CN104360066B

CN104360066B - 检测副溶血性弧菌的方法及其单抗

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Publication number: CN104360066B
Application number: CN201410609247.3A
Authority: CN
Inventors: 刘箐; 丁承超
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2014-11-03
Filing date: 2014-11-03
Publication date: 2016-04-13
Anticipated expiration: 2034-11-03
Also published as: CN104360066A

Abstract

本发明属于微生物检测领域。具体而言，本发明涉及一种检测副溶血性弧菌的方法、用于该方法的两株由同一次单克隆抗体制备过程产生的抗副溶血性弧菌的单克隆抗体，该单克隆抗体可特异性地与副溶血性弧菌结合。它由小鼠杂交瘤细胞系3G9E9G3H7，CGMCC？No.8003或3G9F7D5C9，CGMCC？No.9010所产生。本发明还提供了抗副溶血性弧菌的单克隆抗体的用途。

Description

检测副溶血性弧菌的方法及其单抗

技术领域

本发明属于微生物检测领域。具体而言，本发明涉及一种检测副溶血性弧菌的方法、用于该方法的两株抗副溶血性弧菌单克隆抗体以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞。

背景技术

副溶血性弧菌(Bibrioparahemolyticus)又称为副溶血弧菌，属于弧菌属，是一种常见的病原菌。副溶血性弧菌是一种嗜盐性的革兰氏阴性菌，主要的栖息地在海水中。如果食用了遭此菌污染的海鲜，会引发食物中毒；临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。

目前副溶血性弧菌的检测主要依赖于国标所规定的生化鉴定，其缺点是操作繁琐、检测周期较长，无法适应大量的样品筛查。免疫学检测是近年来出现的最快速、准确、稳定的快速检测手段，但是检测产品全部依赖进口，我国目前尚无拥有完全自主知识产权，且可运用于检测实践的快速检测产品，该专利以副溶血性弧菌为检测靶标，所要求保护的技术涉及副溶血性弧菌快速检测产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种体外检测副溶血性弧菌的方法。

本发明的另一个目的是提供用于上述方法的两株由同一次单克隆抗体制备过程产生的可特异性地结合于副溶血性弧菌不同抗原位点的单克隆抗体。

本发明的另一个目的是提供产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞。

本发明的第一方面是提供了一种体外检测副溶血性弧菌的方法，包括以下步骤：

(a)将待测样品加样于包被有捕捉抗体的固相载体，从而使待测样品中的副溶血性弧菌与固相载体上的捕捉抗体结合，形成带有“副溶血性弧菌-捕捉抗体”二元复合物的固相载体；所述的捕捉抗体是特异性地结合于副溶血性弧菌的单克隆抗体3G9F7D5C9，所述的单克隆抗体3G9F7D5C9由小鼠杂交瘤细胞系3G9F7D5C9，CGMCCNo.9010产生；

(b)将检测抗体加样于(a)获得的固相载体，从而形成带有“检测抗体-副溶血性弧菌-捕捉抗体”三元复合物的固相载体；所述的检测抗体是特异性地结合于副溶血性弧菌的单克隆抗体3G9E9G3H7，所述的单克隆抗体3G9E9G3H7由小鼠杂交瘤细胞系3G9E9G3H7，CGMCCNo.8003产生，且所述的单克隆抗体3G9E9G3H7携带一可检测标记物；和

(c)检测三元复合物中的可检测标记物，从而确定待测样品中副溶血性弧菌的存在与否以及存在的量。

在一优选例中，所述的固相载体为酶标反应板。

在另一优选例中，所述的可检测标记物为辣根过氧化物酶。

本发明的第二方面是提供了一种免疫球蛋白，它是特异性地结合于副溶血性弧菌的单克隆抗体，它由小鼠杂交瘤细胞系3G9F7D5C9，CGMCCNo.9010所产生。

本发明的第三方面是提供了一种产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞，它是小鼠杂交瘤细胞系3G9F7D5C9，CGMCCNo.9010。

本发明的第四方面是提供了上述免疫球蛋白的用途，它被用于检测副溶血性弧菌。

本发明的第五方面是提供了一种免疫球蛋白，它是特异性地结合于副溶血性弧菌的单克隆抗体，它由小鼠杂交瘤细胞系3G9E9G3H7，CGMCCNo.8003所产生。

本发明的第六方面是提供了一种产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞，它是小鼠杂交瘤细胞系3G9E9G3H7，CGMCCNo.8003。

