JP2003199572A - サルモネラ属菌検出のためのプライマーおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
サルモネラ属菌検出のためのプライマーおよびそれを用いた検出法Info
- Publication number
- JP2003199572A JP2003199572A JP2001401056A JP2001401056A JP2003199572A JP 2003199572 A JP2003199572 A JP 2003199572A JP 2001401056 A JP2001401056 A JP 2001401056A JP 2001401056 A JP2001401056 A JP 2001401056A JP 2003199572 A JP2003199572 A JP 2003199572A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- salmonella
- primer
- oligonucleotide
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】食中毒原因菌検査、食品の細菌汚染検査あるい
は臨床検査において、サルモネラ属菌を迅速かつ正確に
検出する。 【解決手段】ほとんど全てのサルモネラ属菌が保持して
いる遺伝子のひとつである侵入性因子関連遺伝子invAと
特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドよりな
るプライマー、該プライマーを用いた増幅法、サルモネ
ラ属菌invA遺伝子の増幅を検出する事によるサルモネラ
属菌の同定方法およびサルモネラ属菌を同定するキット
を提供する。
は臨床検査において、サルモネラ属菌を迅速かつ正確に
検出する。 【解決手段】ほとんど全てのサルモネラ属菌が保持して
いる遺伝子のひとつである侵入性因子関連遺伝子invAと
特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドよりな
るプライマー、該プライマーを用いた増幅法、サルモネ
ラ属菌invA遺伝子の増幅を検出する事によるサルモネラ
属菌の同定方法およびサルモネラ属菌を同定するキット
を提供する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、食中毒原因菌検査、食
品の細菌汚染検査あるいは臨床検査において、サルモネ
ラ属菌を迅速かつ正確に検出する。
品の細菌汚染検査あるいは臨床検査において、サルモネ
ラ属菌を迅速かつ正確に検出する。
【０００２】サルモネラ属菌は大腸菌と同じ腸内細菌科
に属し、グラム陰性、通性嫌気性の無芽胞桿菌で、血清
型により2菌種6亜種に分類される。サルモネラ属菌には
重篤な全身感染症を引き起こすチフス菌、パラチフス菌
など感染症予防法の2類感染症の原因菌も含まれるが、
胃腸ビブリオ、ブドウ球菌、O157に代表される病原性大
腸菌などとともに、細菌性食中毒の主要原因菌のひとつ
でもある。実際の検出数は汚染された食肉、牛乳、卵及
びこれらの加工食品を摂取し、腸管内で増殖することに
よって起こる感染型食中毒の原因菌としての方がはるか
に多い。したがってサルモネラ属菌の検出は、患者の便
や吐瀉物検体を用いた細菌性食中毒の原因菌同定、食品
検体や拭き取り検体を用いた食中毒の原因食品や感染ル
ートの究明、さらには重症感染症の原因菌同定の分野で
用いられる。
に属し、グラム陰性、通性嫌気性の無芽胞桿菌で、血清
型により2菌種6亜種に分類される。サルモネラ属菌には
重篤な全身感染症を引き起こすチフス菌、パラチフス菌
など感染症予防法の2類感染症の原因菌も含まれるが、
胃腸ビブリオ、ブドウ球菌、O157に代表される病原性大
腸菌などとともに、細菌性食中毒の主要原因菌のひとつ
でもある。実際の検出数は汚染された食肉、牛乳、卵及
びこれらの加工食品を摂取し、腸管内で増殖することに
よって起こる感染型食中毒の原因菌としての方がはるか
に多い。したがってサルモネラ属菌の検出は、患者の便
や吐瀉物検体を用いた細菌性食中毒の原因菌同定、食品
検体や拭き取り検体を用いた食中毒の原因食品や感染ル
ートの究明、さらには重症感染症の原因菌同定の分野で
用いられる。
【０００３】日常検査における糞便からのサルモネラ属
菌の同定検査は、増菌培地を含めた選択培地や生化学性
状試験用同定キットなど、検査手順、方法がほぼ確立さ
れている。しかし、分離培地上のコロニーをいかに的確
に選択し、その後の検査を行うかがサルモネラ属菌の検
出精度に大きく影響するため、類似したコロニーとの鑑
別が重要である。特にCitorobactor freundiiはサルモ
ネラ属菌と同様に硫化水素産生能を有し、一般的な培養
による同定法ではコロニーの外観が酷似しているために
サルモネラ属菌との判別が困難である。また、食中毒の
原因食品究明のために食品中のサルモネラ菌の検出が行
われるが、食品中のサルモネラ菌は一般的に菌濃度が低
く、直接分離培養で検出することは困難であり、前増菌
培養、選択増菌培養などを行なわなければならず判定ま
でに長時間を要する。具体的には、検査材料が患者の嘔
吐物、糞便、食品または拭き取り材料の場合、サルモネ
ラ属菌と同定するまでには、増菌培養、確認培養に至る
操作を行わなければならず、各培養段階に要する時間
は、18〜24時間であり、総所要時間は約2日間となる。
確認培養では、TSI寒天、SIM培地、VP-MR培地およびリ
シン脱炭酸テスト用培地に接種し、37℃で一晩培養す
る。またO抗原、H抗原の血清型の決定など抗血清による
免疫学的試験を行なう場合もある。（防菌防黴 Vol.2
9, No.9, pp587〜594, 2001）したがって、時間ならび
に費用がかかり、操作的にも煩雑である。
菌の同定検査は、増菌培地を含めた選択培地や生化学性
状試験用同定キットなど、検査手順、方法がほぼ確立さ
れている。しかし、分離培地上のコロニーをいかに的確
に選択し、その後の検査を行うかがサルモネラ属菌の検
出精度に大きく影響するため、類似したコロニーとの鑑
別が重要である。特にCitorobactor freundiiはサルモ
ネラ属菌と同様に硫化水素産生能を有し、一般的な培養
による同定法ではコロニーの外観が酷似しているために
サルモネラ属菌との判別が困難である。また、食中毒の
原因食品究明のために食品中のサルモネラ菌の検出が行
われるが、食品中のサルモネラ菌は一般的に菌濃度が低
く、直接分離培養で検出することは困難であり、前増菌
培養、選択増菌培養などを行なわなければならず判定ま
でに長時間を要する。具体的には、検査材料が患者の嘔
吐物、糞便、食品または拭き取り材料の場合、サルモネ
ラ属菌と同定するまでには、増菌培養、確認培養に至る
操作を行わなければならず、各培養段階に要する時間
は、18〜24時間であり、総所要時間は約2日間となる。
確認培養では、TSI寒天、SIM培地、VP-MR培地およびリ
シン脱炭酸テスト用培地に接種し、37℃で一晩培養す
る。またO抗原、H抗原の血清型の決定など抗血清による
免疫学的試験を行なう場合もある。（防菌防黴 Vol.2
9, No.9, pp587〜594, 2001）したがって、時間ならび
に費用がかかり、操作的にも煩雑である。
【０００４】一方、遺伝子検査法の発達でサルモネラ属
菌に良く保存されている遺伝子配列を特異的に認識する
オリゴヌクレオチドを用いたDNAプローブ法、あるいは
ハイブリダイゼーション法が試みられるようになってき
た。（特許第2795503、特開平06-090797、特公平06-038
759、特許第2780773、特開2001-245677）しかしこの方
法では、十分な検出感度と選択性を得るのが難しい。
菌に良く保存されている遺伝子配列を特異的に認識する
オリゴヌクレオチドを用いたDNAプローブ法、あるいは
ハイブリダイゼーション法が試みられるようになってき
た。（特許第2795503、特開平06-090797、特公平06-038
759、特許第2780773、特開2001-245677）しかしこの方
法では、十分な検出感度と選択性を得るのが難しい。
【０００５】またサルモネラ属菌に特異的な遺伝子領域
を認識し、結合する２種類のプライマーに挟まれる塩基
配列を増幅し、増幅産物をアガロース電気泳動で確認す
るPCR法（Polymerase Chain Reaction ; Science 230,
1350 (1985), Saiki et.al）法も行われている。（特許
第2792462、特開平2000-93181、特開2001-245677）PCR
法は確定培養法およびハイブリダイゼーション法と比較
して、高い感度と簡便な操作性を実現しているが、増幅
反応やアガロース電気泳動に長時間を要し、検体数が多
くなると煩雑なゲル電気泳動を行うため多大な労力と時
間の浪費を伴い、効率良い検出操作を行う上での障害と
なっている。また、複雑な温度制御が不可欠であり、専
用の反応装置を使用しなければならなず、したがって設
備の整った実験室でなければ実施できない。
を認識し、結合する２種類のプライマーに挟まれる塩基
配列を増幅し、増幅産物をアガロース電気泳動で確認す
るPCR法（Polymerase Chain Reaction ; Science 230,
1350 (1985), Saiki et.al）法も行われている。（特許
第2792462、特開平2000-93181、特開2001-245677）PCR
法は確定培養法およびハイブリダイゼーション法と比較
して、高い感度と簡便な操作性を実現しているが、増幅
反応やアガロース電気泳動に長時間を要し、検体数が多
くなると煩雑なゲル電気泳動を行うため多大な労力と時
間の浪費を伴い、効率良い検出操作を行う上での障害と
なっている。また、複雑な温度制御が不可欠であり、専
用の反応装置を使用しなければならなず、したがって設
備の整った実験室でなければ実施できない。
【０００６】これらの課題を解決するための一つの方法
として、本発明者らはループ媒介増幅法（Loop mediate
d Amplification：LAMP法）を完成している（Nucleic A
cidRes., 2000, Vol.28, No.12, e63、WO 00/28082）。
LAMP法は鋳型となるヌクレオチドに自身の3'末端をアニ
ールさせて相補鎖合成の起点とするとともに、このとき
形成されるループにアニールするプライマーを組み合わ
せることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とし
た。またLAMP法では、プライマーの3'末端が常に試料に
由来する領域に対してアニールするために、塩基配列の
相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能する。そ
の結果、特異性の高い遺伝子増幅反応が可能となった。
として、本発明者らはループ媒介増幅法（Loop mediate
d Amplification：LAMP法）を完成している（Nucleic A
cidRes., 2000, Vol.28, No.12, e63、WO 00/28082）。
LAMP法は鋳型となるヌクレオチドに自身の3'末端をアニ
ールさせて相補鎖合成の起点とするとともに、このとき
形成されるループにアニールするプライマーを組み合わ
せることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とし
た。またLAMP法では、プライマーの3'末端が常に試料に
由来する領域に対してアニールするために、塩基配列の
相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能する。そ
の結果、特異性の高い遺伝子増幅反応が可能となった。
【０００７】本発明はサルモネラ属菌のinvA遺伝子を増
幅する事によるサルモネラ属菌の検出に関する。
幅する事によるサルモネラ属菌の検出に関する。
【０００８】
【問題を解決するための手段】本発明者は、上記問題を
解決するため鋭意研究を行なった結果、ほとんど全ての
サルモネラ属菌が保持している遺伝子のひとつである侵
入性因子関連遺伝子invAの存在を、選択的にハイブリダ
イズするオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌク
レオチドをプライマーとしてLAMP法により増幅する事に
より、サルモネラ属菌を検体中から特異的に検出する事
を見出し本発明を完成した。
解決するため鋭意研究を行なった結果、ほとんど全ての
サルモネラ属菌が保持している遺伝子のひとつである侵
入性因子関連遺伝子invAの存在を、選択的にハイブリダ
イズするオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌク
レオチドをプライマーとしてLAMP法により増幅する事に
より、サルモネラ属菌を検体中から特異的に検出する事
を見出し本発明を完成した。
【０００９】すなわち本発明は、（１）、Salmonella t
yphimurium invA遺伝子配列の１９１番から６８７番の
塩基配列またはその相補鎖から選ばれた、標的領域の核
酸配列を増幅するための (a) 第１のセグメントとして、サルモネラ属菌のinvA遺
伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列 (b)第２のセグメントとして、第１のセグメントの3’側
の塩基配列の相補鎖よりなり、第１のセグメントの5’
側に位置する塩基配列 のセグメントを含むプライマーを提供する。
yphimurium invA遺伝子配列の１９１番から６８７番の
塩基配列またはその相補鎖から選ばれた、標的領域の核
酸配列を増幅するための (a) 第１のセグメントとして、サルモネラ属菌のinvA遺
伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列 (b)第２のセグメントとして、第１のセグメントの3’側
の塩基配列の相補鎖よりなり、第１のセグメントの5’
側に位置する塩基配列 のセグメントを含むプライマーを提供する。
【００１０】また本発明は（２）、Salmonella typhimu
rium invA遺伝子より選ばれた塩基配列 TGGCATTATCGATCAGTACCAG 配列番号２ AGTTTTTCAACGTTTCCTGCGG 配列番号３ GGCGATATTGGTGTTTATGGGG 配列番号４ GATGCCGGTGAAATTATCGC 配列番号５ CCTGGCGGTGGGTTTTGT 配列番号６ CAGTTTATCGTTATTACCAAAGGTTCA 配列番号７ ACAGATGAGTATTGATGCCGAT 配列番号８ AGGTTCAGAACGTGTCGCG 配列番号９ ATTGGCGATAGCCTGGCG 配列番号１０ GGCCGGTATTATTGATGCG 配列番号１１ AAGCCAGCTTTACGGTTCCTT 配列番号１２ GACGCTATTGCCGGCATC 配列番号１３ TGGTTGATTTCCTGATCGCA 配列番号１４ GAAGGCCGGTATTATTGATGCG 配列番号１５ AGCGTACTGGAAAGGGAAAGC 配列番号１６ あるいはそれと相補的な塩基配列より選ばれた、少なく
とも連続する１５塩基配列を有する（１）のプライマー
を提供する。
rium invA遺伝子より選ばれた塩基配列 TGGCATTATCGATCAGTACCAG 配列番号２ AGTTTTTCAACGTTTCCTGCGG 配列番号３ GGCGATATTGGTGTTTATGGGG 配列番号４ GATGCCGGTGAAATTATCGC 配列番号５ CCTGGCGGTGGGTTTTGT 配列番号６ CAGTTTATCGTTATTACCAAAGGTTCA 配列番号７ ACAGATGAGTATTGATGCCGAT 配列番号８ AGGTTCAGAACGTGTCGCG 配列番号９ ATTGGCGATAGCCTGGCG 配列番号１０ GGCCGGTATTATTGATGCG 配列番号１１ AAGCCAGCTTTACGGTTCCTT 配列番号１２ GACGCTATTGCCGGCATC 配列番号１３ TGGTTGATTTCCTGATCGCA 配列番号１４ GAAGGCCGGTATTATTGATGCG 配列番号１５ AGCGTACTGGAAAGGGAAAGC 配列番号１６ あるいはそれと相補的な塩基配列より選ばれた、少なく
とも連続する１５塩基配列を有する（１）のプライマー
を提供する。
【００１１】さらに、（３）、サルモネラ属菌invA遺伝
子を増幅できる、配列番号２より選ばれる塩基配列と相
補的なオリゴヌクレオチド−塩基数０から５０の任意の
塩基配列よりなるオリゴヌクレオチド−配列番号３より
選ばれる塩基配列よりなるオリゴヌクレオチド、配列番
号８より選ばれる塩基配列と相補的なオリゴヌクレオチ
ド−塩基数０から５０の任意の塩基配列よりなるオリゴ
ヌクレオチド−配列番号９より選ばれる塩基配列よりな
るオリゴヌクレオチド、配列番号４より選ばれるオリゴ
ヌクレオチド−塩基数０から５０の任意の塩基配列より
なるオリゴヌクレオチド−配列番号５より選ばれる塩基
配列と相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号８より選
ばれるオリゴヌクレオチド−塩基数０から５０の任意の
塩基配列よりなるオリゴヌクレオチド−配列番号９より
選ばれる塩基配列と相補的なオリゴヌクレオチド、配列
番号１４より選ばれるオリゴヌクレオチド−塩基数０か
ら５０の任意の塩基配列よりなるオリゴヌクレオチド−
配列番号１５より選ばれる塩基配列と相補的なオリゴヌ
クレオチド、よりなる（２）のプライマーを提供する。
子を増幅できる、配列番号２より選ばれる塩基配列と相
補的なオリゴヌクレオチド−塩基数０から５０の任意の
塩基配列よりなるオリゴヌクレオチド−配列番号３より
選ばれる塩基配列よりなるオリゴヌクレオチド、配列番
号８より選ばれる塩基配列と相補的なオリゴヌクレオチ
ド−塩基数０から５０の任意の塩基配列よりなるオリゴ
ヌクレオチド−配列番号９より選ばれる塩基配列よりな
るオリゴヌクレオチド、配列番号４より選ばれるオリゴ
ヌクレオチド−塩基数０から５０の任意の塩基配列より
なるオリゴヌクレオチド−配列番号５より選ばれる塩基
配列と相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号８より選
ばれるオリゴヌクレオチド−塩基数０から５０の任意の
塩基配列よりなるオリゴヌクレオチド−配列番号９より
選ばれる塩基配列と相補的なオリゴヌクレオチド、配列
番号１４より選ばれるオリゴヌクレオチド−塩基数０か
ら５０の任意の塩基配列よりなるオリゴヌクレオチド−
配列番号１５より選ばれる塩基配列と相補的なオリゴヌ
クレオチド、よりなる（２）のプライマーを提供する。
【００１２】さらに、（４）、核酸の増幅法がLAMP法で
ある（１）から（３）のプライマーを提供し（５）、
（１）から（３）のプライマーを用いるLAMP法によるサ
ルモネラ属菌のinvA遺伝子の増幅法を提供し、（６）、
（５）のサルモネラ属菌のinvA遺伝子の増幅を検出する
事によるサルモネラ属菌の同定方法を提供し（７）、
（１）から（３）のプライマー、鎖置換型核酸合成酵素
および、基質を含むサルモネラ属菌を同定するキットを
提供する。以下、本発明を詳細に説明する。
ある（１）から（３）のプライマーを提供し（５）、
（１）から（３）のプライマーを用いるLAMP法によるサ
ルモネラ属菌のinvA遺伝子の増幅法を提供し、（６）、
（５）のサルモネラ属菌のinvA遺伝子の増幅を検出する
事によるサルモネラ属菌の同定方法を提供し（７）、
（１）から（３）のプライマー、鎖置換型核酸合成酵素
および、基質を含むサルモネラ属菌を同定するキットを
提供する。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
【発明の実施の形態】核酸増幅によるサルモネラ属菌の
同定の検体としては、臨床検査材料、たとえば培養した
菌体、糞便、吐瀉物、尿、血液、組織など、また食品材
料や拭き取り検体でも良い。これら被検体をLAMP法の試
料に用いるには、検体中に存在する菌の濃縮、分離や、
菌体から核酸を遊離や濃縮などの操作を前処理として行
なうこともできる。その方法としては酵素、界面活性
剤、アルカリ、熱による処理などが知られていて、その
中から適宜選択できる。
同定の検体としては、臨床検査材料、たとえば培養した
菌体、糞便、吐瀉物、尿、血液、組織など、また食品材
料や拭き取り検体でも良い。これら被検体をLAMP法の試
料に用いるには、検体中に存在する菌の濃縮、分離や、
菌体から核酸を遊離や濃縮などの操作を前処理として行
なうこともできる。その方法としては酵素、界面活性
剤、アルカリ、熱による処理などが知られていて、その
中から適宜選択できる。
【００１４】本発明において標的配列とは、増幅すべき
ポリヌクレオチドの塩基配列を意味する。一般にポリヌ
クレオチドの塩基配列は、5'側から3'側に向けてセンス
鎖の塩基配列を記載する。本発明において、連続的に新
たな標的塩基配列が合成される事を増幅と呼ぶ。更に本
発明において、相補鎖合成の起点を与えることとは、鋳
型となるポリヌクレオチドに対して、相補鎖合成に必要
なプライマーとして機能するポリヌクレオチドの3'末端
をハイブリダイズさせることを言う。また本発明におい
て、3'末端、あるいは5'末端とは、単にいずれかの末端
の１塩基のみならず、末端の１塩基を含み、かつ末端に
位置する領域を意味する。本発明において、プライマー
セットとは同時に用いられるプライマーの組み合わせを
言う。
ポリヌクレオチドの塩基配列を意味する。一般にポリヌ
クレオチドの塩基配列は、5'側から3'側に向けてセンス
鎖の塩基配列を記載する。本発明において、連続的に新
たな標的塩基配列が合成される事を増幅と呼ぶ。更に本
発明において、相補鎖合成の起点を与えることとは、鋳
型となるポリヌクレオチドに対して、相補鎖合成に必要
なプライマーとして機能するポリヌクレオチドの3'末端
をハイブリダイズさせることを言う。また本発明におい
て、3'末端、あるいは5'末端とは、単にいずれかの末端
の１塩基のみならず、末端の１塩基を含み、かつ末端に
位置する領域を意味する。本発明において、プライマー
セットとは同時に用いられるプライマーの組み合わせを
言う。
【００１５】PCR法は、標的配列の両端の一方のセンス
鎖を認識するオリゴヌクレオチドと、両端の他方のアン
チセンス鎖を認識するオリゴヌクレオチドよりなる２種
類のプライマーを用いた核酸増幅法である。まず熱変性
により一本鎖状態になった試料核酸に対し、プライマー
が相補的に結合し、鋳型依存性核酸合成酵素により核酸
合成反応を行ない、これにより二本鎖核酸を生成するま
での工程を１サイクルとし、このサイクルを繰り返し行
なう事により標的配列を増幅する方法であり、反応温度
は反応の段階に応じて変更しなくてはならない。
鎖を認識するオリゴヌクレオチドと、両端の他方のアン
チセンス鎖を認識するオリゴヌクレオチドよりなる２種
類のプライマーを用いた核酸増幅法である。まず熱変性
により一本鎖状態になった試料核酸に対し、プライマー
が相補的に結合し、鋳型依存性核酸合成酵素により核酸
合成反応を行ない、これにより二本鎖核酸を生成するま
での工程を１サイクルとし、このサイクルを繰り返し行
なう事により標的配列を増幅する方法であり、反応温度
は反応の段階に応じて変更しなくてはならない。
【００１６】これに対してLAMP法は、プライマーとして
少なくとも４種類のオリゴヌクレオチドを用いる核酸増
幅法で、２種類はインナープライマー（Inner Prime
r）、残りの２種類はアウタープライマー（Outer Prime
r）と呼ぶ。LAMP法はこれらのプライマーと、鎖置換合
成活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素と基質を用い
て、熱変性を必要とせず終始等温で速やかに特異性の高
い遺伝子増幅反応が進行することを特徴とする。
少なくとも４種類のオリゴヌクレオチドを用いる核酸増
幅法で、２種類はインナープライマー（Inner Prime
r）、残りの２種類はアウタープライマー（Outer Prime
r）と呼ぶ。LAMP法はこれらのプライマーと、鎖置換合
成活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素と基質を用い
て、熱変性を必要とせず終始等温で速やかに特異性の高
い遺伝子増幅反応が進行することを特徴とする。
【００１７】標的塩基配列の3'末端から当該ポリヌクレ
オチド鎖の3'末端方向に向かって順に第1の任意配列F1
c、第2の任意配列F2c、第3の任意配列F3cをそれぞれ選
択し、標的領域の5'末端から当該ヌクレオチド鎖の5'末
端方向に向かって順に第4の任意配列R1、第5の任意配列
R2、第6の任意配列R3それぞれ選択する。F1c、F2c、F3c
の相補配列をそれぞれF1、F2、F3またR1、R2、R3の相補
鎖をR1c、R2c、R3cと呼ぶ。
オチド鎖の3'末端方向に向かって順に第1の任意配列F1
c、第2の任意配列F2c、第3の任意配列F3cをそれぞれ選
択し、標的領域の5'末端から当該ヌクレオチド鎖の5'末
端方向に向かって順に第4の任意配列R1、第5の任意配列
R2、第6の任意配列R3それぞれ選択する。F1c、F2c、F3c
