換増幅（thermophilic Strand Displacement Amplifi
cation（tSDA））または蛍光リアルタイムtSDAの技法の
1つを使用し、任意選択的にマイクロエレクトロニック
アレイを使用してC. ジェジュニ（C. jejuni）およびC.
コリ（C. coli）のスーパーオキシドジムスターゼ(sod
B)遺伝子を特異的に増幅する核酸プライマーを使用する
ことを含む。

【０００２】発明の背景 C.ジェジュニ（C. jejuni）およびC.コリ（C. coli）は
全世界にわたってヒトの急性下痢疾患の重要な原因であ
ると認識されている。核酸増幅は、特異的な標的配列の
迅速な検出を可能にする強力な技術である。従って、核
酸増幅は、C.ジェジュニ（C. jejuni）およびC.コリ
（C. coli）の迅速な検出および同定を可能にする有望
な技術である。本発明のオリゴヌクレオチドプライマー
は、スーパーオキシドジスムターゼ（sodB）遺伝子のC.
ジェジュニ（C. jejuni）特異的領域およびC.コリ（C.
coli）特異的領域の核酸増幅および検出に適用できる。
SodB遺伝子はサイズが約900塩基対で、空中および感染
中のC.ジェジュニ（C. jejuni）およびC.コリ（C. col
i）の生存に重要である。

【０００３】以下の用語は本明細書において以下のよう
に定義される。増幅プライマーは、標的配列にハイブリ
ダイゼーションした後にプライマーを伸長することによ
って標的配列を増幅するためのプライマーである。増幅
プライマーは、一般に、鎖長約10〜75ヌクレオチドであ
り、好ましくは鎖長約15〜50ヌクレオチドである。SDA
用の増幅プライマーの総鎖長は、一般に、約25〜50ヌク
レオチドである。SDA増幅プライマーの3'末端（標的結
合配列）は、標的配列の3'末端にハイブリダイゼーショ
ンする。標的結合配列は鎖長約10〜25ヌクレオチドであ
り、増幅プライマーにハイブリダイゼーションの特異性
を与える。SDA増幅プライマーは、さらに、標的結合配
列に対する制限エンドヌクレアーゼ5'の認識部位を含
む。認識部位は、ウォルカー（G. Walker）ら（1992. P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392-396および1992 Nu
cl. Acids Res. 20:1691-1696）によって記載されてい
るように、認識部位が半改変される場合に、DNA二重ら
せんの一方の鎖にニックを入れる制限エンドヌクレアー
ゼのためである。制限エンドヌクレアーゼ認識部位の5'
末端（「テール」）は、増幅プライマーの残りがSDA中
にニックを入れられ、置換される場合にポリメラーゼリ
プライミング部位として機能する。テールヌクレオチド
のリプライミング機能はSDA反応を持続させ、一標的分
子から多数のアンプリコンの合成を可能にする。テール
は、一般に、鎖長約10〜25ヌクレオチドである。テール
の鎖長および配列は一般に重大ではなく、日常的に選択
され、改変され得る。標的結合配列は、標的の特異性を
決定するプライマーの一部であるので、標的の末端部に
おいて特定の配列を必要としない増幅方法では、一般
に、増幅プライマーは本質的に標的結合配列だけからな
る。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain
Reaction（PCR））を使用した本発明による標的配列の
増幅は、本明細書に記載する増幅プライマーの標的結合
配列からなる特定の増幅プライマーを使用する。ニック
を入れることが可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位
およびSDAのテール以外に標的に付加される配列（例え
ば、自己持続型配列複製（Self-Sustained Sequence Re
plication（3SR））、核酸配列をベースとした増幅（Nu
cleic Acid Sequence-Based Amplification（NASBA））
または転写をベースとした増幅システム（Transcriptio
n-Based Amplification System（TAS））のRNAポリメラ
ーゼプロモーター）を必要とする増幅方法では、必要な
特定の配列は、プライマーのハイブリダイゼーション特
異性を変更することなく、オリゴヌクレオチドを製造す
る通常の方法を使用して標的結合配列に連結することが
できる。

【０００４】バンパープライマー、すなわち外部プライ
マーは、等温増幅反応においてプライマー伸長産物を置
換するために使用するプライマーである。バンパープラ
イマーの伸長が下流の増幅プライマーおよびその伸長産
物と置換するように、バンパープライマーは増幅プライ
マーの標的配列の上流にアニーリングする。

【０００５】標的または標的配列という用語は、増幅さ
れる核酸配列をいう。これらには、増幅される核酸配
列、増幅される元の核酸配列に相補的な第2の鎖および
増幅反応によって産生される元の配列のコピーの一方の
鎖が含まれる。これらのコピーは、増幅プライマーがハ
イブリダイゼーションする配列のコピーを含有するとい
うことにより増幅可能な標的として作用する。

【０００６】増幅反応の間に作製される標的配列のコピ
ーは、増幅産物、アンプリマーまたはアンプリコンと呼
ばれる。

【０００７】伸長産物という用語は、プライマーのハイ
ブリダイゼーションおよび鋳型として標的配列を使用し
たポリメラーゼによるプライマーの伸長によって作製さ
れる標的配列のコピーをいう。

【０００８】種特異的という用語は、同じ属の他の種ま
たは異なる属の種の実質的な検出、増幅またはオリゴヌ
クレオチドのハイブリダイゼーションを生じることな
く、ある種の生物または関連する種の群を検出、増幅ま
たはオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションする
ことをいう。

【０００９】アッセイプローブという用語は、核酸の検
出または同定を容易にするために使用する任意のオリゴ
ヌクレオチドをいう。以下に記載されている検出プロー
ブ、犬種ｒつプライマー、捕獲プローブ、シグナルプラ
イマーおよびレポータープローブはアッセイプローブの
例である。

【００１０】アンプリコンという用語は、増幅プライマ
ーの対の一方または両方を伸長することによって作製さ
れる増幅反応の産物をいう。使用する両プライマーが標
的配列にハイブリダイゼーションする場合には、アンプ
リコンは指数的に増幅した核酸を含有しうる。または、
使用するプライマーの一方が標的配列にハイブリダイゼ
ーションしない場合には、アンプリコンは線形増幅によ
って作製され得る。従って、この用語は本明細書におい
て総称的に使用され、指数的に増幅する核酸の存在を意
味するものではない。

【００１１】マイクロエレクトロニックアレイ（または
エレクトロニックマイクロアレイ）は、電子的に自己位
置指定可能な微視的位置の並びを有する装置である。各
微視的位置は、基材に支持され、基底で作動する直流
（DC）微小電極を含有する。各微小位置の表面は、小さ
い対イオンの自由輸送のための透過層と特異的な結合要
素が共有結合するための結合層とを有する。

【００１２】アレイまたはマトリックスは装置上の位置
の並びである。位置は二次元列、三次元列または他のマ
トリックス形式で並べられる。位置の数は数個から数十
万個の範囲であってもよい。

【００１３】電子的位置指定（または標的化）は、特異
的な試験部位に荷電分子を置くことである。DNAは強い
負電荷を有するので、電子の作用により正電荷領域に移
動することができる。マイクロチップ上の試験部位また
は試験部位の並びは、正電荷で電子的に活性化される。
DNAプローブの溶液をマイクロチップに導入する。負に
荷電したプローブは正に荷電した部位に速やかに移動
し、そこで濃縮し、その部位に化学的に結合する。次い
で、マイクロチップを洗浄し、別個のDNAプローブの別
溶液を添加することができる。部位ごとに、並びごと
に、特異的に結合したDNAプローブのアレイがマイクロ
チップ上に集成または位置指定され得る。特異的部位に
捕獲プローブを電子的に位置指定する能力を用いると、
このシステムではマイクロチップ上に特異的な捕獲プロ
ーブを置くことによって特注のアレイの作製が可能にな
る。これに関連して、「電子的に位置指定可能な」とい
う用語は、チップの捕獲部位に電子的にバイアスをかけ
ることによって核酸および酵素並びに他の増幅成分など
の材料をマイクロチップのある位置から別の位置に差し
向けるマイクロチップの能力をいう。「電子的にバイア
スをかける」は、マイクロチップに接触する溶液中の分
子をマイクロチップのある位置に向かうもしくはある位
置から離れるまたはある位置から別の位置に差し向けら
れることができるように、マイクロチップ上の一捕獲部
位または別の位置の電子電荷が正味正電荷と正味負電荷
の間に操作できることを意味することが意図されてい
る。

