CN108866163A - 一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法 - Google Patents

一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，其包括以下步骤：S1、环介导等温扩增技术(LAMP)引物的设计与合成；S2、DNA模板的制备：制备志贺氏菌菌液，人工污染脱脂奶粉样品，采用热裂解法提取细菌基因组；S3、样品的LAMP检测：取DNA模板分别加入内引物FIP/BIP、外引物F3/B3、环引物LF/LB在LAMP反应体系及反应条件下进行扩增，最后分别取扩增产物通过直接目测法或琼脂糖凝胶电泳法，判断结果。对于本发明，不仅操作简单、检测速度快，而且灵敏度高、特异性强、准确度高，检出限达到1.0×101CFU/mL，检测准确度为99.09％。

Description

一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法。
背景技术
志贺氏菌为兼性厌氧型革兰氏阴性菌，可通过消化道传播并引发机体急性感染性痢疾，因此也被称作为痢疾杆菌。志贺氏菌附着力、侵袭力强，其进入机体后能分泌大量的内、外毒素，造成腹痛、腹泻、局部粘膜炎症甚至溃疡、坏死等病症，尤其对婴幼儿具有致命性危害。流行病显示，感染性痢疾多发于6-9月，主要为患病者进食被志贺氏菌污染的食物所致，具有感染率高、致病率高等特点。志贺氏菌通过食品感染人类，在奶制品、水产品、鸡肉、水果、面包等食品中经常被检出。发病时若不及时救助，会危及生命。因此，志贺氏菌是食品安全领域的重点监测对象，建立并应用快速、准确的志贺氏菌检测方法具有重要意义。
目前，对志贺氏菌的检测方法主要有传统的分离鉴定方法、免疫学方法及分子生物学方法。然而，传统的志贺氏菌检测方法是根据国家标准(GB4789.4-2016)进行的，其步骤比较繁琐，耗时较长，至少需要4-7天才能得出明确的诊断结果，虽然此方法为“金标准”，但已不能满足实际工作的需要；免疫学方法主要利用抗原-抗体之间的特异性反应，是一种定性或定量的诊断技术，其灵敏性和特异性比较高，但其操作复杂、试验条件要求高等因素，在临床应用上带来了较大的不便；分子生物学方面需要昂贵的仪器设备，且受人为操作技术的影响较大，不能区别核酸来源于死细胞还是活细胞，在基层单位也很难普及和推广应用。
发明内容
为了克服上述技术缺陷，本发明的目的是提供一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，其不仅操作简单、检测速度快，而且灵敏度高、特异性强、准确度高。
为了解决上述问题，本发明按以下技术方案予以实现的：
一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，包括以下步骤：
S1、环介导等温扩增技术(LAMP)引物的设计与合成：
根据志贺氏菌ipaH基因(GenBank登录号：HE616529.1)，并用生物学在线软件分析该基因的保守核苷酸序列，针对ipaH基因的保守区域，结合环介导等温扩增方法的引物设计原则，利用Primer Explorer V4在线引物设计软件筛选并合成LAMP引物：内引物FIP/BIP、外引物F3/B3、环引物LF/LB；
S2、DNA模板的制备：
制备志贺氏菌菌液，人工污染脱脂奶粉样品，将污染样品梯度稀释，采用热裂解法提取细菌基因组，得到不同浓度的DNA模板溶液；
S3、样品的LAMP检测：
取步骤S2所得不同浓度的DNA模板分别加入步骤S1所得内引物FIP/BIP、外引物F3/B3、环引物LF/LB在LAMP反应体系及反应条件下进行扩增，分别取扩增产物通过直接目测法或琼脂糖凝胶电泳法，判断结果。
进一步的，步骤S1所得LAMP引物包括：内引物FIP为TCCGCGACACGTTCCCTCTATTGTCAGTACGCTTCGCC，内引物BIP为TGCCGATTTGAAGGCCGGTACACCGTGGTCCGTTCTGAA，外引物F3为ACTCTCCCAGTGTGCTTTGAT，外引物B3为CTTTTCGTGAAAAATTGAAA，环引物LF为TGGCATGCTTTGAACAGATAA，环引物LB为TATTGAGTTCGTTCTAATCAACT。
进一步的，步骤S2包括：将志贺氏菌接种于R&F志贺氏菌属显色培养基，37℃培养16-24h，再挑取单菌落于LB培养液中，37℃、200r/min条件下，振荡培养16-48h，得到所述志贺氏菌菌液。
