CN103134937B - 一种检测牛奶中β-内酰胺酶的双抗体夹心法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测牛奶中β-内酰胺酶的双抗体夹心法，属于免疫分析技术领域。本发明应用购于上海阿拉丁试剂公司的重组β-内酰胺酶免疫8周龄的BALB/c小鼠，经过正常的免疫、细胞融合、筛选后得到15株β-内酰胺酶单克隆抗体。15株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶（HRP）并进行两两配对。以JN2011-03、JN2011-04分别为包被抗体和酶标抗体，以β-内酰胺酶为标准品建立了β-内酰胺酶的夹心ELISA分析方法，LOD为1.22ng/mL，线性范围为10-100ng/mL。本发明采用理化性质高度均一、特异性好、可以大量制备的单克隆抗体，建立的夹心法灵敏度高，成本低，为牛奶中非法添加物β-内酰胺酶的检测提供了快速高效的分析手段。

Description

一种检测牛奶中β-内酰胺酶的双抗体夹心法

技术领域

本发明涉及了一种检测牛奶中β-内酰胺酶的双抗体夹心法，属于免疫分析技术领域。 

背景技术

β-内酰胺酶是由革兰氏阴性菌分泌的一类可以选择性分解β-内酰胺类抗生素的酶蛋白。β-内酰胺酶具有使β-内酰胺类抗生素的母核内酰胺环被破坏而失去活性的能力，产β-内酰胺酶是某些细菌耐药的原因。 

由于食品中残留的抗生素会破坏胃肠道菌群平衡，引起过敏体质者产生剧烈的过敏反应，严重时危及生命，长期食用含有抗生素残留的食品会增强体内细菌的耐药性。同时，残留的抗生素的原奶不能用于生产发酵乳，附加值较低。因此，近年来β-内酰胺酶开始被添加到原奶中用于消除残留的β-内酰胺类抗生素，从而使不合格的原奶或者奶制品中β-内酰胺类抗生素含量合格。然而β-内酰胺酶制剂的安全性信息尚未可知，因此我国禁止在食品中添加β-内酰胺酶，并出台了一系列β-内酰胺酶的检测规定。 

目前检测β-内酰胺酶的方法主要有微生物培养法，碘量法，酸量法等。微生物法利用克拉维酸、舒巴坦的特异性抑制β-内酰胺酶的特点做细菌培养，通过测量抑菌圈得出结果，优点是不需特殊试剂，容易操作，结果容易判断，但特异性差，灵敏度一般在5μ/mL。碘量法是根据β-内酰胺酶类抗生素经β-内酰胺酶作用而产生的酸与碘结合, 与淀粉竞争游离碘，从而使兰色的碘淀粉复合物褪色的原理而设计的。该法试剂易得、简便易行、重现性好，可迅速获取结果，主要缺点是需要高浓度底物，灵敏度较差，且不适用于头孢菌素。酸量法是根据青霉素或头抱菌素经β-内酰胺酶作用产生裂解酸引起 pH 值变化，使指示剂色变或碳酸钠溶液释放出二氧化碳的压力变化及以碱滴定来设计的。这些检测方法均利用β-内酰胺酶的催化能力进行检测，缺点是检测限依然不能满足实际检测的需求而且无法区分外源性和内源性的β-内酰胺酶。 

Elisa凭借其灵敏、快速、特异性好、易于推广的特点越来越多地用于食品安全检测中。对于牛奶中β-内酰胺酶的检测，双抗体夹心Elisa具有以下特点：首先，基于抗原抗体特异性识别原理，不依赖酶活检测，降低了基质pH、温度、离子强度等环境条件对检测的影响，稳定性好、灵敏度高。其次，由于内源性的β-内酰胺酶存在于细菌的周质空间而不分泌到菌体外，所以理论上Elisa可以区分牛奶中非法添加的β-内酰胺酶与存在于牛奶中起作用的内源性的β-内酰胺酶。单克隆抗体具有理化性质高度均一、特异性好、可以大量制备的优点，因此，在Elisa方法的建立中具有更大的意义。因此有必要开发一种基于单克隆抗体双抗体夹心法的β-内酰胺酶检测方法。 

