CN100342033C

CN100342033C - 一种检测空肠弯曲菌的方法

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Publication number: CN100342033C
Application number: CNB2004100510814A
Authority: CN
Inventors: 刘光明; 韩雅莉; 章跃陵
Original assignee: Shantou University
Current assignee: Shantou University
Priority date: 2004-08-13
Filing date: 2004-08-13
Publication date: 2007-10-10
Anticipated expiration: 2024-08-13
Also published as: CN1598544A

Abstract

本发明涉及空肠弯曲菌的荧光PCR检测，提供一种空肠弯曲菌的实时荧光PCR检测方法，应用抗血清和磁性微珠制备空肠弯曲菌免疫磁珠，利用免疫磁珠直接捕获检样中的空肠弯曲菌，煮沸法提取空肠弯曲菌的DNA，设计合成用于扩增空肠弯曲菌鞭毛蛋白A(flaA)基因的引物与探针和/或空肠弯曲菌的马尿酸酶(hipO)基因的引物与探针，通过荧光PCR技术检测得到扩增产物的荧光信号；其中flaA基因的引物序列为flaA1：5’-ctgaatttgataccttaagtgcagc-3’/flaA2：5’-aggcacgcctaaacctatagct-3’，探针序列为5’-tgtgaaagaatttatcctaaagatgagcaaggaga-3’；hipO基因引物序列为hipO1：5’-tgcttctttacttgttgtggcttt-3’/hipO2：5’-gctcctatgcttacaactgctgaatt-3’，探针序列为5’-caaagcatagtatctcgcaatgttgatcccc-3’，本发明为畜禽等食品中的空肠弯曲菌的检测提供快捷方法。

Description

一种检测空肠弯曲菌的方法

技术领域

本发明涉及细菌的基因检测，特别涉及空肠弯曲菌的检测。

背景技术

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是近十几年来被认识的世界范围广泛流行的人兽共患病原菌。鸟、禽、狗、牛、猪等动物是该菌的贮存宿主，其中猪带菌率为30％，奶牛带菌率为10.7％，鸡带菌率高达60％～95％。该菌可引起牛和绵羊流产，火鸡肝炎和蓝冠病，重子鸡和雏鸡坏死性肝炎，以及雏鸡、犊牛和仔猪腹泻等多种疾病。空肠弯曲菌可以通过动物、鸟和患病者的粪便进入环境中，由于该菌对环境较敏感，所以不可能在宿主外存活时间太长，但在水中可以进入一种称为“非可培养状态”(Viable butnon-culturerable，VNC)的休眠期。在条件适宜时，VNC状态的空肠弯曲菌可增殖生长，通过环境及食物链进入人体。接触畜禽类，或食入受到污染的禽制品、水源和牛奶是该菌感染人体的主要媒介。

空肠弯曲菌可引起人体急性肠炎和食物中毒，并引发格林-巴利综合症、反应性关节炎、瑞特氏病和肝炎等严重的并发症。世界卫生组织已将该病列为最常见的食源性传染病之一，并指出必须加强监测各地区空肠弯曲菌在动物和人体中的分布，减少或切断主要传染家禽、家畜及其制品对人体的传播。

建立空肠弯曲菌快速而特异性的分离和检测方法，是有效控制和预防该类“正在发展的食源性病原菌”的关键所在。面对复杂多样的实物样品时，传统的分离鉴定方法需要耗费大量的时间和人力，而且存在敏感性低、难以检测VNC状态的空肠弯曲菌和易出现假阴性结果等问题，这将严重制约对该菌的快速准确检测，因此迫切要求新的检测技术能有效的改变这一状况。

发明内容

本发明旨在提供一种空肠弯曲菌的实时荧光PCR检测方法。该方法利用抗弯曲菌免疫磁珠直接捕获检样中的目的菌，通过荧光PCR技术分别检测空肠弯曲菌特定的基因，从而达到准确、快速、灵敏检测畜禽类食品中空肠弯曲菌的目的。

实现本发明方法的技术方案是：应用抗血清和磁性微珠制备空肠弯曲菌免疫磁珠，利用免疫磁珠直接捕获检样中的空肠弯曲菌；煮沸法提取空肠弯曲菌的DNA，设计合成用于扩增空肠弯曲菌鞭毛蛋白A(flaA)基因的引物与探针和/或空肠弯曲菌的马尿酸酶(hipO)基因的引物与探针，通过荧光PCR技术检测得到荧光信号或扩增产物。

