CN104360069B - 一种检测丁香假单胞菌丁香致病变种的双抗体夹心酶联免疫法 - Google Patents

一种检测丁香假单胞菌丁香致病变种的双抗体夹心酶联免疫法 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫分析领域。本发明用丁香假单胞菌丁香致病变种NCPPB？2844免疫8周龄BALB/c小鼠，经免疫、细胞融合、筛选得7株单抗。7株单抗分别标记HRP并以NCPPB？2844作标准品两两配对。以13B10抗体为包被抗体，13B10抗体标记HRP后为酶标抗体，以NCPPB？2844为标准品建立了丁香致病变种的夹心ELISA法。LOD：2.4×104？cfu/mL，线性范围4.57×104~1.11×108cfu/mL。本发明用理化性质高度均一、特异性好、可大量制备的单抗建立的夹心法灵敏度高，成本低，特异性好，为丁香致病变种的检测提供快速高效的分析手段。

Description

一种检测丁香假单胞菌丁香致病变种的双抗体夹心酶联免疫法
技术领域
本发明涉及了一种检测丁香假单胞菌丁香致病变种的双抗体夹心酶联免疫法，属于酶联免疫分析领域。
背景技术
丁香假单胞菌（Pseudomonassyringae）是一种常见植物致病菌，属于革兰氏染色阴性细菌假单胞菌属（Pseudomonas）。假单胞菌是一类重要的植物病原菌，主要侵染十字花科植物引起叶片或根茎的疾病。丁香假单胞菌可以引发多种植物产生超敏反应，可使40多种植物致病，引发植物的叶片、根茎等处疾病，而且该菌还是一种冰核细菌，可使植物在较高温度下产生冻害。丁香假单胞菌的部分成员具有宿主特异性，根据其寄主植物的不同以及所引发症状的不同可分为40多种致病变种（pv.）。丁香假单胞菌丁香致病变种，学名：Pseudomonassyringaepv.syringae，丁香属植物发病后出现叶部坏死斑，严重时病斑迅速扩散最终导致失去观赏价值和绿化价值，因此研究并提出相应的综合防治建议具有非常重要的意义。
对丁香假单胞菌丁香致病变种的传统检测技术耗时长，且检测结果存在不可靠性。PCR检测方法快速、准确、灵敏，但是技术条件高，设备昂贵，普及推广受到很大限制。
建立丁香假单胞菌丁香致病变种的有效而且便捷快速的检测方法有利于对丁香属植物的检验、检疫。而ELISA方法凭借其灵敏、快速、特异性好、易于推广的特点成为致病菌的常规检测方法。抗体的亲和力、交叉反应、稳定性对于ELISA方法的灵敏度和特异性有着关键性的决定作用。
因此本发明制备了高灵敏的丁香假单胞菌丁香致病变种的单克隆抗体并以此为基础建立了双抗体夹心ELISA法，为丁香属植物中丁香假单胞菌丁香致病变种的大批量、快速、准确的检测奠定基础。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的在于建立一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的酶联免疫吸附检测方法，用于丁香属植物中丁香假单胞菌丁香致病变种的大批量、快速、准确检测。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明建立了一种丁香属植物中丁香假单胞菌丁香致病变种的双抗体夹心检测方法，该方法包括对检测方法的优化。
其中，单克隆抗体是采用丁香假单胞菌丁香致病变种菌体NCPPB2844经过特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，经杂交瘤技术融合、筛选得到的。
其中，用于配对的抗体是通过优化参数下夹心法配对，并通过多次试验筛选确定的，具有稳定性好、灵敏度高的特点。
其中，建立的夹心法优化了包被抗体的浓度，包被液，封闭液，标准品稀释液，酶标抗体稀释液，酶标抗体稀释浓度。LOD达到了2.4×104cfu/mL。
一种基于单克隆抗体的检测丁香属植物中丁香假单胞菌丁香致病变种的双抗体夹心酶联免疫法，步骤为：
（1）丁香假单胞菌丁香致病变种单克隆抗体的制备
以丁香假单胞菌丁香致病变种NCPPB2844（来自湖南省进出口检验检疫局）菌体做为免疫原，免疫8周龄的BALB/c小鼠，经杂交瘤技术融合、筛选，共筛选到7个细胞株；
（2）单克隆抗体的配对筛选
将纯化后的7株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对；配对参数如下：包被抗体2μg/mL；包被液为0.01M、pH9.6的碳酸盐缓冲液；标品浓度1×108cfu/mL；标品稀释液0.01M、pH7.2的PBS+0.2%Tween；酶标抗体稀释500倍使用；在此条件下，实验成功得到了5对P/N值>2.1的配对；
（3）夹心法的建立
选择检测限稳定、灵敏的配对，即以编号13B10抗体即CGMCCNo.9801单克隆细胞株L作为包被抗体，编号13B10抗体标记辣根过氧化酶HRP后作为酶标检测抗体13B10-HRP，建立夹心法；具体参数如下：
包被抗体13B10浓度：2μg/mL；
包被液：0.01M、pH9.6碳酸盐缓冲液；
标品稀释液：0.01M、pH7.2PBS+0.2%Tween；
酶标检测抗体13B10-HRP浓度：2.5μg/mL；
反应时间：包被抗体：封闭37℃，反应2h；标准品：37℃，反应1h；酶标检测抗体37℃，反应1h；显色时间10min。
丁香假单胞菌丁香致病变种夹心法的LOD：2.4×104cfu/mL。
本发明方法的检测分析原理是：
