CN109735462A

CN109735462A - 一种快速检测人畜共患病原菌气单胞菌属的双抗体夹心elisa方法

Info

Publication number: CN109735462A
Application number: CN201910039778.6A
Authority: CN
Inventors: 王文彬; 刘丹丹; 胥传来; 盘赛昆; 高云山; 桑雨浓; 徐俊林; 刘建欣; 梁夏夏
Original assignee: Jiangnan University; Huaihai Institute of Techology
Current assignee: Jiangnan University; Huaihai Institute of Techology
Priority date: 2019-01-16
Filing date: 2019-01-16
Publication date: 2019-05-10

Abstract

一种快速检测人畜共患病原菌气单胞菌属的双抗体夹心ELISA方法，属于免疫分析技术领域。本发明经筛选不同配对抗体的交叉反应、灵敏度，以14H5作为包被抗体，1B1‑HRP作为酶标抗体建立的夹心ELISA方法对测试的气单胞菌属内的菌均有交叉反应。本发明制备了气单胞菌属特异性的单克隆抗体，并建立了菌属特异性双抗体夹心ELISA法，为水产病原菌气单胞菌的检测提供了准确、可靠、快速的分析手段。

Description

一种快速检测人畜共患病原菌气单胞菌属的双抗体夹心 ELISA方法

技术领域

本发明涉及一种快速检测人畜共患病原菌气单胞菌属的双抗体夹心ELISA方法，属于免疫分析技术领域。

背景技术

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是革兰氏阴性菌，隶属气单胞菌科、气单胞菌属，是一类嗜温性、运动性的气单胞菌。嗜水气单胞菌是导致嗜血单胞菌病或出血性败血症或运动性气单胞菌败血症的主要病原体，其特征是身体充血，腹部充气。它主要存在于淡水鱼类中，偶尔也存在于海洋鱼类中。其他水生动物，如虾，螃蟹，贻贝，鳗鱼和青蛙也很容易受到影响，给水产养殖业带来了巨大的经济损失。

人们普遍认为嗜水气单胞菌是引起淡水水生动物出血性败血症的主要病原菌。然而，根据鱼类的流行病学的调查发现气单胞菌属中的其他菌种，如维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌、杀鲑气单胞菌、温和气单胞菌也会导致鱼类感染。最近有研究表明，在2009-2014年间，引起中国南方四省的鲤科鱼类败血症的爆发主要病原菌是维氏气单胞菌而不是嗜水气单胞菌。此外，近年来越来越多地气单胞菌属被发现是引起人类急性腹泻，皮肤和软组织感染的致病因子。气单胞菌属种类多样、血清型复杂，这对于在水产养殖，食品和临床分析中鉴定这种人畜共患的病原体提出了巨大挑战。

目前检测气单胞菌的方法主要有生化培养法、免疫学检测方法、分子检测方法。传统的生化培养法是检测气单胞菌的国标方法，尽管权威可靠，但一般需要3-5天得到结果，且操作过程繁琐，耗时耗力，不适合快速检测的要求；分子检测方法是基于气单胞菌脱氧核糖核酸（DNA）聚合酶链式反应（PCR）建立起来的。目前发展为传统PCR、基因芯片/DNA微阵列技术、环介导的等温扩增技术、各种分型、指纹技术等等，但这些都依赖于先进的仪器与专业人员。另外，基于抗体-抗原反应的免疫学检测方法操作简单且快速，但是由于气单胞菌属抗原的多样性，以往研究中的抗体主要由全细胞抗原产生，抗体特异性通常有限且难以控制。据报道，先前大多数的气单胞菌属免疫测定法具有低敏感性和特异性，通常不可靠。因此，在水产养殖，食品和临床分析中仍然需要快速免疫分析的方法以准确和灵敏地检测气单胞菌属。

