JP5874122B2 - 腸炎ビブリオの検出方法 - Google Patents
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(1)マウスの免疫
免疫源には、患者糞便から分離された腸炎ビブリオ(V2409,O3K6)をB−PERII バクテリアタンパク抽出試薬(B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent (Pierce, Rockford社製)を用いて処理したのち、遠心分離(21,900×g,10min)して得られた上清を用いた。この上清のタンパク濃度を測定した後、90μgのタンパク量分をフロイントの完全アジュバント(和光純薬(株)製)と2:3の用量比で乳化させ、腹腔内投与してマウスを免疫した。4、7、10、13週後にフロイントの不完全アジュバントと上記免疫源を乳化したものをそれぞれ腹腔内に投与し、追加免疫を行った。14週間後に採血し、前記免疫源を用いたELISA法により各マウスの血清中の上記免疫源に対する抗体力価を測定した。最も高い抗体価を有していたマウスの腹腔内に、免疫開始20週後に上記免疫源のみ300μgを投与して最終免疫をおこなった。
最終免疫の3日後にマウスの脾臓細胞を、P3-X63-Ag8.U1 ミエローマ細胞と融合し、得られた融合細胞からハイブリドーマを調製した。ハイブリドーマの作製方法は川津らの方法(Kawatsu, K., et al., 2008. Development and evaluation of immunochromatographic assay for simple and rapid detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in human stool specimens. J. Clin. Microbiol. 46:1226-1231)に準じた。すなわち、細胞融合に次いで選択培養とクローン化を行い、各クローンの培養上清について上記免疫源を用いたELISA法によるスクリーニングを行い、陽性クローンを選択した。
前記ハイブリドーマの陽性クローンについて、その培養上清を用いてELISA法により、腸炎ビブリオに特異的なモノクローナル抗体を産生する細胞のスクリーニングを行った。スクリーニングには、6株の腸炎ビブリオ(4株の臨床分離株:O3K6,O4K68,O4K8,O1KUT及び2株の食品(魚介類)分離株:O12KUT,01KUT)と、5株のその他ビブリオ属細菌(V. mimicus, V. vulnificus, V. alginolyticus, V. campbellii, V. harveyi)の培養液を抗原としてコーティングされたプレートが用いられた。ELISA法は次の方法に従った。
上記11株の腸炎ビブリオ属細菌をそれぞれ2mlの1%の塩化ナトリウムを含むTSB培地(Becton Dickinson and Company社製)に懸濁し、36℃又は28℃で16時間静置培養した。培養液を50mMの重炭酸バッファーで10倍に希釈し、その50μlを、96ウェルのELISA用プレート(Greiner Bio-One社製)のウェルに分注し、4℃で一夜放置した。抗原液をプレートから除去した後、20%FBSを含むPBSを用いて、室温で1時間ブロッキング反応を行った。ブロッキング液を除去した後、0.05%の界面活性剤(Tween20:商品名)を含むPBS(PBS−T)で3回洗浄した。次いで、20%のFBSを含むPBS−Tで1:10に希釈したハイブリドーマの培養上清の50μlを前記ウェルに加え、室温で1時間反応させた。さらにPBS−Tでウェルを4回洗浄した後、50μlのペルオキシダーゼで標識された抗マウスIgG溶液(IgG, Sigma Chemical社製)(20%のFBSを含むPBS−Tで希釈した0.5μg/ml濃度の溶液)をウェルに加え、室温で1時間反応させた。PBS−Tで5回洗浄後、酵素基質であるテトラメチルベンジジン(商品名:1-StepTM Ultra TMB-ELISA, Pierce)を加えて10分間室温で反応させた。2Mの硫酸を加えて反応を停止し、吸光度の自動計測装置を用いて450nmにおける吸光度を計測した。吸光度が0.2を超えた場合に陽性であるとした。
次に、スクリーニングにより選択されたハイブリドーマを再クローン化した後、拡大培養によって得られた培養上清から、モノクローナル抗体を精製した。ハイブリドーマからの抗体の取得及び抗体の精製も、前記川津らの方法に従った。また、特異性の検討には、140株の腸炎ビブリオ(臨床検体より分離した89株、魚介類より分離した51株)と、28種62株のその他ビブリオ属細菌と29種35株の非ビブリオ属細菌を用いた。用いた腸炎ビブリオ株は、1984年から2010年に分離され、血清型(O抗原とK抗原の組み合わせ)で72の型に分類された。これらは、KimらによるtoxR−PCR法(Kim, Y. B. et al., 1999. Identification of Vibrio parahaemolyticus strains at the species level by PCR targeted to the toxR gene. J. Clin. Microbiol. 37:1173-1177.)により、腸炎ビブリオであることを確認した。