本发明还提供了上述免疫球蛋白的用途，它被用于检测副溶血性弧菌。

本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。

附图说明

图1本发明的单克隆抗体的SDS-PAGE电泳图

Lane1：3G9F7D5C9，Lane2：3G9E9G3H7。

具体实施方式

单克隆抗体

本发明人的研究表明，以副溶血性弧菌作为免疫原，免疫Balb/c小鼠，分离纯化得到两株抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7和3G9F7D5C9，其抗体效价可达到1:100000，其能够特异性、高效地与副溶血性弧菌结合，与单增李斯特、猪霍乱沙门、鼠伤寒沙门、肠炎沙门、福氏志贺、宋内氏志贺、鲍氏志贺、大肠杆菌O157:H7、阪崎肠杆菌、小肠耶尔森氏菌、肺炎链球菌、蜡样芽孢杆菌等共计77种病原细菌均无交叉反应。

本发明提供了抗副溶血性弧菌单克隆抗体。本发明的抗副溶血性弧菌单克隆抗体可以利用小鼠杂交瘤细胞系3G9E9G3H7(CGMCCNo.8003)或3G9F7D5C9(CGMCCNo.9010)分泌产生。本发明包括具有抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7和3G9F7D5C9的相应氨基酸序列的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与抗副溶血性弧菌单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与抗副溶血性弧菌单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。

对于本发明的抗副溶血性弧菌单克隆抗体重链和轻链序列，可以用常规方法测定。抗副溶血性弧菌单克隆抗体V链的超变区或互补决定区(complementaritydeterminingregion,CDR)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的免疫球蛋白轻链和重链可变链的分子，只要其CDR与抗副溶血性弧菌单克隆抗体CDR具有90％以上(较佳地95％以上)的同源性。本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab‘)₂片段；抗体重链；抗体轻链。

本发明还提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。这些DNA分子的序列可以用常规技术，利用杂交瘤细胞系3G9E9G3H7(CGMCCNo.8003)或3G9F7D5C9(CGMCCNo.9010)获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中己知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如出血性大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaC12法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgC12。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可运用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7和3G9F7D5C9，其效价高(可以达到1:100000)，能够特异性地、高效地检测副溶血性弧菌，与单增李斯特、猪霍乱沙门、鼠伤寒沙门、肠炎沙门、福氏志贺、宋内氏志贺、鲍氏志贺、大肠杆菌O157:H7、阪崎肠杆菌、小肠耶尔森氏菌、肺炎链球菌、蜡样芽孢杆菌等共计77种病原细菌均无交叉反应，此为本发明的最大创新点。上述单克隆抗体3G9E9G3H7可以用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、纳米金颗粒标记，专一性地作为检测抗体使用。上述单克隆抗体3G9F7D5C9在各种检测运用中，可专一性地作为捕捉抗体使用。

检测试剂盒

本发明人经过广泛的研究和试验，意外地发现，当采用小鼠杂交瘤细胞系3G9F7D5C9(CGMCCNo.9010)所产生的抗副溶血性弧菌单克隆抗体作为捕捉抗体捕获副溶血性弧菌后，再用可检测的标记物标记的由小鼠杂交瘤细胞系3G9E9G3H7(CGMCCNo.8003)所产生的抗副溶血性弧菌单克隆抗体作为检测抗体，可以极其有效地结合于副溶血性弧菌，从而通过双抗夹心法高灵敏度地检测副溶血性弧菌。

如本文所用，所述的“样品”是指食品、人畜粪便、呕吐物等物质，包括但不限于：血清、血浆、粪便、食品等的增菌液。优选的，所述的样品是食品。

如本文所用，所述的“捕捉抗体”、“包被抗体”、“第一抗体”与“一抗”可互换使用，都是指所述的可特异性地结合于副溶血性弧菌的单克隆抗体，其由小鼠杂交瘤细胞系3G9F7D5C9，CGMCCNo.9010产生。

