CN102426233B - 液相芯片检测空肠弯曲菌的方法 - Google Patents

液相芯片检测空肠弯曲菌的方法 Download PDF

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Abstract

一种液相芯片检测空肠弯曲菌的方法，属于免疫技术及食品卫生检测技术领域。本发明的目的是提供一种运用液相芯片技术，提供一种用于检测空肠弯曲菌的方法，以便实现对空肠弯曲菌的快速检测。本发明制备了液相芯片，然后应用液相芯片检测空肠弯曲菌。本发明应用液相芯片检测空肠弯曲菌与其它几种检测方法相比，优势在于检测样品数量和检测项目的双向高通量（可同时对大量样品进行多达96个项目的检测）且具有灵活性好、灵敏度高、信噪比好、操作简便、标准曲线范围宽和应用范围广等特点，液相芯片技术作为生物信息学先进的操作平台，在临床诊断、兽医传染病诊断、食品微生物检测等领域具有广阔的应用前景。实现对空肠弯曲菌的快速检测，为食品安全做出贡献。

Description

液相芯片检测空肠弯曲菌的方法
技术领域
本发明属于免疫技术及食品卫生检测技术领域。
背景技术
空肠弯曲菌是80年代起受到国内外广泛重视的人畜共同感染的病原菌，可以引起人和动物发生多种疾病，被认为是引起全世界人类细菌性腹泻的主要病原菌，对人的感染率不亚于沙门氏菌和志贺氏菌，是一种重要的食源性病原菌。传染源主要是动物及其污染的食品，弯曲菌属广泛散布在各种动物体内，其中以家禽、野禽和家畜带菌最多，其次在啮齿类动物也分离出过弯曲菌。目前对于食品中空肠弯曲菌的检测方法（无论是经典方法，还是分子生物学方法、免疫学方法等）的方法都存在操作繁琐，需要时间较长的特点，而且一次只能检一种菌。
发明内容
本发明的目的是提供一种运用液相芯片技术，用于检测空肠弯曲菌的方法，以便实现对空肠弯曲菌的快速检测。
本发明液相芯片由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素-藻红蛋白组成，所述微球为羧基化的35号微球；所述捕获抗体是空肠弯曲菌单克隆抗体，所述检测抗体是空肠弯曲菌的多克隆抗体，生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔IgG；所述捕获抗体和检测抗体均能特异与空肠弯曲菌结合，以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光，以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白，测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球型基质上结合空肠弯曲菌的数量；
液相芯片的制备：捕获抗体与微球偶联形成偶联体
取微球原液室温恢复30min，用超声波清洗机进行超声10min，漩涡震荡30s，使微球均匀分布，用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS，然后取200μl 的微球原液置于1.5ml的离心管中，14000 rpm，离心5min，取出后弃上清，加入NHS和EDC各10μl，再加入80μl的活化缓冲液，混匀后，用铝箔纸包好，置于37℃摇床120 rpm，20min，然后14000 rpm，离心5min，小心移去上清，加入500μl稀释至250μg/ml的捕获抗体，重悬混匀，置于37℃摇床120 rpm，孵育2h，取出后离心弃上清，用500μl的PBS进行洗涤，洗涤后加入500μl 1％BSA的 PBS溶液，重悬微球，37℃水浴摇床孵育两个小时进行封闭，封闭后4℃保存；
液相芯片检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法
将已偶联的微球混合液室温恢复10min，漩涡振荡器震荡约3min，取约5000个微球，加入108 CFU/ml 的空肠弯曲菌10μl，用PBS-TBN补足到100μl，置于37℃摇床120rpm，1h，取出后离心弃上清，用200μl PBS-TBN洗两次，加入已稀释的检测抗体10μl，用PBS-TBN补足到100μl，置于37℃摇床120rpm，1h，取出后离心，弃上清，用PBS-TBN洗两次，然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG 10μl，用PBS-TBN补足到100μl，置于37℃摇床反应1h，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗两次，再加入SA-PE，用PBS-TBN补足到100μl，置于37℃摇床反应，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗涤两次，重悬于100μl PBS-TBN中，上机进行检测。
本发明应用液相芯片检测空肠弯曲菌与其它几种检测方法相比，优势在于检测样品数量和检测项目的双向高通量（可同时对大量样品进行多达96个项目的检测）且具有灵活性好、灵敏度高、信噪比好、操作简便、标准曲线范围宽和应用范围广等特点，液相芯片技术作为生物信息学先进的操作平台，在临床诊断、兽医传染病诊断、食品微生物检测等领域具有广阔的应用前景。实现对空肠弯曲菌的快速检测，为食品安全做出贡献。
附图说明
图1是本发明捕获抗体最佳工作浓度；