【００１４】電子の濃縮およびハイブリダイゼーション
はマイクロチップ上の１カ所以上の試験部位（すなわ
ち、捕獲部位）に標的分子を移動し、濃縮する電子を使
用する。各試験部位の試料DNAの電子の濃縮は試料DNAと
相補的な捕獲プローブとの迅速なハイブリダイゼーショ
ンを促進する。受動的なハイブリダイゼーション過程と
は異なり、電子濃縮過程はハイブリダイゼーションの速
度を有意に加速するという明白な利点を有する。各部位
から未結合のDNAまたは非特異的な結合のDNAを除去する
ために、その部位の極性または荷電を負に逆転させ、そ
れによって未結合または非特異的結合のいかなるDNAを
も捕獲プローブから溶液に戻させる。また、試験分子は
試験部位に電子的に濃縮されるので、低濃度の標的DNA
分子が必要であり、従って予備試験の試料調製に必要な
時間と労力が削減される。「捕獲部位」という用語は、
電子的なバイアスがかけられ、核酸プローブおよび標的
分子がこのようなバイアスによって結合または位置指定
される、電子的に位置指定可能なマイクロチップの特異
的な位置をいう。

【００１５】電子的厳密性制御(electronic stringency
control)は、ハイブリダイゼーション過程の一部とし
て未結合および非特異的結合DNAを迅速かつ容易に除去
するための電位の逆転である。電子的な厳密性により、
ハイブリダイゼーション過程の品質が管理され、DNAの
いかなる結合対も真に相補的であることが確実となる。
電子的厳密性過程において制御された電流の送達を使用
することにより、プラットホーム技術の精度、制御性お
よび正確度は、１カ所の点変異、１カ所の塩基対のミス
対合または他の遺伝的変異の検出を可能にし、数多くの
診断および研究への応用において意義ある適応となり得
る。従来の方法で同じ結果を得るのに必要なめんどうな
処理および取り扱いを行うことなく電子的厳密性は達成
される。受動的なアレイとは異なり、本発明の技術は短
鎖および長鎖の一本鎖DNA断片を収容することができ
る。より長いプローブを使用することにより、捕獲プロ
ーブとハイブリダイゼーションするDNAが適切な標的と
なる確実性が増す。電子的緊縮制御は、従来のDNAアレ
イと比較して必要なプローブ数、従ってマイクロチップ
上の試験部位数を低下する。一方、伝統的な受動的ハイ
ブリダイゼーション過程は制御が困難であり、適切な対
合が正に同定され得るように全ての可能な塩基対対合の
より多くの複製物を必要とする。

【００１６】電子的多重送信(electronic ultiplexing)
は、一試料からの多数試験の同時解析を可能にする。同
一マイクロチップ上の生化学的に関連のない分子の同時
使用を可能にする電子的多重送信は、（捕獲プローブま
たは捕獲分子の位置指定および試験試料分子の濃縮のた
めに）個々の試験部位を個別に制御する能力によって容
易にされる。従来のDNAアレイ上の部位は個別に制御で
きないので、同一の過程段階はアレイ全体で実施しなけ
ればならない。本発明の技術では電子を使用することに
より、このような従来の方法に比べて融通性および柔軟
性が高くなる。

【００１７】発明の概要本発明は、C.ジェジュニ（C. jejuni）およびC.コリ
（C. coli）中に見いだされるsodB標的配列を増幅する
ために使用することができるオリゴヌクレオチドプライ
マーを提供する。さらに詳細には、標的配列はsodB遺伝
子セグメントを含む。増幅プライマーは、tSDAおよびPC
Rなどの高温における高効率、高特異性増幅のために設
計されたが、それらは、従来のSDA、3SRまたはNASBAな
どの比較的低温での増幅反応においても有用である。増
幅される標的のアッセイ領域にハイブリダイゼーション
するオリゴヌクレオチドアッセイプローブは、増幅産物
を検出するために使用される。

【００１８】本発明のオリゴヌクレオチドは、培養され
た生物の正体を確認するための手段として培養後に使用
されてもよい。または、既知の増幅方法を使用してC.ジ
ェジュニ（C. jejuni）およびC.コリ（C. coli）の核酸
を検出および同定するために、糞もしくは尿などのヒト
もしくは動物の臨床試料または汚染食物もしくは飲料水
試料とともに使用されてもよい。どちらの場合でも、本
発明のオリゴヌクレオチドおよびアッセイ方法は、C.ジ
ェジュニ（C. jejuni）およびC.コリ（C. coli）と、他
の微生物とを迅速に識別するための手段となり、それに
よって担当者は従来頼りにされていたより伝統的な手法
を使用しないでこの微生物を迅速に同定することができ
る。ある種の感染症に関与する特定の病原菌をこのよう
に迅速に同定することは、短い期間のうちに適当な行動
を決定するために使用することができる情報を提供す
る。

【００１９】配列番号1〜3は、C.ジェジュニ（C. jejun
i）およびC.コリ（C. coli）のsodB遺伝子の増幅のため
の上流プライマーとして使用するオリゴヌクレオチドの
配列である。配列番号4〜6は、C.ジェジュニ（C. jejun
i）およびC.コリ（C. coli）のsodB遺伝子の増幅のため
の下流プライマーとして使用するオリゴヌクレオチドの
配列である。配列番号7は、SDA増幅の上流バンパーとし
て使用するオリゴヌクレオチドの配列である。配列番号
8は、SDA増幅の下流バンパーとして使用するオリゴヌク
レオチドの配列である。配列番号9〜10は、C.ジェジュ
ニ（C. jejuni）およびC.コリ（C. coli）のsodB遺伝子
の検出オリゴヌクレオチド（プローブまたはレポータ
ー）の配列である。

【００２０】発明の詳細な説明本発明は、核酸増幅反応においてC.ジェジュニ（C. jej
uni）およびC.コリ（C. coli）に特異性を示すオリゴヌ
クレオチド、増幅プライマーおよびアッセイプローブに
関する。また、本発明のオリゴヌクレオチドを使用して
C.ジェジュニ（C. jejuni）およびC.コリ（C. coli）の
sodBの核酸を検出し、同定するための方法も提供され
る。好ましい方法はSDA、tSDAまたは均一リアルタイム
蛍光tSDAを使用することである。これらの方法は、それ
らの開示内容を参照することにより、特に本明細書に組
み入れられている、米国特許第5,547,861号、米国特許
第5,648,211号、米国特許第5,846,726号および1997年5
月30日に提出された米国特許出願番号第08/865,675号な
どの参照文献から当業者に周知である。核酸の分析のた
めのマイクロエレクトロニックアレイの使用は、米国特
許第5,605,662号および米国特許第5,632,957号並びにPC
T出願国際公開公報第96/01836号および国際公開公報第9
7/12030号などの参照文献から当業者に周知である。

【００２１】本発明のプライマーはGenBankから入手可
能なゲノムsodBに基づいて設計された。C.ジェジュニ
（C. jejuni）、C.コリ（C. coli）、ヘリコバクター
ピロリ（Helicobacter pylori）および大腸菌（Escheri
chia coli）の配列を比較した。GeneWorksソフトウェア
ーを用いてこれらの配列を編集して、アラインメントを
作成し、配列の相同性を求めた。DNA整列研究から、C.
ジェジュニ（C. jejuni）とC.コリ（C. coli）の間には
600塩基対領域に89%の相同性があることが同定された。
SDAに使用するために開発したプライマーを表1に示す。
得られたアンプリコンの検出のためのプローブも示して
ある。増幅プライマーにおける例示的な制限エンドヌク
レアーゼ認識部位（BsoBI）を下線で示し、標的結合配
列を斜字で示す。増幅プライマーの標的結合配列は標的
の特異性を決定する。

【００２２】

【表１】

【００２３】核酸は、ハイブリダイゼーションするため
に完全な相補性を必要としないので、C.ジェジュニ（C.
jejuni）とC.コリ（C. coli）に特異的プローブおよび
プライマーとしての利用性を損失しない程度に本明細書
に開示されているプローブおよびプライマー配列を改変
できることが理解されるべきである。当技術上知られて
いるように、相補的な核酸配列および部分的に相補的な
核酸配列のハイブリダイゼーションは、厳密性を増加ま
たは低下するようにハイブリダイゼーション条件を調整
することによって実施することができる（すなわち、ハ
イブリダイゼーションpH、温度または緩衝液の塩濃度の
調整）。開示されている配列のこのようなわずかな変更
およびC.ジェジュニ（C. jejuni）とC.コリ（C. coli）
に特異性を維持するために必要なハイブリダイゼーショ
ン条件の任意の調整には日常的な実験しか必要ではな
く、当技術上の通常の技術の範囲内である。