发明内容

(一)要解决的技术问题 

  本发明的目的在于建立一种具有高灵敏度、操作方法简单的酶联免疫吸附检测方法，用于牛奶中β-内酰胺酶的批量、快速检测。

(二)技术方案 

为实现上述目的，本发明建立了一种牛奶中β-内酰胺酶的双抗体夹心检测方法，该方法包括对检测方法的优化。

其中，单克隆抗体是采用重组β-内酰胺酶经过特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，经杂交瘤技术融合、筛选得到的。 

其中，用于配对的抗体是通过优化参数下夹心法配对，并通过多次试验筛选确定的，具有稳定性好、灵敏度高的特点。 

其中，建立的夹心法优化了包被抗体的浓度，包被液，封闭液，标准品稀释液，酶标抗体稀释液，酶标抗体稀释浓度。LOD达到1.22ng/mL，R²为0.99。 

本发明方法的检测分析原理是： 

酶标板上包被了JN2011-03抗体，合适的浓度下可以最大限度捕获β-内酰胺酶；洗板3次，洗去未结合的包被抗体，加入封闭液200μL封闭板孔上多余结合位点；洗板3次，加入样品及对照，37℃孵育1h；洗板3次，加入酶标抗体JN2011-04-HRP，37℃孵育1h；洗板4次，加入显色液显色12min。如果样品中β-内酰胺酶浓度≥15ng/mL的，那么样品中β-内酰胺酶被包被抗体JN2011-03捕获并与酶标抗体JN2011-04-HRP结合，并催化底物在450nm产生吸收值，并被判定为阳性；如果样品中β-内酰胺酶浓度＜15ng/mL，那么样品中β-内酰胺酶不被包被抗体JN2011-03捕获或者捕获数量太小不足以引起足够的信号，被判定为阴性。

（1）β-内酰胺酶单克隆抗体的制备 

    以重组表达的β-内酰胺酶（阿拉丁试剂公司，上海，1000unit）为免疫原，免疫 8周龄的BALB/c小鼠，免疫程序如下：第一周进行首免，100μg/只，弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射；第四周进行二免，100ug/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第六周进行三免，50μg/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第七周尾部采血测效价，选择效价最高的老鼠；第八周进行冲刺免疫，20μg/只，生理盐水溶解，腹腔注射；冲刺免疫3天后眼眶采血后进行融合。筛选采用间接Elisa进行，共筛选到15个细胞株。

（2）单克隆抗体的配对筛选 

将纯化后的15株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶（HRP），直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对。配对参数如下：包被抗体5μg/mL；包被液为0.01M，pH9.6的碳酸盐缓冲液；标品浓度50ng/mL，标品稀释液0.01M、pH7.2 的PBS；酶标抗体稀释500倍使用。在此条件下，实验成功得到了14对P/N值>10的配对。

（3）夹心法的建立 

选择检测限最稳定的配对，即以JN2011-03为包被抗体，以JN2011-04作为酶标抗体建立夹心法。具体参数如下：

包被抗体包被浓度：6μg/mL

包被液：0.01M，pH9.6碳酸盐缓冲液CBS

封闭液：含0.2%明胶的0.01M，pH9.6CBS，200μL /孔，37℃封闭2h。

标品稀释液：0.01M，pH7.2 PBS 

洗涤液：含0.05%吐温-20的PBS

检测抗体浓度：4μg/mL

抗体稀释液：含有0.1%（W/V）明胶和0.05%吐温-20的PBS

显色液A：0.933 g柠檬酸，3.68 g Na₂HPO₄·12H₂O，18 μL 30%H₂O₂，100mL水

显色液B：60 mg四甲基联苯胺（TMB）溶于100 mL乙二醇。

显色液：显色液应在使用前，按照显色液A:显色液B体积比=5:1的比例配置使用 

反应时间：包被、封闭37℃，2h；标准品，37℃，1h；检测抗体37℃，1h；显色12min。

终止液：2 mol/L的硫酸 

优化后β-内酰胺酶夹心法，LOD：1.22ng/mL（检测限15ng/mL），相当于15U/L，这比目前报道的方法具有更高的灵敏度。

 (三)有益效果 

本发明提供的β-内酰胺酶双抗体夹心检测方法采用了理化性质高度均一、特异性好、可以大量制备的单克隆抗体，建立的夹心法灵敏度高，稳定性好、成本低，样品的前处理过程简单，能同时检测大量样品，适合食品行业大规模、高通量、快速、灵敏的检测要求，具有推广和应用价值。

