CN103713104B - 一种检测食品中阪崎肠杆菌的双抗体夹心法 - Google Patents

Abstract

一种检测食品中阪崎肠杆菌的双抗体夹心法，属于免疫分析领域。本发明应用阪崎肠杆菌(ATCC29544)，及阪崎肠杆菌ATCC29544耦联BSA提取的LPS分别为免疫原同时免疫BALB/c小鼠，经免疫、融合、筛选得11株阪崎肠杆菌单抗，分别标记HRP并以阪崎肠杆菌进行两两配对。以7号单抗CGMCCNo.7207为包被抗体，8号单抗CGMCCNo.7208为酶标抗体，以ATCC29544为标准品建立了阪崎肠杆菌的夹心ELISA法，LOD为53000CFU/mL。本发明采用理化性质高那均一、特异性好、可大量制备的单抗，建立的夹心法灵敏度高，成本低，与肠炎沙门氏菌、E.coli、E.coliO157:H7、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌无交叉反应，为食品中阪崎肠杆菌的检测提供了快速高效的分析手段。

Description

一种检测食品中阪崎肠杆菌的双抗体夹心法

技术领域

本发明涉及了一种检测食品中阪崎肠杆菌的双抗体夹心法，属于免疫分析领域。

背景技术

  阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）是一种婴儿配方奶粉中的病原菌，其污染与控制在第35次CCFH大会上引起了关注。生物学上阪崎肠杆菌是一类寄生在人与动物肠道中的周生鞭毛、能运动、无芽孢的革兰氏阴性细菌，在一定条件下可引起人和动物致病。主要抗原有O抗原、H抗原、Vi抗原。由其引发的婴儿、早产儿脑膜炎、败血症及坏死性结肠炎散发和暴发的病例已在全球相继出现。多份研究报告表明婴儿配方奶粉是当前发现致婴儿、早产儿脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎的主要感染渠道，在某些情况下，由阪崎肠杆菌引发疾病而导致的死亡率可达40%～80%。阪崎肠杆菌已引起世界多国相关部门的重视。

  2008年研究表明阪崎肠杆菌实际上至少包括6 个基因种，现已将阪崎肠杆菌定义为肠杆菌科的一个新属——克罗诺杆菌属(Cronobacter sp.)。良好规范的生产操作过程和危害分析与关键点控制（HACCP）等管理体系的应用可以很大程度上减少食源性致病菌的发生。然而对原料和生产过程、产品的质量监测也是保障食品生物安全的重要过程。

  目前检测阪崎肠杆菌的方法主要有培养法、免疫学检测方法、分子检测方法。传统的生化培养法是检测阪崎肠杆菌的国标方法，尽管权威可靠，但一般需要5-10天得到结果，且操作过程繁琐，不能适应快速检测的要求；分子检测方法是基于阪崎肠杆菌脱氧核糖核酸（DNA）聚合酶链式反应（PCR）建立起来的。目前发展为传统PCR、实时荧光定量PCR（RT-PCR）、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)。与传统PCR相比，RT-PCR具有实现定量检测目标DNA、特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。LAMP方法具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方面不亚于常规PCR技术，不依赖专门的仪器设备，可以现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR。同样常规PCR和实时PCR也面临着检测成本高、对操作人员技术要求较高的问题。

  免疫学检测方法主要有酶联免疫反应（ELISA）、免疫层析试纸条（Immuno chromatographic test strip）。ELISA凭借其灵敏、快速、特异性好、易于推广的特点成为食源性致病菌的常规检测方法。抗体的亲和力、交叉反应、稳定性对于ELISA方法的灵敏度和特异性有着关键性的决定作用。虽然胶体金试纸条具有操作简单、稳定性高、不需要借助专门仪器、适合现场快速检测的优点，但一般而言，ELISA比胶体金试纸条具有更好的灵敏度，而且更适合高通量检测，因此ELISA也具有相当广泛的应用空间。