所述的捕捉抗体可被包被在固相载体上。本发明对所采用的固相载体没有特别的限制，只要其能够与捕捉抗体相偶联(连接)即可。例如，所述的固相载体为酶标反应板。

如本文所用，所述的“检测抗体”、“第二抗体”、“酶标抗体”与“二抗”可互换使用，都是指可特异性结合于副溶血性弧菌的另一株单克隆抗体，其由小鼠杂交瘤细胞系3G9E9G3H7，CGMCCNo.8003产生。

如本文所用，所述的“特异性”是指抗体只能结合于副溶血性弧菌；更特别地，指那些能与副溶血性弧菌结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。

本发明人进而根据双抗夹心法的原理，制备了一种可用于检测样品中副溶血性弧菌的酶联免疫试剂盒。双抗夹心法常规的做法是将捕捉抗体固定于载体，然后捕捉抗体与抗原反应，洗涤后再与检测抗体反应(所述的检测抗体携带可检测标记物，或可与携带可检测标记物的物质结合)，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。并且，相对于单抗体的竞争法来说，双抗体夹心法的测定效果更为优良，因而测定时只需很少的样品量。所以采用双抗体夹心法无论在灵敏度、精确度、准确度、特异性及稳定性上更具有优势。

具体而言，本发明的酶联免疫试剂盒含有：

(a)酶标反应板，所述的酶标反应板上包被有作为捕捉抗体的抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9F7D5C9，所述的抗副溶血性弧菌单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系3G9F7D5C9，CGMCCNo.9010产生；

(b)容器a，所述的容器a中装有作为检测抗体的抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7，所述的抗副溶血性弧菌单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系3G9E9G3H7，CGMCCNo.8003产生。

作为本发明的优选方式，所述的检测抗体带有可检测的标记物。

如本文所用，所述的“可检测的标记物”是指用于确定待检测样品中副溶血性弧菌的存在与否以及存在的量的标志物。在确定了本发明的试剂盒所采用的捕捉抗体和/或检测抗体后，可以采用本领域常规用于与检测抗体结合来进行检测的各种标记物。本发明对所采用的标记物没有特别的限制，只要是能够与所述的检测抗体结合，且在适当处理后能够准确地指示待检测样品中副溶血性弧菌的存在与否以及存在量的标记物均是可用的。所述的标记物可直接被设置于检测抗体上；或者，所述的标记物也可被设置于特异性抗检测抗体的抗抗体上，本领域人员可根据所采用的抗体的种类和特性，选择适宜的标记物。例如，所述的标记物可以选自：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸醋酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。

当采用如上所示的一些酶标记物时，还需要采用一些与相应的酶结合的底物，从而可通过显色等方式来报导标记物的存在情况或者存在量。如本文所用，所述的“与标记物相对应的底物”是指可被标记物所催化显色，用于显示检测抗体与副溶血性弧菌发生结合的识别信号。所述的底物例如：用于辣根过氧化物酶的邻苯二肢(OPD)、四甲基联苯肢(TMB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸醋(p-nitrophenylphosphate,p-NPP)等等。本领域人员可根据所采用的标记物的种类和特性，选择适宜的底物。

作为本发明的优选方式，所述的检测抗体与标记物直接相连接。更优选地，所述的标记物是HRP。与以生物素标记检测抗体、反应后再与链亲和素HRP反应相比较，直接在检测抗体上标记HRP、反应结束后直接加底物显色更为简单便捷。

为了获得定量结果，还可以在检测过程中设置含己知浓度的多个副溶血性弧菌的标准品。对于标准品的设置方法可采用常规的方法。

为了消除假阳性和假阴性，也可在检测过程中设置质控(对照)。作为本发明的优选方式，所述的阳性对照为灭活的副溶血性弧菌菌液，所述的阴性对照为3％氯化钠碱性蛋白胨水(APW)。

此外，为了使本发明的试剂盒在检测时更方便，所述的试剂盒中优选的还包含其它一些辅助试剂，所述的辅助试剂是ELISA试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的。所述的试剂例如(但不限于)：显色剂、洗涤液、终止液、增菌液、稀释液。