图2是本发明灵敏度检测结果；
图3是本发明特异性的检测结果；
图4是本发明重复性检测结果。
具体实施方式
本发明所采用的技术方案是：通过空肠弯曲菌的特异抗体，与微球进行偶联后，制备出可以对空肠弯曲菌进行检测的液相芯片，在应用时，加入样品增菌液，使增菌液中的空肠弯曲菌被微球上的捕获抗体所捕获，检测抗体也与空肠弯曲菌结合后，再与生物素标记的抗抗体共同孵育，然后通过生物素与链霉亲和素-藻红蛋白反应，应用Luminex100检测系统实现对空肠弯曲菌的特异检测。
本发明涉及的检测空肠弯曲菌液相芯片主要由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE）组成。其特征是，所述微球为羧基化的35号微球；所述捕获抗体是空肠弯曲菌的单克隆抗体（Ca.j mAb），所述检测抗体是空肠弯曲菌的多克隆抗体（Ca.j pAb），生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔IgG(biotin-羊抗兔IgG)；所述捕获抗体和检测抗体均能特异与空肠弯曲菌结合。以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光，以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白，测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球型基质上结合空肠弯曲菌的数量。
上述的检测抗体是用于识别空肠弯曲菌的另一类抗体，其作用是将与液相芯片上捕获抗体结合的空肠弯曲菌与抗抗体结合，而抗抗体能与检测荧光偶联，间接将结合的空肠弯曲菌浓度与检测荧光的强度结合起来，从而实现对空肠弯曲菌的浓度进行定量测定。生物素标记的抗抗体通过生物素与链霉亲和素-藻红蛋白结合，最后通过Luminex100检测系统对空肠弯曲菌进行定性定量检测。
（1）捕获抗体与微球偶联形成偶联体
取微球原液室温恢复30min，用超声波清洗机进行超声10min，漩涡震荡30s，使微球均匀分布。用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS。然后取200μl 的微球原液置于1.5ml的离心管中，14000 rpm，离心5min。取出后弃上清，加入NHS和EDC各10μl，再加入80μl的活化缓冲液。混匀后，用铝箔纸包好，置于37℃摇床120 rpm，20min，然后14000 rpm，离心5min，小心移去上清。加入500μl稀释至250μg/ml的捕获抗体，重悬混匀，置于37℃摇床120 rpm，孵育2h。取出后离心弃上清，用500μl的PBS进行洗涤，洗涤后加入500μl 1％BSA的 PBS溶液，重悬微球，37℃水浴摇床孵育两个小时进行封闭。封闭后4℃保存。
（2）应用液相芯片检测空肠弯曲菌的方法
将已偶联的微球混合液室温恢复10min，漩涡振荡器震荡约3min。取约5000个微球，加入108 CFU/ml 的空肠弯曲菌10μl，用PBS-TBN补足到100μl。置于37℃摇床120rpm，1h。取出后离心弃上清，用200μl PBS-TBN洗两次。加入已稀释的检测抗体10μl，用PBS-TBN补足到100μl。 置于37℃摇床120rpm，1h。取出后离心，弃上清，用PBS-TBN洗两次。然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG 10μl，用PBS-TBN补足到100μl。 置于37℃摇床反应1h。取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗两次。再加入SA-PE，用PBS-TBN补足到100μl，置于37℃摇床反应，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗涤两次。重悬于100μl PBS-TBN中，上机进行检测。
1.捕获抗体最佳工作浓度的确定
当单抗浓度为250μg/ml时，其MFI值达到最大，故单抗最佳的工作浓度为250μg/ml（见图1）。
2．偶联是否成功的检测
Figure 446102DEST_PATH_IMAGE002
由上述结果可知单抗与微球偶联效果很好，且封闭效果也良好。
3. 正交实验结果—确定反应较优条件
Figure 425560DEST_PATH_IMAGE003
 根据上述结果可知实验条件A1B1C5D5为较优实验条件，即多抗工作浓度为1:100，生物素标记的羊抗兔IgG工作浓度为1:500，SA-PE的工作浓度为10μg/ml,生物素标记的抗体与SA-PE反应时间为90min。
4. 灵敏度检测结果
由图2可以看出，由上述图可以看出，在菌的浓度达到103CFU/ml时仍可被检出。因此本方法的灵敏度较高，可达到103CFU/ml。
5.特异性的检测结果
用已建立的方法检测空肠弯曲杆菌从图3中可看出此方法特异性良好，与其它的菌无交叉反应。
6. 重复性试验
在1d，5，d，7d用此方法分别检测阳性菌和阴性菌，由图4可见阳性菌，阴性菌MFI值上下浮动都不大，可证明本方法重复性较好。
7. 实际样品添加的检测结果
Figure 18346DEST_PATH_IMAGE004
分别在绿豆和兔肉中添加空弯菌，沙门氏菌，并做空白对照，由上表可见在添加了实际样品后应用本方法仍可将空弯菌检出。

Claims (1)

1.一种液相芯片检测空肠弯曲菌的方法，其特征在于：液相芯片由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素-藻红蛋白组成，所述微球为羧基化的35号微球；所述捕获抗体是空肠弯曲菌单克隆抗体，所述检测抗体是空肠弯曲菌的多克隆抗体，生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔IgG；所述捕获抗体和检测抗体均能特异与空肠弯曲菌结合，以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光，以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白，测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球型基质上结合空肠弯曲菌的数量；
液相芯片的制备：捕获抗体与微球偶联形成偶联体
取微球原液室温恢复30min，用超声波清洗机进行超声10min，漩涡震荡30s，使微球均匀分布，用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS，然后取200μl 的微球原液置于1.5ml的离心管中，14000 rpm，离心5min，取出后弃上清，加入NHS和EDC各10μl，再加入80μl的活化缓冲液，混匀后，用铝箔纸包好，置于37℃摇床120 rpm，20min，然后14000 rpm，离心5min，小心移去上清，加入500μl稀释至250μg/ml的捕获抗体，重悬混匀，置于37℃摇床120 rpm，孵育2h，取出后离心弃上清，用500μl的PBS进行洗涤，洗涤后加入500μl 1％BSA的 PBS溶液，重悬微球，37℃水浴摇床孵育两个小时进行封闭，封闭后4℃保存；
液相芯片检测空肠弯曲菌的方法
将已偶联的微球混合液室温恢复10min，漩涡振荡器震荡约3min，取约5000个微球，加入108 CFU/ml 的空肠弯曲菌10μl，用PBS-TBN补足到100μl，置于37℃摇床120rpm，1h，取出后离心弃上清，用200μl PBS-TBN洗两次，加入已稀释的检测抗体10μl，用PBS-TBN补足到100μl，置于37℃摇床120rpm，1h，取出后离心，弃上清，用PBS-TBN洗两次，然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG 10μl，用PBS-TBN补足到100μl，置于37℃摇床反应1h，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗两次，再加入SA-PE，用PBS-TBN补足到100μl，置于37℃摇床反应，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗涤两次，重悬于100μl PBS-TBN中，上机进行检测。
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