CN101470113A

CN101470113A - 一种检测大肠杆菌的新型荧光生物传感器的制备方法

Info

Publication number: CN101470113A
Application number: CNA2008100310322A
Authority: CN
Inventors: 贺全国; 黄景科; 曾晓希
Original assignee: Hunan University of Technology
Current assignee: Hunan University of Technology
Priority date: 2008-04-09
Filing date: 2008-04-09
Publication date: 2009-07-01

Abstract

本方法利用磁性粒子负载抗体，捕获抗原，通过水溶性共轭聚电解质诱导产生荧光放大来开发检测大肠杆菌O157:H7的超灵敏荧光生物传感器。首先利用磁粒捕获大肠杆菌O157:H7抗原，产生带荧光标记的抗原抗体结合体。随后加入水溶性共轭聚电解质，利用共轭聚电解质诱导与静电作用，使抗原抗体结合体与共轭聚电解质之间的超分子识别形成超分子荧光复合物体系。该荧光复合物经共轭聚电解质的光或电激发，导致原荧光标记信号产生数千甚至百万倍数量级的超级荧光放大，从而形成超灵敏荧光生物传感器。本生物传感器体系基于水溶性共轭聚电解质的荧光增敏增效，可用于大肠杆菌O157:H7等一些急性传染病菌的快速超灵敏检测。

Description

一种检测大肠杆菌的新型荧光生物传感器的制备方法

所属技术领域

本发明涉及一种共轭聚电解质诱导荧光放大的超灵敏、高选择性大肠杆菌O157:H7新型荧光生物传感器的制备方法。

背景技术

随着纳米科学技术在生物传感器领域的渗透，生物传感器领域进展最快、研究最多的两大类型是电化学生物传感器与光学生物传感器。由于电化学生物传感器具有灵敏度高、易微型化、能在浑浊的溶液中操作等优点，且所需的仪器简单、便宜。因而被广泛地应用于生物传感器制备；相比而言，光学生物传感器的优点在于无需参比电极，不受电磁场的干扰，可以在非平衡条件下测量某些物质(如氧)，稳定性好，尤其是在双波长的情下，可采用不同的波长监测同一物质的不同状态，但缺点是易受背景光的干扰，动力学范围较窄，不易于小型化，试剂的稳定性也存在一定的问题等。针对以上问题通常从两个方面着手：通过模板扩增在识别体系中引入各种生化反应(如酶切、延伸、联接和扩增等反应，如Taqman探针与分子信标)来提高对生物分子识别能力，提高灵敏度和特异性。或者利用信号放大即采用各种化学标记和物理检测方法来放大生物识别过程的微小差异，从而提高检测的灵敏度和特异性。这些方法包括各种纳米标记、荧光标记、银染技术、分支DNA标记、酶放大标记等生物和化学放大技术等。从而使生物传感器的接受器、换能器或者检测器各部分的过程、反应或信号能直接或间接的放大。

肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻是近年来新发现的危害严重的肠道传染病，它除引起腹泻、出血性肠炎外，还可发生溶血性尿毒综合症(HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等严重的并发征，后者病情凶险，病死率高。研究发现只要有10个大肠杆菌O157:H7就足以致病。目前，常用的大肠杆菌O157:H7检测方法主要有三类：细菌学分离、免疫学检测以及分子生物学检测。细菌学分离耗时长，操作烦琐，不利于及早诊断。临床上主要采用免疫磁珠法和血清特异性抗体检测。免疫法虽然特异性高，但检测限低，往往仅达到10³～10⁸CFU/ml，而且需要两次增菌，耗时长，也不利于疾病的早期诊断。分子生物学检测技术虽然灵敏度高，尤其是采用最新的DNA探针技术或者基因芯片技术可以达到10²～10³CFU/ml甚至几十CFU/ml的最低检测限，但是往往会出现一定的假阳性，而且需要大型设备、专业及人员，不利于在基层医疗机构和环境监测中的推广。表格1是关于常用的大肠杆菌O157:H7检测方法的对比。

常见检测方法及其灵敏度

近年来，利用高度荧光、水溶性的共轭聚电解质分子结构发展的一大类可对生物分子进行实时检测的高灵敏度检测体系，受到人们的广泛关注，并且相关研究进展很快^[1]。共轭聚电解质包括聚吡咯、聚噻吩、聚苯乙烯等，它们由较大的有效共轭单元构成，彼此间存在着有效的电子耦合和具有快速的分子链内和链间的能量或电子转移能力，因此基于此类型的生物传感器能够对一些微小的扰动给予积极的响应。与其它小分子体系的生物传感器相比，其灵敏度能得到很大的提高。由于这类集体性的响应可影响到化合物一系列的光电子性能，诸如：

的荧光共振能量转移(FRET)，电导能力，荧光发光效率等，因此将之用作为荧光生物传感器非常合适。与传统的生物传感器相比，共轭聚电解质生物传感器由于共轭聚合物光电特性的“放大作用”而具有极高的灵敏度，同时聚合物的光电特性的变化是在极快的过程中完成，保证了检测的快速性。因此，共轭聚电解质荧光生物传感器很快成为了国际上的一个新的研究热点。

发明目的

本发明的目的是为了提供一种检测大肠杆菌的新型荧光生物传感器的制备方法，通过利用磁粒捕获富集待分析样本的特定的生物分子(大肠杆菌O157:H7抗原)，产生带荧光标记的生物分子识别体系(抗原抗体结合体)。随后加入水溶性共轭聚电解质，通过共轭聚电解质诱导与静电作用等，共轭聚电解质之间的超分子识别可形成超分子荧光复合物体系。该荧光复合物经共轭聚电解质的光或电激发，导致原荧光标记信号产生数千甚至百万倍数量级的超级荧光放大，从而形成超灵敏、高选择性生物传感器。