此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。

本发明的酶联免疫试剂盒的检测原理及有益效果如下：

本发明的试剂盒采用的是双抗体夹心酶联免疫法。当在酶标反应板上预包被有抗副溶血性弧菌单克隆抗体(捕捉抗体)，加入样品溶液或标准品后，再加入带有可检测的标记物如辣根过氧化物酶的另一株抗副溶血性弧菌单克隆抗体(检测抗体)，样品或标准品中存在的副溶血性弧菌就会与酶标反应板上包被的捕捉抗体相结合，待加入检测抗体后，会形成“抗体—抗原—酶标抗体”复合物，经过TMB(四甲基联苯胺)显色后会形成黄色物质，从而可判断样品中副溶血性弧菌的存在与否以及存在的量。

用酶标仪于450nm下测定吸光度值。阴性对照≤0.1、阳性对照≥0.3，实验结果有效，否则结果判定为无效；检测孔OD值≥0.2时，判定为阳性；检测孔OD值介于0.1-0.2之间时，判定为弱阳性；检测孔OD值≤0.1判定为阴性。

试验表明，本发明的副溶血性弧菌酶联免疫试剂盒，有较高的灵敏度和准确度。板间误差小于5％，板内CV小于3％。与单增李斯特、猪霍乱沙门、鼠伤寒沙门、肠炎沙门、福氏志贺、宋内氏志贺、鲍氏志贺、大肠杆菌O157:H7、阪崎肠杆菌、小肠耶尔森氏菌、肺炎链球菌、蜡样芽孢杆菌等共计77种病原细菌均无交叉反应，此为本发明的最大创新点。

总之，本发明的试剂盒对样品的前处理要求低，操作简便，检测极限为105cfu/ml，特异性和稳定性好，并与大多数食源性致病菌都没有交叉反应。

检测方法

本发明还提供了一种利用本发明的试剂盒体外检测副溶血性弧菌的方法，包括以下步骤：

(c)检测三元复合物中的可检测标记物，从而确定待检测样品中副溶血性弧菌的存在与否以及存在的量。

作为本发明的一种优选方式，定量检测副溶血性弧菌的方法具体如下：

(ⅰ)抗原抗体反应：将本发明的捕捉抗体包被在多孔板上，之后在多孔板的微孔内分别加入不同浓度的标准品、质控品(可选)，或待测样品；

(ⅱ)酶联反应：将检测抗体(其上设置有标记物)溶液加入各孔，振荡、孵育、洗涤；

(ⅲ)显色反应：每孔加入对应于标记物的底物、显色剂，孵育，每孔加入反应终止液，结束反应：

(ⅳ)酶标仪测定OD值：

(ⅴ)结果计算：

A)制作标准曲线：以副溶血性弧菌标准品浓度为横坐标，标准品测定OD值为纵坐标，做出标准曲线；

B)评判质控品浓度(可选)：根据质控品的OD值，从标准曲线上读出相应的浓度值；质控品测定浓度值处于给定范围时，该次测定有效；

C)计算待测样品浓度：当标准曲线和质控品均被判定有效时，根据待测样本的OD值从标准曲线计算出待测样品的副溶血性弧菌浓度。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1.抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7和3G9F7D5C9的制备

一、免疫原和阳性标准品的准备

副溶血性弧菌(ATCCNo.17802)接种于3％氯化钠碱性蛋白胨水(APW)，37℃、150r/min振荡培养17h，计数，加入0.3％甲醛溶液室温灭活1天。用生理盐水调整副溶血性弧菌(ATCCNo.17802)浓度至5×10⁹cfu/ml作为免疫原；用生理盐水调整浓度为10⁸cfu/ml作为阳性对照标准品，3％氯化钠碱性蛋白胨水(APW)为阴性对照标准品。

二、单克隆抗体的制备

1)实验动物：选3只8周龄，体重20g左右、雌性Balb/c小鼠为实验动物。

2)免疫方法：每只小鼠腹腔注射0.2ml免疫原，每间隔2周用同样剂量加强注射一次。

3)采血：3次加强免疫后从尾部静脉采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。待效价不再上升，腹腔注射同样量免疫原，3天后按照常规方法进行细胞融合。

4)细胞融合：取免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50％PEG作用下常规融合，分别接种于96孔培养板，置于37℃、5％CO₂培养箱培养。