酶标板上包被了捕获抗体13B10，合适的浓度下可以最大限度捕获丁香假单胞菌丁香致病变种；洗板3次，洗去未结合的抗体，加入封闭液220μL封闭板孔上多余结合位点；洗板3次，加入样品和对照，37℃孵育1h；洗板3次，加入酶标抗体13B10-HRP，37℃孵育1h；洗板4次，加入显色液显色10min。如果样品有足够的丁香假单胞菌丁香致病变种菌体，那么丁香假单胞菌丁香致病变种菌体被捕获抗体13B10捕获并与酶标抗体13B10-HRP结合，并催化底物在450nm产生吸收值，并被判定为阳性（P/N≥2.1）；如果样品丁香假单胞菌丁香致病变种菌体浓度太低那么样品不被捕获或者捕获数量太小不足以引起足够的信号，被判定为阴性（P/N≤2.1）。
(三)有益效果
本发明提供的丁香假单胞菌丁香致病变种双抗体夹心检测方法采用了理化性质高度均一、特异性好、可以大量制备的丁香假单胞菌丁香致病变种单克隆抗体，建立的夹心法灵敏度高，稳定性好、成本低，样品的前处理过程简单，能同时检测大量样品，适合丁香属植物中大规模、高通量、快速、灵敏的检测要求，具有推广和应用价值。
生物材料样品保藏：一株单克隆细胞株L（又称13B10），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2014年10月15日，保藏编号为CGMCCNo.9801。
附图说明
图1丁香假单胞菌丁香致病变种双抗体夹心法的标准曲线。
具体实施方案
以下通过实施例进一步说明本发明。
一、仪器：
TGL－40B台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂
KFLOW纯水机，凯佛隆公司
ZD–9556水平摇床，太仓科教器材厂
96孔8×12可拆酶标板，厦门怡佳美实验器材有限公司
MuLtiskaMks酶标仪，ThermoLabsystems公司
可调试移液器，ThermoLabsystems公司
涡旋混合器，上海沪西仪器分析厂
二、试剂：
四甲基联苯胺(TMB)，上海晶纯实业有限公司
其他试剂均为分析纯试剂
三、步骤
1．单抗制备
1)实验动物：选5只，8周龄的BALB/c小鼠进行免疫；
2)抗原配置：将免疫原用生理盐水稀释，配成1×109cfu/mL的溶液；
3)乳化：将上述溶液与等量完全或不完全福氏佐剂用混合搅拌法将其乳化，乳化完全后皮下多点注射小鼠；
免疫方法：按照特定免疫流程免疫小鼠，3免后用间接竞争法测定效价，效价达到要求后，进行冲刺免疫；冲免3天后眼眶采血后进行融合；
4)采血：第三次免疫后1周进行断尾采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价；
5)融合、筛选：采用杂交瘤技术进行融合，采用间接ELISA筛选阳性细胞孔，采用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆；
6)抗体的纯化和保存：采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水，透析后得到单克隆抗体，采用微量紫外方法测定其浓度后分装，放入-20℃保存。
2、ELISA反应过程：
抗体效价测定步骤：
1)将包被原用包被缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板，100μL/孔，于4℃冰箱过夜。次日取出酶标板回至室温，每孔注入200μLPBST溶液，摇床上振荡3min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤2次。以下洗涤方法相同；
2)充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，220μL/孔，于37℃温育箱内温育2h后取出烘干待用；
3)将阳性血清系列稀释对应加入到酶标板的前7行列，第8行加入阴性血清，100μL/孔，37℃孵育1h后洗涤、拍干；
4)每孔加入100μL，1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1h后洗涤、拍干；
5)每孔加入100μL显色液(TMB与底物液比例为1:5)，暗处37℃反应15min，取出后每孔加入50μL终止液(2mol/L的硫酸)，用酶标仪测定吸光值A450。
丁香假单胞菌丁香致病变种双抗体夹心法测定步骤：
a、包被：用2μg/mL的13B10包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜；
b、洗涤：用PBST洗涤反应板三次，每次3min，200μL/孔，然后甩干反应板；
c、封闭：含0.2%明胶的CBS，220μL/孔，37℃封闭2h；
d、洗涤：同b；
e、样品：用PBST将丁香假单胞菌丁香致病变种稀释成1.0×109、3.33×108、1.11×108、3.70×107、1.23×107、4.11×106、1.37×106、4.57×105、1.52×105cfu/mL系列浓度，另设一个PBST空白对照。每孔加入100μL样品，于37℃温育1h；
f、洗涤：同b；
g、加酶标抗体(13B10-HRP，2.5μg/mL)，100μL/孔，37℃反应1h；
h、洗涤：同b；
i、显色：加底物TMB100μL/孔，显色10min；
j、终止：加终止液50μL/孔；
k、测定：用酶标仪检测OD450nm。
试验结果如下：
1、标准曲线：本发明所获得的抗原检测的检测范围是为4.57×104~1.11×108cfu/mL，具体请见说明书附图1。
2、LOD：LOD是空白的平均吸收值加3倍的空白吸收值的标准偏差对应的抗原浓度，丁香假单胞菌丁香致病变种双抗体夹心法LOD为2.4×104cfu/mL。