  本发明首次采用菌体菌，与耦联BSA的阪崎肠杆菌LPS同时免疫的方法，成功制备了高灵敏的阪崎肠杆菌菌体的单克隆抗体并应用两株单克隆抗体实现了阪崎肠杆菌的双抗体夹心法检测。单纯的通过菌体免疫制备阪崎肠杆菌的单克隆抗体进行夹心法检测比较困难的。作为阪崎肠杆菌的主要抗原，且在菌体表面大量均匀分布，LPS是有潜力的检测抗原且其可以很好的避免检测中假阴性结果的出现。但LPS的免疫原性较弱，在小鼠体内很难引起足够的免疫应答。因此我们将阪崎肠杆菌的LPS与BSA进行耦联作为一种免疫原进行免疫。并将两种免疫方法同时进行免疫工作。

发明内容

(一)要解决的技术问题

  本发明的目的提供一种检测食品中阪崎肠杆菌的双抗体夹心法，在于建立一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的酶联免疫吸附检测方法，用于食品中阪崎肠杆菌的批量、快速检测。

(二) 本发明的技术方案

为实现上述目的，本发明建立了一种基于单克隆抗体的检测食品中阪崎肠杆菌的双抗体夹心法，该方法包括对检测方法的优化。

其中，单克隆抗体是采用阪崎肠杆菌菌体，与耦联BSA的阪崎肠杆菌LPS同时免疫，经过特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，经杂交瘤技术融合、筛选得到的。

其中，用于配对的抗体是通过优化参数下夹心法配对，并通过多次试验筛选确定的，具有稳定性好、灵敏度高的特点。

其中，建立的夹心法优化了包被抗体的浓度，包被液，封闭液，标准品稀释液，酶标抗体稀释液，酶标抗体稀释浓度。LOD达到了53000 CFU/mL，R²为0.998。

一种基于单克隆抗体的检测食品中阪崎肠杆菌的双抗体夹心法，步骤为：

（1）阪崎肠杆菌菌体与耦联BSA的阪崎肠杆菌LPS单克隆抗体的制备

    以阪崎肠杆菌ATCC 29544菌体，与耦联BSA的阪崎肠杆菌提取的LPS分别做为免疫原，同时免疫 8周龄的BALB/c小鼠，进行免疫、融合、筛选，共筛选到11个细胞株；

所述阪崎肠杆菌ATCC 29544菌，购自上海北诺生物科技有限公司及中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）等市售品；

免疫程序如下：第一周进行首免，（10^8cfu阪崎肠杆菌菌体/100μg耦联BSA的阪崎肠杆菌LPS）/只，弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射；第四周进行二免，（10^8cfu阪崎肠杆菌菌体/80μg耦联BSA的阪崎肠杆菌LPS）/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第六周进行三免，（10^8cfu阪崎肠杆菌菌体/60μg耦联BSA的阪崎肠杆菌LPS）/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第七周尾部采血测效价，分别挑选对阪崎肠杆菌菌体效价最高的老鼠；第九周进行冲刺免疫，10^7cfu阪崎肠杆菌菌体/40μg耦联BSA的阪崎肠杆菌LPS/只，生理盐水溶解，腹腔注射；冲刺免疫3天后分别眼眶采血后进行融合、筛选，共筛选到11个细胞株；

（2）单克隆抗体的配对筛选

将纯化后的11株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对，配对参数如下：包被抗体2μg/mL；包被液为pH9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液；标品浓度10^8cfu/mL；标品稀释液pH7.2、0.01M的PBS；酶标抗体稀释500倍使用，在此条件下，实验成功得到了8对P/N值>5的配对；

（3）夹心法的建立

选择检测限稳定、灵敏的配对，即以CGMCC No.7207为包被抗体，CGMCC No.7208为酶标抗体建立夹心法；具体参数如下：

抗体包被浓度：2μg/mL，

包被液：pH9.6、0.01M碳酸盐缓冲液，

标品稀释液：含0.2% Tween 的pH7.2、0.01M的PBS，

检测抗体浓度：2.5μg/mL，

反应时间：包被、封闭：37℃，2h；标准品：37℃，1h；检测抗体37℃，1h；显色10min；

优化后阪崎肠杆菌夹心法的LOD为53000 CFU/mL。

本发明方法的检测分析原理是：

酶标板上包被了捕获抗体7号，合适的浓度下可以最大限度捕获阪崎肠杆菌；洗板3次，洗去未结合的抗体，加入封闭液220μL封闭板孔上多余结合位点；洗板3次，加入样品及对照，37℃孵育1h；洗板3次，加入酶标抗体8号-HRP，37℃孵育1h；洗板4次，加入显色液显色12min。如果样品有足够的阪崎肠杆菌，那么阪崎肠杆菌被捕获抗体7号捕获并与酶标抗体8号-HRP结合，并催化底物在450nm产生吸收值（P/N≥2.1），并被判定为阳性；如果样品阪崎肠杆菌浓度太低（P/N＜2.1）那么样品中阪崎肠杆菌不被捕获或者捕获数量太小不足以引起足够的信号，被判定为阴性。

(三) 本发明的有益效果

本发明提供的检测阪崎肠杆菌双抗体夹心法采用了理化性质高度均一、特异性好、可以大量制备的阪崎肠杆菌单克隆抗体，建立的夹心法灵敏度高，稳定性好、成本低，样品的前处理过程简单，能同时检测大量样品，适合食品行业大规模、高通量、快速、灵敏的检测要求，具有推广和应用价值。

生物材料样品保藏：

1、单克隆细胞株7号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.7207，保藏日期2013年1月23日。

2、单克隆细胞株8号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.7208，保藏日期2013年1月23日。

附图说明

图1 阪崎肠杆菌双抗体夹心法的标准曲线。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明。

一、仪器：

TGL－40B台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂

KFLOW纯水机，凯佛隆公司                                                    

ZD–9556水平摇床，太仓科教器材厂                                         

96孔8×12可拆酶标板，厦门怡佳美实验器材有限公司

MuLtiska Mks酶标仪，Thermo Labsystems公司

可调试移液器，Thermo Labsystems公司

涡旋混合器，上海沪西仪器分析厂

二、试剂：

四甲基联苯胺(TMB)，上海晶纯实业有限公司

其他试剂均为分析纯试剂

三、步骤

1．单克隆抗体的制备

（1）实验动物：选5只，8周龄的BALB/c小鼠进行免疫；

（2）抗原配置：将免疫原用生理盐水稀释，分别配成10^9CFU/mL与1mg/mL的溶液；

（3）乳化：将上述溶液与等量完全或不完全福氏佐剂用混合搅拌法将其乳化，乳化完全后皮下多点注射小鼠；

免疫方法：按照特定免疫流程免疫小鼠，3免后用间接竞争法测定效价，效价达到要求后，进行冲刺免疫；冲免3天后眼眶采血后进行融合；

（4）采血：第三次免疫后1周进行断尾采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价；

（5）融合、筛选：采用杂交瘤技术进行融合，采用间接Elisa筛选阳性细胞孔，采用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆；

（6）抗体的纯化和保存：采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水，透析后得到单克隆抗体，采用微量紫外方法测定其浓度后分装后放入-20℃保存。

2、ELISA反应过程：

抗体效价测定步骤：

（1）将包被原用包被缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板，100 μL/孔，于4 ℃冰箱过夜。次日取出酶标板回至室温，每孔注入200 μL PBST溶液，摇床上振荡3 min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤2次。以下洗涤方法相同；

（2）充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200 μL/孔，于37 ℃温育箱内温育2 h后取出烘干待用；

（3）将阳性血清系列稀释对应加入到酶标板的前7行列，第8行加入阴性血清，100 μL/孔，37℃孵育1 h后洗涤、拍干；

（4）每孔加入100 μL，1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h后洗涤、拍干；

（5）每孔加入100 μL显色液(TMB与底物液比例为1:5)，暗处37℃反应15 min，取出后每孔加入50 μL终止液(2 mol/L的硫酸)，用酶标仪测定吸光值A₄₅₀。

阪崎肠杆菌双抗体夹心法测定步骤：

a、包被：用2μg/mL的7号包被酶标板，100μL /孔，4℃过夜；

b、洗涤：用PBST洗涤反应板三次，每次3min，200μL/孔，然后甩干反应板；

c、封闭：含0.2%明胶的CBS，200μL /孔，37℃封闭2h；

d、洗涤：同b；

e、样品：用PBST将阪崎肠杆菌稀释成1.00*10^8、3.33E*10^7、1.11*10^7、3.70 *10^6、1.23 *10^6、4.11 *10^5、1.37 *10^5、4.57*10^4、1.52 *10^4 cfu/mL系列浓度，另设一个PBST空白对照。每孔加入100μL样品，于37℃温育1h；

f、洗涤：同b；

g、加酶标抗体(8号-HRP，2.5μg/mL)，100μL /孔，37℃反应1h。

h、洗涤：同b；

i、显色：加底物TMB 100μL /孔，显色10min；

j、终止：加终止液50μL /孔；

k、测定：用酶标仪检测OD₄₅₀nm。

交叉率的测定

将肠炎沙门氏菌、E.coli、E.coli O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌分别精确稀释成10^8 cfu/mL、10^7 cfu/mL、10^6 cfu/mL、10^5cfu/mL，在建立的阪崎肠杆菌双抗体夹心法体系中检测吸光值，并设空白孔和阪崎肠杆菌阳性对照，每个浓度做6次测定平均值，做3次重复实验。

试验结果如下：

1、标准曲线：本发明所获得的抗原检测的检测范围为1.4*10^5～1.1*10^8cfu/mL，R²=0.998，具体请见说明书附图。

2、LOD：LOD是空白的平均吸收值加3倍的空白吸收值的标准偏差对应的抗原浓度，阪崎肠杆菌双抗体夹心法LOD为53000 CFU/mL。

3、交叉反应率(CR%)

结果：阪崎肠杆菌正常显色，而10^8 cfu/mL及以下浓度的其它测试菌株均不显色（OD< 0.15）。说明建立的阪崎肠杆菌夹心法与肠炎沙门氏菌、E.coli、E.coli O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌无交叉反应，特异性良好。

Claims (1)

1.一种基于单克隆抗体的检测食品中阪崎肠杆菌的双抗体夹心法，其特征在于步骤为：

（1）单克隆抗体的制备

    以阪崎肠杆菌ATCC 29544菌体及耦联BSA的阪崎肠杆菌提取的LPS分别做为免疫原，同时免疫 8周龄的BALB/c小鼠，进行免疫、融合、筛选，共筛选到11个细胞株；

（2）单克隆抗体的配对筛选

将纯化后的11株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对，配对参数如下：包被抗体2μg/mL；包被液为pH9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液；标品浓度10^8cfu/mL；标品稀释液pH7.2、0.01M的PBS；酶标抗体稀释500倍使用，在此条件下，实验成功得到了8对P/N值>5的配对；

（3）夹心法的建立

选择检测限稳定、灵敏的配对，即以CGMCC No.7207为包被抗体，CGMCC No.7208为酶标抗体建立夹心法；具体参数如下：

抗体包被浓度：2μg/mL，

包被液：pH9.6、0.01M碳酸盐缓冲液，

标品稀释液：含0.2% Tween 的pH7.2、0.01M的PBS，

酶标抗体浓度：2.5μg/mL，

反应时间：包被：4℃过夜、封闭：37℃，2h；标准品：37℃，1h；酶标抗体37℃，1h；显色10min；

优化后阪崎肠杆菌夹心法的LOD为53000 CFU/mL。