CN102520167B - 液相芯片检测大肠杆菌o157的方法 - Google Patents
液相芯片检测大肠杆菌o157的方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种液相芯片检测大肠杆菌O157的方法,属于免疫技术及食品卫生检测技术领域。本发明的目的是提供一种采用液相芯片技术用于检测大肠杆菌O157的方法,以便实现对大肠杆菌O157的快速检测。本发明首先制备液相芯片,捕获抗体与微球偶联形成偶联体,然后应用液相芯片检测大肠杆菌O157。本发明运用液相芯片技术,提供一种用于检测大肠杆菌O157(EscherichiacoliO157)的方法,以便实现对大肠杆菌O157的快速检测,为食品安全做出贡献。液相芯片是集合流式细胞技术、激光技术、数字信号处理技术及传统化学技术为一体的新型生物分子检测技术,其最大的特点是高通量,灵活性好,灵敏度高。
Description
技术领域
本发明属于免疫技术及食品卫生检测技术领域。
背景技术
大肠杆菌 O157:H7是肠出血性大肠埃希氏菌的主要血清型,是重要的人类致病菌,可引起出血性肠炎(HC) 、溶血性尿毒综合症( HUS) 、血栓性血小板减少性紫癜( TTP) 及死亡等。由于肠出血性大肠埃希菌( enterohemorrhagic E.coli, EHEC)O157:H7对人的致病力强,近年来世界范围内由该菌引起的不同规模、不同区域的爆发流行不断发生,发病呈明显上升趋势,已引起世界各国的高度重视。该菌主要通过食物、水以及直接接触感染,动物是其主要的宿主,因此今年来加强对进口冷冻肉类、禽类及其制品的检验力度。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用液相芯片技术用于检测大肠杆菌O157的方法,以便实现对大肠杆菌O157的快速检测。
本发明由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素-藻红蛋白组成,其中微球是羧基化的21号微球、捕获抗体是大肠杆菌O157单克隆抗体、检测抗体是大肠杆菌O157的多克隆抗体、生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔IgG,捕获抗体和检测抗体均能特异与大肠杆菌O157结合,以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光,以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白,测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量,用于间接确定球型基质上结合大肠杆菌O157的数量;
液相芯片的制备:捕获抗体与微球偶联形成偶联体
取微球原液室温恢复30min,用超声波清洗机进行超声10min,漩涡震荡30s,使微球均匀分布,用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS,然后取200μl 的微球原液置于1.5ml的离心管中,14000 rpm,离心5min,取出后弃上清,加入NHS和EDC各10μl,再加入80μl的活化缓冲液,混匀后,用铝箔纸包好,置于37℃摇床120 rpm,20min,然后14000 rpm,离心5min,小心移去上清,加入500μl稀释至250μg/ml的捕获抗体,重悬混匀,置于37℃摇床120 rpm,孵育2h,取出后离心弃上清,用500μl的PBS进行洗涤,洗涤后加入500μl 1%BSA的 PBS溶液,重悬微球,37℃水浴摇床孵育两个小时进行封闭,封闭后4℃保存;
液相芯片检测大肠杆菌O157的方法:
将已偶联的微球混合液室温恢复10min,漩涡振荡器震荡约3min,取约5000个微球,加入108 CFU/ml 的大肠杆菌O15710μl,用PBS-TBN补足到100μl,置于37℃摇床120rpm,1h,取出后离心弃上清,用200μl PBS-TBN洗两次,加入已稀释的检测抗体10μl,用PBS-TBN补足到100μl,置于37℃摇床120rpm,1h,取出后离心,弃上清,用PBS-TBN洗两次,然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG 10μl,用PBS-TBN补足到100μl, 置于37℃摇床反应1h,取出后离心弃上清,用PBS-TBN洗两次,再加入SA-PE,用PBS-TBN补足到100μl,置于37℃摇床反应,取出后离心弃上清,用PBS-TBN洗涤两次,重悬于100μl PBS-TBN中,上机进行检测。