の相補配列をそれぞれF1、F2、F3またR1、R2、R3の相補
鎖をR1c、R2c、R3cと呼ぶ。
【００１８】インナープライマー（Inner Primer）は、
標的遺伝子上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」を
認識しかつ合成起点を与える塩基配列を3'末端に有し、
同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物
の任意の領域に対して相補的な塩基配列を5'末端に有す
ることを特徴としたオリゴヌクレオチドである。Fとは
標的遺伝子のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提
供するプライマーの表示であり、Rとは標的遺伝子のア
ンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプ
ライマーの表示である。F2より選ばれた塩基配列およ
び、F1より選ばれた塩基配列と相補的な塩基配列を含む
プライマーをインナープライマーF、R2より選ばれた塩
基配列およびR1より選ばれた塩基配列と相補的な塩基配
列を含むからなるプライマーをインナープライマーＲと
呼ぶ。
標的遺伝子上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」を
認識しかつ合成起点を与える塩基配列を3'末端に有し、
同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物
の任意の領域に対して相補的な塩基配列を5'末端に有す
ることを特徴としたオリゴヌクレオチドである。Fとは
標的遺伝子のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提
供するプライマーの表示であり、Rとは標的遺伝子のア
ンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプ
ライマーの表示である。F2より選ばれた塩基配列およ
び、F1より選ばれた塩基配列と相補的な塩基配列を含む
プライマーをインナープライマーF、R2より選ばれた塩
基配列およびR1より選ばれた塩基配列と相補的な塩基配
列を含むからなるプライマーをインナープライマーＲと
呼ぶ。
【００１９】アウタープライマー（Outer Primer）は、
標的塩基配列上の『「ある特定のヌクレオチド配列領
域」の下流に存在するある特定のヌクレオチド配列領
域』を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有すること
を特徴としたオリゴヌクレオチドである。F3より選ばれ
た塩基配列を含むプライマーをアウタープライマーF、R
3より選ばれた塩基配列を含むプライマーをアウタープ
ライマーRと呼ぶ。
標的塩基配列上の『「ある特定のヌクレオチド配列領
域」の下流に存在するある特定のヌクレオチド配列領
域』を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有すること
を特徴としたオリゴヌクレオチドである。F3より選ばれ
た塩基配列を含むプライマーをアウタープライマーF、R
3より選ばれた塩基配列を含むプライマーをアウタープ
ライマーRと呼ぶ。
【００２０】標的遺伝子に選択的にアニールしたインナ
ープライマーからの核酸合成反応が進行すると同時に、
アウタープライマーを起点とするその下流からの核酸合
成反応によって鎖置換反応が起こる。そのためにインナ
ープライマーを起点とする伸長鎖が鋳型である標的遺伝
子から分離し、自身の5'末端でループ構造を形成する。
インナープライマーの3'末端を起点とした伸長鎖に、も
うひとつのインナープライマーが選択的にアニールし、
合成起点となり核酸合成が進行する。同時にもうひとつ
のアウタープライマーを起点とする核酸合成反応によっ
て鎖置換反応が起こる。その結果、自己を鋳型としなが
ら合成起点となる3'末端を有し、両端にそれぞれループ
構造を有することを特徴とする「ダンベル型」ヌクレオ
チドが形成される。
ープライマーからの核酸合成反応が進行すると同時に、
アウタープライマーを起点とするその下流からの核酸合
成反応によって鎖置換反応が起こる。そのためにインナ
ープライマーを起点とする伸長鎖が鋳型である標的遺伝
子から分離し、自身の5'末端でループ構造を形成する。
インナープライマーの3'末端を起点とした伸長鎖に、も
うひとつのインナープライマーが選択的にアニールし、
合成起点となり核酸合成が進行する。同時にもうひとつ
のアウタープライマーを起点とする核酸合成反応によっ
て鎖置換反応が起こる。その結果、自己を鋳型としなが
ら合成起点となる3'末端を有し、両端にそれぞれループ
構造を有することを特徴とする「ダンベル型」ヌクレオ
チドが形成される。
【００２１】上述の「ダンベル型」ヌクレオチドのルー
プの塩基配列は、3'末端側のループの一本鎖部分にイン
ナープライマーが相補的にアニールし合成起点を与える
ので、ループ構造を有する中間産物は連続的にインナー
プライマーの鋳型として機能し、核酸合成が進行する。
特に、ループ構造を複数有する中間産物は、複数の核酸
合成反応が同時多発的に進行する鋳型となりながら、鎖
置換反応によってまた新たなループ構造を有する中間産
物を生成させる。このように等温条件下で連続的かつ大
量に標的遺伝子の特定のヌクレオチド配列を増幅するこ
とを可能にしたのがLAMP法である。
プの塩基配列は、3'末端側のループの一本鎖部分にイン
ナープライマーが相補的にアニールし合成起点を与える
ので、ループ構造を有する中間産物は連続的にインナー
プライマーの鋳型として機能し、核酸合成が進行する。
特に、ループ構造を複数有する中間産物は、複数の核酸
合成反応が同時多発的に進行する鋳型となりながら、鎖
置換反応によってまた新たなループ構造を有する中間産
物を生成させる。このように等温条件下で連続的かつ大
量に標的遺伝子の特定のヌクレオチド配列を増幅するこ
とを可能にしたのがLAMP法である。
【００２２】LAMP法においては、インナープライマーと
アウタープライマーに加え、他のプライマーを用いる事
ができる。ダンベル構造の5'末端側のループの一本鎖部
分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマーをル
ーププライマー(Loop Primer)と言う。これを用いると
核酸合成の起点を増やす事により、反応時間の短縮と検
出感度の上昇ができる。（特願2000-283862）ループプ
ライマーの塩基配列は上述のダンベル構造の5'末端側の
ループの1本鎖部分の塩基配列に相補的であれば、標的
遺伝子の塩基配列あるいはその相補鎖から選ばれても良
く、他の塩基配列でも良い。またループプライマーは１
種類でも２種類でも良い。
アウタープライマーに加え、他のプライマーを用いる事
ができる。ダンベル構造の5'末端側のループの一本鎖部
分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマーをル
ーププライマー(Loop Primer)と言う。これを用いると
核酸合成の起点を増やす事により、反応時間の短縮と検
出感度の上昇ができる。（特願2000-283862）ループプ
ライマーの塩基配列は上述のダンベル構造の5'末端側の
ループの1本鎖部分の塩基配列に相補的であれば、標的
遺伝子の塩基配列あるいはその相補鎖から選ばれても良
く、他の塩基配列でも良い。またループプライマーは１
種類でも２種類でも良い。
【００２３】本発明でインナープライマーとして用いら
れるオリゴヌクレオチドは、30塩基以上、望ましくは35
塩基以上の長さを持ち、化学合成あるいは天然のどちら
でも良い。Ｆ側のインナープライマーはその塩基配列と
して、標的遺伝子配列のある配列よりなるオリゴヌクレ
オチドを3'側に持ち、それより下流の別の塩基配列の相
補鎖よりなるオリゴヌクレオチドを5'側に持ち、その間
には０から50塩基よりなる任意のオリゴヌクレオチドを
持っても良い。Ｒ側のインナープライマーの塩基配列
は、Ｆ側のインナープライマーより下流の、標的遺伝子
配列のある配列の相補鎖よりなるオリゴヌクレオチドを
3'側に持ち、それより上流の別の塩基配列を5'側に持
ち、その間には０から50塩基よりなる任意の塩基配列を
持っても良い。また、プライマーは特に検出用として標
識されていても良い。
れるオリゴヌクレオチドは、30塩基以上、望ましくは35
塩基以上の長さを持ち、化学合成あるいは天然のどちら
でも良い。Ｆ側のインナープライマーはその塩基配列と
して、標的遺伝子配列のある配列よりなるオリゴヌクレ
オチドを3'側に持ち、それより下流の別の塩基配列の相
補鎖よりなるオリゴヌクレオチドを5'側に持ち、その間
には０から50塩基よりなる任意のオリゴヌクレオチドを
持っても良い。Ｒ側のインナープライマーの塩基配列
は、Ｆ側のインナープライマーより下流の、標的遺伝子
配列のある配列の相補鎖よりなるオリゴヌクレオチドを
3'側に持ち、それより上流の別の塩基配列を5'側に持
ち、その間には０から50塩基よりなる任意の塩基配列を
持っても良い。また、プライマーは特に検出用として標
識されていても良い。
【００２４】またアウタープライマーとして用いられる
オリゴヌクレオチドは、同様な理由から10塩基以上、望
ましくは15塩基以上の長さを持ったヌクレオチドで、化
学合成あるいは天然のどちらでも良い。またループプラ
イマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、同様な
理由から10塩基以上、望ましくは15塩基以上の長さを持
ったヌクレオチドで、化学合成あるいは天然のどちらで
も良い。
オリゴヌクレオチドは、同様な理由から10塩基以上、望
ましくは15塩基以上の長さを持ったヌクレオチドで、化
学合成あるいは天然のどちらでも良い。またループプラ
イマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、同様な
理由から10塩基以上、望ましくは15塩基以上の長さを持
ったヌクレオチドで、化学合成あるいは天然のどちらで
も良い。
【００２５】LAMP法で使用する各プライマーは単一のオ
リゴヌクレオチドであっても良く、複数のオリゴヌクレ
オチドの混合物であっても良い。
リゴヌクレオチドであっても良く、複数のオリゴヌクレ
オチドの混合物であっても良い。
【００２６】本発明者は、サルモネラ属菌invA遺伝子を
特異的にかつ迅速に増幅できるLAMP法のプライマーの塩
基配列とその組み合わせを鋭意研究した結果、プライマ
ーセットとして１から３の３組を選定した。プライマー
セット１とプライマーセット３のインナープライマー
Ｆ、プライマーセット２とプライマーセット３のアウタ
ープライマーＲはそれぞれ同一の塩基配列である。また
ループプライマーＦとループプライマーＲはプライマー
セット１と共に用いる事が出来るように選定したプライ
マーである。 プライマーセット１ インナープライマーＦ:CTGGTACTGATCGATAATGCCAAGTTTTT
CAACGTTTCCTGCGG 配列番号１７ インナープライマーＲ:GATGCCGGTGAAATTATCGCACAAAACCC
ACCGCCAGG 配列番号１８ アウタープライマーＦ:GGCGATATTGGTGTTTATGGGG 配列
番号４ アウタープライマーＲ:TGAACCTTTGGTAATAACGATAAACTG
配列番号７ プライマーセット２ インナープライマーＦ:ATCGGCATCAATACTCATCTGTAGGTTCA
GAACGTGTCGCG 配列番号１９ インナープライマーＲ:GGCCGGTATTATTGATGCGAAGGAACCGT
AAAGCTGGCTT 配列番号２０ アウタープライマーＲ:ATTGGCGATAGCCTGGCG 配列番号
１０ アウタープライマーＲ:GATGCCGGCAATAGCGTC 配列番号
１３ プライマーセット３ インナープライマーＦ:GACGACTGGTACTGATCGATAGTTTTTCA
ACGTTTCCTGCGG 配列番号１７ インナープライマーＲ:GAAGGCCGGTATTATTGATGCGGCTTTCC
CTTTCCAGTACGCT 配列番号２１ アウタープライマーＦ:TGGTTGATTTCCTGATCGCA 配列番
号１４ アウタープライマーＲ:GATGCCGGCAATAGCGTC 配列番号
１３ ループプライマー ループプライマーＦ :GACGAAAGAGCGTGGTAATTAAC 配列
番号２２ ループプライマーＲ :GGGCAATTCGTTATTGGCG 配列番号
２３
特異的にかつ迅速に増幅できるLAMP法のプライマーの塩