进一步的，步骤S2包括：将所得志贺氏菌菌液接种到脱脂奶粉样品中，10倍梯度稀释所述污染样品，使所述污染样品中志贺氏菌的浓度依次为100、101、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL，再分别取1.0mL所述污染样品，10000-12000r/min离心2-5min，灭菌蒸馏水洗涤两次，再用300μL TE缓冲液悬浮，隔水煮沸10-20min，8000-10000r/min离心10-20min，取上清液，得到不同浓度的所述DNA模板溶液。
进一步的，步骤S3包括：所述LAMP反应体系(25μL)为：2.5μL 10×ThermoPol缓冲液，1.5μL MgSO4，3μL引物，3.5μL dNTPs，2.5μL甜菜碱，1μL Bst 2.0DNA聚合酶，2μL DNA模板，1μL钙黄绿素，8μL ddH2O。
进一步的，3μL所述引物包括1μL的20μmol/L内引物FIP/BIP、1μL的10μmol/L外引物F3/B3、1μL的15μmol/L环引物LF/LB。
进一步的，步骤S3包括：所述LAMP反应条件为：将配备好的所述LAMP反应体系于60-65℃恒温水浴扩增30-60min，再75-85℃使所述Bst 2.0DNA聚合酶失活。
进一步的，步骤S3包括：所述LAMP反应条件为：将配备好的所述LAMP反应体系于63℃恒温水浴扩增60min，再80℃使所述Bst 2.0DNA聚合酶失活。
进一步的，步骤S3包括：直接观察反应混合液中是否显示绿色，显示绿色，则为阳性结果，未显示绿色，则为阴性结果。
进一步的，步骤S3包括：分别取5μL的所述扩增产物，在30g/L琼脂糖凝胶中电泳，电压100V，时间30min，置于凝胶成像系统照相，出现梯度条带，则为阳性结果，未出现梯度条带，则为阴性结果。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明提供的一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，克服了目前传统的分离鉴定方法步骤比较繁琐、耗时较长，免疫学方法操作复杂、试验条件要求高，以及分子生物学方法需要昂贵的仪器设备、受人为操作技术的影响较大等缺点；本发明的LAMP检测方法检测奶粉中的志贺氏菌，不仅操作简单、检测速度快，而且灵敏度高、特异性强、准确度高。
(2)本发明所述的环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，检出限达到1.0×101CFU/mL，检测准确度为99.09％。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，其中：
图1为本发明所述环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的流程图；
图2为实施例1-6的扩增产物在琼脂糖凝胶电泳的结果图，其中，1为阴性对照，2-7依次为实施例1-6的电泳结果；
图3为实施例1稀释倍数为100-108倍的琼脂糖凝胶电泳结果；
图4为对比例1稀释倍数为100-108倍的琼脂糖凝胶电泳结果。
具体实施方式
各种试验仪器与试剂均为市售商品，均为可通过商业途径购买获得。
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，如图1所示，包括以下步骤：
S1、环介导等温扩增技术(LAMP)引物的设计与合成：
根据志贺氏菌ipaH基因(GenBank登录号：HE616529.1)，并用生物学在线软件分析该基因的保守核苷酸序列，针对ipaH基因的保守区域，结合环介导等温扩增方法的引物设计原则，利用Primer Explorer V4在线引物设计软件筛选并合成LAMP引物：
内引物FIP：TCCGCGACACGTTCCCTCTATTGTCAGTACGCTTCGCC；
内引物BIP：TGCCGATTTGAAGGCCGGTACACCGTGGTCCGTTCTGAA；
外引物F3：ACTCTCCCAGTGTGCTTTGAT；
外引物B3：CTTTTCGTGAAAAATTGAAA；
环引物LF：TGGCATGCTTTGAACAGATAA；
环引物LB：TATTGAGTTCGTTCTAATCAACT；
S2、DNA模板的制备：
