CN102520167A - 液相芯片检测大肠杆菌o157的方法 - Google Patents

液相芯片检测大肠杆菌o157的方法 Download PDF

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Abstract

一种液相芯片检测大肠杆菌O157的方法，属于免疫技术及食品卫生检测技术领域。本发明的目的是提供一种采用液相芯片技术用于检测大肠杆菌O157的方法，以便实现对大肠杆菌O157的快速检测。本发明首先制备液相芯片，捕获抗体与微球偶联形成偶联体，然后应用液相芯片检测大肠杆菌O157。本发明运用液相芯片技术，提供一种用于检测大肠杆菌O157（EscherichiacoliO157）的方法，以便实现对大肠杆菌O157的快速检测，为食品安全做出贡献。液相芯片是集合流式细胞技术、激光技术、数字信号处理技术及传统化学技术为一体的新型生物分子检测技术，其最大的特点是高通量，灵活性好，灵敏度高。

Description

液相芯片检测大肠杆菌O157的方法
技术领域
本发明属于免疫技术及食品卫生检测技术领域。
背景技术
大肠杆菌 O157：H7是肠出血性大肠埃希氏菌的主要血清型,是重要的人类致病菌,可引起出血性肠炎(HC) 、溶血性尿毒综合症( HUS) 、血栓性血小板减少性紫癜( TTP) 及死亡等。由于肠出血性大肠埃希菌( enterohemorrhagic E.coli, EHEC)O157：H7对人的致病力强，近年来世界范围内由该菌引起的不同规模、不同区域的爆发流行不断发生，发病呈明显上升趋势,已引起世界各国的高度重视。该菌主要通过食物、水以及直接接触感染,动物是其主要的宿主，因此今年来加强对进口冷冻肉类、禽类及其制品的检验力度。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用液相芯片技术用于检测大肠杆菌O157的方法，以便实现对大肠杆菌O157的快速检测。
本发明由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素-藻红蛋白组成，其中微球是羧基化的21号微球、捕获抗体是大肠杆菌O157单克隆抗体、检测抗体是大肠杆菌O157的多克隆抗体、生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔IgG，捕获抗体和检测抗体均能特异与大肠杆菌O157结合，以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光，以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白，测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球型基质上结合大肠杆菌O157的数量；
液相芯片的制备：捕获抗体与微球偶联形成偶联体
取微球原液室温恢复30min，用超声波清洗机进行超声10min，漩涡震荡30s，使微球均匀分布，用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS，然后取200ul 的微球原液置于1.5ml的离心管中，14000 rpm，离心5min，取出后弃上清，加入NHS和EDC各10ul，再加入80ul的活化缓冲液，混匀后，用铝箔纸包好，置于37℃摇床120 rpm，20min，然后14000 rpm，离心5min，小心移去上清，加入500ul稀释至250ug/ml的捕获抗体，重悬混匀，置于37℃摇床120 rpm，孵育2h，取出后离心弃上清，用500ul的PBS进行洗涤，洗涤后加入500ul 1％BSA的 PBS溶液，重悬微球，37℃水浴摇床孵育两个小时进行封闭，封闭后4℃保存；
液相芯片检测大肠杆菌O157的方法：
将已偶联的微球混合液室温恢复10min，漩涡振荡器震荡约3min，取约5000个微球，加入108 CFU/ml 的大肠杆菌O15710ul，用PBS-TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床120rpm，1h，取出后离心弃上清，用200ul PBS-TBN洗两次，加入已稀释的检测抗体10ul，用PBS-TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床120rpm，1h，取出后离心，弃上清，用PBS-TBN洗两次，然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG 10ul，用PBS-TBN补足体积到100ul， 置于37℃摇床反应1h，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗两次，再加入SA-PE，用PBS-TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床反应，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗涤两次，重悬于100ul PBS-TBN中，上机进行检测。
本发明运用液相芯片技术，提供一种用于检测大肠杆菌O157（Escherichia coli O157）的方法，以便实现对大肠杆菌O157的快速检测，为食品安全做出贡献。液相芯片是集合流式细胞技术、激光技术、数字信号处理技术及传统化学技术为一体的新型生物分子检测技术，其最大的特点是高通量，灵活性好，灵敏度高。
附图说明
图1是本法明捕获抗体最佳工作浓度；
图2是本发明灵敏度检测结果；
图3是本发明特异性的检测结果；
图4是本发明重复性检测。
具体实施方式