基配列とその組み合わせを鋭意研究した結果、プライマ
ーセットとして１から３の３組を選定した。プライマー
セット１とプライマーセット３のインナープライマー
Ｆ、プライマーセット２とプライマーセット３のアウタ
ープライマーＲはそれぞれ同一の塩基配列である。また
ループプライマーＦとループプライマーＲはプライマー
セット１と共に用いる事が出来るように選定したプライ
マーである。 プライマーセット１ インナープライマーＦ:CTGGTACTGATCGATAATGCCAAGTTTTT
CAACGTTTCCTGCGG 配列番号１７ インナープライマーＲ:GATGCCGGTGAAATTATCGCACAAAACCC
ACCGCCAGG 配列番号１８ アウタープライマーＦ:GGCGATATTGGTGTTTATGGGG 配列
番号４ アウタープライマーＲ:TGAACCTTTGGTAATAACGATAAACTG
配列番号７ プライマーセット２ インナープライマーＦ:ATCGGCATCAATACTCATCTGTAGGTTCA
GAACGTGTCGCG 配列番号１９ インナープライマーＲ:GGCCGGTATTATTGATGCGAAGGAACCGT
AAAGCTGGCTT 配列番号２０ アウタープライマーＲ:ATTGGCGATAGCCTGGCG 配列番号
１０ アウタープライマーＲ:GATGCCGGCAATAGCGTC 配列番号
１３ プライマーセット３ インナープライマーＦ:GACGACTGGTACTGATCGATAGTTTTTCA
ACGTTTCCTGCGG 配列番号１７ インナープライマーＲ:GAAGGCCGGTATTATTGATGCGGCTTTCC
CTTTCCAGTACGCT 配列番号２１ アウタープライマーＦ:TGGTTGATTTCCTGATCGCA 配列番
号１４ アウタープライマーＲ:GATGCCGGCAATAGCGTC 配列番号
１３ ループプライマー ループプライマーＦ :GACGAAAGAGCGTGGTAATTAAC 配列
番号２２ ループプライマーＲ :GGGCAATTCGTTATTGGCG 配列番号
２３
【００２７】鋳型依存性核酸合成反応を行なう酵素は、
鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば起
源については特に規定しない。このような酵素としてBs
t DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント)、Bca(exo-)D
NAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノウ
フラグメント、Vent(Exo-)DNAポリメラーゼ（Vent DNA
ポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたも
の）、DeepVent(Exo-)DNAポリメラーゼ（DeepVent DNA
ポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたも
の）、KOD DNAポリメラーゼなどが挙げられる。好まし
くはBst DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント)であ
り、当酵素を用いる場合、当酵素の反応至適温度である
65℃付近で反応を行うのが望ましい。
鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば起
源については特に規定しない。このような酵素としてBs
t DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント)、Bca(exo-)D
NAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノウ
フラグメント、Vent(Exo-)DNAポリメラーゼ（Vent DNA
ポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたも
の）、DeepVent(Exo-)DNAポリメラーゼ（DeepVent DNA
ポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたも
の）、KOD DNAポリメラーゼなどが挙げられる。好まし
くはBst DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント)であ
り、当酵素を用いる場合、当酵素の反応至適温度である
65℃付近で反応を行うのが望ましい。
【００２８】増幅産物の検出には公知の技術が適用でき
る。たとえば増幅された遺伝子配列を特異的に認識する
標識オリゴヌクレオチドを用いて検出ができる。あるい
は、反応終了後の反応液をそのままアガロース電気泳動
にかけることでも容易に検出できる。LAMP法では塩基長
の異なる多数のバンドがラダー（はしご）状となる。
る。たとえば増幅された遺伝子配列を特異的に認識する
標識オリゴヌクレオチドを用いて検出ができる。あるい
は、反応終了後の反応液をそのままアガロース電気泳動
にかけることでも容易に検出できる。LAMP法では塩基長
の異なる多数のバンドがラダー（はしご）状となる。
【００２９】さらに、LAMP法による遺伝子増幅は加速度
的かつ効率的に行なわれるので、反応液中にあらかじめ
二本鎖核酸の分子内に特異的に取り込まれるインターカ
レーターであるエチジウムブロマイドやSYBR Green（Mo
lecular Probes 社製）などを添加することにより増幅
を確認できる。（特開2001-242169）また、経時的に蛍
光強度を観察することができるABI Prism 7700（Applie
d Biosystems社製）などの連続蛍光光度計で、増幅の有
無の確認や速度論的解析をすることも可能である。
的かつ効率的に行なわれるので、反応液中にあらかじめ
二本鎖核酸の分子内に特異的に取り込まれるインターカ
レーターであるエチジウムブロマイドやSYBR Green（Mo
lecular Probes 社製）などを添加することにより増幅
を確認できる。（特開2001-242169）また、経時的に蛍
光強度を観察することができるABI Prism 7700（Applie
d Biosystems社製）などの連続蛍光光度計で、増幅の有
無の確認や速度論的解析をすることも可能である。
【００３０】そのほか、LAMP法では核酸の合成により基
質が大量に消費され、副生物であるピロリン酸がマグネ
シウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、肉眼
でも確認できるほど白濁する。この白濁を反応終了後の
観察、もしくは反応中の濁度の上昇を経時的に光学的に
観察できる測定機器、例えば400mmの吸光度の変化を通
常の分光光度計を用いて増幅の確認が可能である。（特
願2000-132667）
質が大量に消費され、副生物であるピロリン酸がマグネ
シウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、肉眼
でも確認できるほど白濁する。この白濁を反応終了後の
観察、もしくは反応中の濁度の上昇を経時的に光学的に
観察できる測定機器、例えば400mmの吸光度の変化を通
常の分光光度計を用いて増幅の確認が可能である。（特
願2000-132667）
【００３１】また、増幅された遺伝子配列を特異的に認
識する担体固相オリゴヌクレオチドによるハイブリダイ
ゼーションまたはそれを起点とした伸長反応により、増
幅の確認が可能である。（特願2001-161486）
識する担体固相オリゴヌクレオチドによるハイブリダイ
ゼーションまたはそれを起点とした伸長反応により、増
幅の確認が可能である。（特願2001-161486）
【００３２】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。 実施例１ プライマーの合成 以下の配列のオリゴヌクレオチドを、β-シアノエチル
フォスファアミダイト法により化学合成した。合成後の
精製は、C18逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラ
フィーで行った。 プライマーセット１ インナープライマーＦ:CTGGTACTGATCGATAATGCCAAGTTTTT
CAACGTTTCCTGCGG インナープライマーＲ:GATGCCGGTGAAATTATCGCACAAAACCC
ACCGCCAGG アウタープライマーＦ:GGCGATATTGGTGTTTATGGGG アウタープライマーＲ:TGAACCTTTGGTAATAACGATAAACTG プライマーセット２ インナープライマーＦ:ATCGGCATCAATACTCATCTGTAGGTTCA
GAACGTGTCGCG インナープライマーＲ:GGCCGGTATTATTGATGCGAAGGAACCGT
AAAGCTGGCTT アウタープライマーＦ:ATTGGCGATAGCCTGGCG アウタープライマーＲ:GATGCCGGCAATAGCGTC プライマーセット３ インナープライマーＦ:GACGACTGGTACTGATCGATAGTTTTTCA
ACGTTTCCTGCGG インナープライマーＲ:GAAGGCCGGTATTATTGATGCGGCTTTCC
CTTTCCAGTACGCT アウタープライマーＦ:TGGTTGATTTCCTGATCGCA アウタープライマーＲ:GATGCCGGCAATAGCGTC ループプライマー ループプライマーＦ:GACGAAAGAGCGTGGTAATTAAC ループプライマーＲ:GGGCAATTCGTTATTGGCG
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。 実施例１ プライマーの合成 以下の配列のオリゴヌクレオチドを、β-シアノエチル
フォスファアミダイト法により化学合成した。合成後の
精製は、C18逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラ
フィーで行った。 プライマーセット１ インナープライマーＦ:CTGGTACTGATCGATAATGCCAAGTTTTT
CAACGTTTCCTGCGG インナープライマーＲ:GATGCCGGTGAAATTATCGCACAAAACCC
ACCGCCAGG アウタープライマーＦ:GGCGATATTGGTGTTTATGGGG アウタープライマーＲ:TGAACCTTTGGTAATAACGATAAACTG プライマーセット２ インナープライマーＦ:ATCGGCATCAATACTCATCTGTAGGTTCA
GAACGTGTCGCG インナープライマーＲ:GGCCGGTATTATTGATGCGAAGGAACCGT
AAAGCTGGCTT アウタープライマーＦ:ATTGGCGATAGCCTGGCG アウタープライマーＲ:GATGCCGGCAATAGCGTC プライマーセット３ インナープライマーＦ:GACGACTGGTACTGATCGATAGTTTTTCA
ACGTTTCCTGCGG インナープライマーＲ:GAAGGCCGGTATTATTGATGCGGCTTTCC
CTTTCCAGTACGCT アウタープライマーＦ:TGGTTGATTTCCTGATCGCA アウタープライマーＲ:GATGCCGGCAATAGCGTC ループプライマー ループプライマーＦ:GACGAAAGAGCGTGGTAATTAAC ループプライマーＲ:GGGCAATTCGTTATTGGCG
【００３３】実施例２ LAMPプライマーセットの種類に
よる反応性の比較 １ 検体の調製 サルモネラ属菌のSalmonella typhimurium（菌株番号78
6）、S. enteritidis（菌株番号5197）、S. typhi（菌
株番号785）の３菌株、および非サルモネラ属菌のCitor
obactor freundii（菌株番号33）、Escherichia coli
（菌株番号4496）、Shigella dysenteriae（菌株番号48
4）の３菌株を用いた。これらの菌株をブレインハート
インフュージョン寒天培地に接種し、37℃恒温器中で培
養を行った。増殖した各菌体のコロニーを滅菌した綿棒
で採取後、生理食塩水中に懸濁し、620nmでの吸光度に
より、菌体濃度を測定した。それぞれ一定量の菌体量(2
x109 cell)から、DNeasy Tissue Kit（ QIAGEN社製）を
用い、キット能書記載の操作でDNA抽出を行った。抽出
したDNA濃度を260nmでの吸光度により濃度を測定し、す
べての菌種由来のDNAを50ng/ulにそれぞれ調製し、下記
の反応に供した。