本发明运用液相芯片技术,提供一种用于检测大肠杆菌O157(Escherichia coli O157)的方法,以便实现对大肠杆菌O157的快速检测,为食品安全做出贡献。液相芯片是集合流式细胞技术、激光技术、数字信号处理技术及传统化学技术为一体的新型生物分子检测技术,其最大的特点是高通量,灵活性好,灵敏度高。
附图说明
图1是本法明捕获抗体最佳工作浓度;
图2是本发明灵敏度检测结果;
图3是本发明特异性的检测结果;
图4是本发明重复性检测。
具体实施方式
本发明所采用的技术方案是:通过大肠杆菌O157的特异抗体,与微球进行偶联后,制备出可以对大肠杆菌O157进行检测的液相芯片,在应用时,加入样品增菌液,使增菌液中的大肠杆菌O157被微球上的捕获抗体所捕获,检测抗体也与大肠杆菌O157结合后,再与生物素标记的抗抗体共同孵育,然后通过生物素与链霉亲和素-藻红蛋白反应,应用Luminex100检测系统实现对大肠杆菌O157的特异检测。
本发明涉及的检测大肠杆菌O157液相芯片主要由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)组成。其特征是,所述微球为羧基化的21号微球;所述捕获抗体是大肠杆菌O157的单克隆抗体(EcoliO157 mAb),所述检测抗体是大肠杆菌O157的多克隆抗体(EcoliO157 pAb),生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔IgG(biotin-羊抗兔IgG);所述捕获抗体和检测抗体均能特异与大肠杆菌O157结合。以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光,以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白,测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量,用于间接确定球型基质上结合大肠杆菌O157的数量。
上述的检测抗体是用于识别大肠杆菌O157的另一类抗体,其作用是将与液相芯片上捕获抗体结合的大肠杆菌O157与抗抗体结合,而抗抗体能与检测荧光偶联,间接将结合的大肠杆菌O157浓度与检测荧光的强度结合起来,从而实现对大肠杆菌O157的浓度进行定量测定。生物素标记的抗抗体通过生物素与链霉亲和素-藻红蛋白结合,最后通过Luminex100检测系统对大肠杆菌O157进行定性定量检测。
本发明所述的大肠杆菌O157液相检测芯片的制备方法,其步骤是:
(1)捕获抗体与微球偶联形成偶联体
取微球原液室温恢复30min,用超声波清洗机进行超声10min,漩涡震荡30s,使微球均匀分布。用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS。然后取200μl 的微球原液置于1.5ml的离心管中,14000 rpm,离心5min。取出后弃上清,加入NHS和EDC各10μl,再加入80μl的活化缓冲液。混匀后,用铝箔纸包好,置于37℃摇床120 rpm,20min,然后14000 rpm,离心5min,小心移去上清。加入500μl稀释至250μg/ml的捕获抗体,重悬混匀,置于37℃摇床120 rpm,孵育2h。取出后离心弃上清,用500μl的PBS进行洗涤,洗涤后加入500μl 1%BSA的 PBS溶液,重悬微球,37℃水浴摇床孵育两个小时进行封闭。封闭后4℃保存。
(2)应用液相芯片检测大肠杆菌O157的方法
将已偶联的微球混合液室温恢复10min,漩涡振荡器震荡约3min。取约5000个微球,加入108 CFU/ml 的大肠杆菌O15710μl,用PBS-TBN补足到100μl。置于37℃摇床120rpm,1h。取出后离心弃上清,用200μl PBS-TBN洗两次。加入已稀释的检测抗体10μl,用PBS-TBN补足到100μl。 置于37℃摇床120rpm,1h。取出后离心,弃上清,用PBS-TBN洗两次。然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG 10μl,用PBS-TBN补足到100μl。 置于37℃摇床反应1h。取出后离心弃上清,用PBS-TBN洗两次。再加入SA-PE,用PBS-TBN补足到100μl,置于37℃摇床反应,取出后离心弃上清,用PBS-TBN洗涤两次。重悬于100μl PBS-TBN中,上机进行检测。