其中flaA基因的引物序列为flaA1：5’-ctgaatttgataccttaagtgcagc-3’及flaA2：5’-aggcacgcctaaacctatagct-3’，探针为5’-tgtgaaagaatttatcctaaagatgagcaaggaga-3’；hipO基因的引物序列为hipO1：5’-tgcttctttacttgttgtggcttt-3’及hipO2：5’-gctcctatgcttacaactgctgaatt-3’，探针为5’-caaagcatagtatctcgcaatgttgatcccc-3’，所有探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团，二者可构成能量传递结构。本发明的优点是：(1)利用免疫磁珠捕获技术可快速收集、浓缩检样中的目的菌，简便、特异、安全的免疫磁珠法也为分离受损伤或处于VNC状态的空肠弯曲菌提供了一种有效手段，这也是常规培养分离方法所不及的。(2)实时荧光PCR使PCR扩增与产物分析的全过程在单管封闭条件下进行，实现了对PCR扩增及产物分析的实时监控和自动化操作，无须电泳步骤，避免了交叉污染和假阳性结果。而且实时荧光PCR增加了荧光标记探针与目标序列的杂交步骤，因而专一性更高、结果更准确。(3)免疫磁珠捕获结合实时荧光PCR检测方法，更显示出优越性。免疫磁珠直接分离检样中的靶细菌，除去了PCR抑制物质，提高了畜禽类食品中空肠弯曲菌的检出率和灵敏度；荧光PCR特异性地扩增空肠弯曲菌flaA基因和hipO基因，免疫磁珠吸附的其它杂菌不会干扰PCR结果，解决了亲缘关系很近的空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的鉴别难题。

附图说明

图1为flaA引物及荧光探针的实时PCR特异性试验结果。其中各条曲线表示：1.空肠弯曲菌ATCC33560，Ct＝23.248；2.空肠弯曲菌ATCC8341，Ct＝27.147；3.空肠弯曲菌XMIQ030516，Ct＝29.196；4.灭菌超纯水，Ct＝40.00；5.埃希氏大肠杆菌，Ct＝40.00；6.鼠伤寒沙门氏菌，Ct＝40.00；7.结肠弯曲菌，Ct＝40.00；8.单核细胞增生李斯特菌，Ct＝40.00；9.宋氏志贺氏菌，Ct＝40.00。

图2为hipO引物及荧光探针的实时PCR特异性试验结果。其中各条曲线表示：1.空肠弯曲菌ATCC33560，Ct＝21.344；2.空肠弯曲菌ATCC8341，Ct＝16.348；3.空肠弯曲菌XMIQ030516，Ct＝16.147；4.空肠弯曲菌XMIQ030827，Ct＝22.796；5.灭菌超纯水，Ct＝40.00；6.埃希氏大肠杆菌，Ct＝40.00；7.结肠弯曲菌，Ct＝40.00。

图3为磁捕获-荧光PCR检测混合菌结果。其中各条曲线表示：1.hipO引物及探针的PCR扩增，Ct＝18.766；2.flaA引物及探针的PCR扩增，Ct＝22.038；3.灭菌超纯水，Ct＝40.00。

图4为磁捕获-荧光PCR(hipO引物及探针)检测实物样品结果。其中各条曲线表示：1.实物样品-3，Ct＝17.432；2.实物样品-5，Ct＝19.021；3.空肠弯曲菌ATCC33560，Ct＝19.011；4.结肠弯曲菌，Ct＝40.000。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明首先是用抗弯曲菌免疫磁珠直接捕获检样中的空肠弯曲菌，磁捕获方法分离空肠弯曲菌特异性高且时间短。磁捕获方法分离空肠弯曲菌采用以下步骤：

1.免疫磁珠的制备：取磁珠液于磷酸缓冲液(PBST)中，混匀，2000～5000rpm离心2～5min，弃液体；重复清洗2～3次后，加入PBST使磁珠重悬其中；加入弯曲菌免疫血清，4℃轻缓旋转振荡15～25h；同上清洗3～5次后，加入PBST使磁珠重悬其中，制备的免疫磁珠悬液于4℃保存备用。

