CN111534620A - 一种通用致病性弧菌试剂盒及其快速检测方法 - Google Patents
一种通用致病性弧菌试剂盒及其快速检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111534620A CN111534620A CN202010392917.6A CN202010392917A CN111534620A CN 111534620 A CN111534620 A CN 111534620A CN 202010392917 A CN202010392917 A CN 202010392917A CN 111534620 A CN111534620 A CN 111534620A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- vibrio
- tube
- pathogenic
- steps
- microliter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 title claims abstract description 123
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 100
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 75
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 68
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 49
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 206010047400 Vibrio infections Diseases 0.000 claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 28
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 51
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 45
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 40
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 29
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 17
- 241000607265 Vibrio vulnificus Species 0.000 claims description 15
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 15
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 15
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 15
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims description 15
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 11
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 241000607594 Vibrio alginolyticus Species 0.000 claims description 11
- 241000607618 Vibrio harveyi Species 0.000 claims description 11
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 claims description 11
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 10
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 10
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 10
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 10
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 9
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 6
- 241000544286 Vibrio anguillarum Species 0.000 claims description 6
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 claims description 6
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 6
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 6
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 5
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 claims description 5
- 241001596950 Larimichthys crocea Species 0.000 claims description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 5
- 241000207961 Sesamum Species 0.000 claims description 5
- 235000003434 Sesamum indicum Nutrition 0.000 claims description 5
- 241001148079 Vibrio splendidus Species 0.000 claims description 5
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 5
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 5
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 5
- NXPPAOGUKPJVDI-UHFFFAOYSA-N naphthalene-1,2-diol Chemical group C1=CC=CC2=C(O)C(O)=CC=C21 NXPPAOGUKPJVDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 5
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 5
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 5
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L magnesium sulphate Substances [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims 1
- FYFFGSSZFBZTAH-UHFFFAOYSA-N methylaminomethanetriol Chemical compound CNC(O)(O)O FYFFGSSZFBZTAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 abstract description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 abstract description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 43
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 33
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 9
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 9
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000607516 Aeromonas caviae Species 0.000 description 4
- 241000607528 Aeromonas hydrophila Species 0.000 description 4
- 241000607522 Aeromonas sobria Species 0.000 description 4
- 241000607574 Aeromonas veronii Species 0.000 description 4
- 241000607471 Edwardsiella tarda Species 0.000 description 4
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 4
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 4
- 238000009364 mariculture Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- UWQJHXKARZWDIJ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Cys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O UWQJHXKARZWDIJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- DECCMEWNXSNSDO-ZLUOBGJFSA-N Ala-Cys-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DECCMEWNXSNSDO-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- CVOZXIPULQQFNY-ZLUOBGJFSA-N Cys-Ala-Cys Chemical compound C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O CVOZXIPULQQFNY-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 3
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 3
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 3
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 3
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 3
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 description 2
- SMYXEYRYCLIPIL-ZLUOBGJFSA-N Cys-Cys-Cys Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O SMYXEYRYCLIPIL-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- FTTZLFIEUQHLHH-BWBBJGPYSA-N Cys-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O FTTZLFIEUQHLHH-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 2
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 2