よる反応性の比較 １ 検体の調製 サルモネラ属菌のSalmonella typhimurium（菌株番号78
6）、S. enteritidis（菌株番号5197）、S. typhi（菌
株番号785）の３菌株、および非サルモネラ属菌のCitor
obactor freundii（菌株番号33）、Escherichia coli
（菌株番号4496）、Shigella dysenteriae（菌株番号48
4）の３菌株を用いた。これらの菌株をブレインハート
インフュージョン寒天培地に接種し、37℃恒温器中で培
養を行った。増殖した各菌体のコロニーを滅菌した綿棒
で採取後、生理食塩水中に懸濁し、620nmでの吸光度に
より、菌体濃度を測定した。それぞれ一定量の菌体量(2
x109 cell)から、DNeasy Tissue Kit（ QIAGEN社製）を
用い、キット能書記載の操作でDNA抽出を行った。抽出
したDNA濃度を260nmでの吸光度により濃度を測定し、す
べての菌種由来のDNAを50ng/ulにそれぞれ調製し、下記
の反応に供した。
【００３４】２ LAMP各試薬濃度
３組のプライマーセットごとにLAMP反応を行なった。使
用した各試薬の内容は次の通りである。 10倍濃度反応用緩衝液：200mM Tris-HCl（pH 8.8）、10
0mM KCl、100mM (NH4)2SO4、20mM MgSO4、1% Triton X-
100 Betaine溶液：5M Betaine MgSO4溶液：100mM MgSO4 EtBr溶液：6.25ug/ml エチジウムブロマイド水溶液 基質溶液：dATP、dCTP、dGTP、dGTPを混合させたもの
で、各終濃度が10mM インナープライマーＦおよびＲ：各40pmol/ul水溶液 アウタープライマーＦおよびＲ：各10pmol/ul水溶液 DNAポリメラーゼ：Bst DNAポリメラーゼ（ラージフラグ
メント)（8unit/ul、NewEngland BioLab社製）
用した各試薬の内容は次の通りである。 10倍濃度反応用緩衝液：200mM Tris-HCl（pH 8.8）、10
0mM KCl、100mM (NH4)2SO4、20mM MgSO4、1% Triton X-
100 Betaine溶液：5M Betaine MgSO4溶液：100mM MgSO4 EtBr溶液：6.25ug/ml エチジウムブロマイド水溶液 基質溶液：dATP、dCTP、dGTP、dGTPを混合させたもの
で、各終濃度が10mM インナープライマーＦおよびＲ：各40pmol/ul水溶液 アウタープライマーＦおよびＲ：各10pmol/ul水溶液 DNAポリメラーゼ：Bst DNAポリメラーゼ（ラージフラグ
メント)（8unit/ul、NewEngland BioLab社製）
【００３５】３ LAMP反応液組成
前記検体液 1ulに、滅菌蒸留水 8ul、10倍濃度反応用緩
衝液 2.5ul、Betaine溶液 4ul、MgSO4溶液 0.5ul、EtBr
溶液 1ul、基質溶液 1ul、プライマー１および２各2u
l、プライマー３および４各1ul、そしてDNAポリメラー
ゼ 1ulを加え、全量25ulの反応液を調製した。 ４ LAMP反応 LAMP反応は65℃の等温で120分間行った。連続蛍光光度
計ABI PRISM 7700（Applied Biosystems社製）を用いて
蛍光強度を反応開始から経時的に観察し、蛍光強度が上
昇するものを陽性、蛍光強度の上昇が認められないもの
を陰性とした。 ５ 結果 図１から３に示すように、３組のプライマーセット全て
でサルモネラ属菌は陽性を、非サルモネラ属菌は陰性を
示した。中でもセット１は陰性、陽性の判定に要する時
間が短かく、迅速なサルモネラ属菌検出に適しているも
のと考えられた。
衝液 2.5ul、Betaine溶液 4ul、MgSO4溶液 0.5ul、EtBr
溶液 1ul、基質溶液 1ul、プライマー１および２各2u
l、プライマー３および４各1ul、そしてDNAポリメラー
ゼ 1ulを加え、全量25ulの反応液を調製した。 ４ LAMP反応 LAMP反応は65℃の等温で120分間行った。連続蛍光光度
計ABI PRISM 7700（Applied Biosystems社製）を用いて
蛍光強度を反応開始から経時的に観察し、蛍光強度が上
昇するものを陽性、蛍光強度の上昇が認められないもの
を陰性とした。 ５ 結果 図１から３に示すように、３組のプライマーセット全て
でサルモネラ属菌は陽性を、非サルモネラ属菌は陰性を
示した。中でもセット１は陰性、陽性の判定に要する時
間が短かく、迅速なサルモネラ属菌検出に適しているも
のと考えられた。
【００３６】実施例３ 反応の特異性
１ 検体の調製
サルモネラ属菌61株(表1)および非サルモネラ属菌79株
(表2)を用いた。ブレインハートインフュージョン寒天
培地に接種し、37℃恒温器中で培養を行った。増殖した
各菌体のコロニーを滅菌した綿棒で採取後、生理食塩水
中に懸濁し、620nmでの吸光度により、菌体濃度を測定
した。それぞれ一定量の菌体量(2x109 cell)からDNeasy
Tissue Kit（QIAGEN社製）を用いキット能書記載の操
作でDNA抽出を行った。抽出したDNA濃度を260nmでの吸
光度により濃度を測定し、サルモネラ属菌由来のDNAを1
ng/ul、非サルモネラ属菌由来のDNAを十倍量の10ng/ul
にそれぞれ調製し、下記の反応に供した。
(表2)を用いた。ブレインハートインフュージョン寒天
培地に接種し、37℃恒温器中で培養を行った。増殖した
各菌体のコロニーを滅菌した綿棒で採取後、生理食塩水
中に懸濁し、620nmでの吸光度により、菌体濃度を測定
した。それぞれ一定量の菌体量(2x109 cell)からDNeasy
Tissue Kit（QIAGEN社製）を用いキット能書記載の操
作でDNA抽出を行った。抽出したDNA濃度を260nmでの吸
光度により濃度を測定し、サルモネラ属菌由来のDNAを1
ng/ul、非サルモネラ属菌由来のDNAを十倍量の10ng/ul
にそれぞれ調製し、下記の反応に供した。
【００３７】２ LAMP各試薬濃度
使用した各試薬の内容は次の通りである。
10倍濃度反応用緩衝液：200mM Tris-HCl（pH 8.8）、10
0mM KCl、100mM (NH4)2SO4、20mM MgSO4、1% Triton X-
100 Betaine溶液：5M Betaine MgSO4溶液：100mM MgSO4 EtBr溶液：6.25ug/ml エチジウムブロマイド溶液 基質溶液：dATP、dCTP、dGTP、dGTPを混合させたもの
で、各終濃度が10mM セット１インナープライマーＦおよびＲ：各40pmol/ul
水溶液 セット１アウタープライマーＦおよびＲ：各10pmol/ul
水溶液 ループプライマーＦおよびＲ：各40pmol/ul水溶液 DNAポリメラーゼ：Bst DNAポリメラーゼ（ラージフラグ
メント)（8unit/ul、NewEngland BioLab社製）
0mM KCl、100mM (NH4)2SO4、20mM MgSO4、1% Triton X-
100 Betaine溶液：5M Betaine MgSO4溶液：100mM MgSO4 EtBr溶液：6.25ug/ml エチジウムブロマイド溶液 基質溶液：dATP、dCTP、dGTP、dGTPを混合させたもの
で、各終濃度が10mM セット１インナープライマーＦおよびＲ：各40pmol/ul
水溶液 セット１アウタープライマーＦおよびＲ：各10pmol/ul
水溶液 ループプライマーＦおよびＲ：各40pmol/ul水溶液 DNAポリメラーゼ：Bst DNAポリメラーゼ（ラージフラグ
メント)（8unit/ul、NewEngland BioLab社製）
【００３８】３ LAMP反応液組成
前記検体液 1ulに、滅菌蒸留水 6ul、10倍濃度反応用緩
衝液 2.5ul、Betaine溶液 4ul、MgSO4溶液 0.5ul、EtBr
溶液 1ul、基質溶液 1ul、セット１プライマー１および
２各2ul、セット１プライマー３および４各1ul、ループ
プライマー１および２各1ul、そしてDNAポリメラーゼ 1
ulを加え、全量25ulの反応液を調製した。 ４ LAMP反応 LAMP反応は65℃の等温で60分間行った。連続蛍光光度計
ABI PRISM 7700（Applied Biosystems社製）を用いて蛍
光強度を反応開始から経時的に観察し、蛍光強度が上昇
するものを陽性、蛍光強度の上昇が認められないものを
陰性とした。 ５ 結果 表１で示す様にではサルモネラ菌61菌株すべてにおいて
30分以内の早い時間に増幅が確認でき、陽性となった。
また表２で示す様に、DNA濃度をサルモネラ属菌の10倍
としたにもかかわらず、非サルモネラ属菌79菌株すべて
において陰性となった。特にサルモネラ属菌と系統的に
近縁で、従来の培養法では鑑別が難しかったシトロバク
ター属菌にも反応を示すことはなかった。
衝液 2.5ul、Betaine溶液 4ul、MgSO4溶液 0.5ul、EtBr
溶液 1ul、基質溶液 1ul、セット１プライマー１および
２各2ul、セット１プライマー３および４各1ul、ループ
プライマー１および２各1ul、そしてDNAポリメラーゼ 1
ulを加え、全量25ulの反応液を調製した。 ４ LAMP反応 LAMP反応は65℃の等温で60分間行った。連続蛍光光度計
ABI PRISM 7700（Applied Biosystems社製）を用いて蛍
光強度を反応開始から経時的に観察し、蛍光強度が上昇
するものを陽性、蛍光強度の上昇が認められないものを
陰性とした。 ５ 結果 表１で示す様にではサルモネラ菌61菌株すべてにおいて
30分以内の早い時間に増幅が確認でき、陽性となった。
また表２で示す様に、DNA濃度をサルモネラ属菌の10倍
としたにもかかわらず、非サルモネラ属菌79菌株すべて
において陰性となった。特にサルモネラ属菌と系統的に
近縁で、従来の培養法では鑑別が難しかったシトロバク
ター属菌にも反応を示すことはなかった。
【００３９】比較例１ PCR
１ PCRキット
PCR反応は食品・環境分析用invA遺伝子検出キット「サ
ルモネラ菌 One Step PCR Screening Kit Ver.2.0」
（宝酒造社製）を、キット添付の能書記載の方法で使用
した。酵素や基質、緩衝液などを含む反応液48ul、Salm
onella invA検出用プライマー溶液 2ul、そして前記検
体液をサルモネラ属菌由来のDNAを1ng/test、非サルモ
ネラ属菌由来のDNAを十倍量の10ng/testと、テストあた
りのDNA量がLAMP反応と同量となるように希釈したもの5
0ulを加え、全量100ulの反応液を調製、下記の反応に供
した。 ２ PCR反応 DNAサーマルサイクラーBiometra T3 thermocycle（Biom
etra社製）を用いて下記のように、キット添付の能書に
記載通りPCR反応を行った。 熱変性：94℃、1分 アニーリング：55℃、1分 重合反応：72℃、1分 熱変性からアニーリングを経て重合反応までを1サイク
ルとし、これを35サイクル総所要時間約2.5時間の反応
を行った。
ルモネラ菌 One Step PCR Screening Kit Ver.2.0」
（宝酒造社製）を、キット添付の能書記載の方法で使用
した。酵素や基質、緩衝液などを含む反応液48ul、Salm
onella invA検出用プライマー溶液 2ul、そして前記検
体液をサルモネラ属菌由来のDNAを1ng/test、非サルモ
ネラ属菌由来のDNAを十倍量の10ng/testと、テストあた
りのDNA量がLAMP反応と同量となるように希釈したもの5
0ulを加え、全量100ulの反応液を調製、下記の反応に供
した。 ２ PCR反応 DNAサーマルサイクラーBiometra T3 thermocycle（Biom
etra社製）を用いて下記のように、キット添付の能書に
記載通りPCR反応を行った。 熱変性：94℃、1分 アニーリング：55℃、1分 重合反応：72℃、1分 熱変性からアニーリングを経て重合反応までを1サイク
ルとし、これを35サイクル総所要時間約2.5時間の反応
を行った。
【００４０】３ 電気泳動による検出
PCR増幅産物の検出はキット添付の能書記載の方法で行
なった。2%（W/V）のアガロースゲルを調製し、1レーン
当たりPCR反応液10ulと6倍濃度Loading Buffer（ニッポ
ンジーン社製）1.5ulを混合したものを全量アプライし
た。100Vの定電圧で、35分電気泳動を行い、1ug/mlのエ
チジウムブロマイド溶液中で泳動後のゲルを染色した。
UVトランスイルミネーター下でバンドの有無と、同時に
泳動したDNAサイズマーカーとの相対的移動度から合成
産物のサイズを確認した。PCRプライマーにより特異的