1.捕获抗体最佳工作浓度的确定
图1所示当单抗浓度为250μg/ml时,其MFI值达到最大,故单抗最佳的工作浓度为250μg/ml。
2.偶联是否成功的检测
由上述结果可知单抗与微球偶联效果很好,且封闭效果也良好。
3. 正交实验结果—确定反应较优条件
根据上述结果可知实验条件A1B1C1D1为较优实验条件,即多抗工作浓度为1:100,生物素标记的羊抗兔IgG工作浓度为1:500,SA-PE的工作浓度为1μg/ml,生物素标记的抗体与SA-PE反应时间为30min。
4. 灵敏度检测结果
由图2可以看出,在菌的浓度达到103CFU/ml时仍可被检出。因此本方法的灵敏度较高,可达到103CFU/ml。
5.特异性的检测结果
用已建立的方法检测从图3中可看出此方法特异性良好,与其它的菌无交叉反应。
6. 重复性试验
在1d,5,d,7d用此方法分别检测阳性菌和阴性菌,由图4可见阳性菌,阴性菌MFI值上下浮动都不大,可证明本方法重复性较好。
7. 实际样品添加的检测结果
分别在绿豆和兔肉中添加大肠杆菌O157,沙门氏菌,并做空白对照,由上表可见在添加了实际样品后应用本方法仍可将大肠杆菌O157检出。
Claims (1)
1.一种液相芯片检测大肠杆菌O157的方法,其特征在于:液相芯片由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素-藻红蛋白组成,其中微球是羧基化的21号微球、捕获抗体是大肠杆菌O157单克隆抗体、检测抗体是大肠杆菌O157的多克隆抗体、生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔IgG,捕获抗体和检测抗体均能特异与大肠杆菌O157结合,以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光,以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白,测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量,用于间接确定球型基质上结合大肠杆菌O157的数量;
液相芯片的制备:捕获抗体与微球偶联形成偶联体
取微球原液室温恢复30min,用超声波清洗机进行超声10min,漩涡震荡30s,使微球均匀分布,用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS,然后取200μl 的微球原液置于1.5ml的离心管中,14000 rpm,离心5min,取出后弃上清,加入NHS和EDC各10μl,再加入80μl的活化缓冲液,混匀后,用铝箔纸包好,置于37℃摇床120 rpm,20min,然后14000 rpm,离心5min,小心移去上清,加入500μl稀释至250μg/ml的捕获抗体,重悬混匀,置于37℃摇床120 rpm,孵育2h,取出后离心弃上清,用500μl的PBS进行洗涤,洗涤后加入500μl 1%BSA的 PBS溶液,重悬微球,37℃水浴摇床孵育两个小时进行封闭,封闭后4℃保存;
液相芯片检测大肠杆菌O157的方法:
将已偶联的微球混合液室温恢复10min,漩涡振荡器震荡约3min,取5000个微球,加入108 CFU/ml 的大肠杆菌O15710μl,用PBS-TBN补足到100μl,置于37℃摇床120rpm,1h,取出后离心弃上清,用200μl PBS-TBN洗两次,加入已稀释的检测抗体10μl,用PBS-TBN补足到100μl,置于37℃摇床120rpm,1h,取出后离心,弃上清,用PBS-TBN洗两次,然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG 10μl,用PBS-TBN补足到100μl, 置于37℃摇床反应1h,取出后离心弃上清,用PBS-TBN洗两次,再加入SA-PE,用PBS-TBN补足到100μl,置于37℃摇床反应,取出后离心弃上清,用PBS-TBN洗涤两次,重悬于100μl PBS-TBN中,上机进行检测。
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