外膜蛋白（OMP）是革兰氏阴性菌细胞膜的重要结构，其中OmpF是嗜水气单胞菌重要的粘附因子，也是该菌在不利条件下存活至关重要的双组分调控系统的关键成分。同时，OmpF在气单胞菌属内的同源性在83%以上，是比较有前景的免疫靶点，很有希望开发用于鱼类的气单胞菌疫苗。OmpF可用作免疫靶点来制备属特异性抗体和用免疫测定法来鉴定这种人畜共患的病原体。然而，先前的研究表明该蛋白质仅在包涵体中表达，其在结构和抗原性方面不同于天然蛋白质。与蛋白质抗原相比，经过筛选和设计的多肽抗原更能精确地控制特异性，比较容易合成。我们之前的研究通过生物信息学工具选择OmpF表面暴露性较好的保守性多肽序列Pep1，采用氨基酸序列为多肽pep1制备人工抗原并制备了属特异性的多克隆抗体（专利申请号：CN 108659116 A），Pep1具体氨基酸序列为Tyr Lys Gly Glu Gly ArgGly Tyr Glu Leu Ala Ala。本发明中以Pep1和Pep4分别合成的人工抗原制备了9株针对气单胞菌属的单克隆抗体并成功开发了双抗体夹心ELISA，用于在水产养殖、食品和临床分析中快速准确地测定气单胞菌属细菌。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种快速检测人畜共患病原菌气单胞菌属的双抗体夹心ELISA方法，其为一种在菌属水平上检测气单胞菌属的酶联免疫吸附检测方法，用于人畜共患病原菌气单胞菌属的批量、快速检测。

本发明的技术方案，为实现上述目的，本发明建立了一种基于单克隆抗体的检测人畜共患病原菌气单胞菌属的特异性双抗体夹心法，该方法包括对检测方法的优化。

其中，单克隆抗体是采用气单胞菌保守性多肽表位Pep1-BSA和Pep4-BSA人工抗原分别作为免疫原免疫6-8周龄的BALB/c小鼠并经杂交瘤技术融合、筛选得到的。

其中，用于配对的抗体是通过优化参数下对气单胞菌属不同种菌株进行夹心法配对，并通过多次重复试验确定的，具有稳定性好、灵敏度高的特点。

本发明方法的检测分析原理是：酶标板上包被了识别包被抗体14H5，该抗体识别气单胞菌属外膜蛋白OmpF 保守多肽位点Pep4，可特异性捕获气单胞菌属细菌（杀鲑气单胞菌除外）。

本发明检测时，洗板3次，洗去未结合的抗体，加入封闭液200 μL封闭板孔上多余结合位点；洗板3次，加入样品和对照，37 ℃孵育1 h；洗板3次，加入酶标抗体1B1-HRP，37℃孵育1 h；1B1-HRP识别气单胞菌属外膜蛋白OmpF 保守多肽位点Pep1，可与板上的气单胞菌属细菌（杀鲑气单胞菌除外）反应。洗板4次，加入显色液显色12 min。

如果样品有足够的气单胞菌，那么气单胞菌被包被抗体捕获并与酶标抗体1B1-HRP结合，并催化底物在450 nm产生吸收值（P/N≥2.1），并被判定为阳性；如果样品气单胞菌浓度太低（P/N＜2.1）那么样品捕获数量太小不足以引起足够的信号，被判定为阴性。

具体步骤如下：

（1）气单胞菌保守性多肽单克隆抗体细胞株的制备：用合成的气单胞菌保守性多肽表位Pep1-BSA和Pep4-BSA人工抗原为免疫原，免疫6-8周龄的BALB/c小鼠，经免疫、融合，筛选采用不同血清群的气单胞菌测试细胞株的交叉反应并挑选具有较强交叉反应的细胞进行亚克隆，最终得到了9株交叉型的气单胞菌属特异性单克隆抗体，其中识别Pep1的单克隆抗体有6株（含1B1），识别Pep4的单克隆抗体有3株（含14H5）；

（2）单克隆抗体的配对筛选：9株气单胞菌属特异性单克隆抗体纯化后分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对，配对参数如下：包被抗体4 μg/mL；包被液为pH9.6、0.01 M的碳酸盐缓冲液；标品浓度10⁷CFU/mL；标品稀释液pH7.2、0.01 M的PBST；酶标抗体稀释1000倍使用，在此条件下，实验成功得到了2对P/N值>5的配对；

（3）气单胞菌属特异性ELISA方法的建立：选择检测限稳定、灵敏的配对，用包被抗体14H5和酶标抗体1B1-HRP建立了气单胞菌属特异性的夹心ELISA分析方法；具体参数如下：