- XPNSAQMEAVSQRD-FBCQKBJTSA-N Thr-Gly-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XPNSAQMEAVSQRD-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- WOJJIRYPFAZEPF-YFKPBYRVSA-N 2-[[(2s)-2-[[2-[(2-azaniumylacetyl)amino]acetyl]amino]propanoyl]amino]acetate Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)CN WOJJIRYPFAZEPF-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HKLYDUXIXBVZOQ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoethane-1,1,1-triol Chemical compound NCC(O)(O)O HKLYDUXIXBVZOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N Ala-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)N JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- UQJUGHFKNKGHFQ-VZFHVOOUSA-N Ala-Cys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O UQJUGHFKNKGHFQ-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- LJFNNUBZSZCZFN-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Cys Chemical compound N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O LJFNNUBZSZCZFN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- VGPWRRFOPXVGOH-BYPYZUCNSA-N Ala-Gly-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O VGPWRRFOPXVGOH-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- OBVSBEYOMDWLRJ-BFHQHQDPSA-N Ala-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N OBVSBEYOMDWLRJ-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N Ala-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- KUFVXLQLDHJVOG-SHGPDSBTSA-N Ala-Thr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O KUFVXLQLDHJVOG-SHGPDSBTSA-N 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- TVYMKYUSZSVOAG-ZLUOBGJFSA-N Cys-Ala-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O TVYMKYUSZSVOAG-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- YFXFOZPXVFPBDH-VZFHVOOUSA-N Cys-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CS)C(O)=O YFXFOZPXVFPBDH-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- URDUGPGPLNXXES-WHFBIAKZSA-N Cys-Gly-Cys Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O URDUGPGPLNXXES-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- NAPULYCVEVVFRB-HEIBUPTGSA-N Cys-Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](N)CS NAPULYCVEVVFRB-HEIBUPTGSA-N 0.000 description 1
- QSDKBRMVXSWAQE-BFHQHQDPSA-N Gly-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN QSDKBRMVXSWAQE-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- NMROINAYXCACKF-WHFBIAKZSA-N Gly-Cys-Cys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NMROINAYXCACKF-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- IDOGEHIWMJMAHT-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Cys Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O IDOGEHIWMJMAHT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ZKJZBRHRWKLVSJ-ZDLURKLDSA-N Gly-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)CN)O ZKJZBRHRWKLVSJ-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- JQFILXICXLDTRR-FBCQKBJTSA-N Gly-Thr-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCC(O)=O JQFILXICXLDTRR-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 1
- ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N L-cysteinylglycine Chemical compound SC[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N Thr-Ala-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N Thr-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- LYGKYFKSZTUXGZ-ZDLURKLDSA-N Thr-Cys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O LYGKYFKSZTUXGZ-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- UQCNIMDPYICBTR-KYNKHSRBSA-N Thr-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O UQCNIMDPYICBTR-KYNKHSRBSA-N 0.000 description 1
- 206010048038 Wound infection Diseases 0.000 description 1
- 108010076324 alanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- -1 deoxyribonucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 108010084264 glycyl-glycyl-cysteine Proteins 0.000 description 1
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Natural products NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种通用致病性弧菌试剂盒，所述的试剂盒包括：①内装有预混合液的预混合液管、②内装有Bst DNA聚合酶的Bst DNA聚合酶管、③内装有致病性弧菌阳性质粒DNA的阳性模板管、④内装有阴性模板的阴性模板管、⑤内装有显色剂的显色剂管、⑥内装有引物的引物管、⑦内装有灭菌的双蒸水的水管；本发明的试剂盒样品易得，而且能检测多种致病性弧菌。检测方法简单快速，从取样到检测仅需要一个小时采样15分钟检测45分钟，不需要依附昂贵的仪器。可结合简单的DNA提取，扩增结束后肉眼观察颜色变化即可，不需要昂贵的PCR仪，从采样到检测到结果方便快捷，可广泛应用于病原的基层检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种通用致病性弧菌试剂盒及其快速检测方法。
背景技术
致病性弧菌是海洋环境中常见的病原菌类群之一，引起的弧菌病是一种流行范围广，危害严重的传染性疾病，大量研究表明，多种弧菌可引起海水养殖鱼类、贝类及甲壳类等经济动物的流行性和暴发性死亡，主要包括副溶血弧菌、灿烂弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌等。弧菌病给水产养殖业造成巨大经济损失，并且该病还会导致野生海水鱼类、贝类及甲壳类的死亡，进而威胁海洋自然生物资源。另外弧菌还是一类重要的食源性致病菌，会引起人体肠道疾病、伤口感染和败血症等病症，有效的检测出水产品中的弧菌，对人类健康有着重要意义。因此，对该疾病的预防与控制研究一直备受国内外研究人员的关注，是海水养殖动物病害的主要研究领域之一。对由致病性弧菌中的不同种类感染引起的海水养殖动物病害，在养殖生产采用的具体预防或控制措施基本上是相似的，海水养殖动物生病后，养殖场(户)关心的是养殖种类是否被致病性弧所感染，不太会去关心是哪一种致病性弧所感染，因此建立一种致病性弧菌的通用检测方法及检测试剂盒是非常有必要的，但现行的弧菌检测方法基本上都是针对样品单一而且操作步骤繁项，不易实现现场批量检测，很难满足海水养殖动物病害防治的需要。
发明内容
本发明提供一种通用致病性弧菌试剂盒及快速检测方法，采用该试剂盒能快速地检测是否含有致病性弧菌，检测过程简单，只要含有致病性弧菌，就能检测出。
本发明通过以下技术方案实现：
一种通用致病性弧菌试剂盒，所述的试剂盒包括：
①内装有预混合液的预混合液管
②内装有Bst DNA聚合酶的Bst DNA聚合酶管
③内装有致病性弧菌阳性质粒DNA的阳性模板管
④内装有阴性模板的阴性模板管
⑤内装有显色剂的显色剂管
⑥内装有引物的引物管
⑦内装有灭菌的双蒸水的水管；
其中，所述的预混合物由以下组分按照以下比例配制而成：每450～530毫摩尔三羟甲基氨基甲烷加210～280毫摩尔的KCl、80～130毫摩尔的MgSO4、210～280毫摩尔的(NH4)2SO4、3～8摩尔的甜菜碱、9～12毫摩尔的三磷酸脱氧核糖核苷酸和1.1～1.5毫升的Tween-20；
所述的阴性模板为无菌水；
所述的引物为16s-F3-1、16s-B3-1、16s-FIP-1和16s-BIP-1按照体积比为1:1～2:6～8:6～8混合而成；
所述的16s-F3-1的序列为CCCTGGACAGATACTGACACT；
所述的16s-B3-1的序列为AAACCACATGCTCCACCG；
所述的16s-FIP-1的序列为GGCCACAACCTCCAAGTAGACAGTGGGGAGCAAACAGGATT；
所述的16s-BIP-1的序列为TGGCTTTCGGAGCTAACGCGCCCCCGTCAATTCATTTGAGT。
进一步地，所述的致病性弧菌阳性DNA由致病性弧菌通过以下依序的步骤制备而成：
步骤①：将致病性弧菌活化单克隆菌液；
步骤②：从步骤①中得到的单克隆菌液中提取基因组DNA；
步骤③：将步骤②所提取的基因组DNA进行PCR扩增；
