CN103913577A - 一种基于光纤倏逝波生物传感器检测大肠杆菌o157：h7的方法 - Google Patents

一种基于光纤倏逝波生物传感器检测大肠杆菌o157：h7的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于光纤倏逝波生物传感器检测大肠杆菌O157：H7的方法，它是用CdTe量子点与大肠杆菌O157:H7多克隆抗体的偶联，大肠杆菌O157:H7单克隆抗体包被光纤，光纤探针插入含有待测菌的溶液中，使抗原与捕获抗体发生的特异反应从而将抗原固定于光纤上，然后再将该光纤探针插入发含有检测抗体的溶液中，使检测抗体上的纳米量子点也结合到光纤表面，再利用光纤倏逝波生物传感器对大肠杆菌O157:H7进行检测，该对提高食品中病原微生物的检出率具有重要应用价值，对于促进人类健康和我国的经济发展具有重要意义。

Description

一种基于光纤倏逝波生物传感器检测大肠杆菌O157:H7的方法
技术领域
本发明属于免疫技术及卫生检测技术领域，具体涉及一种基于光纤倏逝波生物传感器检测大肠杆菌O157：H7的方法。 
背景技术
大肠杆菌 O157:H7是肠出血性大肠埃希氏菌的主要血清型，是重要的人类致病菌，可引起出血性肠炎(HC) 、溶血性尿毒综合症( HUS) 、血栓性血小板减少性紫癜( TTP) 及死亡等。由于肠出血性大肠埃希菌( enterohemorrhagic E.coli, EHEC)O157:H7对人的致病力强，近年来世界范围内由该菌引起的不同规模、不同区域的爆发流行不断发生，发病呈明显上升趋势。该菌主要通过食物、水以及直接接触感染，动物是其主要的宿主，因此加强对进口冷冻肉类、禽类及其制品的检验力度是预防该菌污染食品的重要手段。 
发明内容
本发明的目的是提供一种安全、快速、灵敏的检测食品中大肠杆菌O157:H7的方法，一种基于光纤倏逝波生物传感器检测大肠杆菌O157：H7的方法。 
一种基于光纤倏逝波生物传感器检测大肠杆菌O157：H7的方法，它包括： 
1）CdTe量子点与大肠杆菌O157:H7多克隆抗体的偶联
取水溶性CdTe量子点与PBS缓冲液混合，大肠杆菌O157:H7多克隆抗体加入到上述混合液中，然后将加入新制备的EDC溶液，将混合样品在37℃培养箱中避光反应2个小时，然后4℃过夜，将反应混合液离心，上清液用超滤膜反复进行超滤，去除小分子物质和未反应的CdTe量子点，收集超滤膜截留的 CdTe-多克隆抗体偶联物；
2）捕获抗体光纤探针的制备
将聚苯乙烯光纤表面，先用盐酸和乙醇混合液清洗，再用硫酸清洗，接下来在超纯水中煮沸，使光纤表面具有亲水的极化层；然后将处理好的光纤放入1 大肠杆菌O157单抗的溶液中浸泡，取出用去离子水洗净，即得到包被有捕获抗体光纤探针；
3）大肠杆菌O157:H7的检测
将CdTe-多克隆抗体偶联物制成水溶液，将捕获抗体光纤探针插入待测溶液中，然后再将捕获抗体光纤探针放入CdTe-多克隆抗体偶联物制成水溶液中，用光纤倏逝波生物传感器检测；
步骤1）所述的混合样品，包含1.0mL量子点，1.0mL PBS，400uL抗体，100uL EDC。
步骤2）所述的光纤为聚苯乙烯光纤； 
步骤2）所述的大肠杆菌O157:H7单抗溶液为10 μg/ml；
步骤3）CdTe-多克隆抗体偶联物制成水溶液为100 μg/ml。
本发明所采用的技术方案是：将捕获抗体（大肠杆菌O157:H7单克隆抗体）与探针共价偶联形成光纤探针；所用检测抗体为用纳米量子点（CdFe）进行了标记的大肠杆菌O157:H7多克隆抗体；其中捕获抗体和检测抗体均能特异与大肠杆菌O157:H7结合；当将光纤探针插入含有待测菌的溶液中，使抗原与捕获抗体发生的特异反应从而将抗原固定于光纤上，然后再将该光纤探针插入发含有检测抗体的溶液中，使检测抗体上的纳米量子点也结合到光纤表面，再通过向光纤传感器中输入激发光使其形成的倏逝波场效应，从而激发光纤传感器表面的检测抗体上的纳米量子点标记物产生荧光信号，根据检测荧光信号强度变化可判断免疫反应是否发生以此来实现对大肠杆菌O157:H7的特异检测。 
本方法建立了一种基于倏逝波场激发的纳米量子点免疫光纤生物传感器检测大肠杆菌O157:H7的方法。基于倏逝波场激发的量子点免疫光纤生物传感器是荧光生物传感器的一种。它主要结合了光在光纤中传播时产生倏逝波场以及抗体－抗原免疫反应的高特异性和高灵敏度的特点。倏逝波场激发的原理是：当光在光纤内以全反射方式传输时，产生一种横贯光纤的波，通过纤芯与包层的交界处传出光纤，这种波随传播距离呈指数衰减，称为倏逝波。由于传送到待测微生物溶液中的倏逝波场深度只有波长量级，所以光纤倏逝波生物传感器只能探测到结合于倏逝波场范围内的荧光染料发出的荧光，而溶液中游离的荧光染料对测量结果无影响。因此与其他生物检测手段相比，光纤倏逝波生物传感器具有如下优点：1)灵敏度高，生物特异性强；2)操作简单，测量速度快；3)可以对生物反应过程进行动态监测；4)可以使仪器小型化。 
而量子点具有激发光谱宽，且连续分布，发射光谱呈对称分布且宽度窄，颜色随粒径大小可调，不同发光波长的量子点可用同一波长的光激发，并且光化学稳定性极高，不易分解。量子点代替传统的荧光染料检测食品中的病源性微生物，其获得了更强的荧光强度，更长的发光时间和更灵敏的信号，从而使得大大的降低了待测样品的检测限。    
本发明提供了一种基于光纤倏逝波生物传感器检测大肠杆菌O157：H7的方法，它是用CdTe量子点与大肠杆菌O157:H7多克隆抗体的偶联，大肠杆菌O157:H7单克隆抗体包被光纤，光纤探针插入含有待测菌的溶液中，使抗原与捕获抗体发生的特异反应从而将抗原固定于光纤上，然后再将该光纤探针插入发含有检测抗体的溶液中，使检测抗体上的纳米量子点也结合到光纤表面，再利用光纤倏逝波生物传感器对大肠杆菌O157:H7进行检测，该方法提高了检测效率，对提高食品中病原微生物的检出率具有重要应用价值，对于促进人类健康和我国的经济发展具有重要意义。