MAb−VP34のサブクラスのタイピングを前記川津らの方法に従って行った。その結果、MAb−VP34は、G1(k)のサブクラスに属していた。3株の腸炎ビブリオ(臨床分離株;O3K6,O4K8,O1KUT)と6株のその他ビブリオ属細菌(V. mimicus, V. vulnificus, V. campbellii, V. harveyi, V. alginolyticus, V. cholerae)を、600nmにおける吸光度が0.6−0.7となるようにPBSに懸濁した。この懸濁液を遠心分離して沈殿した菌体をSDS−PAGE用のサンプルバッファーに懸濁した。得られた懸濁液をSDS−PAGEに供し、分離されたタンパク質をPVDFメンブレン(フッ化ポリビリニデン膜:Bio-Rad Laboratories社製)に電気的にブロッティングした。この膜を15%の過酸化水素を含むTBSで処理し、T−TBSで3回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識したMAb−VP34をCan Get Signal Solution2(登録商標:東洋紡社製)に溶かした溶液(0.05μg/ml)と反応させ、抗原抗体反応を生じさせた。その後、テトラメチルベンジジン(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)(商品名:1-StepTM TMB-Blotting, Pierce)を基質に用いて抗原抗体反応を検出した。その結果を図1に示す。
次に、MAb−VP34がF0F1−ATP合成酵素のデルタサブユニットを認識するかどうか、リコンビナントタンパク質を作製し、ウェスタンブロッティングにより確認した。腸炎ビブリオのF0F1−ATP合成酵素のデルタサブユニットの全遺伝子配列は、GenBankデータベースより取得された(accession number:BA0000031)。
次に、MAb−VP34を用いて、分離平板上のコロニーが腸炎ビブリオであるかどうかを判別するドットブロッティング法(VP−Dot法)を開発した。VP−Dot法は以下の方法に従った。TCBS寒天培地上に形成されたショ糖非分解性の1コロニーを、1μlループを用いてかきとり、20μlの50mMの重炭酸バッファー(pH9.6)に懸濁した。その1μlをニトロセルロース膜(Bio-Rad Laboratories社製)上にスポットし、36℃で5分間乾燥させた。以下の反応はすべて室温で行った。0.3%の過酸化水素水と5分間反応させた後、蒸留水で20秒間洗浄した。その後、0.5%のTween−20を含むトリス緩衝液(TBST)で5分間洗浄した。この膜を、0.5μg/mlのペルオキシダーゼ標識されたMAb−VP34抗体を含むTBS溶液(0.1%のTween−20と20%のFBSを含む)中で5分間反応させた。TBSTで2分間洗浄する作業を4回行い、基質であるテトラメチルベンジジンと3分間反応させ、大量の水で反応を停止させた。サンプルをスポットした部位に明瞭な青色の呈色が認められた場合を陽性とした。
表2に示す菌株を用いて、VP−Dot法の精度をtoxR−PCR法の同定結果と比較することにより評価した。用いた20株の腸炎ビブリオと10株のその他ビブリオ属細菌並びに9種の未同定株は、V. campbelliiを除いて、TCBS寒天培地上で36℃で1晩培養された。V. campbelliiは一般にTCBS寒天培地で成育するが、今回の実験で用いたV. campbellii(NBRC15631)株はTCBS寒天培地では成育しなかったので、1%NaClを含むTSA培地で培養した。9株の未同定株は、TCBS寒天培地上でコロニーを形成し、かつショ糖非分解性の菌である。また、MAb−VP34は、ペルオキシダーゼラベリングキット−SH(同仁化学研究所社製)を用いて予めペルオキシダーゼを標識した。 toxR−PCR法では、山崎らの方法(Yamazaki, W., et al., 2008. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Vibrio parahaemolyticus. BMC Microbiol. 8:163-169.)に従って平板上のコロニーからDNAテンプレートを作製し、PCRは前記Kimらの方法に従った。