步骤④：将步骤③PCR扩增后基因组DNA的目的片段回收；
步骤⑤：将步骤④回收的PCR产物与pMD19-T载体链接；
步骤⑥：用DH5α大肠杆菌感受态细胞热击转化；
步骤⑦：阳性克隆鉴定并挑选出条带大小为475bp的样品；
步骤⑧：致病性弧菌阳性DNA提取。
进一步地，所述的步骤①：将保种的致病性弧菌置于室温下解冻融化，取100～200μL TSB培养基加入到灭菌后的试管中，然后加入2～4mL解冻融化后的致病性弧菌菌液进行菌种活化；将稀释后的致病性弧菌接种到盛有TSA固体培养基的培养皿中，之后将培养皿倒置于25～30℃的恒温培养箱中过夜培养形成多个弧菌单克隆菌株，最后将培养皿中的弧菌单克隆菌株接种入盛有4～10mL液体培养基的灭菌后的试管中，最后将接种后的弧菌液体培养基放入25～30℃的恒温培养箱中过夜培养形成单克隆菌液。
进一步地，所述的致病性弧菌为创伤弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌中的一种或者任意两种以上按照任意比例混合。
进一步地，所述的步骤②的具体步骤为：将步骤①活化所得到的单克隆菌液按照离心柱型的细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书进行基因组DNA提取。
进一步地，所述的步骤③的具体步骤为：先将提取的基因组DNA、Taq DNA聚合酶、2×HSTM反应混合液、正向引物16s-F3、反向引物16s-R3和超纯水按照体积比为0.5：0.25：12.5：1：1：9.75混合；
然后将上述混合物依次进行如下步骤：
首先，在94℃加热3分钟；
然后，重复如下步骤35次：先在94℃加热30秒，接着在58～62℃加热30秒，之后在72℃加热60秒；
最后在72℃加热10分钟。
进一步地，所述的步骤④的具体步骤如下：将经过步骤③PCR扩增后的产物用琼脂糖凝胶电泳，然后在琼脂糖凝胶中切割出条带大小在475bp的目的条带，放入重量已知的离心管中，然后使用琼脂凝胶回收试剂盒按照相应的说明书将所述的目的片段进行回收。
进一步地，所述的步骤⑤具体步骤如下：将经步骤④目的片段回收后的产物用pMD19-T Vector试剂盒并按照其说明书将经步骤④目的片段回收后的产物与pMD19-T载体链接。
进一步地，所述的步骤⑥具体包括如下步骤：
先将盛有DH5α大肠杆菌感受态细胞的试管放在冰上溶解，然后加入步骤⑤制备的产物，之后冰上冰浴30min；
接着在温度为42℃的水浴锅中加热45s，之后在冰上冰浴1min；
然后在试管中加入SOC培养基，在温度为37℃转速为160r/min的摇床上振荡培养2.5～3h；
最后从试管中吸取振荡培养2.5～3h后的产物均匀涂布于具氨苄抗性的LB固体培养基上，LB固体培养基中氨苄青霉素的浓度为100mg/mL，然后在37℃培养箱中过夜培养；
所述的DH5α大肠杆菌、步骤⑤制备的产物与SOC培养基的体积比为5:100:890；
进一步地，所述的步骤⑦具体包括如下步骤：挑选步骤⑥过夜培养得到的单菌落，置于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，所述含氨苄青霉素的LB液体培养基中的氨苄青霉素的浓度为100μg/mL，之后在温度为37℃转速为160r/min的摇床上振荡培养4～8h，
然后将从摇床上振荡培养的产物、Taq DNA聚合酶、2×HSTM反应混合液、M13F、M13R和超纯水按照体积比为0.6：0.15：7.5：0.6：0.6：2.65混合均匀，接着将上述混合物依次进行如下步骤：
首先，在94℃加热3分钟；
其次，重复如下步骤35～38次：先在94℃加热30秒，接着在58～62℃加热30秒，之后在72℃加热60秒；
重复完35～38次上述步骤后再在72℃加热10分钟；
用质量浓度为1.0％～2.0％的琼脂糖凝集电泳，挑选出条带大小为475bp的样品。
进一步地，所述的步骤⑧具体包括如下步骤：将步骤⑦制备的符合要求的样品使用质粒提取试剂盒并按照相应的说明书提取出所述的致病性弧菌阳性质粒DNA。
进一步地，所述的显色剂为羟基萘酚蓝。
一种通用致病性弧菌的快速检测方法，包括如下步骤：采集多个芝麻粒大小的大黄鱼身体任意部位的组织，分别加入到30～80微升的ALL-DNA-OUT试剂中，然后在80℃加热5～15分钟，作为待检测样品；
然后分别将0.5～2微升阴性模板管内的无菌水加入容器一中，0.5～2微升阳性模板管内的致病性弧菌阳性DNA加入容器二中，分别将0.5～2微升待检测样品加入容器三中，之后在容器一中分别量取14微升预混合液管中的取预混合液、1～2微升Bst DNA聚合酶管中的Bst DNA聚合酶、1微升显色剂管中的显色剂和2.5～3.5微升引物管中的引物，然后混合均匀，之后在67℃水浴锅中加热45分钟后颜色为紫色，作为对照；
在容器二中分别量取14微升预混合液管中的取预混合液、1～2微升Bst DNA聚合酶管中的Bst DNA聚合酶、1微升显色剂管中的显色剂和2.5～3.5微升引物管中的引物，然后混合均匀，之后在67℃水浴锅中加热45分钟后颜色为蓝色，作为对照；
在容器三中分别量取14微升预混合液管中的取预混合液、1～2微升Bst DNA聚合酶管中的Bst DNA聚合酶、1微升显色剂管中的显色剂和2.5～3.5微升引物管中的引物，然后混合均匀，之后在67℃水浴锅中加热45分钟后的颜色如果与容器一中的颜色一致，则样品中没有致病性弧菌，如果与容器二中的颜色一致，则样品中带有致病性弧菌。
本实施例的所述的引物的根据弧菌属保守的16s RNA基因序列设计(选取了16种弧菌进行比对)，根据比对结果在保守区域应用Primer Explorer version5.0在线引物设计，委托生工生物工程股份有限公司制备出所述引物，并最终筛选出本发明的引物组合。
较之前的现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明的试剂盒样品易得，而且能检测多种致病性弧菌。检测方法简单快速，从取样到检测仅需要一个小时采样15分钟检测45分钟，不需要依附昂贵的仪器。可结合简单的DNA提取，扩增结束后肉眼观察颜色变化即可，不需要昂贵的PCR仪，从采样到检测到结果方便快捷，可广泛应用于病原的基层检测。
本发明的引物特异性强、灵敏度高，最低检出限为940fg/μL。
附图说明
图1为实施例1的反应结果直观图。
图2为实施例1的多个菌种的反应结果柱状图。
图3为实施例1多个菌种的反应柱状图。
图4为实施例2创伤弧菌各个浓度下的反应柱状图。
图5为实施例2创伤弧菌各个浓度下的反应结果图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
以下实施例中的Bst DNA聚合酶、三磷酸脱氧核糖核苷酸、MgSO4溶液和缓冲液(10×)购自New England Biolab公司；三羟甲基氨基甲烷Tris-Hcl(PH8.8)购自索莱宝；KCl购自阿拉丁；(NH4)2SO4及Tween-20购自罗恩；甜菜碱购自Sigma公司。所述的16s-F3-1、16s-B3-1、16s-FIP-1和16s-BIP-1由生工生物工程股份有限公司合成。
实施例1
一种通用致病性弧菌试剂盒，所述的试剂盒包括：
①内装有预混合液的预混合液管
②内装有Bst DNA聚合酶的Bst DNA聚合酶管
③内装有致病性弧菌阳性质粒DNA的阳性模板管
④内装有阴性模板的阴性模板管
⑤内装有显色剂的显色剂管
⑥内装有引物的引物管
⑦内装有灭菌的双蒸水的水管；
其中，所述的预混合物由以下组分按照以下比例配制而成：每450毫摩尔三羟甲基氨基甲烷加入以下物质：280毫摩尔的KCl、130毫摩尔的MgSO4、280毫摩尔的(NH4)2SO4、8摩尔的甜菜碱、12毫摩尔的三磷酸脱氧核糖核苷酸和1.5毫升的Tween-20；
所述的阴性模板为无菌水；
所述的引物为16s-F3-1、16s-B3-1、16s-FIP-1和16s-BIP-1按照体积比为1:1:6:6混合而成；
所述的16s-F3-1的序列为CCCTGGACAGATACTGACACT；
所述的16s-B3-1的序列为AAACCACATGCTCCACCG；
所述的16s-FIP-1的序列为GGCCACAACCTCCAAGTAGACAGTGGGGAGCAAACAGGATT；
所述的16s-BIP-1的序列为TGGCTTTCGGAGCTAACGCGCCCCCGTCAATTCATTTGAGT。
所述的致病性弧菌阳性DNA由致病性弧菌通过以下依序的步骤制备而成：
步骤①：将致病性弧菌活化单克隆菌液；
步骤②：从步骤①中得到的单克隆菌液中提取基因组DNA；
步骤③：将步骤②所提取的基因组DNA进行PCR扩增；
步骤④：将步骤③PCR扩增后基因组DNA的目的片段回收；
步骤⑤：将步骤④回收的PCR产物与pMD19-T载体链接；
步骤⑥：用DH5α大肠杆菌感受态细胞热击转化；
步骤⑦：阳性克隆鉴定并挑选出条带大小为475bp的样品；
步骤⑧：致病性弧菌阳性DNA提取。
所述的步骤①：将保种的致病性弧菌置于室温下解冻融化，取100μL TSB培养基加入到灭菌后的试管中，然后加入2mL解冻融化后的致病性弧菌菌液进行菌种活化；将稀释后的致病性弧菌接种到盛有TSA固体培养基的培养皿中，之后将培养皿倒置于25℃的恒温培养箱中过夜培养形成多个弧菌单克隆菌株，最后将培养皿中的弧菌单克隆菌株接种入盛有4mL液体培养基的灭菌后的试管中，最后将接种后的弧菌液体培养基放入25℃的恒温培养箱中过夜培养形成单克隆菌液。
所述的致病性弧菌为创伤弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌中的一种或者任意两种以上按照任意比例混合。
所述的步骤②的具体步骤为：将步骤①活化所得到的单克隆菌液按照离心柱型的细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书进行基因组DNA提取。
本实施例用minibest细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)及其说明书进行DNA提取，具体步骤如下：
1)用1.5ml Tube收集菌液，12,000rpm离心2min，弃上清。
2)加入180μl的Buffer GL、20μl的Proteinase K(20mg/ml)和10μl的RNase A(10mg/ml)充分振荡混匀，于56℃水浴温育10min，此时溶液应呈透明、澄清状。
3)加入200μl的Buffer GB和200μl的100％乙醇，充分吸打混匀。
4)将Spin Column安装在Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12,000rpm离心2min，弃滤液。
5)将500μl的Buffer WA加入至Spin Column中，12,000rpm离心1min，弃滤液。
6)将700μl的Buffer WB加入至Spin Column中，12,000rpm离心1min，弃滤液。
注)请确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100％乙醇。请沿Spin Column管壁四周加入Buffer WB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。
7)重复操作步骤3。
8)将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000rpm离心2min。
9)将Spin Column安置于新的1.5ml离心管上，在Spin Column膜的中央处加入200μl的灭菌水或Elution Buffer，室温静置5min。注)将灭菌水或Elution Buffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率。
10)12,000rpm离心2min洗脱DNA。如需获得更大收量，可将离下液重新加入到SpinColumn膜的中央或再加入200μl的灭菌水或Elution Buffer，室温静置5min后，12,000rpm离心2min洗脱DNA。
所述的步骤③的具体步骤为：先将提取的基因组DNA、Taq DNA聚合酶、2×HSTM反应混合液、正向引物16s-F3、反向引物16s-R3和超纯水按照体积比为0.5：0.25：12.5：1：1：9.75混合；
然后将上述混合物依次进行如下步骤：
首先，在94℃加热3分钟；
然后，重复如下步骤35次：先在94℃加热30秒，接着在58℃加热30秒，之后在72℃加热60秒；
最后在72℃加热10分钟。
所述的步骤④的具体步骤如下：将经过步骤③PCR扩增后的产物用琼脂糖凝胶电泳，然后在琼脂糖凝胶中切割出条带大小在475bp的目的条带，放入重量已知的离心管中，然后使用琼脂凝胶回收试剂盒按照相应的说明书将所述的目的片段回收进行回收。
本实施例使用E.Z.N.
Gel Extraction Kit(OMEGA，美国)试剂盒及其说明书进行回收，具体操作如下：
(1)取出新的Hibind DNA结合柱装在收集管上，加入200μL的Buffer GPS平衡缓冲液，室温下静置5min，12000g室温离心2min。