に増幅されたinvA由来の増幅産物のサイズは378bpであ
る。 ４ 結果 表１で示す様に、サルモネラ菌61菌株すべてにおいて陽
性となった。また表２で示す様に、DNA濃度をサルモネ
ラ属菌の10倍としたにもかかわらず、非サルモネラ属菌
79菌株すべてにおいて陰性となった。PCR法でもシトロ
バクター属菌にも反応を示すことはなかった。このよう
に特異性では両法とも同じ結果だった。
なった。2%（W/V）のアガロースゲルを調製し、1レーン
当たりPCR反応液10ulと6倍濃度Loading Buffer（ニッポ
ンジーン社製）1.5ulを混合したものを全量アプライし
た。100Vの定電圧で、35分電気泳動を行い、1ug/mlのエ
チジウムブロマイド溶液中で泳動後のゲルを染色した。
UVトランスイルミネーター下でバンドの有無と、同時に
泳動したDNAサイズマーカーとの相対的移動度から合成
産物のサイズを確認した。PCRプライマーにより特異的
に増幅されたinvA由来の増幅産物のサイズは378bpであ
る。 ４ 結果 表１で示す様に、サルモネラ菌61菌株すべてにおいて陽
性となった。また表２で示す様に、DNA濃度をサルモネ
ラ属菌の10倍としたにもかかわらず、非サルモネラ属菌
79菌株すべてにおいて陰性となった。PCR法でもシトロ
バクター属菌にも反応を示すことはなかった。このよう
に特異性では両法とも同じ結果だった。
【００４１】
【表１】
────────────────────────────────────
属 種 菌株番号 ＬＡＭＰ ＰＣＲ
────────────────────────────────────
Salmonella anatum 4480 ＋ ＋
Salmonella arizonae 387 ＋ ＋
Salmonella arizonae 482 ＋ ＋
Salmonella arizonae 483 ＋ ＋
Salmonella arizonae 736 ＋ ＋
Salmonella arizonae 737 ＋ ＋
Salmonella arizonae 784 ＋ ＋
Salmonella choleraesuis 783 ＋ ＋
Salmonella choleraesuis 751 ＋ ＋
Salmonella choleraesuis 783 ＋ ＋
Salmonella choleraesuis 791 ＋ ＋
Salmonella choleraesuis 792 ＋ ＋
Salmonella derby 767 ＋ ＋
Salmonella enteritidis 740 ＋ ＋
Salmonella enteritidis 755 ＋ ＋
Salmonella enteritidis 756 ＋ ＋
Salmonella enteritidis 758 ＋ ＋
Salmonella enteritidis 761 ＋ ＋
Salmonella enteritidis 4513 ＋ ＋
Salmonella enteritidis 5197 ＋ ＋
Salmonella gallinarum 790 ＋ ＋
Salmonella gallinarum 790 ＋ ＋
Salmonella give 748 ＋ ＋
Salmonella jaba B 709 ＋ ＋
Salmonella newport 770 ＋ ＋
Salmonella paratyphi A 477 ＋ ＋
Salmonella paratyphi A 478 ＋ ＋
Salmonella paratyphi A 479 ＋ ＋
Salmonella tennessee 765 ＋ ＋
Salmonella thompson 769 ＋ ＋
Salmonella thompson 771 ＋ ＋
Salmonella typhi 473 ＋ ＋
Salmonella typhi 474 ＋ ＋
Salmonella typhi 475 ＋ ＋
Salmonella typhi 476 ＋ ＋
Salmonella typhi 785 ＋ ＋
Salmonella typhimurium 757 ＋ ＋
Salmonella typhimurium 772 ＋ ＋
Salmonella typhimurium 786 ＋ ＋
────────────────────────────────────
【００４２】
【表２】
────────────────────────────────────
属 種 菌株番号 ＬＡＭＰ ＰＣＲ
────────────────────────────────────
Alcaligenes xylosoxidans subsp. 61 − −
Citrobacter freundii 36 − −
Citrobacter freundii 389 − −
Citrobacter freundii 390 − −
Citrobacter freundii 391 − −
Citrobacter freundii 392 − −
Citrobactor freundii 33 − −
Edwardsiella tarda 638 − −
Edwardsiella tarda 639 − −
Edwardsiella tarda 640 − −
Enterobacter cloacae 415 − −
Enterobacter cloacae 459 − −
Enterobacter aerogenes 521 − −
Enterobacter aerogenes 566 − −
Enterobacter cloacae 5261 − −
Escherichia coli 677 − −
Escherichia coli 678 − −
Escherichia coli 679 − −
Escherichia coli 687 − −
Escherichia coli 689 − −
Escherichia coli 704 − −
Escherichia coli 3631 − −
Escherichia coli 3632 − −
Escherichia coli 3633 − −
Escherichia coli 4331 − −
Escherichia coli 4476 − −
Escherichia coli 4496 − −
Escherichia coli 4496 − −
Haemophilus influenzae 2002 − −
Hafnia alvei 416 − −
Hafnia alvei 417 − −
Klebsiella oxytoca 406 − −
Klebsiella pneumoniae 407 − −
Klebsiella pneumoniae 408 − −
Klebsiella pneumoniae 409 − −
Klebsiella pneumoniae 504 − −
Klebsiella pneumoniae 505 − −
Klebsiella oxytoca 554 − −
Klebsiella oxytoca 556 − −
Klebsiella pneumoniae 5262 − −
Legionella pneumophila 3677 − −
Legionella pneumophila 3678 − −
Legionella pneumophila 3679 − −
Legionella pneumophila 3680 − −
Legionella pneumophila 3681 − −
Legionella pneumophila 3682 − −
Legionella pneumophila 3683 − −
Legionella bozemanii 3684 − −
Legionella micdadei 3685 − −
Legionella dumoffii 3686 − −
Legionella gormanii 3687 − −
Legionella dumoffii 3688 − −
Legionella longbeachae 3689 − −
Morganella morganii 183 − −
Morganella morganii 186 − −
Morganella morganii 438 − −
Proteus vulgaris 184 − −
Proteus vulgaris 185 − −
Proteus mirabilis 433 − −
Proteus vulgaris 434 − −
Proteus mirabilis 436 − −
Proteus mirabilis 437 − −
Providencia stuartii 82 − −
Providencia alcalifaciens 182 − −
Providencia rettgeri 441 − −
Providencia rettgeri 442 − −
Providencia alcalifaciens 446 − −
Pseudomonas aeruginosa 1376 − −
Pseudomonas aeruginosa 1378 − −
Pseudomonas fluorescens 2553 − −
Serratia marcescens 420 − −
Serratia marcescens 421 − −
Serratia marcescens 422 − −
Serratia marcescens 524 − −
Shigella sonnei 461 − −
Shigella dysenteriae 484 − −
Shigella dysenteriae 486 − −
Shigella boydii 492 − −
Yersinia enterocolitica 539 − −
Yersinia enterocolitica 793 − −
────────────────────────────────────
【００４３】実施例４ サルモネラ属菌の検出感度
１ 検体の調製
培養菌体から熱により抽出したDNAサンプルを用い検討
を行った。Salmonellaenteritidis（菌株番号5197）を
ブレインハートインフュージョン寒天培地に接種し、37
℃恒温器中で培養を行った。増殖した各菌体のコロニー
を滅菌した綿棒で採取後、生理食塩水中に懸濁し、620n
mでの吸光度により、菌体濃度を6 x 108cfu/mlになるよ
うに合わせた。当懸濁液をTE緩衝液（10mM Tris/HCl、1
mM EDTA、pH8.0）で6 x 103cfu/mlまでの10倍希釈系を
作製し、95℃で5分間熱処理を行った。さらに12,000rp
m、4℃、10分間の遠心分離を行い、上清を回収した。こ
れを熱抽出検体液とし、下記の反応に供した。 ２ LAMP反応 LAMP反応は、実施例３と同じ条件で行なった。 ３ 結果 図４に段階希釈抽出DNAサンプルのLAMP法の増幅反応カ
ーブを示す。LAMP法ではテストあたり60 cfuまで検出で
きた。
を行った。Salmonellaenteritidis（菌株番号5197）を
ブレインハートインフュージョン寒天培地に接種し、37
℃恒温器中で培養を行った。増殖した各菌体のコロニー
を滅菌した綿棒で採取後、生理食塩水中に懸濁し、620n
mでの吸光度により、菌体濃度を6 x 108cfu/mlになるよ
うに合わせた。当懸濁液をTE緩衝液（10mM Tris/HCl、1
mM EDTA、pH8.0）で6 x 103cfu/mlまでの10倍希釈系を
作製し、95℃で5分間熱処理を行った。さらに12,000rp
m、4℃、10分間の遠心分離を行い、上清を回収した。こ
れを熱抽出検体液とし、下記の反応に供した。 ２ LAMP反応 LAMP反応は、実施例３と同じ条件で行なった。 ３ 結果 図４に段階希釈抽出DNAサンプルのLAMP法の増幅反応カ
ーブを示す。LAMP法ではテストあたり60 cfuまで検出で
きた。
【００４４】比較例２
１ PCR反応
PCR反応は実施例４で作成した熱抽出検体液をテストあ
たりの菌体濃度をLAMP法と同じになるように用い、比較
例１と同じ条件で行なった。 ２ 結果 図５にPCR法のゲル電気泳動図を示す。LAMP法ではテス
トあたり60 cfuまで検出できたが、PCR法ではテストあ
たり600 cfuまでしか検出できなかった。
たりの菌体濃度をLAMP法と同じになるように用い、比較
例１と同じ条件で行なった。 ２ 結果 図５にPCR法のゲル電気泳動図を示す。LAMP法ではテス
トあたり60 cfuまで検出できたが、PCR法ではテストあ
たり600 cfuまでしか検出できなかった。
【００４５】
【発明の効果】本発明は、オリゴヌクレオチドをプライ
マーとして、LAMP法によりサルモネラ属菌のinvA遺伝子
の増幅を確認する事により、サルモネラ属菌を検出する
ものある。従来のPCR法より操作は簡便かつ迅速であ
り、検出限界も従来のPCR法が600cfu/testなのに対して