5)杂交瘤细胞筛选：采用间接非竞争酶联免疫法，筛选强阳性孔的杂交瘤细胞，将其转移至24孔培养板。

6)克隆培养及抗体制备：用有限稀释法进行克隆化培养。当细胞生长至铺满孔底1/10时，再用同样方法检测，将强阳性孔再克隆，如此反复3－4次，直至阳性率达到100％。将杂交瘤细胞扩大培养，注射于经石蜡油预处理的Balb/c小鼠腹腔，每只2×10⁶个杂交瘤细胞，7～10天小鼠腹部隆起，活体穿刺抽取腹水。用辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中纯化抗体。

三、单克隆抗体的效价测定

副溶血性弧菌培养基如下：国标：GB/T4789.7-2008

3％氯化钠碱性蛋白胨水(APW)

成分：蛋白胨10.0g，氯化钠30.0g，蒸馏水1000.0mL

制法：将上述成分混合，调节pH8.5±0.2，121℃高压灭菌10min。

单克隆抗体效价测定的步骤如下：

(1)将饱和培养细菌抗原连同培养基在对应的孔中加入100μl，4℃过夜(约包板36h)。

(2)倒空液体并拍干残留液体，用250μl洗涤液清洗3次。

(3)每个孔中加100μl1％BSA，37℃封闭1h。

(4)倒空液体并拍干残留液体，用250μl洗涤液清洗3次。

(5)每个孔中加100μl血清，37℃孵育1h。

(6)倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加250μlPBST洗涤液洗涤3次。

(7)每个孔中50μl的HRP标记的二抗(sigma)，室温孵育1h。

(8)用洗涤液浸泡5min，倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加250μlPBST洗涤液洗涤3次。

(9)每个孔中加100μl底物，显色30min，加终止液100μl并立即在OD₄₅₀读数。

表1.两株单克隆抗体效价测定结果(OD₄₅₀)

四、单克隆抗体的纯度分析

用SDS-PAGE分析单克隆抗体的纯度，5％积层胶，10％分离胶，120V电压，电泳至胶底部，凝胶用考马斯亮蓝法染色，脱色后用凝胶成像分析系统观察结果(图1)。

如图1所示，泳道1和泳道2分别为3G9F7D5C9和3G9E9G3H7。3G9F7D5C9的重链分子量为48kDa，轻链分子量为26kDa；3G9E9G3H7的重链分子量为48kDa，轻链分子量为26kDa。

实施例2.单克隆抗体3G9E9G3H7和3G9F7D5C9的特性鉴定

一、单克隆抗体亚类鉴定

1、抗原包被：用0.01MPBS包被山羊抗鼠二抗IgG+A+M，每孔50μl，4℃包被过夜，次日弃去孔内液体，洗板3遍。

2、封闭：每孔加入1％BSA200μl，4℃封闭过夜。次日拍干板子不洗板。

3、加入单克隆抗体杂交瘤细胞上清，每个样品8个微孔，每孔50μl。37℃，孵育1h。

4、洗板4遍后，分别加入特异结合的兔抗鼠IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，IgM，κ，λ，37℃孵育1h。

5、洗板4遍后，每孔加入已稀释好的辣根过氧化物酶标记抗兔二抗IgG(H+L)，37℃，孵育30min。

洗板4遍后，加入100μl底物显色液，37℃，避光显色10min。于450nm波长下读取结果。

表2.两株单克隆抗体亚类鉴定结果

二、单克隆抗体交叉反应测试

1、抗原包被：将78种10⁸cfu/ml菌液浓度的致病菌加入到酶标板中，每个致病菌加3各孔，每孔100μl，4℃，包被过夜。

2、封闭：洗板3遍后，每孔加入3％BSA200μl，37℃孵育2h。

3、洗板3遍。每孔加入稀释好的单克隆抗体100μl，37摄氏度孵育1h。

4、洗板3遍。加入已稀释好的山羊抗鼠二抗到所有微孔中，每孔100μl，37摄氏度孵育1h。

5、洗板4遍。加入底物显色液，37℃，避光显色15min。于450nm波长下读取结果。

表3.两株单克隆抗体交叉反应检测结果

实施例3.检测副溶血性弧菌的酶联免疫试剂盒的组成、制备及其应用

一、酶联免疫试剂盒由下述物质组成：

(1)预包被抗体的酶标板：用0.02M醋酸缓冲液(pH2.0)溶液稀释、抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9F7D5C9包被96孔酶标板，每孔100μl。4℃孵育过夜，按照常规ELISA方法封闭洗涤。