包被抗体14H5包被浓度：4 μg/mL；

包被液：pH9.6、0.01 M碳酸盐缓冲液；

标品稀释液：pH7.2、0.01 M的PBST；

酶标抗体1B1-HRP浓度：2 μg/mL；

反应时间：包被、封闭：37 ℃、2 h；标准品：37 ℃、1 h；酶标抗体37 ℃、1 h；显色：12min；

该ELISA对气单胞菌属内的嗜水气单胞菌（CICC 10500、CICC 10868、MCCC 1A00007、MCCC 1A00190）、维氏气单胞菌（MCCC 1K03237、MCCC 1A00180）、斑点气单胞菌（CGMCC1.1960）、双壳气单胞菌（MCCC 1A02126）、波氏气单胞菌（CGMCC 1.9063）、肇东气单胞菌（MCCC 1A12437）、豚鼠气单胞菌（MCCC 1A12231）、湖气单胞菌（MCCC 1K03235）、达卡气单胞菌（MCCC 1A12235）均有交叉反应，对应的检测限P/N≥2.1，分别为：4.57×10⁵ CFU/mL、1.52×10⁵ CFU/mL、1.52×10⁵ CFU/mL、1.52×10⁵ CFU/mL、1.37×10⁶ CFU/mL、4.57×10⁵CFU/mL、1.52×10⁵ CFU/mL、1.52×10⁵ CFU/mL、4.57×10⁵ CFU/mL、1.52×10⁵ CFU/mL、4.57×10⁵ CFU/mL、4.57×10⁵ CFU/mL、5.08×10⁴ CFU/mL；与副溶血弧菌（CICC 21619）、迟钝爱德华氏菌（分离株），假单胞菌属（分离株），霍乱弧菌（分离株），大肠杆菌DH5α，大肠杆菌O157：H7（CGMCC 1.12873）无交叉反应。

气单胞菌外膜蛋白OmpF保守性多肽PepF4序列的具体筛选和确定方法参考已申请的专利—一种用于制备水产病原菌气单胞菌属交叉型抗体的免疫原合成方法（CN108659116 A）。

本发明的有益效果：本发明提供的气单胞菌双抗体夹心ELISA检测方法基于气单胞菌外膜蛋白OmpF保守性多肽表位的单克隆抗体，建立的夹心法可以在菌属水平上检测气单胞菌。同时稳定性好、成本低，能同时检测大量样品，适合水产养殖、食品和临床样本大规模、高通量、快速、灵敏的检测要求，具有推广和应用价值。

生物材料样品保藏：

一株气单胞菌属特异性细胞株B号，分类命名为单克隆细胞株，保藏编号CGMCCNo.17302，保藏时间2018年5月24日，保藏地址中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

一株气单胞菌属特异性细胞株C号，分类命名为单克隆细胞株，保藏编号CGMCCNo.17303，保藏时间2018年5月24日，保藏地址中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1 气单胞菌属特异性单克隆抗体1B1的交叉反应。

图2气单胞菌属特异性单克隆抗体14H5的交叉反应。

图3气单胞菌属特异性单克隆抗体1B1的免疫印迹。

图4气单胞菌属特异性单克隆抗体14H5的免疫印迹。

M：蛋白Marker；1：嗜水气单胞菌 CICC 10500；2：嗜水气单胞菌CICC 1A00007；3：嗜水气单胞菌CICC 1A00190；4：嗜水气单胞菌CICC 10868；5：双壳气单胞菌；6：肇东气单胞菌；7：斑点气单胞菌；8：波氏气单胞菌；9：兽气单胞菌；10：OmpF蛋白；11：杀鲑气单胞菌；12：豚鼠气单胞菌；13：23565气单胞菌；14：E.coli DH5α；15：霍乱弧菌；16：鳗弧菌；17：副溶血弧菌。

图5气单胞菌属特异性双抗体夹心法对7株气单胞菌标准菌株的标准曲线。

图6气单胞菌属特异性双抗体夹心法对6株气单胞菌标准菌株的标准曲线。

具体实施方式

实施例中所述的气单胞菌菌株购于中国工业微生物保藏中心（CICC），中国普通微生物保藏中心（CGMCC），中国海洋微生物保藏中心（MCCC）。单克隆抗体细胞株保存于中国普通微生物保藏中心（CGMCC）。多肽序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

以下通过实施例进一步说明本发明。

一、仪器：

TGL－40B台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂

KFLOW纯水机，凯佛隆公司

ZD–9556水平摇床，太仓科教器材厂

96孔8×12可拆酶标板，无锡国盛生物工程有限公司（中国无锡）

酶标仪Multiskan FC， Thermo Fisher Scientific公司

可调试移液器，Thermo Labsystems公司

涡旋混合器，上海沪西仪器分析厂

二、试剂：牛血清白蛋白（BSA），3,3'，5,5'-四甲基联苯胺（TMB），辣根过氧化物酶（HRP），完全和不完全弗氏佐剂，Sigma-Aldrich公司；其他试剂均为分析纯试剂。