将志贺氏菌接种于R&F志贺氏菌属显色培养基，37℃培养18h，再挑取单菌落于LB培养液中，37℃、200r/min条件下，振荡培养18h，得到所述志贺氏菌菌液，将志贺氏菌菌液接种到脱脂奶粉样品中，10倍梯度稀释所述污染样品，使污染样品中志贺氏菌的浓度依次为100、101、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL，再分别取1.0mL所述污染样品，12000r/min离心3min，灭菌蒸馏水洗涤两次，再用300μL TE缓冲液悬浮，隔水煮沸20min，10000r/min离心10min，取上清液，得到不同浓度的所述DNA模板溶液。
S3、样品的LAMP检测：
反应体系(25μL)：2.5μL 10×ThermoPol缓冲液，1.5μL MgSO4(10mmoL/L)，1μL内引物FIP/BIP(20μmol/L)，1μL外引物F3/B3(10μmol/L)，1μL环引物LF/LB(15μmol/L)，3.5μLdNTPs(10mmol/L)，2.5μL甜菜碱(10mol/L)，1μL Bst 2.0DNA聚合酶(8U/μL)，2μL DNA模板，1μL钙黄绿素，8μL ddH2O；
反应条件：将配备好的反应体系于60℃恒温水浴扩增60min，再80℃使所述Bst2.0DNA聚合酶失活。
检测结果判定：
1)直接目测法：直接观察反应混合液中是否显示绿色，显示绿色，则为阳性结果，未显示绿色，则为阴性结果；
当污染样品中志贺氏菌的浓度为101、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL(即稀释倍数依次为107、106、105、104、103、102、101、100倍)时，对应的检测管明显显示荧光绿色，即为检测阳性；当污染样品中志贺氏菌的浓度为100CFU/mL(即稀释倍数为108倍)时，对应的检测管仍为反应前的浅橘红色，即为检测阴性；
2)琼脂糖凝胶电泳法：分别取5μL的扩增产物，在30g/L琼脂糖凝胶中电泳，电压100V，时间30min，置于凝胶成像系统照相，出现梯度条带，则为阳性结果，未出现梯度条带，则为阴性结果；
经琼脂糖凝胶电泳检测志贺氏菌的浓度为101-108CFU/mL(即稀释倍数依次为107、106、105、104、103、102、101、100倍)的污染样品对应的扩增产物，显示出明显的梯状条带，则为检测阳性。
注：选用的脱脂奶粉样品均已用FDA推荐的传统方法证明不含志贺氏菌。
实施例2
一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，其与实施例1的区别在于：
S3、样品的LAMP检测：
反应条件：将配备好的反应体系于61℃恒温水浴扩增60min，再80℃使所述Bst2.0DNA聚合酶失活。
其余过程同实施例1。
检测结果判定：
当污染样品中志贺氏菌的浓度为101、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL(即稀释倍数依次为107、106、105、104、103、102、101、100倍)时，对应的检测管明显显示荧光绿色，即为检测阳性；当污染样品中志贺氏菌的浓度为100CFU/mL(即稀释倍数为108倍)时，对应的检测管仍为反应前的浅橘红色，即为检测阴性；
经琼脂糖凝胶电泳检测志贺氏菌的浓度为101-108CFU/mL(即稀释倍数依次为107、106、105、104、103、102、101、100倍)的污染样品对应的扩增产物，显示出明显的梯状条带，则为检测阳性。
实施例3
一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，其与实施例1的区别在于：
S3、样品的LAMP检测：
反应条件：将配备好的反应体系于62℃恒温水浴扩增60min，再80℃使所述Bst2.0DNA聚合酶失活。
其余过程同实施例1。
检测结果判定：
当污染样品中志贺氏菌的浓度为101、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL(即稀释倍数依次为107、106、105、104、103、102、101、100倍)时，对应的检测管明显显示荧光绿色，即为检测阳性；当污染样品中志贺氏菌的浓度为100CFU/mL(即稀释倍数为108倍)时，对应的检测管仍为反应前的浅橘红色，即为检测阴性；