【００２４】本明細書において開示されているプライマ
ーを使用して作製される増幅産物は、例えば、臭化エチ
ジウムで染色したポリアクリルアミドまたはアガロース
ゲル上で特徴的なサイズによって検出することができ
る。または、増幅した標的配列は、検出可能な標識で標
識されたオリゴヌクレオチドであるアッセイプローブに
よって検出することができる。一実施態様において、ハ
イブリダイゼーションによって（検出プローブ）、Walk
erら（1992、Nucl. Acids Res. 22: 1691-1696）によっ
て記載されているようにハイブリダイゼーションおよび
伸長によって（検出プライマー）または欧州特許第0 67
8 582号に記載されているようにハイブリダイゼーショ
ン、伸長および二本鎖形態への変換によって（シグナル
プライマー）、増幅した標的配列を検出するために少な
くとも1つの標識されたアッセイプローブを使用するこ
とができる。配列番号9および配列番号10は、検出プラ
イマー、すなわち、C.ジェジュニ（C. jejuni）とC.コ
リ（C. coli）を検出するための本発明の増幅プライマ
ーと併用したプライマー伸長検出プローブとして特に有
用である。好ましくは、アッセイプローブは、増幅プラ
イマーの間にある標的の配列にハイブリダイゼーション
するように選択される。すなわち、それは内部アッセイ
プローブでなければならない。または、増幅プライマー
またはその標的結合配列はアッセイプローブとして使用
することができる。

【００２５】アッセイプローブの検出可能な標識は、標
的核酸の存在を示すものとして直接または間接的に検出
できる部分である。標識を直接検出するためには、当技
術上周知であるように、アッセイプローブを放射性同位
体で標識し、オートラジオグラフィーで検出する、また
は蛍光部分で標識して蛍光によって検出することができ
る。または、標識を検出可能にする別の試薬を必要とす
る標識で標識することによってアッセイプローブを間接
的に検出することができる。間接的に検出可能な標識に
は、例えば、化学発光剤、目に見える反応生成物を産生
する酵素および標識した特異的な結合相手（例えば、抗
体または抗原/ハプテン）に結合することによって検出
することができるリガンド（例えば、ハプテン、抗体ま
たは抗原）が含まれる。リガンドは、リガンドで標識し
たオリゴヌクレオチド（捕獲プローブ）を固相に固定し
てその検出を容易にするために有用である。特に有用な
標識にはビオチン（標識したアビジンまたはストレプト
アビジンに結合することによって検出可能）およびセイ
ヨウワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファ
ターゼなどの酵素（着色した反応生成物を産生する酵素
基質を添加することによって検出可能）が含まれる。オ
リゴヌクレオチドにこのような標識を添加するための方
法またはオリゴヌクレオチドにこのような標識を含ませ
るための方法は当技術上周知であり、これらの方法の任
意のものが本発明に使用するために好適である。

【００２６】使用することができる特異的な検出方法の
例には、米国特許第5,470,723号に記載されているビオ
チン化捕獲プローブおよび酵素結合検出プローブを使用
して増幅産物を検出する化学発光方法が含まれる。これ
ら2つのアッセイプローブを標的配列のアッセイ領域の
異なる部位（2つの増幅プライマーの結合部位間）にハ
イブリダイゼーションした後に、複合体は捕獲プローブ
によってストレプトアビジンを被覆したマイクロタイタ
ープレートに捕獲され、化学発光信号を発し、ルミノメ
ーターで読まれる。増幅産物を検出する別法として、欧
州特許第0 678582号に記載されているシグナルプライマ
ーをSDA反応に加えてもよい。この実施態様では、標識
された第2の増幅産物がSDA中に標的増幅依存的な方法で
作製され、結合した標識によって標的増幅を示すものと
して検出することができる。

【００２７】市販上簡便にするために、核酸を特異的に
検出し、同定するための増幅プライマーはキットの形態
で包装されてもよい。一般に、このようなキットは少な
くとも1対の増幅プライマーを含有する。例えば、緩衝
液、別のプライマー、ヌクレオチド三リン酸、酵素等の
ような、核酸増幅反応を実施するための試薬を標的特異
的増幅プライマーに加えることもできる。キットの構成
要素は、本発明の方法の具体的な実施態様を実施するた
めの取扱説明書を任意に加えて、通常の容器に包装され
る。例えば、アッセイプローブとして使用するのに好適
な標識で標識したオリゴヌクレオチドおよび/または標
識を検出するための試薬または手段のような他の任意の
構成要素をキットに加えることもできる。

【００２８】増幅プライマーの標的結合配列は、オリゴ
ヌクレオチドにハイブリダイゼーションの種特異性を与
えるので、増幅反応に種特異性を提供する。従って、本
発明の増幅プライマーの標的結合配列は、PCR、従来のS
DA（反応スキームはtSDAと本質的に同じであるが、中温
酵素を使用して比較的低温で実施される）、3SR、NASBA
およびTASなどの他の核酸増幅プロトコールにも有用で
ある。具体的には、標的配列へのプライマーの環状の特
異的なハイブリダイゼーション、鋳型として標的配列を
使用したプライマーの伸長および標的配列からの伸長産
物の分離または置換を使用する任意の増幅プロトコール
は、本発明の標的結合配列を使用することができる。特
殊な非標的結合配列を必要としない増幅方法では（例え
ば、PCR）、増幅プライマーは表1に掲載する増幅プライ
マーの標的結合配列だけからなることができる。

【００２９】選択した増幅反応を実施するのに必要な他
の配列を、オリゴヌクレオチドの種特異性を変更するこ
となく本明細書に開示されている標的結合配列に任意に
添加してもよい。一例として、特異的な増幅プライマー
は、SDA反応の間にニックを入れられる制限エンドヌク
レアーゼBsoBIの認識部位を含有してもよい。欧州特許
第0 684 315号に開示されている認識部位を含むがこれ
らに限定されない、ニックを入れることができる他の制
限エンドヌクレアーゼ認識部位をBsoBI認識部位と交換
することができることは当業者に明らかである。好まし
くは、増幅反応がtSDA条件下で実施することができるよ
うに、認識部位は好熱性制限エンドヌクレアーゼ用であ
る。同様に、増幅プライマーのテール配列（制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位の5'側）は一般に重要ではない
が、SDAに使用する制限部位およびそれら自体の標的結
合配列または他のプライマーのどちらかにハイブリダイ
ゼーションする配列は避けられるべきである。従って、
SDAのためのいくつかの増幅プライマーは3'末端標的結
合配列、標的結合配列のニックを入れることが可能な5'
末端制限エンドヌクレアーゼ認識部位および制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位の5'末端の鎖長約10〜25ヌクレオ
チドのテール配列からなる。ニックを入れることが可能
な制限エンドヌクレアーゼ認識部位およびテール配列
は、SDA反応に必要な配列である。他の増幅反応では
（例えば、3SR、NASBAおよびTAS）では、増幅プライマ
ーは選択した増幅反応に必要な標的結合配列および追加
の配列からなってもよい（例えば、上記のSDAに必要な
配列または3SRのためのRNAポリメラーゼによって認識さ
れるプロモーター）。本発明の標的結合配列をSDA以外
の増幅方法に適合するには、選択した増幅反応のプライ
マーのための化学合成などの増幅プライマーを製造する
ための通常の方法および周知の構造上の要件を使用す
る。従って、本発明の標的結合配列は、製造、スクリー
ニングおよび最適化のための通常の方法だけを使用して
種々の増幅反応におけるC.ジェジュニ（C. jejuni）と
C.コリ（C. coli）に特異的標的増幅および検出に容易
に適合することができる。