附图说明
图1、大肠杆菌O157灵敏度的检测结果； 
图2、大肠杆菌O157特异性检测结果。
具体实施方式
实施例1大肠杆菌O157:H7抗原菌液的制备和BALB/c小鼠免疫
取本研究实-80℃保存的标准大肠杆菌O157:H7（ATCC11229），经肉汤培养后，划线法于LB上培养，常规方法增菌培养，6000r/min离心10min，收集菌体沉淀，用灭菌生理盐水重复离洗三次后进行菌落计数（2.0×108CFU/mL），加入终浓度为0.3%的甲醛4℃过夜使菌体灭活。次日将洗脱好的菌液在20KHz、150W的冰浴条件下进行超声波使菌体细胞破碎，每次破碎10s，间隔10s，总用时20min。采用BCA蛋白测定试剂盒测定菌体蛋白含量，结果为2.636 mg/mL。
取8周龄雌性BALB/c小鼠进行免疫。首免采用上述灭活菌液（2×108CFU/mL）与等量弗氏完全佐剂混合后腹腔注射50μL，皮下注射50μL，以后每隔2周免疫1次，换用弗氏不完全佐剂，剂量同前，共免3次。 
3免后，小鼠断尾采血，用常规间接ELISA方法检测血清效价。其中，包被抗原是实施例1所制备的大肠杆菌O157:H7菌液，稀释度为1:50，小鼠血清浓度为200×稀释度开始的梯度浓度，酶标二抗为HRP(辣根过氧化物酶)标记的兔抗小鼠IgG（稀释度为1:15000）。测定结果表明，抗体效价为1:25600。 
实施例2  CdTe量子点与大肠杆菌O157:H7多克隆抗体的偶联
取1mL的水溶性CdTe量子点与1mL PBS（pH=7.4）缓冲液混合，将400uL 的大肠杆菌O157:H7多克隆抗体（1mg/ml）加入到上述混合液中，然后将100uL新制备的EDC溶液（4mg/ml）加入到混合液中，样品在37℃培养箱中避光反应2个小时，然后4℃过夜。将2.5mL反应混合液（包含1.0mL量子点，1.0mL PBS，400uL抗体，100uL EDC）5000r/min离心2min，取上清液，上清用截留分子量为100000的超滤膜反复进行超滤，去除小分子物质和未反应的CdTe量子点，收集超滤膜截留的 CdTe-抗体偶联物，然后用PBS（pH7.4）溶解。4℃避光保存备用。
实施例3  光纤与捕获抗体的包被
将聚苯乙烯光纤表面，先用清洗液（36-38%浓HCL:70-90%乙醇溶液体积比为1:1）清洗10分钟，再用70%浓硫酸清洗10分钟，接下来在超纯水中煮沸10分钟，使光纤表面具有亲水的极化层。然后将处理好的光纤放入10 μg/ml 大肠杆菌O157:H7单抗（保藏编号为：CGMCC No.6251，抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2012年06月20日送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市北辰西路1号院3号保藏。）的溶液中浸泡1h，取出用去离子水洗净，即得到包被有捕获抗体光纤探针。 
实施例4 应用光纤倏逝波生物传感器检测大肠杆菌O157:H7的方法
将捕获抗体光纤探针插入待测溶液中，如果该溶液中存在与光纤探针上捕获抗体反应的大肠杆菌O157:H7，由于该菌能与捕获抗体特异性结合从而形成复合分子；然后再将光纤探针放入含有100 μg/ml纳米量子点标记的检测抗体溶液中，则该溶液中的检测抗体与光纤上与捕获抗体结合的大肠杆菌O157:H7通过免疫反应结合，则该纳米量子点被固定在光纤探针上，然后通过倏逝波生物传感器（光纤传感器及光纤均由中科院长春光学精密机械与物理所提供）进行检测。
实施例5 检测灵敏度的确定
将大肠杆菌O157:H7菌株在 LB液体培养基中，42 ℃培养18 h～24 h。琼脂平板进行计数。将包被大肠杆菌O157:H7菌的单克隆抗体的光纤探针分别插入浓度为5×100 CFU/mL 、5×101 CFU/mL、5×102 CFU/mL、5×103 CFU/mL、5×104 CFU/mL、5×105 CFU/mL和5×106 CFU/mL的大肠杆菌O157:H7菌溶液及空白溶液中孵育10 min，加阴性对照，PBS清洗三遍后再与量子点标记的多抗反应10min，然后上机进行测量。测试结果如下图1所示，其中大肠杆菌O157菌液浓度高于5×101 CUF/mL都能够检出，说明该方法最低能检测到50个CFU/ml的大肠杆菌O157。
实施例6  特异性试验 
用建立的光纤倏逝波生物传感器检测大肠杆菌O157:H7菌的方法对已知的产气荚膜梭菌（ATCC13124）、绵羊李斯特氏菌（ATCC11387）、英诺克李斯特氏菌（ATCC19119）、金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、肠炎沙门氏菌（ATCC13076）、伤寒沙门氏菌（ATCC13311）、大肠埃希菌（ATCC25922）、蜡样芽胞杆菌（ATCC11778)）、大肠杆菌O157（ATCC35150）、空肠弯曲杆菌（ATCC33291）等细菌进行特异性交叉试验，同时空白对照。如图2所示，结果表明该方法特异性较强，只对大肠杆菌O157:H7具有发生反应，而对其他菌没有交叉反应。
实施例7  人工添加样品的检测
取鸡肉25g加入225mL的LB培养基中，分别加入大肠杆菌O157菌悬液，使其初始菌液浓度达到5 CFU/mL，10 CFU/mL，20 CFU/mL， 50 CFU/mL，100 CFU/mL，均质后，取2mL上清，煮沸灭菌，各取1mL用于检测。检测结果如表1所示，其检测灵敏度可达到50 CFU/mL，即在样品中若含有50 CFU/mL的在大肠杆菌O157即可被检出，而对于20 CFU/mL的浓度的样品3 次检测中可能有1～2 次结果为阳性。