本发明所采用的技术方案是：通过大肠杆菌O157的特异抗体，与微球进行偶联后，制备出可以对大肠杆菌O157进行检测的液相芯片，在应用时，加入样品增菌液，使增菌液中的大肠杆菌O157被微球上的捕获抗体所捕获，检测抗体也与大肠杆菌O157结合后，再与生物素标记的抗抗体共同孵育，然后通过生物素与链霉亲和素-藻红蛋白反应，应用Luminex100检测系统实现对大肠杆菌O157的特异检测。
本发明涉及的检测大肠杆菌O157液相芯片主要由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE）组成。其特征是，所述微球为羧基化的21号微球；所述捕获抗体是大肠杆菌O157的单克隆抗体（EcoliO157 mAb），所述检测抗体是大肠杆菌O157的多克隆抗体（EcoliO157 pAb），生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔IgG(biotin-羊抗兔IgG)；所述捕获抗体和检测抗体均能特异与大肠杆菌O157结合。以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光，以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白，测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球型基质上结合大肠杆菌O157的数量。
上述的检测抗体是用于识别大肠杆菌O157的另一类抗体，其作用是将与液相芯片上捕获抗体结合的大肠杆菌O157与抗抗体结合，而抗抗体能与检测荧光偶联，间接将结合的大肠杆菌O157浓度与检测荧光的强度结合起来，从而实现对大肠杆菌O157的浓度进行定量测定。生物素标记的抗抗体通过生物素与链霉亲和素-藻红蛋白结合，最后通过Luminex100检测系统对大肠杆菌O157进行定性定量检测。
本发明所述的大肠杆菌O157液相检测芯片的制备方法，其步骤是：
（1）捕获抗体与微球偶联形成偶联体
取微球原液室温恢复30min，用超声波清洗机进行超声10min，漩涡震荡30s，使微球均匀分布。用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS。然后取200ul 的微球原液置于1.5ml的离心管中，14000 rpm，离心5min。取出后弃上清，加入NHS和EDC各10ul，再加入80ul的活化缓冲液。混匀后，用铝箔纸包好，置于37℃摇床120 rpm，20min，然后14000 rpm，离心5min，小心移去上清。加入500ul稀释至250ug/ml的捕获抗体，重悬混匀，置于37℃摇床120 rpm，孵育2h。取出后离心弃上清，用500ul的PBS进行洗涤，洗涤后加入500ul 1％BSA的 PBS溶液，重悬微球，37℃水浴摇床孵育两个小时进行封闭。封闭后4℃保存。
（2）应用液相芯片检测大肠杆菌O157的方法
将已偶联的微球混合液室温恢复10min，漩涡振荡器震荡约3min。取约5000个微球，加入108 CFU/ml 的大肠杆菌O15710ul，用PBS-TBN补足体积到100ul。置于37℃摇床120rpm，1h。取出后离心弃上清，用200ul PBS-TBN洗两次。加入已稀释的检测抗体10ul，用PBS-TBN补足体积到100ul。 置于37℃摇床120rpm，1h。取出后离心，弃上清，用PBS-TBN洗两次。然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG 10ul，用PBS-TBN补足体积到100ul。 置于37℃摇床反应1h。取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗两次。再加入SA-PE，用PBS-TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床反应，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗涤两次。重悬于100ul PBS-TBN中，上机进行检测。
1.捕获抗体最佳工作浓度的确定
图1所示当单抗浓度为250ug/ml时，其MFI值达到最大，故单抗最佳的工作浓度为250ug/ml。
2．偶联是否成功的检测
  生物素标记羊抗鼠IgG 生物素标记羊抗兔IgG
MFI 5678.5 213
MFI背景值 25 10
 由上述结果可知单抗与微球偶联效果很好，且封闭效果也良好。
3. 正交实验结果—确定反应较优条件
Figure 327779DEST_PATH_IMAGE002
 根据上述结果可知实验条件A1B1C1D1为较优实验条件，即多抗工作浓度为1:100，生物素标记的羊抗兔IgG工作浓度为1:500，SA-PE的工作浓度为1ug/ml,生物素标记的抗体与SA-PE反应时间为30min。
4. 灵敏度检测结果
由图2可以看出，在菌的浓度达到103CFU/ml时仍可被检出。因此本方法的灵敏度较高，可达到103CFU/ml。
5.特异性的检测结果
用已建立的方法检测从图3中可看出此方法特异性良好，与其它的菌无交叉反应。
6. 重复性试验
在1d，5，d，7d用此方法分别检测阳性菌和阴性菌，由图4可见阳性菌，阴性菌MFI值上下浮动都不大，可证明本方法重复性较好。
7. 实际样品添加的检测结果
样品 细菌 MFI
绿豆 大肠杆菌O157 1643
绿豆 沙门氏菌 235
绿豆 空白 98
绿豆 空白 12（背景值）
兔肉 大肠杆菌O157 1258
兔肉 沙门 273
兔肉 空白 212
兔肉 空白 14（背景值）
分别在绿豆和兔肉中添加大肠杆菌O157，沙门氏菌，并做空白对照，由上表可见在添加了实际样品后应用本方法仍可将大肠杆菌O157检出。