(2)去滤液，将Hibind DNA结合柱装重新装在收集管上，加入700μL灭菌水至柱子中；12000g室温离心2min。
(3)弃滤液，将Hibind DNA结合柱装重新装在收集管上以备用；
(4)在装有目的条带的离心管中，加入一定体积的Binding Buffer(0.1g胶加入100μL Binding Buffer)；
(5)55℃～60℃金属浴加热7min，使胶块完全融化(期间可取出混匀)；
(6)完全溶解后，将混合液转移至平衡好的柱子中，10000g离心1min；
(7)弃滤液，加入300μL Binding Buffer，10000g离心1min；
(8)弃滤液，加入700μL SPW(已经加入无水乙醇)，10000g离心1min；
(9)重复操作第8步；
(10)弃滤液，将柱子重新放置在收集管上，14000g空管离心2min；
(11)弃收集管，将柱子置于新的1.5mL离心管上，在柱子吸附膜中心加入30μL的Elution Buffer，室温静置2min；
(12)14000g离心1min，收集回收产物；
(13)使用超微量分光光度计(NanoDrop 2000)测定PCR产物的浓度和纯度。
所述的步骤⑤具体步骤如下：所述的步骤⑤具体步骤如下：将经步骤④目的片段回收后的产物用pMD19-T Vector试剂盒并按照其说明书将经步骤④目的片段回收后的产物与pMD19-T载体链接。
步骤如下：
(1)反应体系：
加样后混匀离心
(2)反应程序：16℃，过夜连接16h。
所述的步骤⑥具体包括如下步骤：
先将盛有DH5α大肠杆菌感受态细胞的试管放在冰上溶解，然后加入步骤⑤制备的产物，之后冰上冰浴30min；
接着在温度为42℃的水浴锅中加热45s，之后在冰上冰浴1min；
然后在试管中加入SOC培养基，在温度为37℃转速为160r/min的摇床上振荡培养2.5h；
最后从试管中吸取振荡培养2.5～3h后的产物均匀涂布于具氨苄抗性的LB固体培养基上，LB固体培养基中氨苄青霉素的浓度为100mg/mL，然后在37℃培养箱中过夜培养；
所述的DH5α大肠杆菌、步骤⑤制备的产物与SOC培养基的体积比为5:100:890；
所述的步骤⑦具体包括如下步骤：挑选步骤⑥过夜培养得到的单菌落，置于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，所述含氨苄青霉素的LB液体培养基中的氨苄青霉素的浓度为100μg/mL，之后在温度为37℃转速为160r/min的摇床上振荡培养4h，
然后将从摇床上振荡培养的产物、Taq DNA聚合酶、2×HSTM反应混合液、M13F、M13R和超纯水按照体积比为0.6：0.15：7.5：0.6：0.6：2.65混合均匀，接着将上述混合物依次进行如下步骤：
首先，在94℃加热3分钟；
其次，重复如下步骤38次：先在94℃加热30秒，接着在58℃加热30秒，之后在72℃加热60秒；
重复完38次上述步骤后再在72℃加热10分钟；
用质量浓度为1.0％～1.2％的琼脂糖凝集电泳，挑选出条带大小为475bp的符合要求的样品。
所述的步骤⑧具体包括如下步骤：将步骤⑦制备的符合要求的样品使用质粒提取试剂盒并按照相应的说明书提取出所述的致病性弧菌阳性质粒DNA。
本实施例采用质粒提取试剂盒(OMEGA，USA)提取质粒，具体操作步骤如下：
(1)将菌液分装于1.5mL离心管中，分装5管，10000g室温离心1min；
(2)弃上清，加入250μL的SolutionI/RNaseA并上下吹吸混合，使菌体彻底悬浮；
(3)然后加入250μL的SolutionII，将离心管上下颠倒数次获得均一的溶解产物，室温静置2min；
(4)加入350μL的SolutionIII，立即颠倒数次，获得絮状的白色沉底，14000g室温离心10min；
(5)吸取上清到收集管的柱子内，10000g室温离心1min；
(6)弃滤液，将收集管放于原位，再加入500μL Buffer HB，10000g室温离心1min；
(8)弃滤液，将收集管放于原位，再加入500μLDNA Wash Buffer(已加入无水乙醇)，10000g室温离心1min；
(9)重复操作第8步；
(10)弃滤液，将柱子13000g室温离心2min；
(11)弃收集管，将柱子置于一个新的1.5mL离心管中，向柱子膜中心加入50μL无菌水，室温静置2min后，13000g室温离心1min；
(12)弃柱子，NanoDrop 2000超微量分光光度计测定1.5mL离心管中质粒的浓度和纯度，-20℃保存备用。
所述的显色剂为羟基萘酚蓝。
一种通用致病性弧菌的快速检测方法，包括如下步骤：采集多个芝麻粒大小的大黄鱼身体任意部位的组织，加入到30微升的ALL-DNA-OUT试剂中，然后在80℃加热10分钟，作为待检测样品；
然后将0.5微升阴性模板管内的无菌水加入容器一中，之后在容器一中分别量取14微升预混合液管中的取预混合液、2微升Bst DNA聚合酶管中的Bst DNA聚合酶、1微升显色剂管中的显色剂和2.5微升引物管中的引物，然后混合均匀，之后在67℃水浴锅中加热45分钟后颜色为紫色，作为对照；
0.5微升阳性模板管内的致病性弧菌阳性DNA加入容器二中，在容器二中分别量取14微升预混合液管中的取预混合液、1微升Bst DNA聚合酶管中的Bst DNA聚合酶、1微升显色剂管中的显色剂和2.5微升引物管中的引物，然后混合均匀，之后在67℃水浴锅中加热45分钟后颜色为蓝色，作为对照；
将0.5微升待检测样品加入容器三中，在容器三中分别量取14微升预混合液管中的取预混合液、1微升Bst DNA聚合酶管中的Bst DNA聚合酶、1微升显色剂管中的显色剂和2.5微升引物管中的引物，然后混合均匀，之后在67℃水浴锅中加热45分钟后的颜色如果与容器一中的颜色一致，则样品中没有致病性弧菌，如果与容器二中的颜色一致，则样品中带有致病性弧菌。
分别将溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、水、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、温和气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌，按照如上步骤做阳性和阴性测试，结果如图1所示，总共有13个管子，从左向右依次为含有如下菌的试验结果：溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、水、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、温和气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌，实验结果显示45分钟内只检测出溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌，而其它菌没有发生反应(即仅有弧菌被检测出来)。
图2多个菌种的反应结果柱状图，图2中1为溶藻弧菌，2为哈维氏弧菌，3为副溶血弧菌，4为创伤弧菌，5为水，6为大肠杆菌，7为嗜水气单胞菌，8为金黄色葡萄球菌。
图3为多个菌种的反应柱状图，图3中1为绿脓杆菌，2为温和气单胞菌，3为迟钝爱德华氏菌，4为豚鼠气单胞菌，5为维氏气单胞菌。图2与图3的结果与图1一致，说明本试剂盒特异性良好，只能检出弧菌，而且能用来检测多种弧菌。
实施例2
一种通用致病性弧菌试剂盒，所述的试剂盒包括：
①内装有预混合液的预混合液管
②内装有Bst DNA聚合酶的Bst DNA聚合酶管
③内装有致病性弧菌阳性质粒DNA的阳性模板管
④内装有阴性模板的阴性模板管
⑤内装有显色剂的显色剂管
⑥内装有引物的引物管
⑦内装有灭菌的双蒸水的水管；
其中，所述的预混合物由以下组分按照以下比例配制而成：每500毫摩尔三羟甲基氨基甲烷加入以下物质：280毫摩尔的KCl、80毫摩尔的MgSO4、210毫摩尔的(NH4)2SO4、3摩尔的甜菜碱、9毫摩尔的三磷酸脱氧核糖核苷酸和1.1毫升的Tween-20；
所述的阴性模板为无菌水；
所述的引物为16s-F3-1、16s-B3-1、16s-FIP-1和16s-BIP-1按照体积比为1:1:8:8混合而成；
所述的16s-F3-1的序列为CCCTGGACAGATACTGACACT；
所述的16s-B3-1的序列为AAACCACATGCTCCACCG；
所述的16s-FIP-1的序列为GGCCACAACCTCCAAGTAGACAGTGGGGAGCAAACAGGATT；
所述的16s-BIP-1的序列为TGGCTTTCGGAGCTAACGCGCCCCCGTCAATTCATTTGAGT。
所述的致病性弧菌阳性DNA由致病性弧菌通过以下依序的步骤制备而成：
步骤①：将致病性弧菌活化单克隆菌液；
步骤②：从步骤①中得到的单克隆菌液中提取基因组DNA；
步骤③：将步骤②所提取的基因组DNA进行PCR扩增；
步骤④：将步骤③PCR扩增后基因组DNA的目的片段回收；
步骤⑤：将步骤④回收的PCR产物与pMD19-T载体链接；
步骤⑥：用DH5α大肠杆菌感受态细胞热击转化；
步骤⑦：阳性克隆鉴定并挑选出条带大小为475bp的样品；
步骤⑧：致病性弧菌阳性DNA提取。
所述的步骤①：将保种的致病性弧菌置于室温下解冻融化，取200μL TSB培养基加入到灭菌后的试管中，然后加入4mL解冻融化后的致病性弧菌菌液进行菌种活化；将稀释后的致病性弧菌接种到盛有TSA固体培养基的培养皿中，之后将培养皿倒置于30℃的恒温培养箱中过夜培养形成多个弧菌单克隆菌株，最后将培养皿中的弧菌单克隆菌株接种入盛有10mL液体培养基的灭菌后的试管中，最后将接种后的弧菌液体培养基放入30℃的恒温培养箱中过夜培养形成单克隆菌液。
所述的致病性弧菌为创伤弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌中的一种或者任意两种以上按照任意比例混合。
所述的步骤②的具体步骤为：将步骤①活化所得到的单克隆菌液按照离心柱型的细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书进行基因组DNA提取。
本实施例用minibest细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)及其说明书进行DNA提取，具体步骤如下：
1)用1.5ml Tube收集菌液，12,000rpm离心2min，弃上清。
2)加入180μl的Buffer GL、20μl的Proteinase K(20mg/ml)和10μl的RNase A(10mg/ml)充分振荡混匀，于56℃水浴温育10min，此时溶液应呈透明、澄清状。
3)加入200μl的Buffer GB和200μl的100％乙醇，充分吸打混匀。
4)将Spin Column安装在Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12,000rpm离心2min，弃滤液。
5)将500μl的Buffer WA加入至Spin Column中，12,000rpm离心1min，弃滤液。
6)将700μl的Buffer WB加入至Spin Column中，12,000rpm离心1min，弃滤液。
注)请确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100％乙醇。请沿Spin Column管壁四周加入Buffer WB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。
7)重复操作步骤3。
8)将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000rpm离心2min。
9)将Spin Column安置于新的1.5ml离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50～200μl的灭菌水或Elution Buffer，室温静置5min。注)将灭菌水或Elution Buffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率。
10)12,000rpm离心2min洗脱DNA。如需获得更大收量，可将离下液重新加入到SpinColumn膜的中央或再加入50～200μl的灭菌水或Elution Buffer，室温静置5min后，12,000rpm离心2min洗脱DNA。
所述的步骤③的具体步骤为：先将提取的基因组DNA、Taq DNA聚合酶、2×HSTM反应混合液、正向引物16s-F3、反向引物16s-R3和超纯水按照体积比为0.5：0.25：12.5：1：1：9.75混合；
然后将上述混合物依次进行如下步骤：
首先，在94℃加热3分钟；
然后，重复如下步骤35次：先在94℃加热30秒，接着在62℃加热30秒，之后在72℃加热60秒；
最后在72℃加热10分钟。
所述的步骤④的具体步骤如下：将经过步骤③PCR扩增后的产物用琼脂糖凝胶电泳，然后在琼脂糖凝胶中切割出条带大小在475bp的目的条带，放入重量已知的离心管中，然后使用琼脂凝胶回收试剂盒按照相应的说明书将所述的目的片段回收进行回收。
本实施例使用E.Z.N.