モノクローナル抗体MAb−VP34のエピトープマッピングを行った。まず、GenBankデータベースより取得された腸炎ビブリオのF0F1−ATP合成酵素のデルタサブユニットの完全遺伝子配列(177個のアミノ酸、停止コドンを含む534bp)を元にして、デルタサブユニットの上流側(1〜87番目のアミノ酸から構成される)と下流側(80〜177番目のアミノ酸で構成される)に対応するリコンビナントタンパク質を作製し、上記VP−Dot法に準じて、抗原抗体反応を確認した。前記リコンビナント抗原に対する認識性の確認における方法と同様の方法でリコンビナントタンパク質を作製した。この際、上流側のタンパク発現用として配列番号2で示される塩基配列を有するプライマー(Forward側)及び配列番号4で示される塩基配列を有するプライマー(Reverse側)を、下流側のタンパク発現用として配列番号5で示される塩基配列を有するプライマー(Forward側)及び配列番号3で示される塩基配列を有するプライマー(Reverse側)を用いた。VP−Dot法には、リコンビナントタンパク質を発現した大腸菌をB-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent(PIERCE)を用いてタンパクを可溶化して得た上清液を用いた。この結果、上流側のタンパクとの反応が認められたが、下流側のタンパクとの反応は認められなかった。ネガティブコントロールには、IPTG誘導前の大腸菌BL21(DE3)を用いた。
成される、タンパクB:46〜87番目のアミノ酸から構成される、タンパクC:16〜73番目のアミノ酸から構成される)を上記方法に準じて作製し、上記VP−Dot法に
従って抗原抗体反応を確認した。この際、タンパクAの発現用として配列番号2で示される塩基配列を有するプライマー(Forward側)及び配列番号6で示される塩基配列を有するプライマー(Reverse側)を、タンパクBの発現用として配列番号9で示される塩基配列を有するプライマー(Forward側)及び配列番号4で示される塩基配列を有するプライマー(Reverse側)を、タンパクCの発現用として配列番号7で示される塩基配列を有するプライマー(Forward側)及び配列番号8で示される塩基配列を有するプライマー(Reverse側)を用いた。この結果、リコンビナントタンパク質B及びリコンビナントタンパク質Cについて抗原抗体反応がそれぞれ認められ、エピトープは46〜73番目のアミノ酸配列に存在すると考えられた。
Claims (15)
- 配列番号1に記載されたアミノ酸配列からなるペプチドによって構成されるエピトープを認識し、腸炎ビブリオ(Vibrio parahaemolyticus)のF0F1−ATP合成酵素のデルタサブユニットと特異的な抗原抗体反応を起こし得るモノクローナル抗体。
- 請求項1に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
- 受託番号FERM P−22157として寄託されたハイブリドーマ細胞。
- 受託番号FERM P−22157として寄託されたハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体。
- 試料と請求項1又は4に記載のモノクローナル抗体を接触させる工程を含む腸炎ビブリオの検出方法。
- 試料をスポットして担体に吸着させる工程を含む請求項5に記載の腸炎ビブリオの検出方法。
- 前記モノクローナル抗体は標識された抗体である請求項5又は6に記載の腸炎ビブリオの検出方法。
- 試料と接触させた後の前記標識された抗体と、前記標識と反応して可視化できる試薬を接触させる工程をさらに含む請求項7に記載の腸炎ビブリオの検出方法。
- 試料とモノクローナル抗体を接触させる前の工程として、試料に対して前処理を施す工程をさらに含む請求項5〜8の何れか1項に記載の腸炎ビブリオの検出方法。
- 前記前処理は、界面活性剤と接触させる工程である請求項9に記載の腸炎ビブリオの検出方法。
- 食品を培養液に浸漬して培養する培養工程と、当該培養工程から腸炎ビブリオの選択培地上で培養する培養工程とを含み、前記選択培地で培養されたコロニーを試料とする請求項5〜10の何れか1項に記載の腸炎ビブリオの検出方法。
- 請求項1又は4に記載のモノクローナル抗体を含む腸炎ビブリオの検出用試薬。
- 前記モノクローナル抗体は、標識された抗体である請求項12に記載の腸炎ビブリオの検出用試薬。
- 前記モノクローナル抗体は、ペルオキシダーゼ標識されたモノクローナル抗体である請求項13に記載の腸炎ビブリオの検出用試薬。
- 前記モノクローナル抗体が基材に固定された請求項12〜14の何れか1項に記載の腸炎ビブリオの検出用試薬。
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