【００３０】SDAでは、バンパープライマーは下流の種
特異的増幅プライマーを置換する作用をするので、種特
異性に必須ではない。バンパープライマーが伸長された
とき、それらは増幅プライマーおよびその伸長産物と置
換するように、バンパープライマーは増幅プライマーの
上流の標的にハイブリダイゼーションすることだけが要
求される。従って、バンパープライマーの特定の配列は
一般に重大ではなく、バンパープライマーの伸長の結
果、増幅プライマー伸長産物の置換を可能にするため
に、増幅プライマーの結合部位に十分に近接した上流の
任意の標的配列から誘導されてもよい。バンパープライ
マーが特異的標的配列とハイブリダイゼーションするこ
とができ続ける限り、バンパープライマー配列の標的と
の時折のミス対合または非標的配列との数カ所の交差ハ
イブリダイゼーションは一般に増幅効率に負の影響を与
えない。

【００３１】本発明のプライマーを使用した増幅反応
は、ウォルカー（Walker）ら（1992、Nucl. Acids Res.
20: 1691-1696）によって教示されるようにチミンを導
入することができ、または例えば欧州特許第0 624 643
に教示されているように、その後の増幅反応の交差汚染
を低下するために、反応において2'-デオキシウリジン
5'-トリホスフェートとTTPとを全てもしくは一部交換す
ることができる。dU（ウリジン）は増幅産物に導入さ
れ、ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）で処理すること
によって切除することができる。これらの非塩基性部位
はその後の増幅反応において増幅産物を増幅不可能にす
る。UDＧは、新たに形成された増幅産物中のdUの切除を
防止するために、その後の増幅を実施する前に、ウラシ
ルDNAグリコシラーゼ阻害剤（UGI）によって不活性化し
てもよい。

【００３２】SDAは、プライマーの伸長、半改変制限エ
ンドヌクレアーゼ認識/切断部位へのニッキング、1本鎖
伸長産物の置換、伸長産物（または元の標的配列）への
プライマーのアニーリングおよびプライマーのその後の
伸長が反応混合物中で同時に生じる等温核酸増幅方法で
ある。これは、反応ステップが反応の特徴である温度サ
イクルの結果として別個の相またはサイクルで生じるPC
Rと対照的である。SDAは、1）2本鎖認識/切断部位のヘ
ミホスホロチオエート形態の半改変鎖にニックを入れる
制限エンドヌクレアーゼの能力および2）ニック部位で
複製を開始し、下流の非鋳型鎖と置換するある種のポリ
メラーゼの能力に基づいている。プライマーをアニーリ
ングするために2本鎖標的配列を変性した後、新たに合
成された鎖のその後の重合および置換は一定の温度で生
じる。標的配列の新たな各コピーの作製は以下の5つの
ステップからなる。1）元の標的配列または以前に重合
され置換された1本鎖伸長産物への増幅プライマーの結
合、2）α-チオデオキシヌクレオシドトリホスフェート
（α-チオ、dNTP）を導入する5'-3'エキソヌクレアーゼ
欠損ポリメラーゼによるプライマーの伸長、3）半改変2
本鎖制限部位へのニッキング、4）ニック部位からの制
限酵素の解離および5）5'-3'エキソヌクレアーゼ欠損ポ
リメラーゼによるニッキングの3'末端からの伸長と新た
に合成された下流の鎖の置換。ニッキングからの伸長
は、ニックを入れることが可能な別の制限部位を再生す
るので、ニッキング、重合および置換は一定の温度にお
いて同時および連続的に生ずる。一対の増幅プライマー
を使用する場合には、その各々は2本鎖標的配列の2本の
鎖の一方にハイブリダイゼーションし、増幅は指数関数
的である。これは、センス鎖およびアンチセンス鎖が、
その後の増幅過程における対向プライマーの鋳型として
作用するからである。1つの増幅プライマーを使用する
場合には、1本の鎖だけがプライマー伸長の鋳型として
作用するので、増幅は線形である。α-チオdNTPを導入
する場合に、2本鎖認識/切断部位に入れ目を入れる制限
エンドヌクレアーゼの例は、HincII、HindII、AvaI、Nc
iIおよびFnu4HIである。これらの制限エンドヌクレアー
ゼの全ておよび必要なニッキング活性を示す他の制限エ
ンドヌクレアーゼは、従来のSDAに使用するのに好適で
ある。しかし、それらは比較的熱感受性であり、約40℃
より高い温度において失活する。

【００３３】SDAによる増幅の標的は、標的配列を切断
しないエンドヌクレアーゼによる制限によってより大き
い核酸を断片化することによって作製することができ
る。しかし、Walkerら、（1992、Nucl. Acids Res. 20:
1691-1696）によっておよび米国特許第5,270,184号
（参照として本明細書に組み入れられている）において
記載されているように、SDA反応においてニックを入れ
るための選択された制限エンドヌクレアーゼ認識部位/
切断部位を有する標的核酸を作製することが一般に好ま
しい。簡単に説明すると、標的配列が2本鎖である場合
には4つのプライマーがそれにハイブリダイゼーション
する。プライマーの2つ（S₁およびS₂）はSDA増幅プライ
マーであり、2つ（B₁およびB₂）は外部すなわちバンパ
ープライマーである。S₁およびS₂は標的配列に隣接する
2本鎖核酸の対向鎖に結合する。B₁およびB₂は、それぞ
れS₁およびS₂の5'側（すなわち、上流側）標的配列に結
合する。次いで、3つのデオキシヌクレオシドトリホス
フェートおよび少なくとも1つの改変デオキシヌクレオ
シドトリホスフェート（例えば、2'-デオキシアデノシ
ン5'-O-（1-チオトリホスフェート）、「dATPαS」）の
存在下においてエキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼを
使用して4つのプライマー全てを同時に伸長する。それ
によって、S₁およびS₂の伸長産物はB₁およびB₂の伸長に
よって元の標的配列鋳型から置換される。増幅プライマ
ーの置換された1本鎖伸長産物は、対向側の増幅および
バンパープライマーの結合のための標的として作用する
（例えば、S₁の伸長産物はS₂およびB₂に結合する）。次
の伸長および置換サイクルによって、2つの2本鎖核酸断
片は各末端において制限エンドヌクレアーゼ認識/切断
部位が半改変される。これらはSDAによる増幅のための
好適な基質である。SDAと同様に、標的作製反応の個々
のステップは同時および連続的に生じて、SDAにおいて
制限酵素によってニックを入れるのに必要な認識/切断
配列を末端に有する標的配列を作製する。SDA反応の成
分の全てはすでに標的作製反応中に存在するので、自動
的で、連続的に作製された標的配列がSDAサイクルに入
り、増幅される。

【００３４】別のものの増幅産物によるSDA反応の交差
汚染を予防するために、増幅反応を阻害することなく、
dTTPの代わりにdUTPをSDA増幅DNAに導入することができ
る。次いで、ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）による
処理によって、ウラシルが改変された核酸が特異的に認
識され、不活性化され得る。従って、前の反応において
dUTPがSDA-増幅DNAに導入されると、その後のいかなるS
DA反応も2本鎖標的の増幅の前にUDGで処理され、前に増
幅された反応のdUを含有するいかなるDNAも増幅不可能
にされる。その後の反応で増幅される標的DNAはdUを含
有せず、UDG処理によって影響されない。次いでUDGは標
的の増幅の前にUGIでの処理によって阻害され得る。ま
たは、UDGは熱によって不活性化されてもよい。tSDAで
は、より高温の反応温度（≧50℃）を同時に使用して、
UDGを不活性化して、標的を増幅することができる。

【００３５】SDAは、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を欠
損し、2本鎖核酸の1本の鎖のニック部位において重合を
開始し、鋳型としてニックの入っていない鎖を使用して
新たな相補鎖を作製すると同時にニックの下流の鎖を置
換するポリメラーゼを必要とする。ポリメラーゼはヌク
レオチドを遊離の3'-OHに付加することによって伸長し
なければならない。SDA反応を最適化するためには、増
幅され得る標的配列の鎖長を最長にするためにポリメラ
ーゼが高処理性であることも望ましい。高処理性ポリメ
ラーゼは、伸長産物を解離し、合成を停止する前に、か
なりの鎖長の新たな鎖を重合することができる。置換活
性は増幅反応に必須である。その理由は、置換活性が別
のコピーを合成するのに利用できる標的を作製し、指数
関数的な増幅反応において第2の増幅プライマーがハイ
ブリダイゼーションすることができる1本鎖伸長産物を
作製するからである。制限酵素のニック活性もかなり重
要である。その理由は、反応を持続し、その後の標的増
幅過程を開始させるのはニッキング作用だからである。