(2)副溶血性弧菌阳性对照标准品和阴性对照标准品。

(3)辣根过氧化物酶标记的抗副溶血性弧菌的单克隆抗体3G9E9G3H7。

(4)酶标抗体稀释液：0.01MPBS，pH7.6。

(5)10×浓缩洗液：含有0.5％吐温-20和0.2％叠氮钠的0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.4，使用时将浓缩洗液10倍稀释即可。

(6)显色液A液，显色液B液。使用前将A液与B液等体积混合。

(7)终止液：2M硫酸溶液。

二、酶联免疫试剂盒中各组分的制备

(一)将副溶血性弧菌单克隆抗体3G9F7D5C9作为捕捉抗体包被酶标板

用包被缓冲液将副溶血性弧菌单克隆抗体3G9F7D5C9稀释成5μg/ml，每孔加入100μl，4℃过夜，次日倾去包被液，用稀释好的洗液洗涤3次，拍干，然后在每孔中加入220μl封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝箔袋密封保存。

包被缓冲液：0.02M醋酸缓冲液，用5MHCl调节pH至2.0。

封闭液：含有0.3％牛血清白蛋白和10％蔗糖的0.01MPBS。

(二)辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体3G9E9G3H7的制备

将副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7与辣根过氧化物酶(HRP)进行偶联，采用的方法是改良的过碘酸钠法，方法如下：

a、5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶解于0.5ml0.2M醋酸缓冲液(pH5.6)中。

b、加入现配制的0.06MNaIO4溶液0.5ml，4℃氧化20min。

c、加入含22％NaCl的0.4M乙二醇溶液0.5ml，室温静置30min。

d、用6ml预冷的无水乙醇沉淀酶，1500rpm离心10min。

e、去上清，将沉淀溶于2.5ml的0.01MPBS(pH7.4)中。

f、加入10mg单克隆抗体3G9E9G3H7，并立即用0.5M碳酸缓冲液(pH9.6)调节pH至9.0。4℃静置过夜。

g、加入10mg/ml硼氢化钠50μl，4℃，静置2h。

h、用0.01MPBS(pH7.4)4℃透析过夜。

i、纯化保存。

三、试剂盒的应用

(一)检测方法

1、样品前处理

取待检样品25g(ml)加入225ml3％氯化钠碱性蛋白胨水(APW)于均质机下均质混匀，36℃±1℃培养16h。将培养好的样品在100℃水浴中加热10min。取出冷却至室温待用。

2、用试剂盒检测

取出所需数量的微孔和所有试剂常温下放置30min。取200μl待检样品加到微孔中，37℃，孵育30min。倒去孔内液体，加入200μl洗液到每个微孔内，轻轻晃动数秒，快速翻转将微孔内液体倒尽，向一叠干净的吸水纸拍几下，如此重复操作共洗板3次。加入100μl酶标单克隆抗体3G9E9G3H7工作液，37℃，孵育60min。倒去孔内液体并洗板4次。将显色A液和显色B液等量混合配成底物显色液。每个微孔加入100μl的底物显色液，室温避光显色15-20min。加入终止液100μl，用酶标仪于450nm下测定吸光度值。

结果判定：阴性对照≤0.1、阳性对照≥0.3，实验结果有效，否则结果判定为无效；检测孔OD值≥0.2时，判定为阳性；检测孔OD值介于0.1-0.2之间时，判定为弱阳性；检测孔OD值≤0.1判定为阴性。

若无酶标仪，可用肉眼判定：阳性对照孔有肉眼可见的黄色，阴性对照孔无颜色，实验结果有效，否则判定为实验结果无效；当检测孔有明显肉眼可见的黄色时为阳性结果；有微弱黄色时，判定为弱阳性结果；无肉眼可见黄色时为阴性结果。