三、步骤

1、单克隆抗体的制备

（1）实验动物：每种抗原选6只6-8周龄的BALB/c小鼠进行免疫；

（2）抗原配置：见已申请专利—一种用于制备水产病原菌气单胞菌属交叉型抗体的免疫原合成方法（CN 108659116 A）;

（3）乳化：将上述溶液与等量完全或不完全弗氏佐剂进行乳化，乳化完全后皮下多点注射小鼠；

（4）免疫：按照特定免疫流程免疫小鼠，3免后用间接竞争法测定效价，效价达到要求后，进行冲刺免疫；冲免3天后眼眶采血后进行融合；

（5）采血：第三次免疫后1周进行断尾采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价；

（6）融合、筛选：采用杂交瘤技术进行融合，采用间接ELISA筛选阳性细胞孔，采用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆；

（7）抗体的纯化和保存：采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水，透析后得到单克隆抗体，采用微量紫外方法测定其浓度后分装后放入-20 ℃保存。

2、间接ELISA反应过程：

抗体效价测定步骤：

（1）将包被原用包被缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板，100μL/孔，于37 ℃温育箱内温育2h。取出酶标板后将板甩干，每孔注入200μL PBST溶液，摇床上振荡3min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤2次。以下洗涤方法相同；

（2）充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200μL/孔，于37℃温育箱内温育2h后取出烘干待用；

（3）将阳性血清系列稀释对应加入到酶标板的前7行列，第8行加入阴性血清，100μL/孔，37℃孵育35min后洗涤、拍干；

（4）每孔加入100μL，1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育35min后洗涤四次、拍干；

（5）每孔加入100μL显色液(TMB与底物液比例为1:5)，暗处37℃反应15min，取出后每孔加入50μL终止液(2mol/L的硫酸)，用酶标仪测定吸光值A₄₅₀；

3、单克隆抗体14H5免疫印迹步骤：

（1）通过冰预超声破碎制备细菌蛋白质并跑蛋白电泳；

（2）将聚丙烯酰胺凝胶用TE-70半干转印系统在30mA下转移至PVDF膜上，持续40min；

（3）将转印后的PVDF膜用封闭液（5％脱脂乳粉、0.01MPBS）于4℃封闭过夜；

（4）将在抗体稀释缓冲液中稀释2000倍的气单胞菌属的mAb 14H5与PVDF膜一起温育，室温，震荡反应1h，PBST洗涤3次；

（5）洗涤后，加入在抗体稀释缓冲液中稀释2000倍的HRP缀合的羊抗鼠二抗，并在室温下孵育1h，洗涤5次；

（6）加入TMB液体底物。在室温下反应10-15min后，拍摄图片。

4、气单胞菌属特异性双抗体夹心法测定步骤：

a、包被：用4μg/mL的14H5包被酶标板，100μL /孔，37℃温育2h；

b、洗涤：用PBST洗板三次，每次3min，200μL/孔，然后甩干酶标板；

c、封闭：含0.2%明胶的CBS，200μL /孔， 37℃封闭2 h；

d、洗涤：同b；

e、样品：用PBST将气单胞菌按3倍梯度从10⁹CFU / mL连续稀释至5645 CFU/mL，另设一个PBST空白对照。每孔加入100μL样品，于37℃温育lh；

f、洗涤：同b；

g、加酶标抗体(1B1-HRP，2μg/mL)，100μL /孔，37℃反应1h；

h、洗涤：洗板四次；

i、显色：加显色液(TMB与底物液比例为1:5) 100μL /孔，显色12min；

j、终止：加终止液50μL /孔；

k、测定：用酶标仪检测OD₄₅₀nm。

交叉率的测定：将气单胞菌属内的嗜水气单胞菌（CICC 10500、CICC 10868、MCCC1A00007、MCCC 1A00190）、维氏气单胞菌（MCCC 1K03237、MCCC 1A00180）、斑点气单胞菌（CGMCC 1.1960）、双壳气单胞菌（MCCC 1A02126）、波氏气单胞菌（CGMCC 1.9063）、肇东气单胞菌（MCCC 1A12437）、豚鼠气单胞菌（MCCC 1A12231）、湖气单胞菌（MCCC 1K03235）、达卡气单胞菌（MCCC 1A12235）按3倍梯度从10⁹ CFU / mL连续稀释至5645 CFU / mL系列浓度并检测。将副溶血弧菌、迟钝爱德华氏菌，假单胞菌属，霍乱弧菌，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌O157：H7稀释到10⁹CFU/mL在建立的气单胞菌双抗体夹心法体系中检测吸光值，并设空白孔，每个浓度做6次测定平均值，做3次重复实验。