Gel Extraction Kit(OMEGA，美国)试剂盒及其说明书进行回收，具体操作如下：
(1)取出新的Hibind DNA结合柱装在收集管上，加入200μL的Buffer GPS平衡缓冲液，室温下静置5min，12000g室温离心2min。
(2)去滤液，将Hibind DNA结合柱装重新装在收集管上，加入700μL灭菌水至柱子中；12000g室温离心2min。
(3)弃滤液，将Hibind DNA结合柱装重新装在收集管上以备用；
(4)在装有目的条带的离心管中，加入一定体积的Binding Buffer(0.1g胶加入100μL Binding Buffer)；
(5)55℃～60℃金属浴加热7min，使胶块完全融化(期间可取出混匀)；
(6)完全溶解后，将混合液转移至平衡好的柱子中，10000g离心1min；
(7)弃滤液，加入300μL Binding Buffer，10000g离心1min；
(8)弃滤液，加入700μL SPW(已经加入无水乙醇)，10000g离心1min；
(9)重复操作第8步；
(10)弃滤液，将柱子重新放置在收集管上，14000g空管离心2min；
(11)弃收集管，将柱子置于新的1.5mL离心管上，在柱子吸附膜中心加入30μL的Elution Buffer，室温静置2min；
(12)14000g离心1min，收集回收产物；
(13)使用超微量分光光度计(NanoDrop 2000)测定PCR产物的浓度和纯度。
所述的步骤⑤具体步骤如下：所述的步骤⑤具体步骤如下：将经步骤④目的片段回收后的产物用pMD19-T Vector试剂盒并按照其说明书将经步骤④目的片段回收后的产物与pMD19-T载体链接。
步骤如下：
(2)反应体系：
加样后混匀离心
(2)反应程序：16℃，过夜连接16h。
所述的步骤⑥具体包括如下步骤：
先将盛有DH5α大肠杆菌感受态细胞的试管放在冰上溶解，然后加入步骤⑤制备的产物，之后冰上冰浴30min；
接着在温度为42℃的水浴锅中加热45s，之后在冰上冰浴1min；
然后在试管中加入SOC培养基，在温度为37℃转速为160r/min的摇床上振荡培养3h；
最后从试管中吸取振荡培养2.5～3h后的产物均匀涂布于具氨苄抗性的LB固体培养基上，LB固体培养基中氨苄青霉素的浓度为100mg/mL，然后在37℃培养箱中过夜培养；
所述的DH5α大肠杆菌、步骤⑤制备的产物与SOC培养基的体积比为5:100:890；
所述的步骤⑦具体包括如下步骤：挑选步骤⑥过夜培养得到的单菌落，置于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，所述含氨苄青霉素的LB液体培养基中的氨苄青霉素的浓度为100μg/mL，之后在温度为37℃转速为160r/min的摇床上振荡培养8h，
然后将从摇床上振荡培养的产物、Taq DNA聚合酶、2×HSTM反应混合液、M13F、M13R和超纯水按照体积比为0.6：0.15：7.5：0.6：0.6：2.65混合均匀，接着将上述混合物依次进行如下步骤：
首先，在94℃加热3分钟；
其次，重复如下步骤38次：先在94℃加热30秒，接着在62℃加热30秒，之后在72℃加热60秒；
重复完38次上述步骤后再在72℃加热10分钟；
用质量浓度为1.0％～1.2％的琼脂糖凝集电泳，挑选出条带大小为475bp的符合要求的样品。
所述的步骤⑧具体包括如下步骤：将步骤⑦制备的符合要求的样品使用质粒提取试剂盒并按照相应的说明书提取出所述的致病性弧菌阳性质粒DNA。
本实施例采用质粒提取试剂盒(OMEGA，USA)提取质粒，具体操作步骤如下：
(1)将菌液分装于1.5mL离心管中，分装5管，10000g室温离心1min；
(2)弃上清，加入250μL的SolutionI/RNaseA并上下吹吸混合，使菌体彻底悬浮；
(3)然后加入250μL的SolutionII，将离心管上下颠倒数次获得均一的溶解产物，室温静置2min；
(4)加入350μL的SolutionIII，立即颠倒数次，获得絮状的白色沉底，14000g室温离心10min；
(5)吸取上清到收集管的柱子内，10000g室温离心1min；
(6)弃滤液，将收集管放于原位，再加入500μL Buffer HB，10000g室温离心1min；
(8)弃滤液，将收集管放于原位，再加入500μLDNA Wash Buffer(已加入无水乙醇)，10000g室温离心1min；
(9)重复操作第8步；
(10)弃滤液，将柱子13000g室温离心2min；
(11)弃收集管，将柱子置于一个新的1.5mL离心管中，向柱子膜中心加入50μL无菌水，室温静置2min后，13000g室温离心1min；
(12)弃柱子，NanoDrop 2000超微量分光光度计测定1.5mL离心管中质粒的浓度和纯度，-20℃保存备用。
所述的显色剂为羟基萘酚蓝。
一种通用致病性弧菌的快速检测方法，包括如下步骤：采集多个芝麻粒大小的大黄鱼身体任意部位的组织，加入到80微升的ALL-DNA-OUT试剂中，然后在80℃加热15分钟，作为待检测样品；
然后将2微升阴性模板管内的无菌水加入容器一中，之后在容器一中分别量取14微升预混合液管中的取预混合液、2微升Bst DNA聚合酶管中的Bst DNA聚合酶、2微升显色剂管中的显色剂和3.5微升引物管中的引物，然后混合均匀，之后在67℃水浴锅中加热45分钟后颜色为紫色，作为对照；
2微升阳性模板管内的致病性弧菌阳性DNA加入容器二中，在容器二中分别量取14微升预混合液管中的取预混合液、2微升Bst DNA聚合酶管中的Bst DNA聚合酶、1微升显色剂管中的显色剂和3.5微升引物管中的引物，然后混合均匀，之后在67℃水浴锅中加热45分钟后颜色为蓝色，作为对照；
将2微升待检测样品加入容器三中，在容器三中分别量取14微升预混合液管中的取预混合液、2微升Bst DNA聚合酶管中的Bst DNA聚合酶、1微升显色剂管中的显色剂和3.5微升引物管中的引物，然后混合均匀，之后在67℃水浴锅中加热45分钟后的颜色如果与容器一中的颜色一致，则样品中没有致病性弧菌，如果与容器二中的颜色一致，则样品中带有致病性弧菌。
按照实施例1的方法结果采用本试剂盒检测溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、水、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、温和气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌，结果与实施例1的结果一致。
实施例3
一种通用致病性弧菌试剂盒，所述的试剂盒包括：
①内装有预混合液的预混合液管
②内装有Bst DNA聚合酶的Bst DNA聚合酶管
③内装有致病性弧菌阳性质粒DNA的阳性模板管
④内装有阴性模板的阴性模板管
⑤内装有显色剂的显色剂管
⑥内装有引物的引物管
⑦内装有灭菌的双蒸水的水管；
其中，所述的预混合物由以下组分按照以下比例配制而成：每480毫摩尔三羟甲基氨基甲烷加250毫摩尔的KCl、100毫摩尔的MgSO4、250毫摩尔的(NH4)2SO4、5摩尔的甜菜碱、10毫摩尔的三磷酸脱氧核糖核苷酸和1.3毫升的Tween-20；
所述的阴性模板为无菌水；
所述的引物为16s-F3-1、16s-B3-1、16s-FIP-1和16s-BIP-1按照体积比为1:2:8:8混合而成；
所述的16s-F3-1的序列为CCCTGGACAGATACTGACACT；
所述的16s-B3-1的序列为AAACCACATGCTCCACCG；
所述的16s-FIP-1的序列为GGCCACAACCTCCAAGTAGACAGTGGGGAGCAAACAGGATT；
所述的16s-BIP-1的序列为TGGCTTTCGGAGCTAACGCGCCCCCGTCAATTCATTTGAGT。
所述的致病性弧菌阳性DNA由致病性弧菌通过以下依序的步骤制备而成：
步骤①：将致病性弧菌活化单克隆菌液；
步骤②：从步骤①中得到的单克隆菌液中提取基因组DNA；
步骤③：将步骤②所提取的基因组DNA进行PCR扩增；
步骤④：将步骤③PCR扩增后基因组DNA的目的片段回收；
步骤⑤：将步骤④回收的PCR产物与pMD19-T载体链接；
步骤⑥：用DH5α大肠杆菌感受态细胞热击转化；
步骤⑦：阳性克隆鉴定并挑选出条带大小为475bp的样品；
步骤⑧：致病性弧菌阳性DNA提取。
所述的步骤①：将保种的致病性弧菌置于室温下解冻融化，取150μL TSB培养基加入到灭菌后的试管中，然后加入4mL解冻融化后的致病性弧菌菌液进行菌种活化；将稀释后的致病性弧菌接种到盛有TSA固体培养基的培养皿中，之后将培养皿倒置于27℃的恒温培养箱中过夜培养形成多个弧菌单克隆菌株，最后将培养皿中的弧菌单克隆菌株接种入盛有7mL液体培养基的灭菌后的试管中，最后将接种后的弧菌液体培养基放入28℃的恒温培养箱中过夜培养形成单克隆菌液。
所述的致病性弧菌为创伤弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌中的一种或者任意两种以上按照任意比例混合。
所述的步骤②的具体步骤为：将步骤①活化所得到的单克隆菌液按照离心柱型的细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书进行基因组DNA提取。
本实施例用minibest细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)及其说明书进行DNA提取，具体步骤如下：
1)用1.5ml Tube收集菌液，12,000rpm离心2min，弃上清。
2)加入180μl的Buffer GL、20μl的Proteinase K(20mg/ml)和10μl的RNase A(10mg/ml)充分振荡混匀，于56℃水浴温育10min，此时溶液应呈透明、澄清状。