生物材料样品保藏 

1、小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株，培养物株号为JN2011-03，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，登记编号为CGMCC8.90003，保藏曰期为2011年5月31日。 

2、小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株，培养物株号为JN2011-04，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，登记编号为CGMCC8.90004，保藏曰期为2011年5月31日。 

附图说明

图1  β-内酰胺酶双抗体夹心法的标准曲线。 

具体实施方案

以下通过实施例进一步说明本发明。 

一、仪器： 

TGL－40B台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂

KFLOW纯水机，凯佛隆公司                                                    

ZD–9556水平摇床，太仓科教器材厂                                         

96孔8×12可拆酶标板，厦门怡佳美实验器材有限公司

MuLtiska Mks酶标仪，Thermo Labsystems公司

可调试移液器，Thermo Labsystems公司

涡旋混合器，上海沪西仪器分析厂

二、试剂：

四甲基联苯胺(TMB)，上海晶纯实业有限公司

其他试剂均为分析纯试剂

三、步骤

1．单克隆抗体的制备

1)实验动物：选5只，7周龄的BALB/c小鼠进行免疫。

2)抗原配置：将免疫原用生理盐水稀释，配成1mg/mL的溶液。 

3)乳化：将上述溶液与等量完全或不完全福氏佐剂用混合搅拌法将其乳化，乳化完全后皮下多点注射小鼠。 

免疫方法：按照特定免疫流程（该免疫过程后老鼠达到了较高的效价，并且没有耐受）免疫小鼠，3免后用间接竞争法测定效价，效价达到要求后，进行冲刺免疫；冲免3天后眼眶采血后进行融合。 

4)采血：第三次免疫后1周进行断尾采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。 

5)融合、筛选：采用杂交瘤技术进行融合，采用间接Elisa筛选阳性细胞孔，采用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆。 

6)抗体的纯化和保存：采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水，透析后得到单克隆抗体，采用微量紫外方法测定其浓度后分装后放入-20℃保存。 

2、ELISA反应过程： 

抗体效价测定步骤：

1)将包被原用包被缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板，100 μL/孔，于4 ℃冰箱过夜。次日取出酶标板回至室温，每孔注入200 μL PBST溶液，摇床上振荡3 min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤2次。以下洗涤方法相同。

2)充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200 μL/孔，于37 ℃温育箱内温育2 h后取出烘干待用。 

3)将阳性血清系列稀释对应加入到酶标板的前7行列，第8行加入阴性血清，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h后洗涤、拍干。 

4)每孔加入100 μL，1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h后洗涤、拍干。 

5)每孔加入100 μL显色液 (显色液A:显色液B=5:1)，暗处37 ℃反应15 min，取出后每孔加入100 μL终止液(2 mol/L的硫酸)，用酶标仪测定吸光值A_450nm。 

牛奶中β-内酰胺酶双抗体夹心法测定步骤： 

a、包被：用6μg/mL的JN2011-03抗体包被酶标板，100μL /孔，4℃过夜；

b、洗涤：用PBST洗涤酶标板三次，每次3min，200μL / 孔，然后甩干酶标板，所述PBST为含0.05%吐温-20的PBS；

c、封闭：含0.2%明胶的0.01M，pH9.6 CBS，200μL /孔，37℃封闭2h；

d、洗涤：同b；

e、样品：用样品稀释液0.01M，pH7.2 PBS将β-内酰胺酶母液从111ng/mL开始稀释成111 ng/mL、55.5ng/mL、27.75ng/mL、13.875ng/mL、6.9375ng/mL、3.46875ng/mL共6个梯度，另设一个PBS空白对照，酶标板1-6列每孔加入100μL系列梯度浓度样品，第7、8列加入空白对照，于37℃孵育1h；

f、洗涤：同b；

g、加酶标抗体(JN2011-04-HRP，用含有0.1%明胶和0.05%吐温-20的PBS的抗体稀释液稀释至4μg/mL，100μL /孔，37 C孵育1h；

h、洗涤：同b。

i、显色：加显色液100μL /孔，显色15min； 

显色液应在使用前，按照显色液A:显色液B体积比=5:1的比例配置使用；

显色液A：0.933 g柠檬酸，3.68 g Na₂HPO₄·12H₂O，18 μL 30%H₂O₂，100mL水

显色液B：60 mg四甲基联苯胺TMB溶于100 mL乙二醇；

j、终止：加2 mol/L硫酸终止液，50μL /孔；

k、测定：用酶标仪检测OD₄₅₀nm，绘制β-内酰胺酶双抗体夹心法的标准曲线，样品测定时从该标准曲线上OD₄₅₀nm值对应求得样品中β-内酰胺酶含量。

试验结果如下： 

1、标准曲线：本实验所获得的抗原检测的线性范围为10～100ng/mL，R²=0.99，具体请见说明书附图1。

2、LOD：LOD是空白的平均吸收值加3倍的标准偏差对应的抗原浓度，β-内酰胺酶双抗体夹心法LOD为1.22ng/mL。 

Claims (2)

1.一种检测牛奶中β-内酰胺酶的双抗体夹心法，其特征在于

酶标板上包被了CGMCC 8.90003抗体，合适的浓度下最大限度捕获β-内酰胺酶；洗板3次，洗去未结合的包被抗体，加入封闭液200μL封闭板孔上多余结合位点；洗板3次，加入样品及对照，37℃孵育1h；洗板3次，加入酶标抗体CGMCC 8.90004-HRP，37℃孵育1h；洗板4次，加入显色液显色12min；

样品中β-内酰胺酶浓度≥15ng/mL，样品中β-内酰胺酶被包被抗体CGMCC 8.90003捕获并与酶标抗体CGMCC 8.90004-HRP结合，并催化底物在450nm产生吸收值，并被判定为阳性；

样品中β-内酰胺酶浓度＜15ng/mL，样品中β-内酰胺酶不被包被抗体CGMCC 8.90003捕获或者捕获数量太小不足以引起足够的信号，被判定为阴性。

2.根据权利要求1所述的检测牛奶中β-内酰胺酶的双抗体夹心法，其特征在于：测定步骤为：

a、包被：用6μg/mL的CGMCC 8.90003抗体包被酶标板，100μL /孔，4℃过夜；

b、洗涤：用PBST洗涤酶标板三次，每次3min，200μL / 孔，然后甩干酶标板，所述PBST为含0.05%吐温-20的PBS；

c、封闭：含0.2%明胶的0.01M，pH9.6 CBS，200μL /孔，37℃封闭2h；

d、洗涤：同b；

e、样品：用样品稀释液0.01M，pH7.2 PBS 将β-内酰胺酶母液从111ng/mL开始稀释成111 ng/mL、55.5ng/mL、27.75ng/mL、13.875ng/mL、6.9375ng/mL、3.46875ng/mL共6个梯度，另设一个PBS空白对照，酶标板1-6行每孔加入100μL系列梯度浓度样品，第7、8行加入空白对照，于37℃孵育1h；

f、洗涤：同b；

g、加酶标抗体CGMCC 8.90004-HRP，用含有0.1%明胶和0.05%吐温-20的PBS的抗体稀释液稀释至4μg/mL，100μL /孔，37 C孵育1h；

h、洗涤：同b；

i、显色：加显色液100μL /孔，显色15min；

显色液应在使用前，按照显色液A:显色液B体积比=5:1的比例配置使用；

显色液A：0.933 g柠檬酸，3.68 g Na₂HPO₄·12H₂O，18 μL 30%H₂O₂，100mL水

显色液B：60 mg四甲基联苯胺TMB溶于100 mL乙二醇；

j、终止：加2 mol/L硫酸终止液，50μL /孔；

k、测定：用酶标仪检测OD₄₅₀nm，绘制β-内酰胺酶双抗体夹心法的标准曲线，样品测定时从该标准曲线上OD₄₅₀nm值对应求得样品中β-内酰胺酶含量。