Claims (2)

1.一种基于单克隆抗体的检测丁香属植物中丁香假单胞菌丁香致病变种的双抗体夹心酶联免疫法，其特征在于步骤为：
（1）丁香假单胞菌丁香致病变种单克隆抗体的制备
以丁香假单胞菌丁香致病变种NCPPB2844菌体做为免疫原，免疫8周龄的BALB/c小鼠，经杂交瘤技术融合、筛选，得到7个细胞株；
（2）单克隆抗体的配对筛选
将纯化后的7株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对；配对参数如下：包被抗体2μg/mL；包被液为0.01M、pH9.6的碳酸盐缓冲液；标品浓度1×108cfu/mL；标品稀释液0.01M、pH7.2的PBS+0.2%Tween；酶标抗体稀释500倍使用；在此条件下，实验成功得到了5对P/N值>2.1的配对；
（3）夹心法的建立
选择检测限稳定、灵敏的配对，即以编号13B10抗体即CGMCCNo.9801单克隆细胞株L作为包被抗体，编号13B10抗体标记辣根过氧化酶HRP后作为酶标检测抗体13B10-HRP，建立夹心法；具体参数如下：
包被抗体13B10浓度：2μg/mL；
包被液：0.01M、pH9.6碳酸盐缓冲液；
标品稀释液：0.01M、pH7.2PBS+0.2%Tween；
酶标检测抗体13B10-HRP浓度：2.5μg/mL；
反应时间：包被抗体：封闭37℃，反应2h；标准品：37℃，反应1h；酶标检测抗体：37℃，反应1h；显色时间10min。
2.根据权利要求1所述基于单克隆抗体的检测丁香属植物中丁香假单胞菌丁香致病变种的双抗体夹心酶联免疫法，其特征在于丁香假单胞菌丁香致病变种夹心法的LOD：2.4×104cfu/mL。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108411017A (zh) * 2018-06-04 2018-08-17 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 检测丁香假单胞菌番茄致病变种的lamp引物及方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1673973A1 (ru) * 1990-07-21 1991-08-30 Киевский Государственный Университет Им.Т.Г.Шевченко Способ диагностики заболеваний растений, вызванных РSеUDомоNаS SYRINGae 1у серогруппы
WO2011003984A1 (fr) * 2009-07-08 2011-01-13 Clause Moyens et methodes de detection et d'identification d'une nouvelle bacterie responsable d'affections phytosanitaires sur des plantes (courgettes) et nouvelles plantes resistantes
CN103197073A (zh) * 2013-04-09 2013-07-10 江南大学 一种检测食品中大肠杆菌的酶联免疫方法
CN103558388A (zh) * 2013-10-24 2014-02-05 江南大学 一种基于单克隆抗体的检测食品中鼠伤寒沙门氏菌的双抗体夹心法
CN103713104A (zh) * 2013-12-26 2014-04-09 中华人民共和国淮安出入境检验检疫局 一种检测食品中阪崎肠杆菌的双抗体夹心法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1673973A1 (ru) * 1990-07-21 1991-08-30 Киевский Государственный Университет Им.Т.Г.Шевченко Способ диагностики заболеваний растений, вызванных РSеUDомоNаS SYRINGae 1у серогруппы
WO2011003984A1 (fr) * 2009-07-08 2011-01-13 Clause Moyens et methodes de detection et d'identification d'une nouvelle bacterie responsable d'affections phytosanitaires sur des plantes (courgettes) et nouvelles plantes resistantes
CN103197073A (zh) * 2013-04-09 2013-07-10 江南大学 一种检测食品中大肠杆菌的酶联免疫方法
CN103558388A (zh) * 2013-10-24 2014-02-05 江南大学 一种基于单克隆抗体的检测食品中鼠伤寒沙门氏菌的双抗体夹心法
CN103713104A (zh) * 2013-12-26 2014-04-09 中华人民共和国淮安出入境检验检疫局 一种检测食品中阪崎肠杆菌的双抗体夹心法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Choi Debby et al..Sandwich capture ELISA by a murine monoclonal antibody against a genus‐specific LPS epitope for the detection of different common serotypes of salmonellas.《Journal of applied bacteriology》.1992,第72卷(第2期),134-138. *

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