Claims (5)

1.一种基于光纤倏逝波生物传感器检测大肠杆菌O157：H7的方法，它包括：
1）CdTe量子点与大肠杆菌O157:H7多克隆抗体的偶联
取水溶性CdTe量子点与PBS缓冲液混合，大肠杆菌O157:H7多克隆抗体加入到上述混合液中，然后将加入新制备的EDC溶液，将混合样品在37℃培养箱中避光反应2个小时，然后4℃过夜，将反应混合液离心，上清液用超滤膜反复进行超滤，去除小分子物质和未反应的CdTe量子点，收集超滤膜截留的 CdTe-多克隆抗体偶联物；
2）捕获抗体光纤探针的制备
将聚苯乙烯光纤表面，先用盐酸和乙醇混合液清洗，再用硫酸清洗，接下来在超纯水中煮沸，使光纤表面具有亲水的极化层；然后将处理好的光纤放入1 大肠杆菌O157单抗的溶液中浸泡，取出用去离子水洗净，即得到包被有捕获抗体光纤探针；
3）大肠杆菌O157:H7的检测
将CdTe-多克隆抗体偶联物制成水溶液，将捕获抗体光纤探针插入待测溶液中，然后再将捕获抗体光纤探针放入CdTe-多克隆抗体偶联物制成的水溶液中，用光纤倏逝波生物传感器检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于光纤倏逝波生物传感器检测大肠杆菌O157：H7的方法，其特征在于：步骤1）所述的混合样品，包含1.0mL量子点，1.0mL PBS，400uL抗体，100uL EDC。
3.根据权利要求2所述的一种基于光纤倏逝波生物传感器检测大肠杆菌O157：H7的方法，其特征在于：步骤2）所述的光纤为聚苯乙烯光纤。
4.根据权利要求3所述的一种基于光纤倏逝波生物传感器检测大肠杆菌O157：H7的方法，其特征在于：步骤2）所述的大肠杆菌O157:H7单抗溶液为10 μg/ml。
5.根据权利要求4所述的一种基于光纤倏逝波生物传感器检测大肠杆菌O157：H7的方法，其特征在于：步骤3）CdTe-多克隆抗体偶联物制成的水溶液为100 μg/ml。
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