3)加入200μl的Buffer GB和200μl的100％乙醇，充分吸打混匀。
4)将Spin Column安装在Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12,000rpm离心2min，弃滤液。
5)将500μl的Buffer WA加入至Spin Column中，12,000rpm离心1min，弃滤液。
6)将700μl的Buffer WB加入至Spin Column中，12,000rpm离心1min，弃滤液。
注)请确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100％乙醇。请沿Spin Column管壁四周加入Buffer WB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。
7)重复操作步骤3。
8)将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000rpm离心2min。
9)将Spin Column安置于新的1.5ml离心管上，在Spin Column膜的中央处加入100μl的灭菌水或Elution Buffer，室温静置5min。注)将灭菌水或Elution Buffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率。
10)12,000rpm离心2min洗脱DNA。如需获得更大收量，可将离下液重新加入到SpinColumn膜的中央或再加入100μl的灭菌水或Elution Buffer，室温静置5min后，12,000rpm离心2min洗脱DNA。
所述的步骤③的具体步骤为：先将提取的基因组DNA、Taq DNA聚合酶、2×HSTM反应混合液、正向引物16s-F3、反向引物16s-R3和超纯水按照体积比为0.5：0.25：12.5：1：1：9.75混合；
然后将上述混合物依次进行如下步骤：
首先，在94℃加热3分钟；
然后，重复如下步骤35次：先在94℃加热30秒，接着在58℃加热30秒，之后在72℃加热60秒；
最后在72℃加热10分钟。
所述的步骤④的具体步骤如下：将经过步骤③PCR扩增后的产物用琼脂糖凝胶电泳，然后在琼脂糖凝胶中切割出条带大小为475bp的目的条带，放入重量已知的离心管中，然后使用琼脂凝胶回收试剂盒按照相应的说明书将所述的目的片段回收进行回收。
本实施例使用E.Z.N.
Gel Extraction Kit(OMEGA，美国)试剂盒及其说明书进行回收，具体操作如下：
(1)取出新的Hibind DNA结合柱装在收集管上，加入200μL的Buffer GPS平衡缓冲液，室温下静置5min，12000g室温离心2min。
(2)去滤液，将Hibind DNA结合柱装重新装在收集管上，加入700μL灭菌水至柱子中；12000g室温离心2min。
(3)弃滤液，将Hibind DNA结合柱装重新装在收集管上以备用；
(4)在装有目的条带的离心管中，加入一定体积的Binding Buffer(0.1g胶加入100μL Binding Buffer)；
(5)55℃～60℃金属浴加热7min，使胶块完全融化(期间可取出混匀)；
(6)完全溶解后，将混合液转移至平衡好的柱子中，10000g离心1min；
(7)弃滤液，加入300μL Binding Buffer，10000g离心1min；
(8)弃滤液，加入700μL SPW(已经加入无水乙醇)，10000g离心1min；
(9)重复操作第8步；
(10)弃滤液，将柱子重新放置在收集管上，14000g空管离心2min；
(11)弃收集管，将柱子置于新的1.5mL离心管上，在柱子吸附膜中心加入30μL的Elution Buffer，室温静置2min；
(12)14000g离心1min，收集回收产物；
(13)使用超微量分光光度计(NanoDrop 2000)测定PCR产物的浓度和纯度。
所述的步骤⑤具体步骤如下：所述的步骤⑤具体步骤如下：将经步骤④目的片段回收后的产物用pMD19-T Vector试剂盒并按照其说明书将经步骤④目的片段回收后的产物与pMD19-T载体链接。
步骤如下：
(3)反应体系：
加样后混匀离心
(2)反应程序：16℃，过夜连接16h。
所述的步骤⑥具体包括如下步骤：
先将盛有DH5α大肠杆菌感受态细胞的试管放在冰上溶解，然后加入步骤⑤制备的产物，之后冰上冰浴30min；
接着在温度为42℃的水浴锅中加热45s，之后在冰上冰浴1min；
然后在试管中加入SOC培养基，在温度为37℃转速为160r/min的摇床上振荡培养2.8h；
最后从试管中吸取振荡培养2.8h后的产物均匀涂布于具氨苄抗性的LB固体培养基上，LB固体培养基中氨苄青霉素的浓度为100mg/mL，然后在37℃培养箱中过夜培养；
所述的DH5α大肠杆菌、步骤⑤制备的产物与SOC培养基的体积比为5:100:890；
所述的步骤⑦具体包括如下步骤：挑选步骤⑥过夜培养得到的单菌落，置于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，所述含氨苄青霉素的LB液体培养基中的氨苄青霉素的浓度为100μg/mL，之后在温度为37℃转速为160r/min的摇床上振荡培养6h，
然后将从摇床上振荡培养的产物、Taq DNA聚合酶、2×HSTM反应混合液、M13F、M13R和超纯水按照体积比为0.6：0.15：7.5：0.6：0.6：2.65混合均匀，接着将上述混合物依次进行如下步骤：
首先，在94℃加热3分钟；
其次，重复如下步骤37次：先在94℃加热30秒，接着在58～62℃加热30秒，之后在72℃加热60秒；
重复完37次上述步骤后再在72℃加热10分钟；
用质量浓度为1.0％～1.2％的琼脂糖凝集电泳，挑选出条带大小为475bp的符合要求的样品。
所述的步骤⑧具体包括如下步骤：将步骤⑦制备的符合要求的样品使用质粒提取试剂盒并按照相应的说明书提取出所述的致病性弧菌阳性质粒DNA。
本实施例采用质粒提取试剂盒(OMEGA，USA)提取质粒，具体操作步骤如下：
(1)将菌液分装于1.5mL离心管中，分装5管，10000g室温离心1min；
(2)弃上清，加入250μL的SolutionI/RNaseA并上下吹吸混合，使菌体彻底悬浮；
(3)然后加入250μL的SolutionII，将离心管上下颠倒数次获得均一的溶解产物，室温静置2min；
(4)加入350μL的SolutionIII，立即颠倒数次，获得絮状的白色沉底，14000g室温离心10min；
(5)吸取上清到收集管的柱子内，10000g室温离心1min；
(6)弃滤液，将收集管放于原位，再加入500μL Buffer HB，10000g室温离心1min；
(8)弃滤液，将收集管放于原位，再加入500μLDNA Wash Buffer(已加入无水乙醇)，10000g室温离心1min；
(9)重复操作第8步；
(10)弃滤液，将柱子13000g室温离心2min；
(11)弃收集管，将柱子置于一个新的1.5mL离心管中，向柱子膜中心加入50μL无菌水，室温静置2min后，13000g室温离心1min；
(12)弃柱子，NanoDrop 2000超微量分光光度计测定1.5mL离心管中质粒的浓度和纯度，-20℃保存备用。
所述的显色剂为羟基萘酚蓝。
一种通用致病性弧菌的快速检测方法，包括如下步骤：采集多个芝麻粒大小的大黄鱼身体任意部位的组织，分别加入到50微升的ALL-DNA-OUT试剂中，然后在80℃加热12分钟，作为待检测样品；
然后分别将1微升阴性模板管内的无菌水加入容器一中，之后在容器一中分别量取14微升预混合液管中的取预混合液、2微升Bst DNA聚合酶管中的BstDNA聚合酶、1.5微升显色剂管中的显色剂和3微升引物管中的引物，然后混合均匀，之后在67℃水浴锅中加热45分钟后颜色为紫色，作为对照；
1微升阳性模板管内的致病性弧菌阳性DNA加入容器二中，在容器二中分别量取14微升预混合液管中的取预混合液、1.5微升Bst DNA聚合酶管中的Bst DNA聚合酶、1微升显色剂管中的显色剂和3微升引物管中的引物，然后混合均匀，之后在67℃水浴锅中加热45分钟后颜色为蓝色，作为对照；
将1微升待检测样品加入容器三中，在容器三中分别量取14微升预混合液管中的取预混合液、1.5微升Bst DNA聚合酶管中的Bst DNA聚合酶、1微升显色剂管中的显色剂和3微升引物管中的引物，然后混合均匀，之后在67℃水浴锅中加热45分钟后的颜色如果与容器一中的颜色一致，则样品中没有致病性弧菌，如果与容器二中的颜色一致，则样品中带有致病性弧菌。
按照实施例1的方法结果采用本试剂盒检测溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、水、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、温和气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌，结果与实施例1的结果一致。
实施例4
将提供的创伤弧菌核酸(94ng/μL)用双蒸水将其进行10倍递进稀释，使其浓度依次为9.4ng/μL、940pg/μL、94pg/μL、9.4pg/μL、940fg/μL、94fg/μL等。每管创伤弧菌稀释液取2微升加入到25微升的本发明试剂盒溶液，与上述实施例不同的是本实施例的显色剂为FD，在LAMP浊度仪上63℃反应45分钟。紫外条件下观察，94fg/μL和水的试管中没有显色，而94ng/μL、9.4ng/μL、940pg/μL、94pg/μL、9.4pg/μL、940fg/μL均显色，因此最低检出限为940fg/μL，结果图图4所示。