经琼脂糖凝胶电泳检测志贺氏菌的浓度为101-108CFU/mL(即稀释倍数依次为107、106、105、104、103、102、101、100倍)的污染样品对应的扩增产物，显示出明显的梯状条带，则为检测阳性。
实施例4
一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，其与实施例1的区别在于：
S3、样品的LAMP检测：
反应条件：将配备好的反应体系于63℃恒温水浴扩增60min，再80℃使所述Bst2.0DNA聚合酶失活。
其余过程同实施例1。
检测结果判定：
当污染样品中志贺氏菌的浓度为101、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL(即稀释倍数依次为107、106、105、104、103、102、101、100倍)时，对应的检测管明显显示荧光绿色，即为检测阳性；当污染样品中志贺氏菌的浓度为100CFU/mL(即稀释倍数为108倍)时，对应的检测管仍为反应前的浅橘红色，即为检测阴性；
经琼脂糖凝胶电泳检测志贺氏菌的浓度为101-108CFU/mL(即稀释倍数依次为107、106、105、104、103、102、101、100倍)的污染样品对应的扩增产物，显示出明显的梯状条带，则为检测阳性。
实施例5
一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，其与实施例1的区别在于：
S3、样品的LAMP检测：
反应条件：将配备好的反应体系于64℃恒温水浴扩增60min，再80℃使所述Bst2.0DNA聚合酶失活。
其余过程同实施例1。
检测结果判定：
当污染样品中志贺氏菌的浓度为101、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL(即稀释倍数依次为107、106、105、104、103、102、101、100倍)时，对应的检测管明显显示荧光绿色，即为检测阳性；当污染样品中志贺氏菌的浓度为100CFU/mL(即稀释倍数为108倍)时，对应的检测管仍为反应前的浅橘红色，即为检测阴性；
经琼脂糖凝胶电泳检测志贺氏菌的浓度为101-108CFU/mL(即稀释倍数依次为107、106、105、104、103、102、101、100倍)的污染样品对应的扩增产物，显示出明显的梯状条带，则为检测阳性。
实施例6
一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，其与实施例1的区别在于：
S3、样品的LAMP检测：
反应条件：将配备好的反应体系于65℃恒温水浴扩增60min，再80℃使所述Bst2.0DNA聚合酶失活。
其余过程同实施例1。
检测结果判定：
当污染样品中志贺氏菌的浓度为101、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL(即稀释倍数依次为107、106、105、104、103、102、101、100倍)时，对应的检测管明显显示荧光绿色，即为检测阳性；当污染样品中志贺氏菌的浓度为100CFU/mL(即稀释倍数为108倍)时，对应的检测管仍为反应前的浅橘红色，即为检测阴性；
经琼脂糖凝胶电泳检测志贺氏菌的浓度为101-108CFU/mL(即稀释倍数依次为107、106、105、104、103、102、101、100倍)的污染样品对应的扩增产物，显示出明显的梯状条带，则为检测阳性。
对比例1
采用常规PCR技术检测奶粉中的志贺氏菌，包括以下步骤：
S1、采用的PCR引物为：
F：GTTCCTTGACCGCCTTTCC，R：GAGGGTTTTCCGGAGATTGT；
S2、DNA模板的制备同实施例1的步骤S2；
S3、样品的PCR检测：
反应体系(20μL)：1μLDNA模板，0.3μL TaqDNA聚合酶(5U/μL)，2μL 10×TaqBuffer(含Mg2+)，0.5μLdNTP混合物(各2.5mmol/L)，各0.5μL引物(25pmol/μL)，15.2μL灭菌蒸馏水；
反应条件：95℃预变性5min，94℃变性60s，58℃退火60s，72℃延伸35s，35个循环，72℃延伸10min；
检测结果判定：分别取5μL的扩增产物，在30g/L琼脂糖凝胶中电泳，电压100V，时间30min，置于凝胶成像系统照相，出现梯度条带，则为阳性结果，未出现梯度条带，则为阴性结果。
对比例2
采用传统检测方法检测奶粉中的志贺氏菌，包括以下步骤：