60 cfu/testと10倍高感度な検出ができる。
マーとして、LAMP法によりサルモネラ属菌のinvA遺伝子
の増幅を確認する事により、サルモネラ属菌を検出する
ものある。従来のPCR法より操作は簡便かつ迅速であ
り、検出限界も従来のPCR法が600cfu/testなのに対して
60 cfu/testと10倍高感度な検出ができる。
【００４６】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Eiken Kagaku Kabushiki Kaisya
<120> Primers for Salmonella spp. detection, and Detection of Salmonell
a spp. Using the Primers
<130> P-459
<160> 23
<210> 1
<211> 497
<212> DNA
<213> Salmonella typhimurium
<220>
<400> 1
tggttgattt cctgatcgca ctgaatatcg tactggcgat attggtgttt atggggtcgt 60
tctacattga cagaatcctc agtttttcaa cgtttcctgc ggtactgtta attaccacgc 120
tctttcgtct ggcattatcg atcagtacca gtcgtcttat cttgattgaa gccgatgccg 180
gtgaaattat cgccacgttc gggcaattcg ttattggcga tagcctggcg gtgggttttg 240
ttgtcttctc tattgtcacc gtggtccagt ttatcgttat taccaaaggt tcagaacgtg 300
tcgcggaagt cgcggcccga ttttctctgg atggtatgcc cggtaaacag atgagtattg 360
atgccgattt gaaggccggt attattgatg cggatgccgc gcgcgaacgg cgaagcgtac 420
tggaaaggga aagccagctt tacggttcct ttgacggtgc gatgaagttt atcaaaggtg 480
acgctattgc cggcatc 497
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 2
tggcattatc gatcagtacc ag 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 3
agtttttcaa cgtttcctgc gg 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 4
ggcgatattg gtgtttatgg gg 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 5
gatgccggtg aaattatcgc 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 6
cctggcggtg ggttttgt 18
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 7
cagtttatcg ttattaccaa aggttca 27
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 8
acagatgagt attgatgccg at 22
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 9
aggttcagaa cgtgtcgcg 19
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 10
attggcgata gcctggcg 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 11
ggccggtatt attgatgcg 19
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 12
aagccagctt tacggttcct t 21
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 13
gacgctattg ccggcatc 18
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 14
tggttgattt cctgatcgca 20
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 15
gaaggccggt attattgatg cg 22
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 16
agcgtactgg aaagggaaag c 21
<210> 17
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 17
ctggtactga tcgataatgc caagtttttc aacgtttcct gcgg 44
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 18
gatgccggtg aaattatcgc acaaaaccca ccgccagg 38
<210> 19
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 19
atcggcatca atactcatct gtaggttcag aacgtgtcgc g 41
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 20
ggccggtatt attgatgcga aggaaccgta aagctggctt 40
<210> 21
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 21
gaaggccggt attattgatg cggctttccc tttccagtac gct 43
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 22
gttaattacc acgctctttc gtc 23
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 23
gggcaattcg ttattggcg 19
【図１】プライマーセット１による増幅を示したグラフ
【図２】プライマーセット２による増幅を示したグラフ
【図３】プライマーセット１による増幅を示したグラフ
【図４】LAMP法の検出感度を示したグラフ
【図５】PCR法の検出感度を示した図、矢印は378bpのin
vA増幅産物、レーンＭはサイズマーカー、レーン1は60
0,000、レーン2は60,000、レーン3は6,000、レーン4は6
00、レーン5は60、レーン6は6 cfu/test、Bはブランク
である
vA増幅産物、レーンＭはサイズマーカー、レーン1は60
0,000、レーン2は60,000、レーン3は6,000、レーン4は6
00、レーン5は60、レーン6は6 cfu/test、Bはブランク
である
Claims (7)
- 【請求項１】Salmonella typhimurium invA遺伝子配列
の１９１番から６８７番の塩基配列またはその相補鎖か
ら選ばれた、標的領域の核酸配列を増幅するための以下
のセグメントを含むプライマー (a) 第１のセグメントとして、サルモネラ属菌のinvA遺
伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列 (b)第２のセグメントとして、第１のセグメントの3’側
の塩基配列の相補鎖よりなり、第１のセグメントの5’
側に位置する塩基配列 - 【請求項２】Salmonella typhimurium invA遺伝子より
選ばれた塩基配列 TGGCATTATCGATCAGTACCAG 配列番号２ AGTTTTTCAACGTTTCCTGCGG 配列番号３ GGCGATATTGGTGTTTATGGGG 配列番号４ GATGCCGGTGAAATTATCGC 配列番号５ CCTGGCGGTGGGTTTTGT 配列番号６ CAGTTTATCGTTATTACCAAAGGTTCA 配列番号７ ACAGATGAGTATTGATGCCGAT 配列番号８ AGGTTCAGAACGTGTCGCG 配列番号９ ATTGGCGATAGCCTGGCG 配列番号１０ GGCCGGTATTATTGATGCG 配列番号１１ AAGCCAGCTTTACGGTTCCTT 配列番号１２ GACGCTATTGCCGGCATC 配列番号１３ TGGTTGATTTCCTGATCGCA 配列番号１４ GAAGGCCGGTATTATTGATGCG 配列番号１５ AGCGTACTGGAAAGGGAAAGC 配列番号１６ あるいはそれと相補的な塩基配列から選ばれた、少なく
とも連続する１５塩基を有する請求項１のプライマー - 【請求項３】サルモネラ属菌invA遺伝子を増幅できる、 配列番号２より選ばれる塩基配列と相補的なオリゴヌク
レオチド−塩基数０から５０の任意の塩基配列よりなる
オリゴヌクレオチド−配列番号３より選ばれる塩基配列
よりなるオリゴヌクレオチド 配列番号８より選ばれる塩基配列と相補的なオリゴヌク
レオチド−塩基数０から５０の任意の塩基配列よりなる
オリゴヌクレオチド−配列番号９より選ばれる塩基配列
よりなるオリゴヌクレオチド 配列番号４より選ばれるオリゴヌクレオチド−塩基数０
から５０の任意の塩基配列よりなるオリゴヌクレオチド
−配列番号５より選ばれる塩基配列と相補的なオリゴヌ
クレオチド 配列番号８より選ばれるオリゴヌクレオチド−塩基数０
から５０の任意の塩基配列よりなるオリゴヌクレオチド
−配列番号９より選ばれる塩基配列と相補的なオリゴヌ
クレオチド 配列番号１４より選ばれるオリゴヌクレオチド−塩基数
０から５０の任意の塩基配列よりなるオリゴヌクレオチ
ド−配列番号１５より選ばれる塩基配列と相補的なオリ
ゴヌクレオチド よりなる請求項２のプライマー - 【請求項４】核酸の増幅法がLAMP法である請求項１から
３のプライマー - 【請求項５】請求項１から３のプライマーを用いるLAMP
法によるサルモネラ属菌invA遺伝子の増幅法 - 【請求項６】請求項５のサルモネラ属菌invA遺伝子の増
幅を検出する事によるサルモネラ属菌の同定方法 - 【請求項７】請求項１から４のプライマー、鎖置換型核
酸合成酵素、および基質を含むサルモネラ属菌を同定す
るキット
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001401056A JP2003199572A (ja) | 2001-12-28 | 2001-12-28 | サルモネラ属菌検出のためのプライマーおよびそれを用いた検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001401056A JP2003199572A (ja) | 2001-12-28 | 2001-12-28 | サルモネラ属菌検出のためのプライマーおよびそれを用いた検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003199572A true JP2003199572A (ja) | 2003-07-15 |
Family
ID=27640039
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001401056A Pending JP2003199572A (ja) | 2001-12-28 | 2001-12-28 | サルモネラ属菌検出のためのプライマーおよびそれを用いた検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003199572A (ja) |
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005083122A2 (en) * | 2004-02-27 | 2005-09-09 | Stichting Laboratorium Voor Infectieziekten | Method for detecting a microorganism in a fecal specimen |