2.空肠弯曲菌的捕获：无菌操作取检样至蛋白胨水中，轻缓振荡20～30min；取检样上清液于2000～3000rpm离心2～5min，上清液再次于3000～5000rpm离心15～30min，弃液体，沉淀重悬于PBST中；取检样悬液于装有免疫磁珠悬液的小管中，室温轻缓旋转振荡20～30min；将小管置于磁场旁1～3min，小心移出管中液体；加入PBST混匀，置于磁架或磁场旁3min，移出液体；重复清洗3～5次，加入灭菌超纯水使吸附弯曲菌的磁珠重悬其中。取弯曲菌磁珠悬液，100℃水浴10min，3000～5000rpm离心5～10min，即可获得空肠弯曲菌。

设计用于检测空肠弯曲菌的两组引物与探针。第一组探针针对flaA基因，其引物为flaA1：5’-ctgaatttgataccttaagtgcagc-3’和flaA2：5’-aggcacgcctaaacctatagct-3’，探针为5’-tgtgaaagaatttatcctaaagatgagcaaggaga-3’；第二组针对hipO基因，其引物为hipO1：5’-tgcttctttacttgttgtggcttt-3’和hipO2：5’-gctcctatgcttacaactgctgaatt-3’，探针为5’-caaagcatagtatctcgcaatgttgatcccc-3’。所有探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团，二者可构成能量传递结构。

3.DNA扩增及实时荧光PCR检测。荧光PCR扩增反应体系含有：10×PCR缓冲液，MgCl₂，dNTP(dATP，dGTP，dCTP，dUTP)，flaA基因引物和/或hipO基因引物，TaqMan探针，DNA糖基化酶(UNG酶)，DNA聚合酶(Taq酶)，细菌DNA模板，灭菌超纯水。扩增或检测时可单独针对flaA基因，也可单独针对hipO基因，也可同时扩增或检测两个基因，即要扩增或检测某个基因，就加入相应的引物及探针。荧光PCR扩增反应条件为50℃/2min，预变性95℃/10min；而后95℃/15s，55℃/60s，共40个循环，不同仪器应将反应参数作适当调整。检测时可设立阳性对照如：空肠弯曲菌ATCC33560，阴性对照如：结肠弯曲菌和灭菌超纯水的空白对照。反应结束后，打开分析软件，仪器自动给出每个检样的循环阀值(Ct值)，依据所得Ct值对检样进行结果判定。

具体实施方式

免疫磁珠的制备与空肠弯曲菌DNA的获取

取0.1mL磁珠液(Dynal公司生产的Dynabeads M-280 Sheep anti-Rabbit lgG)于1.0mL PBST缓冲液中，混匀，3000rpm离心2min，弃液体；重复清洗2～3次后，加入1.0mL PBST缓冲液使磁珠重悬其中；加入0.1mL弯曲菌免疫血清，4℃轻缓旋转振荡18h；用1.0mL PBST缓冲液清洗3～5次后，加入0.5mL PBST缓冲液使磁珠重悬其中，制备的免疫磁珠悬液于4℃保存备用。无菌操作取检样至50mL蛋白胨水中，轻缓振荡30min；取检样上清液于3000rpm离心2min，上清液再次于5000rpm离心20min，弃液体，沉淀重悬于1.0mL PBST缓冲液中；取检样悬液于装有0.1mL免疫磁珠悬液的小管中，室温轻缓旋转振荡30min；将小管置于Dynal MPC-S磁架上3min，小心移出管中液体；加入1.0mL PBST缓冲液混匀，置于磁架上3min，移出洗液；重复清洗3～5次，加入0.1mL PBST缓冲液使吸附弯曲菌的磁珠重悬其中。取50μL弯曲菌磁珠悬液于0.5mL离心管中，100℃水浴10min，5000rpm离心5min，上清液于-20℃条件下保存备用。

设计用于检测空肠弯曲菌的两组引物与探针。第一组探针针对flaA基因，其引物为flaA1：5’-ctgaatttgataccttaagtgcagc-3’和flaA2：5’-aggcacgcctaaacctatagct-3’，探针为5’-tgtgaaagaatttatcctaaagatgagcaaggaga-3’；第二组针对hipO基因，其引物为hipO1：5’-tgcttctttacttgttgtggcttt-3’和hipO2：5’-gctcctatgcttacaactgctgaatt-3’，探针为5’caaagcatagtatctcgcaatgttgatcccc-3’。