Claims (1)

1.一种液相芯片检测大肠杆菌O157的方法，其特征在于：由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素-藻红蛋白组成，其中微球是羧基化的21号微球、捕获抗体是大肠杆菌O157单克隆抗体、检测抗体是大肠杆菌O157的多克隆抗体、生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔IgG，捕获抗体和检测抗体均能特异与大肠杆菌O157结合，以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光，以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白，测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球型基质上结合大肠杆菌O157的数量；
液相芯片的制备：捕获抗体与微球偶联形成偶联体
取微球原液室温恢复30min，用超声波清洗机进行超声10min，漩涡震荡30s，使微球均匀分布，用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS，然后取200ul 的微球原液置于1.5ml的离心管中，14000 rpm，离心5min，取出后弃上清，加入NHS和EDC各10ul，再加入80ul的活化缓冲液，混匀后，用铝箔纸包好，置于37℃摇床120 rpm，20min，然后14000 rpm，离心5min，小心移去上清，加入500ul稀释至250ug/ml的捕获抗体，重悬混匀，置于37℃摇床120 rpm，孵育2h，取出后离心弃上清，用500ul的PBS进行洗涤，洗涤后加入500ul 1％BSA的 PBS溶液，重悬微球，37℃水浴摇床孵育两个小时进行封闭，封闭后4℃保存；
液相芯片检测大肠杆菌O157的方法：
将已偶联的微球混合液室温恢复10min，漩涡振荡器震荡约3min，取约5000个微球，加入108 CFU/ml 的大肠杆菌O15710ul，用PBS-TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床120rpm，1h，取出后离心弃上清，用200ul PBS-TBN洗两次，加入已稀释的检测抗体10ul，用PBS-TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床120rpm，1h，取出后离心，弃上清，用PBS-TBN洗两次，然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG 10ul，用PBS-TBN补足体积到100ul， 置于37℃摇床反应1h，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗两次，再加入SA-PE，用PBS-TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床反应，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗涤两次，重悬于100ul PBS-TBN中，上机进行检测。
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