试验结果如下：

1、标准曲线：本发明建立的气单胞菌属双抗体夹心ELISA方法对测试的菌株的检测范围是为5×10⁴～10⁹ CFU/mL，具体请见说明书附图。

2、检测限：空白的平均吸收值的2.1倍对应的抗原浓度。该ELISA对气单胞菌属内的嗜水气单胞菌（CICC 10500、CICC 10868、MCCC 1A00007、MCCC 1A00190）、维氏气单胞菌（MCCC 1K03237、MCCC 1A00180）、斑点气单胞菌（CGMCC 1.1960）、双壳气单胞菌（MCCC1A02126）、波氏气单胞菌（CGMCC 1.9063）、肇东气单胞菌（MCCC 1A12437）、豚鼠气单胞菌（MCCC 1A12231）、湖气单胞菌（MCCC 1K03235）、达卡气单胞菌（MCCC 1A12235）的检测限分别为：4.57×10⁵ CFU/mL、1.52×10⁵CFU/mL、1.52×10⁵CFU/mL、1.52×10⁵CFU/mL、1.37×10⁶CFU/mL、4.57×10⁵CFU/mL、1.52×10⁵ CFU/mL、1.52×10⁵CFU/mL、4.57×10⁵CFU/mL、1.52×10⁵CFU/mL、4.57×10⁵CFU/mL、4.57×10⁵CFU/mL、5.08×10⁴CFU/mL。

3、交叉反应

结果：对气单胞菌属内的测试菌均有交叉反应。而10⁹CFU/mL浓度的其它测试菌株副溶血弧菌（CICC 21619）、迟钝爱德华氏菌（分离株），假单胞菌属（分离株），霍乱弧菌（分离株），大肠杆菌DH5α，大肠杆菌O157：H7（CGMCC 1.12873）均不显色（OD< 0.15）。说明建立的气单胞菌夹心ELISA方法与其他测试菌交叉反应，具有气单胞菌属特异性。

Claims

1.一株气单胞菌属特异性细胞株B号，分类命名为单克隆细胞株，保藏编号CGMCCNo.17302，保藏时间2018年5月24日，保藏地址中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.一株气单胞菌属特异性细胞株C号，分类命名为单克隆细胞株，保藏编号CGMCCNo.17303，保藏时间2018年5月24日，保藏地址中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

3.由权利要求1所述保藏编号CGMCC No.17302的气单胞菌属特异性细胞株B号分泌所得单克隆抗体14H5。

4.由权利要求2所述保藏编号CGMCC No.17303的气单胞菌属特异性细胞株C号分泌所得单克隆抗体1B1。

5.如权利要求3所述单克隆抗体14H5，其特征在于：其由采用嗜水气单胞菌OmpF蛋白序列Pep4合成的多肽抗原制备。

6.如权利要求5所述单克隆抗体14H5，其特征在于：所述气单胞菌外膜蛋白OmpF保守性多肽PepF4序列具体为Gly Gly Phe Lys Gly Lys Leu Ser Tyr Gln Thr Asn Asp。

7.一种检测人畜共患病原菌气单胞菌属的特异性双抗体夹心ELISA法，其特征在于：采用识别气单胞菌属特异性位点的权利要求3所述单克隆抗体14H5，即识别多肽Pep4，和权利要求4所述单克隆抗体1B1，即识别多肽Pep1，作为配对抗体，酶标板上包被单克隆抗体14H5，其能够特异性捕获气单胞菌属内的细菌。

8.如权利要求7所述检测人畜共患病原菌气单胞菌属的特异性双抗体夹心ELISA法，其特征在于：所述酶标板上的酶标抗体1B1-HRP偶联物与捕获的气单胞菌结合，底物加入后被HRP酶催化并在450 nm产生吸收值。

9.如权利要求8所述检测人畜共患病原菌气单胞菌属的特异性双抗体夹心ELISA法，其特征在于：当P/N≥2.1时被判定为阳性，反之，P/N＜2.1则判定为阴性。

10.如权利要求7所述检测人畜共患病原菌气单胞菌属的特异性双抗体夹心ELISA法，其特征在于具体参数如下：

包被抗体14H5包被浓度：4μg/mL；

包被液：pH9.6、0.01 M碳酸盐缓冲液；

标品稀释液：pH7.2、0.01 M的PBST；

酶标抗体1B1-HRP浓度：2 μg/mL；

反应时间：包被、封闭：37 ℃、2 h；标准品：37 ℃、1 h；酶标抗体37℃、1h；显色：12min。