实施例1

扩增及检测空肠弯曲菌flaA基因的实时荧光PCR

取空肠弯曲菌ATCC33560、空肠弯曲菌ATCC8341、空肠弯曲菌XMIQ030516、埃希氏大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、结肠弯曲菌、单核细胞增生李斯特菌、宋氏志贺氏菌的DNA及灭菌超纯水各2μL，取合成的flaA引物1/2及探针各0.2μL，按照前述的步骤3“DNA扩增及实时荧光PCR检测”中的反应体系及条件进行扩增及检测试验，结果如图1所示，多份空肠弯曲菌DNA均显示阳性结果(图1中曲线1～3)；而其它菌株DNA均显示阴性结果，其中包括属内同源程度极高的结肠弯曲菌(图1中曲线7)。结果表明，flaA引物及荧光探针对空肠弯曲菌检测特异性高，能有效地鉴别空肠弯曲菌和结肠弯曲菌。

实施例2

用于检测空肠弯曲菌hipO基因的实时荧光PCR

取空肠弯曲菌ATCC33560、空肠弯曲菌ATCC8341、空肠弯曲菌XMIQ030516、空肠弯曲菌XMIQ030827、埃希氏大肠杆菌、结肠弯曲菌DNA及灭菌超纯水各2μL，取合成的hipO引物1/2及探针各0.2μL，按照前述的步骤3“DNA扩增及实时荧光PCR检测”中的反应体系及条件进行扩增及检测试验，结果如图2所示，多份空肠弯曲菌DNA均显示阳性结果(图2中曲线1～4)；而其它菌株DNA均显示阴性结果，其中包括属内同源程度极高的结肠弯曲菌(图2中曲线6)。结果表明，hipO基因引物及荧光探针对空肠弯曲菌检测特异性高，能有效地鉴别空肠弯曲菌和结肠弯曲菌。

实施例3

磁捕获-荧光PCR检测混合菌

由于实际检样中可能同时带有多种细菌，本实施例对多种混合菌进行实验，针对含有单核细胞增生李斯特菌、绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、宋氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、腊样芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血性弧菌、豚鼠气单胞菌、溶藻弧菌、绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、埃希氏大肠杆菌、结肠弯曲菌和空肠弯曲菌ATCC33560等16种细菌的混合样品，细菌磁捕获及DNA提取方法按照实施例1进行，采用实施例2和3的步骤检测空肠弯曲菌的flaA及hipO基因，结果如图3所示，磁捕获-荧光PCR检测方法能抵抗其它细菌干扰，从含有混合菌的样品中检出空肠弯曲菌，排除了包括结肠弯曲菌在内的多种细菌干扰，显示出良好的特异性和抗干扰性，具有实际的应用价值。

实施例4

磁捕获-荧光PCR方法检测实物样品

采集畜禽类实物样品，弯曲菌的磁捕获及DNA提取方法按照前述的步骤进行，本实施例只检测空肠弯曲菌的hipO基因，hipO引物和探针的设计合成及hipO基因的荧光PCR检测与实施例3相同，从27份实物样品中检出2份样品含有空肠弯曲菌，结果显示见图4。

本方法利用抗弯曲菌免疫磁珠直接捕获检样中的目的菌，磁珠捕获的细菌进行DNA抽提；通过荧光PCR技术分别检测空肠弯曲菌的鞭毛蛋白A(flaA)基因和马尿酸酶(hipO)基因。本方法采用的磁捕获结合荧光PCR技术，提高了畜禽类食品中空肠弯曲菌的检出率和灵敏度，解决了亲缘关系很近的空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的鉴别难题，达到了准确、快速、灵敏的要求。

Claims

1、一种检测空肠弯曲菌的方法，利用抗弯曲菌免疫磁珠直接捕获检样中的目的菌，磁珠捕获的细菌进行DNA抽提及荧光PCR检测，其特征在于：设计合成用于扩增空肠弯曲菌鞭毛蛋白A基因的引物与探针和马尿酸酶基因的引物与探针，通过荧光PCR技术检测得到相应的荧光信号或扩增产物，其中鞭毛蛋白A基因的引物序列为1：

5’-ctgaatttgataccttaagtgcagc-3’和2：5’-aggcacgcctaaacctatagct-3’，探针序列为

5’-tgtgaaagaatttatcctaaagatgagcaaggaga-3’；马尿酸酶基因引物序列为1：

5’-tgcttctttacttgttgtggcttt-3’和2：5’-gctcctatgcttacaactgctgaatt-3’，探针序列为5’-caaagcatagtatctcgcaatgttgatcccc-3’，所有探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团，二者可构成能量传递结构。