【００３６】tSDAは、Walkerら、（1992、Proc. Natl.
Acad. Sci. USA89:392-396および1992、Nucl. Acids Re
s. 20:1691-1696）によって記載されている従来のSDAの
ように、望ましい熱安定性ポリメラーゼおよび熱安定性
制限エンドヌクレアーゼの置換によって本質的に実施さ
れる。当然のことであるが、反応温度は置換された酵素
に好適な高温に調整され、HincII制限エンドヌクレアー
ゼ認識/切断部位は選択した熱安定性エンドヌクレアー
ゼの適当な制限エンドヌクレアーゼ認識/切断部位によ
って置換される。また、ウォルカー（Walker）らと同じ
く、変性温度において十分に安定であれば、担当者は最
初の変性段階の前に反応混合物に酵素を加えることがで
きる。tSDAに使用するのに好ましい制限エンドヌクレア
ーゼはBsrI、BstNI、BsmAI、Bsl IおよびBsoBI（ニュー
イングランドバイオラボズ（NewEngland BioLabs））お
よびBstOI（プロメガ（Promega））である。好ましい好
熱性ポリメラーゼはBca（パンヴェラ（Panvera））およ
びBst（ニューイングランドバイオラボズ（New England
BioLabs））である。

【００３７】均一リアルタイム蛍光tSDA（Homogenous r
eal time fluorescent tSDA）はtSDAの改良型である。
それは、蛍光の消光を標的依存的に低下するために、検
出オリゴヌクレオチドを使用する。検出オリゴヌクレオ
チドは、標的が存在しない場合に蛍光の消光が生じるよ
うに結合したドナー/アクセプター染料対を含有する。
標的の存在下において検出オリゴヌクレオチドの分子内
塩基対を形成した二次構造のときほぐし(unfolding)、
または線状化は染料間の距離を増し、蛍光を消光させな
い。塩基対を形成した二次構造のときほぐしは、一般に
二次構造の配列と相補鎖との間の分子間塩基対形成に関
係し、その結果二次構造は少なくとも部分的に破壊され
る。それは、十分な鎖長の相補鎖の存在下では、十分に
線状化され得る。好ましい実施態様において、二次構造
と相補鎖との間の分子間塩基対形成は制限エンドヌクレ
アーゼ認識部位（RERS）を2本鎖化し、制限エンドヌク
レアーゼによって切断可能またはニックを入れることを
可能にするように、RERSは2つの染料の間に存在する。
制限エンドヌクレアーゼによる切断またはニッキングは
別個の核酸断片上のドナーおよびアクセプター染料を分
離し、さらに消光の低下に寄与する。どちらの実施態様
においても、蛍光パラメーターの関連ある変化（例え
ば、ドナー蛍光強度の増加、アクセプター蛍光強度の低
下またはときほぐし前後の蛍光比）を標的配列の存在を
示すものとしてモニターする。ドナー蛍光強度の変化を
モニターすることが好ましい。なぜなら、この変化はア
クセプター蛍光強度の変化より一般に大きいからであ
る。蛍光寿命の変化などの他の蛍光パラメーターをモニ
ターしてもよい。

【００３８】均一リアルタイム蛍光tSDAの検出オリゴヌ
クレオチドは、標的配列（標的結合配列）にハイブリダ
イゼーションする1本鎖5'側または3'側部分、並びに標
的結合配列に隣接する分子内塩基対形成した二次構造を
含むオリゴヌクレオチドである。本発明の検出オリゴヌ
クレオチドは、二次構造が分子内塩基対形成した場合に
ドナーの蛍光が消光し、二次構造のときほぐしまたは線
状化によって蛍光の消光が低下するように検出オリゴヌ
クレオチドに連結されたドナー/アクセプター染料対を
さらに含む。オリゴヌクレオチドの切断は、DNA二重ら
せんの両鎖のホスホジエステル結合を切断すること、ま
たは1本鎖DNAのホスホジエステル結合を切断することを
いう。これは、DNA二重らせんの2本鎖の１本だけのホス
ホジエステル結合を切断することをいうニッキングとは
異なる。

【００３９】均一リアルタイム蛍光tSDAのための本発明
の検出オリゴヌクレオチドは、プライマーの伸長または
ハイブリダイゼーションのために選択した条件下におい
て分子内塩基対を形成した二次構造を形成する配列を含
む。二次構造は、標的結合配列の少なくとも一部が1本
鎖3'または5'側テールを形成するように、検出オリゴヌ
クレオチドの標的結合配列に隣接して位置づけられる。
本明細書において使用する「標的結合配列に隣接して」
という用語は、標的結合配列の全てまたは一部が5'また
は3'側テールにおいて1本鎖のままで存在し、標的との
ハイブリダイゼーションに利用可能であることを意味す
る。すなわち、二次構造は標的結合配列全体を含まな
い。標的結合配列の一部は二次構造の分子内塩基対形成
に関与してもよく、二次構造の分子内塩基対形成に関与
する第1の配列の全てもしくは一部を含んでもよく、二
次構造の分子内塩基対形成に関与する第1の配列の全て
もしくは一部を含んでもよいが、好ましくはその相補的
配列に伸長しない。例えば、二次構造がステム-ループ
構造（例えば、「ヘアピン」）であり、検出オリゴヌク
レオチドの標的結合配列が1本鎖3'側テールとして存在
する場合には、標的結合配列はステムの第1のアームの
全てまたは一部を介しておよび任意にループの全てまた
は一部を介して伸長することもできる。しかし、標的結
合配列は、好ましくは、ステムの分子内塩基対形成に関
与する配列の第2のアームには伸長しない。すなわち、
標的にハイブリダイゼーションすることができる二次構
造の分子内塩基対形成に関与する両配列を持たないよう
にすることが望ましい。検出オリゴヌクレオチドの二次
構造の分子内塩基対形成部分のミス対合は、標的の存在
下における蛍光の変化の大きさを低下することがある
が、アッセイ感度が懸念されない場合には許容される。
1本鎖テールの標的結合配列のミス対合も許容される
が、同様にアッセイ感度および/または特異性を低下す
ることがある。しかし、二次構造および標的結合配列の
完璧な塩基対形成が反応を妨害しないことが本発明の特
徴である。ハイブリダイゼーションに関与する配列の完
璧な対合は、反応動態に負の影響を与えることなくアッ
セイの特異性を改善する。

【００４０】増幅反応に添加する場合には、本発明の検
出オリゴヌクレオチドシグナルプライマーは、上記のよ
うにハイブリダイゼーションおよび伸長によって2本鎖
形態に変換される。ポリメラーゼによる鎖置換も二次構
造をときほぐすかまたは線状化し、相補鎖の合成によっ
て2本鎖形態に変換する。存在する場合には、RERSも2本
鎖になり、制限エンドヌクレアーゼによって切断可能ま
たはニッキングされることが可能になる。二次構造はポ
リメラーゼの鎖置換活性によってときほぐされるかまた
は線状化されるので、ドナーとアクセプター染料間の距
離は増加し、それによってドナーの蛍光は消光しない。
ドナーまたはアクセプター染料のどちらかの蛍光の関連
する変化を標的配列の増幅を示すものとしてモニターま
たは検出することができる。RERSの切断またはニッキン
グは一般に、2本鎖の二次増幅産物の2つの別個の断片を
作製し、各々は2つの染料の一方が連結することによっ
て蛍光の変化の大きさをさらに増す。これらの断片は反
応溶液中を自由に拡散し、さらにドナー/アクセプター
対の染料間の距離を増す。ドナー蛍光強度の増加または
アクセプター蛍光強度の低下は、標的増幅が生じている
または生じたことを示すものとして検出および/または
モニターされ得るが、ドナー/アクセプター染料対の接
近によって影響される他の蛍光パラメーターもモニター
されることがある。ドナーまたはアクセプターの蛍光強
度の変化はドナーおよび/またはアクセプターの蛍光強
度の比の変化として検出されることもできる。例えば、
蛍光強度の変化は、a）二次構造を線状化またはときほ
ぐした後のドナー蛍光団の蛍光と線状化またはときほぐ
しの前の検出オリゴヌクレオチドのドナーの蛍光団の蛍
光の比の増加、またはb）洗浄化またはときほぐし後の
アクセプター染料の蛍光と線状化またはときほぐし前の
検出オリゴヌクレオチドのアクセプター染料の蛍光の比
の低下として検出することができる。

【００４１】本発明の検出オリゴヌクレオチドは、SDA
以外に、他のプライマー伸長増幅方法（例えば、PCR、3
SR、TMAまたはNASBA）のシグナルプライマーとして使用
するために適応することができることが明らかになる。
例えば、本発明の方法は、PCRにおいてPCR増幅プライマ
ーおよび5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を欠損する鎖置
換DNAポリメラーゼ（例えば、プロメガ（Promega）社製
のシークエンシンググレードTaqまたはニューイングラ
ンドバイオラボズ（New England BioLabs）社製のexo^-
Ventもしくはexo^-Deep Vent）を使用することによって
PCRにおいて使用するために適応することができる。検
出オリゴヌクレオチドシグナルプライマーは、本質的に
SDAについて記載されているように、PCR増幅プライマー
の下流の標的にハイブリダイゼーションし、置換され、
2本鎖化される。PCRでは、RERSの切断ではなくニッキン
グを誘導すると思われる改変されたデオキシヌクレオシ
ドトリホスフェートが一般に存在しないので、いかなる
RERSも検出オリゴヌクレオチドに使用するために任意に
選択することができる。温度サイクルはPCRによる増幅
の特徴であるので、増幅の終点の検出には、制限エンド
ヌクレアーゼは、好ましくは、プライマーのアニーリン
グおよび伸長の最後のサイクルの後で低温において添加
される。しかし、PCR反応の高温相を通して活性を維持
している好熱性制限エンドヌクレアーゼは、増幅中存在
すると思われ、リアルタイムアッセイとなる。SDAシス
テムと同様に、染料対の分離は蛍光の消光を低下し、強
度などの蛍光パラメーターの変化は標的増幅を示すもの
として作用する。

【００４２】検出オリゴヌクレオチドのときほぐしまた
は線状化による蛍光の変化は、反応の選択された終点に
おいて検出することができる。しかし、線状化された二
次構造はハイブリダイゼーションまたはプライマーの伸
長と同時に作製されるので、蛍光の変化は、反応が生じ
ているとき、すなわち「リアルタイム」にモニターする
こともできる。この均一なリアルタイムアッセイ形式
は、存在する最初の標的量についての半定量または定量
情報を提供するために使用することができる。例えば、
ときほぐしまたは線状化反応中に蛍光強度が変化する速
度（標的増幅の一部としてまたは非増幅検出方法におい
て）は、最初の標的量を示すものである。結果として、
標的配列は最初のコピー量が多いほど、ドナー蛍光は選
択した閾値により迅速に到達する（すなわち、正になる
までの時間がより短い）。選択した最小値に到達するの
に必要な時間として検出するとき、アクセプター蛍光の
低下は、同様に正になるまでの時間の短いことを示す。
また、反応経過中の蛍光パラメーターの変化速度は、最
初の標的量がより少ない試料と比較して最初の標的量が
より多い試料においてより迅速である（すなわち、蛍光
曲線の傾斜が大きい）。標的の存在を示すものとして、
または標的増幅を示すものとしてこれらの測定または当
技術上周知である他の測定を実施することができる。最
初の標的量は、一般に、実験結果を既知量の標的の結果
と比較することによって求められる。

【００４３】本発明の方法による選択した標的配列の存
在に関するアッセイは、溶液中または固相において実施
することができる。検出オリゴヌクレオチドがプライマ
ーとして作用する実時間または終点均一アッセイは、一
般に、溶液中で実施される。本発明の検出オリゴヌクレ
オチドを使用したハイブリダイゼーションアッセイも溶
液中で実施することができるが（例えば、均一リアルタ
イムアッセイ）、標的の実時間検出または終点検出の固
相アッセイに、特に好適である。固相アッセイでは、検
出オリゴヌクレオチドは、当技術上周知な方法を使用し
て、内部または末端標識を介して固相（例えば、ビー
ズ、膜または反応容器）に固定することができる。例え
ば、ビオチンを標識した検出オリゴヌクレオチドは、ア
ビジンを修飾した固相に固定化することができ、そこ
で、適当なハイブリダイゼーション条件下において標的
に暴露されると、蛍光の変化を生ずる。この様式での標
的の捕獲は試料から標的の分離を容易にし、シグナルの
検出またはアッセイの他の局面を妨害することがある試
料中の基質の除去を可能にする。使用することができる
固相系の一例はエレクトロニックマイクロアレイ、すな
わち活発なプログラミング可能なエレクトロニックマト
リックスハイブリダイゼーションシステムである。

【００４４】本発明に使用するための活発なプログラミ
ング可能なエレクトロニックマトリックスハイブリダイ
ゼーションシステムの単純化した形態は以下に記載され
ている。一般に、基材は電子的に位置指定可能な微細位
置のマトリックスまたはアレイを支持する。個々の電極
の上部に透過層が配置される。透過層は比較的小さい荷
電物質の輸送を可能にするが、DNAなどの大きい荷電物
質が電極に直接接触しないようにする。透過層は、電極
に直接接触することによってDNAに生ずると思われる電
気化学的分解を生じないようにする。透過層は、さら
に、電極へのDNAの強力な非特異的吸着をさせないよう
に作用する。結合領域は透過層の上に配置され、標的物
質の特異的結合部位となる。

【００４５】操作時には、検出、分析または使用するた
めの望ましい（および望ましくない）材料を含有するリ
サーバーは、結合領域の上部に空間を有する。荷電した
DNAなどの荷電物質はリサーバーの中に配置される。一
局面にいおいて、活発なプログラミング可能なマトリッ
クスシステムは、荷電物質を特異的な微細位置のいずれ
にも輸送するための方法を含む。活性化すると、微細位
置は荷電し、官能基を導入され特異的に結合したいかな
る物質も電極方向へ自由電界電気泳動的に輸送する。例
えば、一方の電極を正にし、もう一方の電極を負にする
と、電気泳動的な力腺が2つの電極間に働くと思われ
る。電気泳動的な力の方向によって、正味負電荷を有す
る荷電結合物質は正の電極方向に輸送される。正味正電
荷を有する荷電物質は電気泳動力下で負に荷電した電極
方向に移動する。官能基が導入されている正味負に荷電
した結合物質は電気泳動力下でのその移動の結果として
結合層に接触すると、官能基を導入された特異的結合物
質は第1の電極に相当する結合層に共有結合する。

【００４６】電気泳動的な輸送は、一般に、系内で電気
分解およびイオンの輸送を可能にするのに十分な電圧を
適用することにより生ずる。電解質溶液を介するイオン
の輸送によるなどの、電気泳動的移動が生じ、系に電流
が流れる。この方法では、完全な回路はイオン電流を介
して形成され、回路の残りは電極および制御式電気回路
などの従来のエレクトロニック構成要素によって完成さ
れる。例えば、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、緩
衝液およびイオン種などの従来の材料を含有する電解質
水溶液では、電気分解およびイオンの輸送を誘導する電
圧はほぼ1.2ボルトより大きいか、または等しい。

【００４７】対応する電極を負にすることによって反応
を起こさない結合層を保護することが可能である。これ
によって、電気泳動的な力腺がこのような結合領域から
発する。電気泳動的な力腺は、負に荷電した結合物質を
未反応結合層から第1の電極に相当する結合層方向に駆
動する作用をする。この方法では、そのときに荷電分子
と非反応性であることが望ましい「力場」保護が結合層
の周囲に形成される。

【００４８】この系の１つのかなり有利な結果は、荷電
した結合物質はシグナル結合層に隣接する領域に高度に
濃縮され得るということである。例えば、個々の微細位
置が正に荷電され、残りの微細位置が負に荷電される
と、電気泳動的な力腺は正味負に荷電した結合物質を正
に荷電した微細位置方向へ輸送する。この方法では、装
置上のいかなる特異的な微細位置においても分析物質ま
たは反応物質を濃縮し、反応させるための方法を実施す
ることができる。特異的な結合物質を結合層に結合した
後、下層の微細電極は直流（DC）モードで機能し続ける
ことができる。この独自の特徴によって、溶液中で自由
で比較的希薄な荷電した分析物質または反応物質は、分
析物質または反応物質の分子と反対の電荷を維持してい
るいかなる特異的な微細位置においても連続的または平
行的に迅速に輸送、濃縮および反応することができる。
選択した微細位置における希薄な分析物質または反応物
質分子を濃縮するこのような能力はこれらの微細位置に
おける反応速度を大幅に加速する。