图5是创伤弧菌在各个浓度下的反应柱状图，其中，1是94ng/μL，2是9.4ng/μL、3是940pg/μL、4是94pg/μL、5是9.4pg/μL、6是94fg/μL、7是940fg/μL，8是水，灵敏度检测结果显示，16S rRNA-3引物最低检出限为940fg/μL。结果与图4一致。
上述具体实施方式只是对本发明的技术方案进行详细解释，本发明并不只仅仅局限于上述实施例，凡是依据本发明原理的任何改进或替换，均应在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 福建省闽东水产研究所
<120> 一种通用致病性弧菌试剂盒及快速检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 1
Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Thr Ala Cys Thr Gly
1 5 10 15
Ala Cys Ala Cys Thr
20
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 2
Ala Ala Ala Cys Cys Ala Cys Ala Thr Gly Cys Thr Cys Cys Ala Cys
1 5 10 15
Cys Gly
<210> 3
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 3
Gly Gly Cys Cys Ala Cys Ala Ala Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala Gly
1 5 10 15
Thr Ala Gly Ala Cys Ala Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ala Gly Cys Ala
20 25 30
Ala Ala Cys Ala Gly Gly Ala Thr Thr
35 40
<210> 4
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 4
Thr Gly Gly Cys Thr Thr Thr Cys Gly Gly Ala Gly Cys Thr Ala Ala
1 5 10 15
Cys Gly Cys Gly Cys Cys Cys Cys Cys Gly Thr Cys Ala Ala Thr Thr
20 25 30
Cys Ala Thr Thr Thr Gly Ala Gly Thr
35 40
Claims (10)
1.一种通用致病性弧菌试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：
①内装有预混合液的预混合液管，
②内装有Bst DNA聚合酶的Bst DNA聚合酶管，
③内装有致病性弧菌阳性质粒DNA的阳性模板管，
④内装有阴性模板的阴性模板管，
⑤内装有显色剂的显色剂管，
⑥内装有引物的引物管，
⑦内装有灭菌的双蒸水的水管；
其中，所述的预混合液由以下组分按照以下比例配制而成：每450～530毫摩尔三羟甲基氨基甲烷加入以下物质：210～280毫摩尔的KCl、80～130毫摩尔的MgSO4、210～280毫摩尔的(NH4)2SO4、3～8摩尔的甜菜碱、9～12毫摩尔的三磷酸脱氧核糖核苷酸和1.1～1.5毫升的Tween-20；
所述的阴性模板为无菌水；
所述的引物由16s-F3-1、16s-B3-1、16s-FIP-1和16s-BIP-1按照体积比1:1～2:6～8:6～8混合而成；
所述的16s-F3-1的序列为CCCTGGACAGATACTGACACT；
所述的16s-B3-1的序列为AAACCACATGCTCCACCG；
所述的16s-FIP-1的序列为GGCCACAACCTCCAAGTAGACAGTGGGGAGCAAACAGGATT；
所述的16s-BIP-1的序列为TGGCTTTCGGAGCTAACGCGCCCCCGTCAATTCATTTGAGT。
2.根据权利要求1所述的一种通用致病性弧菌试剂盒，其特征在于：所述的致病性弧菌阳性质粒DNA由致病性弧菌通过以下依序的步骤制备而成：
步骤①：将致病性弧菌活化单克隆菌液；
步骤②：从步骤①中得到的单克隆菌液中提取基因组DNA；
步骤③：将步骤②所提取的基因组DNA进行PCR扩增；
步骤④：将步骤③PCR扩增后基因组DNA的目的片段回收；
步骤⑤：将步骤④回收的PCR产物与pMD19-T载体链接；
步骤⑥：用DH5α大肠杆菌感受态细胞热击转化；
步骤⑦：阳性克隆鉴定并挑选出条带大小为475bp的样品；
步骤⑧：致病性弧菌阳性DNA提取。
3.根据权利要求2所述的一种通用致病性弧菌试剂盒，其特征在于：所述的步骤①具体如下：将保种的致病性弧菌置于室温下解冻融化，取100～200μL TSB培养基加入到灭菌后的试管中，然后加入2～4mL解冻融化后的致病性弧菌菌液进行菌种活化；将稀释后的致病性弧菌接种到盛有TSA固体培养基的培养皿中，之后将培养皿倒置于25～30℃的恒温培养箱中过夜培养形成多个弧菌单克隆菌株，最后将培养皿中的弧菌单克隆菌株接种入盛有4～10mL液体培养基的灭菌后的试管中，最后将接种后的弧菌液体培养基放入25～30℃的恒温培养箱中过夜培养形成单克隆菌液。
4.根据权利要求1项所述的一种通用致病性弧菌试剂盒，其特征在于：所述的致病性弧菌为创伤弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌中的一种或者任意两种以上按照任意比例混合。
5.根据权利要求3所述的一种通用致病性弧菌试剂盒，其特征在于：所述的步骤②的具体步骤为：将步骤①活化所得到的单克隆菌液按照离心柱型的细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书所述提取方法进行基因组DNA提取。
6.根据权利要求2所述的一种通用致病性弧菌试剂盒，其特征在于：所述的步骤③的具体步骤为：先将提取的基因组DNA、Taq DNA聚合酶、2×HSTM反应混合液、正向引物16s-F3、反向引物16s-R3和超纯水按照体积比为0.5：0.25：12.5：1：1：9.75混合；
然后将上述混合物依次进行如下步骤：
首先，在94℃加热3分钟；
接着，重复如下步骤35次：先在94℃加热30秒，接着在58～62℃加热30秒，之后在72℃加热60秒；
最后在72℃加热10分钟。
7.根据权利要求2所述的一种通用致病性弧菌试剂盒，其特征在于：所述的步骤④的具体步骤如下：将经过步骤③PCR扩增后的产物用质量浓度为1.0％～2.0％的琼脂糖凝胶电泳，然后在琼脂糖凝胶中切割出条带大小为475bp的目的条带，放入离心管中，然后使用琼脂凝胶回收试剂盒按照相应的说明书所述操作方法将所述的目的片段进行回收。
8.根据权利要求2所述的一种通用致病性弧菌试剂盒，其特征在于：所述的步骤⑤具体步骤如下：将经步骤④目的片段回收后的产物用pMD19-T Vector试剂盒并按照其说明书所述操作方法将经步骤④目的片段回收后的产物与pMD19-T载体链接；
所述的步骤⑥具体包括如下步骤：
先将盛有DH5α大肠杆菌感受态细胞的试管放在冰上溶解，然后加入步骤⑤制备的产物，之后冰上冰浴30min；
接着在温度为42℃的水浴锅中加热45s，之后在冰上冰浴1min；
然后在试管中加入SOC培养基，在温度为37℃转速为160r/min的摇床上振荡培养2.5～3h；
最后从试管中吸取振荡培养2.5～3h后的产物均匀涂布于具氨苄抗性的LB固体培养基上，LB固体培养基中氨苄青霉素的浓度为100mg/mL，然后在37℃培养箱中过夜培养；
所述的DH5α大肠杆菌、步骤⑤制备的产物与SOC培养基的体积比为5:100:890；
所述的步骤⑦具体包括如下步骤：挑选步骤⑥过夜培养得到的单菌落，置于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，所述含氨苄青霉素的LB液体培养基中的氨苄青霉素的浓度为100μg/mL，之后在温度为37℃转速为160r/min的摇床上振荡培养4～8h，
然后将从摇床上振荡培养的产物、Taq DNA聚合酶、2×HSTM反应混合液、M13F、M13R和超纯水按照体积比为0.6：0.15：7.5：0.6：0.6：2.65混合均匀，接着将上述混合物依次进行如下步骤：
首先，在94℃加热3分钟；
接着，重复如下步骤35～38次：先在94℃加热30秒，接着在58～62℃加热30秒，之后在72℃加热60秒；
完成上述重复步骤后再在72℃加热10分钟；
最后，用质量浓度为1.0％～2.0％的琼脂糖凝胶电泳，挑选出条带大小为475bp的样品；
所述的步骤⑧具体包括如下步骤：将步骤⑦制备的样品使用质粒提取试剂盒并按照质粒提取试剂盒的说明书所述操作方法提取出所述的致病性弧菌阳性质粒DNA。
9.根据权利要求1所述的一种通用致病性弧菌试剂盒，其特征在于：所述的显色剂为羟基萘酚蓝。
10.一种用权利要求1-9任一项所述的通用致病性弧菌试剂盒检测致病性弧菌的快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：采集多个芝麻粒大小的大黄鱼身体任意部位的组织，加入到体积为30～80微升的ALL-DNA-OUT试剂中，然后在80℃加热5～15分钟，作为待检测样品；
然后将0.5～2微升阴性模板管内的无菌水加入容器一中，之后在容器一中分别加入14微升预混合液管中的预混合液、1～2微升Bst DNA聚合酶管中的Bst DNA聚合酶、1微升显色剂管中的显色剂和2.5～3.5微升引物管中的引物，然后混合均匀，之后在67℃水浴锅中加热45分钟以上直至颜色变为紫色，作为对照一；