具体参照GB/T4789.5-2012，进行增菌、分离、初步生化试验、生化试验以及血清学鉴定。
效果试验例1
本发明LAMP反应条件的优化：
将实施例1-6在不同反应温度(60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃)下得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳：分别取5μL的扩增产物，在30g/L琼脂糖凝胶中电泳，电压100V，时间30min，置于凝胶成像系统照相，结果如图2所示，其中，1为阴性对照，2-7依次为实施例1-6的电泳结果。
由图2可以看出，在63℃的反应温度下，等温扩增效率最高。
效果试验例2
本发明LAMP检测方法的特异性试验：
选取5株志贺氏菌标准菌株和11株非志贺氏菌标准菌株，分别制备其DNA模板样品，通过实施例1的方法进行测试，其中每份标准菌株DNA样品采用3个平行测试，经观察颜色变化判断检测结果，呈荧光绿色为阳性，浅橘红色为阴性，结果如表1所示。
表1特异性检测结果
由表1可以看出，本发明的LAMP检测方法对志贺氏菌具有特异性。
效果试验例3
本发明的LAMP检测方法与常规PCR检测方法的灵敏度对比：
将实施例1所得扩增产物与对比例1所得扩增产物分别经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3、4所示，图3为实施例1的结果图，图4为对比例1的结果图。
由图3、4可以看出，实施例1的稀释倍数为100-107倍时，显示出明显的梯状条带，对比例1只有在稀释倍数为100-105倍时，显示出较为明显的产物条带；可见，经比较LAMP检测灵敏度比常规PCR检测高出2个数量级，LAMP检测限达到1.0×101CFU/mL。
效果试验例4
本发明的LAMP检测方法与传统检测方法的准确度对比：
将实施例1的LAMP检测方法的检测结果与对比例2的传统检测方法的检测结果进行对比，从中山市不同超市采集10种不同的脱脂奶粉各10份及10份人工污染样品进行检测，其中，检测准确度＝(LAMP检测方法和传统检测方法均为阳性结果例数+LAMP检测方法和传统检测方法均为阴性结果例数)/被检样品例数×100％，即表示该LAMP检测方法和传统检测方法的一致性，结果如表2所示。
表2所有样品的LAMP检测方法和传统方法的检测结果
由表2可以看出，通过对110份样品进行检测，结果显示二者的检测结果具有较高的一致性，LAMP检测方法的检测准确度为99.09％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
序列表
<110> 中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccgcgacac gttccctcta ttgtcagtac gcttcgcc 38
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgccgatttg aaggccggta caccgtggtc cgttctgaa 39
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actctcccag tgtgctttga t 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cttttcgtga aaaattgaaa 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tggcatgctt tgaacagata a 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tattgagttc gttctaatca act 23

Claims (10)

1.一种环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、环介导等温扩增技术(LAMP)引物的设计与合成：
根据志贺氏菌ipaH基因(GenBank登录号：HE616529.1)，并用生物学在线软件分析该基因的保守核苷酸序列，针对ipaH基因的保守区域，结合环介导等温扩增方法的引物设计原则，利用Primer Explorer V4在线引物设计软件筛选并合成LAMP引物：内引物FIP/BIP、外引物F3/B3、环引物LF/LB；
S2、DNA模板的制备：