发明内容

研究制备出一种共轭聚电解质诱导荧光放大的超灵敏、高选择性大肠杆菌O157:H7生物传感器原型，应用于大肠杆菌O157:H7超灵敏检测。

本发明的目的通过下述方案实现：

磁粒识别捕获大肠杆菌O157:H7抗原、剪切分离后与阳离子共轭聚电解质(CCP)形成超分子荧光复合物，包括下列步骤：

1)利用制备好的磁性颗粒经表面生物功能化修饰上二抗，用荧光素标记一抗，带有标记的一抗与二抗结合形成抗体复合物，用抗体复合物处理大肠杆菌O157:H7抗原样品，形成抗原-带标记的一抗-二抗复合体。

2)经磁分离与洗涤后，利用甘氨酸-盐酸缓冲液在一抗和二抗之间水解，形成带负电的荧光标记的抗原抗体结合物。

3)分离后带负电的抗原抗体结合物与阳离子共轭聚电解质(CCP)特异性结合后，形成超分子识别体系，经CCP光激发导致共振能量转移(FRET)，原荧光标记信号出现超级放大，实现荧光生物传感器功能。

本发明相比现有技术具有如下优点：

1)通过水溶性共轭聚电解质的制备与诱导的荧光放大效应，实现新型荧光生物传感器的制备与生物分子的超灵敏识别，方法简单，实用性强；原创思想新颖独特。

2)较之原来使用荧光探针标记检测生物分子的方法，经共轭聚电解质的超级放大后，灵敏度更高，极大地拓展了生物分子超灵敏检测的范围，可望突破现在大肠杆菌O157:H7抗原检测限。

3)通过微阵列化，可将本类新型荧光生物传感器应用于现有实际生物医学传感与检测领域的现场诊断与疾病筛选、分析领域，突破并实现比现行生物芯片或者PCR相关技术更灵敏的荧光生物传感检测新技术。

4)提出磁粒原位法荧光生物传感器与剪切点样法荧光生物传感器两种新方案来实现大肠杆菌超灵敏检测，具有显著的技术创新意义与商业价值。

附图说明

图1为实施方案I的流程图；

图2为实施方案II的流程图。

具体实施方式

实施方案I：

图1表示固相微阵列的制备过程之一：磁粒原位法荧光生物传感器微阵列的制备法。各步骤及原理简要说明如下：1)将固相微阵列化的磁性颗粒表面修饰上二抗，利用荧光探针(如荧光素)标记一抗，再将带有荧光标记的一抗与二抗结合形成抗体复合物；2)利用制备好的用抗体复合物处理大肠杆菌O157:H7抗原样品，得到带有负电荷的大肠杆菌O157:H7抗原抗体结合物；3)磁性颗粒上的负电荷抗原抗体结合物与阳离子共轭聚电解质(CCP)特异的结合后，形成超分子识别体系，经CCP光激发导致共振能量转移(FRET)，磁粒上抗原抗体结合物原荧光标记信号出现超级荧光放大。从而实现磁粒原位法荧光生物传感器微阵列的功能。

实施方案II：

图2表示固相微阵列的制备过程之二：剪切点样法荧光生物传感器微阵列的制备法。各步骤及原理简要说明如下：1)磁性颗粒经表面生物功能化修饰上二抗，用荧光探针(如荧光素)标记一抗，带有标记的一抗与二抗结合形成抗体复合物；2)利用抗体复合物处理大肠杆菌O157:H7抗原样品，再经过剪切、磁分离过程得到带负电荷的大肠杆菌O157:H7抗原抗体结合物；3)带负电荷大肠杆菌O157:H7抗原抗体结合物经过点样与阳离子共轭聚电解质(CCP)特异的结合后，形成超分子识别体系微阵列，经CCP光激发导致共振能量转移(FRET)，原荧光标记信号出现超级荧光放大。从而成功实现剪切点样法荧光生物传感器功能。

Claims

1、一种检测大肠杆菌新型的荧光生物传感器的制备方法，包括下述步骤：

(a)利用制备好的磁性颗粒经表面生物功能化修饰上二抗，用荧光素标记一抗，带有标记的一抗与二抗结合形成抗体复合物，用抗体复合物处理大肠杆菌0157：H7抗原样品，形成抗原-带标记的一抗-二抗复合体。

(b)经过磁分离与洗涤过程后，利用甘氨酸-盐酸缓冲液在一抗和二抗之间水解，形成带负电的荧光标记的抗原抗体结合物。

(c)分离后带负电的抗原抗体结合物与阳离子共轭聚电解质(CCP)特异性结合后，形成超分子识别体系，经CCP光激发导致共振能量转移(FRET)，原荧光标记信号出现超级放大，实现荧光生物传感器功能。

2、根据权利要求1所述的生物传感器制备的方法，其特征在于运用荧光素标记的一抗与二抗以及大肠杆菌0157:H7抗原形成复合体。

3、根据权利要求1所述的生物传感器制备的方法，其特征在于所述步骤(c)中的荧光信号放大是通过带负电的抗原抗体结合体与阳离子共轭聚电解质的特异性结合后经CCP光激发导致共振能量转移来实现的。

4、根据权利要求1、3所述的一种检测大肠杆菌荧光的新型生物传感器的制备方法，其特征在于所述步骤(c)中特异性的结合可以调整点样密度从而实现微阵列化，以提高检测能力。

5、根据权利要求1、3或4所述的生物传感器的制备方法，其特征在于运用磁粒原位法和剪切点样法两种制备方法来实现荧光生物传感器的功能。