| JP2006333785A (ja) * | 2005-06-02 | 2006-12-14 | Japan Health Science Foundation | ＬＡＭＰ法を用いたクロストリディウム・ディフィシルｔｏｘｉｎＢ遺伝子検出方法およびこの方法に用いるプライマーセット |
| JP2007124970A (ja) * | 2005-11-07 | 2007-05-24 | Japan Health Science Foundation | Ｌａｍｐ法を用いた百日咳菌遺伝子検出方法およびこの方法に用いるプライマーセット |
| JP2008072951A (ja) * | 2006-09-21 | 2008-04-03 | Kitasato Gakuen | Ｌａｍｐ法を用いたサルモネラｏ４群の血清型迅速検出法 |
| CN102206703A (zh) * | 2011-01-23 | 2011-10-05 | 浙江省质量技术监督检测研究院 | 三种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒 |
| JP2013505723A (ja) * | 2009-09-25 | 2013-02-21 | アリーア サン ディエゴ， インコーポレイテッド | 粗製のマトリックスにおける核酸の検出 |
| WO2014003583A2 (en) * | 2012-06-26 | 2014-01-03 | University Of The Philippines Diliman | Detection of pathogens |
| CN104830988A (zh) * | 2015-05-22 | 2015-08-12 | 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 | 鼠伤寒沙门氏菌特异性lamp引物组及lamp检测方法 |
| JP2016042801A (ja) * | 2014-08-20 | 2016-04-04 | 東洋紡株式会社 | 食中毒原因菌を分離検出する方法 |
| CN106282375A (zh) * | 2016-09-24 | 2017-01-04 | 中华人民共和国广州机场出入境检验检疫局 | 一种鼠伤寒沙门氏菌的lamp引物组及试剂盒与使用方法 |
| WO2017067942A1 (en) * | 2015-10-19 | 2017-04-27 | Institut Pasteur | Detection of microbial pathogens related to bacterial infections through amplification especially by rt-lamp |
| CN108866163A (zh) * | 2018-07-16 | 2018-11-23 | 中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法 |
| CN109313161A (zh) * | 2016-03-31 | 2019-02-05 | 株式会社岛津制作所 | 微生物的识别方法 |
| CN109652575A (zh) * | 2019-03-05 | 2019-04-19 | 许绍坤 | 一种针对沙门氏菌的核酸快速检测方法 |
| CN111020048A (zh) * | 2015-09-02 | 2020-04-17 | 上海产业技术研究院 | 志贺氏菌的快速恒温检测方法、引物组及试剂盒 |
-
2001
- 2001-12-28 JP JP2001401056A patent/JP2003199572A/ja active Pending
Cited By (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005083122A2 (en) * | 2004-02-27 | 2005-09-09 | Stichting Laboratorium Voor Infectieziekten | Method for detecting a microorganism in a fecal specimen |
| WO2005083122A3 (en) * | 2004-02-27 | 2006-03-23 | Id Voor Groningen En Drenthe S | Method for detecting a microorganism in a fecal specimen |
| JP2006333785A (ja) * | 2005-06-02 | 2006-12-14 | Japan Health Science Foundation | ＬＡＭＰ法を用いたクロストリディウム・ディフィシルｔｏｘｉｎＢ遺伝子検出方法およびこの方法に用いるプライマーセット |
| JP2007124970A (ja) * | 2005-11-07 | 2007-05-24 | Japan Health Science Foundation | Ｌａｍｐ法を用いた百日咳菌遺伝子検出方法およびこの方法に用いるプライマーセット |
| JP2008072951A (ja) * | 2006-09-21 | 2008-04-03 | Kitasato Gakuen | Ｌａｍｐ法を用いたサルモネラｏ４群の血清型迅速検出法 |
| JP2013505723A (ja) * | 2009-09-25 | 2013-02-21 | アリーア サン ディエゴ， インコーポレイテッド | 粗製のマトリックスにおける核酸の検出 |
| CN102206703A (zh) * | 2011-01-23 | 2011-10-05 | 浙江省质量技术监督检测研究院 | 三种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒 |
| WO2014003583A3 (en) * | 2012-06-26 | 2014-08-07 | University Of The Philippines | Detection of pathogens |
| WO2014003583A2 (en) * | 2012-06-26 | 2014-01-03 | University Of The Philippines Diliman | Detection of pathogens |
| JP2016042801A (ja) * | 2014-08-20 | 2016-04-04 | 東洋紡株式会社 | 食中毒原因菌を分離検出する方法 |
| CN104830988A (zh) * | 2015-05-22 | 2015-08-12 | 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 | 鼠伤寒沙门氏菌特异性lamp引物组及lamp检测方法 |
| CN111020048A (zh) * | 2015-09-02 | 2020-04-17 | 上海产业技术研究院 | 志贺氏菌的快速恒温检测方法、引物组及试剂盒 |
| WO2017067942A1 (en) * | 2015-10-19 | 2017-04-27 | Institut Pasteur | Detection of microbial pathogens related to bacterial infections through amplification especially by rt-lamp |
| CN109313161A (zh) * | 2016-03-31 | 2019-02-05 | 株式会社岛津制作所 | 微生物的识别方法 |
| CN109313161B (zh) * | 2016-03-31 | 2021-05-07 | 株式会社岛津制作所 | 微生物的识别方法 |
| CN106282375A (zh) * | 2016-09-24 | 2017-01-04 | 中华人民共和国广州机场出入境检验检疫局 | 一种鼠伤寒沙门氏菌的lamp引物组及试剂盒与使用方法 |
| CN108866163A (zh) * | 2018-07-16 | 2018-11-23 | 中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法 |
| CN109652575A (zh) * | 2019-03-05 | 2019-04-19 | 许绍坤 | 一种针对沙门氏菌的核酸快速检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101113475B (zh) | 病原微生物检测用引物和使用所述引物的多重扩增 | |
| JP2003199572A (ja) | サルモネラ属菌検出のためのプライマーおよびそれを用いた検出法 | |
| JP2008154581A (ja) | 細菌ゲノム増幅反応用プライマー | |
| NO317797B1 (no) | Nukleinsyremolekyl, fremgangsmate og sett for deteksjon og identifisering av Salmonella-arter. | |
| US20200291460A1 (en) | Compositions and Methods for Detecting Gastrointestinal Pathogen Nucleic Acid | |
| AU2013205010B2 (en) | Detection of Shiga toxin genes in bacteria | |
| WO2005005659A1 (en) | Diagnostics of diarrheagenic escherichia coli (dec) and shigella spp. | |
| EP2633082B1 (en) | Rapid salmonella serotyping assay | |
| US20030113757A1 (en) | Rapid and specific detection of campylobacter | |
| US20040110251A1 (en) | Detection of pathogenic bacteria | |
| KR101987388B1 (ko) | 분자비콘을 포함하는 비브리오균의 등온비색 검출용 조성물 및 이의 용도 | |
| JP2003219878A (ja) | レジオネラ属菌検出のためのプライマーおよびそれを用いた検出法 | |
| JP2001512665A (ja) | 大腸菌種に特異的なオリゴヌクレオチド並びにその種の細菌の検出および視覚化法 | |
| KR20090122554A (ko) | 살모넬라 티피무리움 검출용 프라이머 세트 및 프로브 | |
| JP2007075017A (ja) | Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉの検出法 | |
| JP2008072951A (ja) | Ｌａｍｐ法を用いたサルモネラｏ４群の血清型迅速検出法 | |
| KR102178672B1 (ko) | 분자비콘을 포함하는 등온비색 검출용 조성물 및 이의 용도 | |
| JP2004081054A (ja) | 腸管出血性大腸菌ベロトキシン検出のためのプライマーおよびそれを用いた腸管出血性大腸菌の同定法 | |
| JP2902054B2 (ja) | ヒト型結核菌の検出方法 | |
| JP2000093181A (ja) | オリゴヌクレオチド及びこれをプライマーとして用いたサルモネラ属細菌の検出方法 | |
| JP2007075018A (ja) | Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｃｏｌｉの検出法 | |
| CN112375835A (zh) | 一种河流弧菌4个o抗原血清型的环介导等温扩增检测方法及应用 | |
| CN111690723A (zh) | 一种对斯氏普罗威登斯菌o33血清型o抗原分子分型的检测方法 | |
| JP2001521721A (ja) | サルモネラ菌を検出するための核酸分子セット、核酸、キットおよび使用 | |
| JP2004065244A (ja) | ヨーネ菌検出用プライマーおよびこれを用いたヨーネ病の診断法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20041217 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070725 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20071207 |