制备志贺氏菌菌液，人工污染脱脂奶粉样品，将污染样品梯度稀释，采用热裂解法提取细菌基因组，得到不同浓度的DNA模板溶液；
S3、样品的LAMP检测：
取步骤S2所得不同浓度的DNA模板分别加入步骤S1所得内引物FIP/BIP、外引物F3/B3、环引物LF/LB在LAMP反应体系及反应条件下进行扩增，分别取扩增产物通过直接目测法或琼脂糖凝胶电泳法，判断结果。
2.根据权利要求1所述的环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，其特征在于，步骤S1所得LAMP引物包括：内引物FIP为TCCGCGACACGTTCCCTCTATTGTCAGTACGCTTCGCC，内引物BIP为TGCCGATTTGAAGGCCGGTACACCGTGGTCCGTTCTGAA，外引物F3为ACTCTCCCAGTGTGCTTTGAT，外引物B3为CTTTTCGTGAAAAATTGAAA，环引物LF为TGGCATGCTTTGAACAGATAA，环引物LB为TATTGAGTTCGTTCTAATCAACT。
3.根据权利要求1所述的环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，其特征在于，步骤S2包括：将志贺氏菌接种于R&F志贺氏菌属显色培养基，37℃培养16-24h，再挑取单菌落于LB培养液中，37℃、200r/min条件下，振荡培养16-48h，得到所述志贺氏菌菌液。
4.根据权利要求3所述的环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，其特征在于，步骤S2包括：将所得志贺氏菌菌液接种到脱脂奶粉样品中，10倍梯度稀释所述污染样品，使所述污染样品中志贺氏菌的浓度依次为100、101、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL，再分别取1.0mL所述污染样品，10000-12000r/min离心2-5min，灭菌蒸馏水洗涤两次，再用300μL TE缓冲液悬浮，隔水煮沸10-20min，8000-10000r/min离心10-20min，取上清液，得到不同浓度的所述DNA模板溶液。
5.根据权利要求1所述的环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，其特征在于，步骤S3包括：所述LAMP反应体系(25μL)为：2.5μL 10×ThermoPol缓冲液，1.5μL MgSO4，3μL引物，3.5μL dNTPs，2.5μL甜菜碱，1μL Bst 2.0DNA聚合酶，2μL DNA模板，1μL钙黄绿素，8μL ddH2O。
6.根据权利要求5所述的环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，其特征在于：3μL所述引物包括1μL的20μmol/L内引物FIP/BIP、1μL的10μmol/L外引物F3/B3、1μL的15μmol/L环引物LF/LB。
7.根据权利要求5所述的环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，其特征在于，步骤S3包括：所述LAMP反应条件为：将配备好的所述LAMP反应体系于60-65℃恒温水浴扩增30-60min，再75-85℃使所述Bst 2.0DNA聚合酶失活。
8.根据权利要求1所述的环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，其特征在于，步骤S3包括：所述LAMP反应条件为：将配备好的所述LAMP反应体系于63℃恒温水浴扩增60min，再80℃使所述Bst 2.0DNA聚合酶失活。
9.根据权利要求1所述的环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，其特征在于，步骤S3包括：直接观察反应混合液中是否显示绿色，显示绿色，则为阳性结果，未显示绿色，则为阴性结果。
10.根据权利要求1所述的环介导等温扩增技术检测奶粉中志贺氏菌的方法，其特征在于，步骤S3包括：分别取5μL的所述扩增产物，在30g/L琼脂糖凝胶中电泳，电压100V，时间30min，置于凝胶成像系统照相，出现梯度条带，则为阳性结果，未出现梯度条带，则为阴性结果。
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