【００４９】望ましい反応が終了したら、電極はその電
位を逆転させることができ、それによって前の引力と反
対の方向に電気泳動力を生じる。この方法では、非特異
的分析物質または未反応分子が微細位置から移動され得
る。特異的な分析物質または反応産物はいかなる微細位
置からも放出され、さらに分析するために他の位置に輸
送され、他の位置指定可能位置で保存されるかまたは系
から完全に除去される。電場の逆転によるこのような材
料の除去または分解は、非特異的結合物質を除去するこ
とによって、系の識別能力を向上させる。現在反発的な
電気泳動力の量を結合層の非特異的結合材料に制御する
ことによって、電子的な緊縮の制御を達成することがで
きる。部分的にハイブリダイゼーションしたDNA配列を
除去するのに十分な電場を形成するために、電極の電位
を上昇して、それによって1つのミス対合したハイブリ
ダイゼーションの識別を可能にすることによって、点突
然変位を識別することができる。

【００５０】操作は種々の結合層において平行して、ま
たは連続して実施することができる。例えば、反応は、
最初は、示した電位を使用して第1の結合層で生じるこ
とができる。第1の電極の電位を逆転、すなわち負にす
ることができ、隣接する第2の電極を正にすることがで
きる。この方法では一連の反応が生ずる。第1の結合層
に特異的に結合しない材料は結合層への電気泳動力によ
って輸送されると思われる。この方法では、濃縮局面を
使用して、特異的な結合層において高濃度とし、次いで
正の電気泳動力に晒す。次に、濃縮された物質は隣接す
る、または他の結合層に移動することができる。また
は、電極から発し、結合層を通過してリサーバーに入る
正味電気泳動力場が存在するいう意味では、多数の結合
層を脱保護することができる。多数の結合層を脱保護す
ることによって、多数の反応が実施される。所定の結合
層によって位置指定される特定の環境が他の結合層を取
り巻く環境とは異なることがあるという点では、個々の
部位は各々、本質的に別個の生物学的な「試験管」とし
て作用することができる。

【００５１】一実施態様において、透過層はアビジンを
含有し、SDAプライマーの一方はビオチンを含有する。
増幅の後に、アンプリコンはアレイ上で電子的に位置指
定され、アビジンに結合する。次いで、標識した1つ以
上の検出プローブを添加し、アンプリコンとハイブリダ
イゼーションさせる。次いで、ハイブリダイゼーション
した検出プライマーの存在を検出する。第2の実施態様
において、1つ以上の捕獲プローブは増幅された拡散と
ハイブリダイゼーションするように設計される。各捕獲
プローブはビオチンを含有し、結合されるかまたは電子
的に位置指定され、透過層がアビジンを含有するアレイ
に結合される。次いで、アンプリコンはアレイ上で電子
的に位置指定され、捕獲プローブとハイブリダイゼーシ
ョンする。次いで、標識した1つ以上の検出プライマー
を添加して、アンプリコンとハイブリダイゼーションさ
せる。次いで、ハイブリダイゼーションした検出プロー
ブの存在を検出する。

【００５２】エレクトロニックマイクロアレイおよび関
連するシステムのさらなる詳細は、その開示内容が参照
として特に本明細書に組み入れられている、Hellerら
（1997、米国特許第5,605,662号；1997、米国特許第5,6
82,957号；1997、PCT出願国際公開公報第97/12030号）
およびSosnowskiら（1998、PCT出願国際公開公報第98/1
0273号）によって記載されている。

【００５３】また、いくつかのアッセイ形式を含む、SD
Aおよびエレクトロニックマイクロアレイを使用する方
法は、参照することにより本明細書に組み入れられてい
る本明細書と同時提出された、同時係属中の出願番号第
09/ （事務所整理番号第235/139号）に開示されて
いる。この出願に記載されている一実施態様では、1本
鎖捕獲プローブがアレイに電子的に沈着され、標的核酸
またはアンプリコンなどの1本鎖の荷電分子を捕獲する
作用をするサンドイッチアッセイが使用されている。核
酸捕獲プローブなどの多様な分子が異なるパッドのアレ
イに電子的に沈着されてもよい。標的分子またはアンプ
リコンと捕獲プローブのハイブリダイゼーションは、電
子的に実施されることが好ましい。捕獲部位に荷電分子
が捕獲されると、捕獲された分子は、捕獲された分子に
結合する標識されたレポータープローブによって検出す
ることができる。

【００５４】この出願に記載されている第2の実施態様
では、電子的な増幅がマイクロアレイ上で実施される。
この実施態様では、標的核酸は、捕獲部位に配置された
固定プライマーに近接して電子的に濃縮され、SDAまた
は他の増幅方法に使用される。電子的ハイブリダイゼー
ションを使用して、鋳型分子を固定されたSDAプライマ
ーにハイブリダイゼーションする。次いで、マイクロチ
ップを、鋳型および増幅プライマー以外のSDA成分を含
有するSDA反応混合物と共にインキュベーションする。
反応を停止した後、産物を変性し、標的核酸の存在を検
出するためにマイクロチップをレポータープローブとイ
ンキュベーションする。これらの実施態様は、（a）増
幅がエレクトロニックマイクロアレイ上で実施されてか
ら分析できる、または（b）増幅は溶液中で実施され、
次いで分析がエレクトロニックマイクロアレイ上で実施
できることを例示している。

【００５５】実施例以下の実施例は本明細書に記載する本発明の具体的な実
施態様を例示している。当業者に明らかであるように、
種々の変更および修正が可能であり、記載されている本
発明の範囲内であると考えられる。

【００５６】例1プライマースクリーニング表1に示す上流および下流増幅プライマーの対応による
全ての組み合わせを標的の増幅について試験した。増幅
反応は、C.ジェジュニ（C. jejuni）標的DNAの10 ⁶ゲノ
ム当量の存在下において実施した。増幅反応は、以下の
最終濃度の成分を含有する緩衝液中で52℃において実施
した。30〜40 mMリン酸カリウム（pH 7.6）、5〜9 %グ
リセロール、3〜7%ジメチルスルホキシド（DMSO）、5 m
M酢酸マグネシウム、700 ngのヒト胎盤DNA、10 μgの酢
酸化ウシ血清アルビミン、1.82%のトレハロース、0.36
mMのジチオスレイトール、500 nMのtSDAプライマー、50
nMのSDAバンパープライマー、0.25 mMのdUTP、0.7 mM
の2'-デオキシシチジン 5'-O-（1-チオトリホスフェー
ト）、0.1 mMのdATP、0.1 mMのdGTPおよび約640単位のB
soBIおよび40単位のBstポリメラーゼ。

【００５７】簡単に説明すると、95℃において5分間標
的DNAを変性し、室温に冷却してから、プライマーおよ
びバンパーを含有する緩衝液に添加する。インキュベー
ションは室温において20分間持続し、次に偽プライミン
グの可能性を最小にするために、インキュベーションを
70℃において10分間実施した。次いで、増幅酵素を含有
するマイクロタイターウェルに一定容量のプライミング
混合物を移すことによって52℃において増幅を開始し
た。増幅は52℃の一定温度において1時間実施した。P³²
標識検出配列である配列番号１０を用いてプライマーを
伸長し、8%変性性ポリアクリルアミドゲル中に溶解して
から、オートラジオグラフィーによって増幅産物を検出
した。試験した9つのプライマー組み合わせ全てで特異
的な増幅産物が検出された。

【００５８】例2分析感度の判定上記の例1に記載するように、増幅プライマー配列番号1
と配列番号４、配列番号１と配列番号５および配列番号
２と配列番号５を用いてSDAを実施した。反応あたり0、
10²、10³、10⁴または10⁵ゲノム当量の標的DNAを加え
た。10²標的の分析感度が得られた。

【００５９】例3プライマー特異性の評価例1に記載する配列番号１、配列番号５、配列番号７お
よび配列番号８を使用し、30 mM リン酸カリウム、9%グ
リセロールおよび3% DMSOを用いてプライマーの特異性
を評価した。34株のC.ジェジュニ（C. jejuni）および
C.コリ（C. coli）を反応あたり10⁵ゲノム当量で試験し
た（表2）。34株全てが算出した特異性100%に対して正
の結果を示した。

【００６０】

【表２】

【００６１】例4交差反応の評価例3に記載するプライマーおよび反応条件を使用して交
差反応を評価した。C.ジェジュニ（C. jejuni）および
C.コリ（C. coli）以外の生物は、反応あたり10 ⁷ゲノム
当量で試験した。試験した20種の生物全てで陰性の結果
が得られた（表3）。全ての場合において、10⁴コピーの
C.ジェジュニ（C. jejuni）標的DNAを反応物中に接種す
ると、特異的な産物が得られた。これは増幅阻害がない
ことを示す。

【００６２】

【表３】

【００６３】例5エレクトリックマイクロアレイ分析マイクロエレクトリックアレイ集成物は以前に記載され
ている。R. G. Sosnowskiら、1997、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 94: 119-123）捕獲プローブ、アンプリコン
または検出プローブの電子標的化は別の文献に報告され
ている条件を使用した（R. G. Sosnowskiら、1997、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 94: 119-123； C. F. Edman
ら、1997、Nucl. Acids Res. 25: 4907-4914）。マイク
ロエレクトロニックアレイ集成物の透過層は、有利なこ
とに、アビジンを含有する。簡単に説明すると、捕獲プ
ローブはマイクロエレクトロニックアレイ上で電子的に
位置指定される。粗増幅反応物は蒸留水で予め平衡にし
たG6カラム（バイオラッド（Biorad）、カリフォルニア
州ヘルクルス）で2分間スピン（spin）させるか、また
はマルチウェルプレート（ミリポア（Millipore）、マ
サチューセッツ州ベッドフォード）で蒸留水に対して5
時間以上透析する。次いで、調製した試料を100 mMヒス
チジンと1:1の比で混合し、95℃において5分間加熱して
から、電子的に位置指定する。検出のために、蛍光標識
オリゴヌクレオチド（検出プローブ）を6×SSCに添加
し、室温で30分間ハイブリダイゼーションさせる。次い
で、アレイを0.1×STE/1%SDSで洗浄し、次に1×STEで洗
浄する。次いで、検出プローブの存在を検出する。

【００６４】本発明はいくつかの具体例を用いて記載さ
れているが、当業者に明らかな修正を本発明の範囲から
逸脱することなく実施することができる。本発明の種々
の特徴は以下の請求の範囲に記載されている。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> McMillian, Ray A. Fort, Thomas L. Hellyer, Tobin J. You, Qimin <120> Amplification and Detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli. <130> C. jejuni and C. coli Application <140> JP P2000-110098 <141> J2000-04-12 <150> US 09/289,747 <151> 1999-04-12 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer for SDA of C. jejuni and C. coli <400> 1 cgattccgct ccagacttct cgggcaggat ggttttggtt 40 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer for SDA of C. jejuni and C. coli <400> 2 cgattccgct ccagacttct cgggcaggat ggttttggt 39 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer for SDA of C. jejuni and C. coli <400> 3 cgattccgct ccagacttct cgggcaggat ggttttgg 38 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer for SDA of C. jejuni and C. coli <400> 4 accgcatcga atgcatgtct cggggaagta cctacaaatt ct 42 <210> 5 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer for SDA of C. jejuni and C. coli <400> 5 accgcatcga atgcatgtct cgggaagtac ctacaaattc t 41 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer for SDA of C. jejuni and C. coli <400> 6 accgcatcga atgcatgtct cgggagtacc tacaaattct 40 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Bumper for SDA for C. jejuni and C. coli <400> 7 acaggagttt ttggtt 16 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Bumper for SDA for C. jejuni and C. coli <400> 8 aataggtgta gctgc 15 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Detector Probe for SDA for C. jejuni and C. coli <400> 9 ggttagttta taatact 17 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Detector Probe for SDA for C. jejuni and C. coli <400> 10 ctagtttttg atttttagt 19

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (71)出願人 595117091 １ＢＥＣＴＯＮＤＲＩＶＥ，ＦＲＡＮＫＬＩＮＬＡＫＥＳ，ＮＥＷＪＥＲＳＥＹ 07417−1880，ＵＮＩＴＥＤＳＴＡＴＥＳＯＦＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者トーマス・エル・フォートアメリカ合衆国メリーランド州21048，フィンクスバーグ，リッジ・ロード 987 (72)発明者キミン・ユーアメリカ合衆国メリーランド州21093，ルーサーヴィル，キャヴァン・ドライヴ 15

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 AL46（配列番号1）、AL44（配列番号
2）、AL42（配列番号3）、AR48（配列番号4）、AR44
（配列番号5）およびAR42（配列番号6）の標的結合配列
からなる群から選択される標的結合配列と、任意選択に
より、増幅反応に必要な配列とからなるオリゴヌクレオ
チド。
【請求項２】増幅反応に必要な配列が、鎖置換増幅中
に制限エンドヌクレアーゼによってニックが入れられる
制限エンドヌクレアーゼ認識部位である請求項１に記載
のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】 BL42（配列番号7）またはBR42（配列番
号8）からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項４】 DL52（配列番号9）、配列番号9に相補的
な核酸、DR48（配列番号10）および配列番号10に相補的
な核酸からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド。
【請求項５】 a）AL46（配列番号1）、AL44（配列番号
2）およびAL42（配列番号3）からなる群から選択される
1種以上のプライマーと、 b）AR48（配列番号4）、AR44（配列番号5）およびAR42
（配列番号6）からなる群から選択される1種以上のプラ
イマーと、 c）バンパーであるBL42（配列番号7）およびBR42（配列
番号8）と、 d）DL52（配列番号9）、配列番号9に相補的な核酸、DR4
8（配列番号10）および配列番号10に相補的な核酸から
なる群から選択される1種以上の検出用配列とを含んで
なるキット。
【請求項６】試料中のC.ジェジュニ（C. jejuni）ま
たはC.コリ（C. coli）の存在の有無を検出するための
方法であって、 a）核酸増幅反応において一対の核酸プライマーを使用
して前記試料を処理するステップであって、第1のプラ
イマーがAL46（配列番号1）、AL44（配列番号2）および
AL42（配列番号3）からなる群から選択され、第2のプラ
イマーがAR48（配列番号4）、AR44（配列番号5）および
AR42（配列番号6）からなる群から選択されるステップ
と、 b）増幅された任意の核酸産物を検出するステップとを
含み、増幅された産物の検出がC.ジェジュニ（C. jejun
i）およびC.コリ（C.coli）の存在を示す方法。
【請求項７】増幅された前記核酸産物を検出するステ
ップが、増幅された前記核酸産物をDL52（配列番号
9）、配列番号9に相補的な核酸、DR48（配列番号10）お
よび配列番号10に相補的な核酸からなる群から選択され
る検出用配列とハイブリダイゼーションすることによっ
て実施される請求項6に記載の方法。
【請求項８】増幅反応、検出、または増幅反応および
検出の両方がエレクトロニックマイクロアレイを使用す
る請求項6に記載の方法。
【請求項９】 C.ジェジュニ（C. jejuni）およびC.コ
リ（C. coli）の標的核酸配列を増幅するための方法で
あって、 a）i）AL46（配列番号1）、AL44（配列番号2）およびAL
42（配列番号3）の標的結合配列からなる群から選択さ
れる標的結合配列と、任意選択により、増幅反応に必要
な配列とからなる群から選択される第1の増幅プライマ
ーと、 ii）AR48（配列番号4）、AR44（配列番号5）およびAR42
（配列番号6）の標的結合配列からなる群から選択され
る標的結合配列と、任意選択により、増幅反応に必要な
配列とからなる第2の増幅プライマーとを核酸にハイブ
リダイゼーションするステップと、 b）ハイブリダイゼーションした第1および第2の増幅プ
ライマーを標的核酸配列に伸長させることによって、標
的核酸配列を増幅するステップとを含む方法。
【請求項１０】検出プローブにハイブリダイゼーショ
ンすることによって増幅した標的核酸を検出するステッ
プをさらに含む請求項9に記載の方法。
【請求項１１】検出プローブが、検出可能な標識で標
識したDL52（配列番号9）またはDR48（配列番号10）か
らなる請求項10に記載の方法。
【請求項１２】増幅反応、検出、または増幅反応およ
び検出の両方がエレクトロニックマイクロアレイを使用
する請求項10に記載の方法。