(二)酶联免疫试剂盒效果的检测

1、试剂盒重复性和稳定性测试

板内精密度测试：取同一块酶标板上的6个微孔，用被副溶血性弧菌污染过的牛奶进行测试，实验重复4次。

板间精密度测试：取同一批次的4块酶标板，用被副溶血性弧菌污染过的牛奶进行测试，实验重复3次。

变异系数的计算方法：变异系数(CV)＝测定结果的标准差与其平均值的百分比。

表4.板内重复性测试结果

表5.板间重复性测试结果

2、试剂盒交叉反应测试

用试剂盒去检测其他76种食源性致病菌，验证试剂盒检测副溶血性弧菌的特异性，观察是否与其他的致病菌有交叉反应和假阳性出现。

表6.试剂盒特异性测试

注：“+”表示检测结果呈阳性；“—”表示检测结果为阴性。

3、试剂盒保存期实验

试剂盒保存条件为2—8℃，经过12个月后，试剂盒的检测结果与新批次的试剂盒结果一致。考虑到运输和使用过程中会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置8天，进行加速老化试验，结果表明试剂盒的各项指标完全符合要求。因此试剂盒可以在2—8℃至少可以保存12个月以上。

实施例4.单克隆抗体3G9E9G3H7和3G9F7D5C9和副溶血性弧菌鞭毛蛋白的反应特性鉴定

1、副溶血性弧菌鞭毛蛋白提取：

(1)副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)(ATCC17802)接种于3％氯化钠碱性蛋白胨水(APW)，37℃、150r/min振荡培养17h，计数，加入0.3％甲醛溶液室温灭活24h。

(2)次日用收集细菌离心重悬于预冷的0.15MNaCl溶液中，冰浴15～30min，1000rpm匀浆45秒，立即置于冰上10min。

(3)匀浆液4℃条件下10000rpm离心10min；取上清液4℃条件下16000rpm离心2h，弃上清，沉淀重悬于TET(10mMTris，2mMEDTA，pH8.0，1％TritonX-100)缓冲液中。离心过程重复3次。操作过程保持低温下进行。最后留取沉淀，溶于少量Tris-EDTA(0.1MTris，0.1mMEDTA，pH7.8)buffer中，4℃保存备用。

2、间接ELISA测定3G9E9G3H7和3G9F7D5C9和鞭毛蛋白的结合特性

(1)鞭毛蛋白包被：将鞭毛蛋白加入到酶标板中，每个致病菌加3各孔，每孔100μl，4℃，包被过夜。

(2)封闭:洗板3遍后，每孔加入3％BSA200μl，37℃孵育2h。

(3)洗板3遍。每孔加入稀释好的单克隆抗体3G9E9G3H7和3G9F7D5C9各100μl，37摄氏度孵育1h。

(4)洗板3遍。加入已稀释好的山羊抗鼠二抗到所有微孔中，每孔100μl，37摄氏度孵育1h。

(5)洗板4遍。加入底物显色液，37℃，避光显色15min。于450nm波长下读取结果。

结果见表7。研究证实：3G9E9G3H7和3G9F7D5C9两株抗体和副溶血性弧菌鞭毛蛋白无交叉反应。

表7单克隆抗体3G9E9G3H7和3G9F7D5C9和副溶血性弧菌鞭毛蛋白的反应特性

生物材料的保藏

产生经过上述鉴定的副溶血性弧菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株3G9E9G3H7于2013年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，分类命名为“产生抗副溶血性弧菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株”，保藏号为CGMCCNo.8003。

产生经过上述鉴定的副溶血性弧菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株3G9F7D5C9于2014年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮政编码：100101)，分类命名为“抗副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)杂交瘤细胞”，保藏号为CGMCCNo.9010。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种体外检测副溶血性弧菌的方法，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固相载体为酶标反应板。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的可检测标记物为辣根过氧化物酶。

4.一种免疫球蛋白，它是特异性地结合于副溶血性弧菌的单克隆抗体，其特征在于，它由小鼠杂交瘤细胞系3G9F7D5C9，CGMCCNo.9010所产生。

5.一种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，它是小鼠杂交瘤细胞系3G9F7D5C9，CGMCCNo.9010。

6.一种如权利要求4所述的免疫球蛋白的用途，其特征在于，它被用于检测副溶血性弧菌。

7.一种免疫球蛋白，它是特异性地结合于副溶血性弧菌的单克隆抗体，其特征在于，它由小鼠杂交瘤细胞系3G9E9G3H7，CGMCCNo.8003所产生。

8.一种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，它是小鼠杂交瘤细胞系3G9E9G3H7，CGMCCNo.8003。

9.一种如权利要求7所述的免疫球蛋白的用途，其特征在于，它被用于检测副溶血性弧菌。