将0.5～2微升阳性模板管内的致病性弧菌阳性质粒DNA加入容器二中，之后在容器二中分别加入14微升预混合液管中的预混合液、1～2微升Bst DNA聚合酶管中的Bst DNA聚合酶、1微升显色剂管中的显色剂和2.5～3.5微升引物管中的引物，然后混合均匀，之后在67℃水浴锅中加热45分钟以上直至颜色变为蓝色，作为对照二；
将0.5～2微升待检测样品加入容器三中，之后在容器三中分别加入14微升预混合液管中的预混合液、1～2微升Bst DNA聚合酶管中的Bst DNA聚合酶、1微升显色剂管中的显色剂和2.5～3.5微升引物管中的引物，然后混合均匀，之后在67℃水浴锅中加热45分钟，观察容器三中所呈现的颜色，如果与容器一中的颜色一致，则样品中没有致病性弧菌，如果与容器二中的颜色一致，则样品中带有致病性弧菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010392917.6A CN111534620A (zh) | 2020-05-11 | 2020-05-11 | 一种通用致病性弧菌试剂盒及其快速检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010392917.6A CN111534620A (zh) | 2020-05-11 | 2020-05-11 | 一种通用致病性弧菌试剂盒及其快速检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111534620A true CN111534620A (zh) | 2020-08-14 |
Family
ID=71979210
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010392917.6A Pending CN111534620A (zh) | 2020-05-11 | 2020-05-11 | 一种通用致病性弧菌试剂盒及其快速检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111534620A (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101633952A (zh) * | 2009-03-20 | 2010-01-27 | 邵碧英 | 水产品中5种致病性弧菌检测试剂盒及其检测方法 |
| CN102154469A (zh) * | 2011-01-14 | 2011-08-17 | 浙江大学 | 致病性弧菌通用检测法及所用的核酸等温扩增检测试剂盒 |
| JP2013085503A (ja) * | 2011-10-17 | 2013-05-13 | Osaka Prefecture Univ | 腸炎ビブリオの検出方法 |
| CN103409512A (zh) * | 2013-07-10 | 2013-11-27 | 渤海大学 | 一种检测水产品中副溶血弧菌的试剂盒及方法 |
| CN104450945A (zh) * | 2014-12-30 | 2015-03-25 | 山东恒诚检测科技有限公司 | 一种用环介导等温扩增方法检测弗尼斯弧菌的试剂盒 |
| CN108841979A (zh) * | 2018-07-27 | 2018-11-20 | 四川华汉三创生物科技有限公司 | 一种检测致病性弧菌的试剂盒 |
| CN110093428A (zh) * | 2019-01-30 | 2019-08-06 | 宁波大学 | 一种致病性弧菌的高通量定量检测试剂盒 |
-
2020
- 2020-05-11 CN CN202010392917.6A patent/CN111534620A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101633952A (zh) * | 2009-03-20 | 2010-01-27 | 邵碧英 | 水产品中5种致病性弧菌检测试剂盒及其检测方法 |
| CN102154469A (zh) * | 2011-01-14 | 2011-08-17 | 浙江大学 | 致病性弧菌通用检测法及所用的核酸等温扩增检测试剂盒 |
| JP2013085503A (ja) * | 2011-10-17 | 2013-05-13 | Osaka Prefecture Univ | 腸炎ビブリオの検出方法 |
| CN103409512A (zh) * | 2013-07-10 | 2013-11-27 | 渤海大学 | 一种检测水产品中副溶血弧菌的试剂盒及方法 |
| CN104450945A (zh) * | 2014-12-30 | 2015-03-25 | 山东恒诚检测科技有限公司 | 一种用环介导等温扩增方法检测弗尼斯弧菌的试剂盒 |
| CN108841979A (zh) * | 2018-07-27 | 2018-11-20 | 四川华汉三创生物科技有限公司 | 一种检测致病性弧菌的试剂盒 |
| CN110093428A (zh) * | 2019-01-30 | 2019-08-06 | 宁波大学 | 一种致病性弧菌的高通量定量检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 涂志刚: "哈维氏弧菌RT-LAMP检测方法建立与应用", 《中国水产科学》 * |
| 黄梦诗，等: "海水中副溶血弧菌的可视化LAMP快速检测方法", 《中国渔业质量与标准》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tang et al. | An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods | |
| CN110195121B (zh) | 一种检测耐甲氧西林金葡菌的cpa引物及试剂盒和检测方法 | |
| US20200165664A1 (en) | Primer composition for analyzing intestinal flora and application thereof | |
| CN102367475A (zh) | 不同血清型霍乱弧菌的m-PCR检测试剂盒及检测方法 | |
| JP2003199572A (ja) | サルモネラ属菌検出のためのプライマーおよびそれを用いた検出法 | |
| CN105986044B (zh) | 禽流感病毒核酸通用快速检测方法 | |
| CN110564879A (zh) | 一种快速检测霍乱弧菌的试剂盒 | |
| CN106801103B (zh) | 一种无乳链球菌的检测引物组、检测试剂盒和多重pcr检测方法 | |
| CN111440887A (zh) | 变形假单胞菌TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN111534620A (zh) | 一种通用致病性弧菌试剂盒及其快速检测方法 | |
| CN109355404B (zh) | 基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的引物、试剂盒及检测方法 | |
| CN116219064A (zh) | 一种隐球菌的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒 | |
| CN110938704A (zh) | 液态奶中金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的lamp同步检测方法及试剂盒 | |
| CN110863061A (zh) | 检测金黄色葡萄球菌的特异性lamp引物、试剂盒及方法 | |
| CN113549626B (zh) | 与腐霉利特异性结合的核酸适配体Pr-A08及其应用 | |
| CN113234862B (zh) | 非洲猪瘟病毒lamp检测引物组及试剂盒 | |
| CN107022601B (zh) | 用于检测具有国家限量标准的5种食品致病菌的引物组合及其应用 | |
| CN116064838A (zh) | 检测食品中牡蛎成分的引物组、试剂盒和方法 | |
| CN110819734B (zh) | 苹果树腐烂菌lamp扩增引物及苹果树腐烂病检测试剂盒 | |
| CN114085917A (zh) | 基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速可视化检测福氏志贺氏菌的方法和试剂盒 | |
| CN110129460B (zh) | 超级细菌两种耐药基因的双重qPCR试剂盒及检测方法 | |
| CN110093429B (zh) | 一种腹泻性致病菌的高通量定量检测试剂盒 | |
| CN111996268A (zh) | 溶藻弧菌双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN107254527B (zh) | 一种罗氏沼虾螺原体可视化快速检测试剂盒及方法 | |
| CN102220424A (zh) | 肠球菌的快速检测方法及检测引物组和检测试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200814 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |