CN103421898A - 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。本发明根据nuc、mecA和femA基因序列分别设计引物和探针，利用该检测引物和检测探针按照本发明的方法对样品进行三重实时荧光PCR检测，在一次扩增反应中完成对待测样品的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性检测，从而简便、快速、准确的对待检样品中是否含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行判断。按照本发明的方法对样品进行三重实时荧光PCR检测，检测快速，8-10小时可以完成从制备样品到出具检测结果的过程，不受假阳性和交叉污染等干扰，结果可靠，且灵敏度高、特异性强，为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行流行病学调查提供了有利工具。

Description

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Meth icillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的三重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。
背景技术：
Jevons于1961年在英国首次报道了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Meth icil lin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)，现成为全球性的病原微生物，与乙型肝炎、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)同时列为世界上最难解决的三大感染性顽症。目前MRSA耐药检测常用的方法有纸片扩散法、肉汤稀释法、琼脂筛选法、分子生物学诊断方法等。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Meth icil lin-resistant S taphylococcus aureus,MRSA)及耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(Methicillin-resistant coagulase-nega tive staphy lococci,MRCNS)现已成为医院和社区感染的常见病原菌，发病率有逐年上升趋势。mecA(Methicillin determ inantA)是MRSA的耐药决定基因，编码与β-内酰胺类抗生素亲和力极低的PBP2a，促进细菌胞壁合成而耐药，现已明确mecA基因只存在于葡萄球菌中，位于一个由不同整合子、转座子等组成的可移动元件上，因此，mecA基因可作为耐甲氧西林葡萄球菌的分子标志，但mecA基因存在于所有耐甲氧西林葡萄球菌中，且特异和保守，所以只检测mecA基因不能确定为MRSA。femA是甲氧西林耐药的辅助基因，femA插入失活，将导致β-内酰胺类抗生素敏感性上升，femA基因可用于MRSA与MRCNS间鉴别。Francois等将拭子标本中的MRSA增菌后，采用实时荧光PCR方法分别扩增目标FemA和mecA基因，用于鉴定样本中是否含有MRSA，方法的灵敏度优于CLSI推荐方法。耐热核酸酶nuc是金黄色葡萄球菌的特异性酶，通过编码耐热核酸酶的nuc基因的特异扩增可鉴定金黄色葡萄球菌有非常好的特异性。
发明内容：
本发明的目的是提供一种快速、可靠、灵敏度高、特异性强的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法，通过一次反应就能完成耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性检测，还可检测MRCNS及甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌。
本发明的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：
针对nuc基因：5`-GATACACCTGAAACAAAGCATCC-3`；（如SEQ ID NO.1所示）
5`-GACCTTTGTCAAACTCGACTTC-3`；（如SEQ ID NO.2所示）
针对mecA基因：5`-GAAGGTGTGCTTACAAGTGC-3`；（如SEQ ID NO.3所示）
5`-TCAACTAACTATTGATGCTAAAGTTCAA-3`；（如SEQ ID NO.4所示）
针对femA基因：5`-GCCACTATGAGTTAAAGCTTGC-3`；（如SEQ ID NO.5所示）
5`-TCACTGGACCGCGATTTG-3`；（如SEQ ID NO.6所示）
本发明的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：
nuc基因的探针：5`-AGGTGTAGAGAAATATGGCCCTGAAGC-3`；（如SEQ ID NO.7所示）
mecA基因的探针：5`-TTATGGCTCAGGTACTGCTATCCACCC-3`；（如SEQ ID NO.8所示）
femA基因的探针：5`-ACGAGGTCATTGCAGCTTGCTTACT-3`；（如SEQ ID NO.9所示）
探针的5`端标记有荧光报告基团，3`端标记有荧光淬灭基团，三探针的5`端标记的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。
所述的荧光报告基团优选为TET、HEX或FAM，所述的荧光淬灭基团优选为BHQ1。
本发明的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，
所述的检测引物包括三对：
针对nuc基因：5`-GATACACCTGAAACAAAGCATCC-3`；（如SEQ ID NO.1所示）
5`-GACCTTTGTCAAACTCGACTTC-3`；（如SEQ ID NO.2所示）
针对mecA基因：5`-GAAGGTGTGCTTACAAGTGC-3`；（如SEQ ID NO.3所示）
5`-TCAACTAACTATTGATGCTAAAGTTCAA-3`；（如SEQ ID NO.4所示）
针对femA基因：5`-GCCACTATGAGTTAAAGCTTGC-3`；（如SEQ ID NO.5所示）
5`-TCACTGGACCGCGATTTG-3`；（如SEQ ID NO.6所示）
所述的检测探针包括：
nuc基因的探针：5`-AGGTGTAGAGAAATATGGCCCTGAAGC-3`；（如SEQ ID NO.7所示）
mecA基因的探针：5`-TTATGGCTCAGGTACTGCTATCCACCC-3`；（如SEQ ID NO.8所示）
femA基因的探针：5`-ACGAGGTCATTGCAGCTTGCTTACT-3`；（如SEQ ID NO.8所示）
探针的5`端标记有荧光报告基团，3`端标记有荧光淬灭基团，三探针的5`端标记的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。
本发明的非疾病的诊断和治疗目的的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（5）对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板；
（6）使用上述针对nuc基因、mecA基因和femA基因的检测引物及其检测探针，与实时荧光PCR扩增用的反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；
（7）将扩增反应体系在荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录各检测样品的PCR扩增循环次数（Ct）；
（8）根据各样品的Ct值，按照建立的判断标准，判断样品中是否含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
所述的步骤（2）的扩增反应体系优选为：
模板DNA 4μL
10×TaqMan缓冲液 5μL
5mmol/L MgCl2 2μL
2.5mmol/L dNTPs 3μL
20μmol/L TaqMan探针 三种探针各1μL（共3μL）
20μmol/L检测引物 六条引物各1μL（共6μL）
0.55U UNG酶 0.2μL
2.5U/μL Taq聚合酶 3μL
去离子水 3.8μL
所述步骤（3）的进行实时荧光PCR反应，其反应参数优选为：95℃30s、95℃5s、60℃30s、40个循环。结果判断标准：如果出现待测基因的扩增反应曲线，且Ct值小于35，则判断为阳性，如果35<Ct<37，判断为可疑，可以加大模板量，重复扩增，如果得到相同的实验结果，则判断为阳性，否则为阴性，如果Ct值为0或37，则判断为阴性。
本发明根据nuc、mecA和femA基因序列分别设计引物和探针，建立了基于Taqman探针三重荧光PCR检测MRSA的方法。试验结果显示，MRSA扩增出nuc、mecA和femA基因，而14株表皮葡萄球菌等对照菌株未扩增出上述基因。基于TaqMan探针的最佳荧光PCR扩增体系，扩增效率应在90%～105%之间，线性关系数R2在0.98以上。本发明建立的三重荧光PCR扩增体系，nuc、mecA和femA的扩增效率均在90%以上，线性关系数R2均超过0.99，表明设计的引物和探针特异性强、体系的优化效果也较佳，而且能检测MRSA，也可检测MRCNS及甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌。
本发明根据nuc、mecA和femA基因序列分别设计引物和探针，采用blast分析扩增产物的序列特异性，以保证无同源或序列一致性生物基因信息，并充分考虑能否在同一体系中扩增三个靶基因的特异性序列，而进行精心优化和反复测试而获得本发明的检测引物和检测探针，利用该检测引物和检测探针按照本发明的方法对样品进行三重实时荧光PCR检测，在一次扩增反应中完成对待测样品的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性检测，从而简便、快速、准确的对待检样品中是否含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行判断。以本发明的检测引物及探针按照本发明的方法对样品进行三重实时荧光PCR检测，检测快速，8-10小时可以完成从制备样品到出具检测结果的过程，不受假阳性和交叉污染等干扰，结果可靠，且灵敏度高、特异性强，为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行流行病学调查提供了有利工具。适合于食品和水的检验、疾病控制中心、质量监督部门使用。
附图说明：
图1是实施例1的MRSA样品Nuc、mecA、femA基因三重荧光PCR扩增图；
图2是实施例1的MRSA梯度稀释三重荧光PCR扩增图，6：2.2×107cfu/mL，5：2.2×106cfu/mL，4：2.2×105cfu/mL，3：2.2×104cfu/mL，2：2.2×103cfu/mL，1：2.2×102cfu/mL。
具体实施方式：
以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
一、引物和探针的设计和合成。
根据GenBank公布的金黄色葡萄球菌nuc gene(GenBank:EF529607.1)、mecA gene(GenBank:JN108029.1)和femA gene(GenBank:DQ352463.1)，用NCBI上的BLAST功能和DNAman软件反复比对，再用Oligo5.0软件设计引物和TaqMan探针，委托宝生物工程（大连）有限公司合成，引物和探针序列见表1。
表1：荧光PCR引物和探针序列
Figure BDA00003640240100061
Figure BDA00003640240100071
nuc探针5`端标记TET、mecA探针5`端标记HEX、femA探针5`端标记FAM，3端标记有荧光淬灭基团BHQ1。
实施例1：
将MRSA标准菌株ATCC33591接种到质量分数7.5%胰蛋白胨大豆肉汤，37℃震荡培养过夜。取2mL培养物，12000r/min离心3min去上清，用1mL去离子水漂浮沉淀，12000r/min离心2min去上清，重复两次，最后加200μL去离子水在核酸提取仪上提取DNA用于荧光PCR扩增。
实时荧光PCR扩增体系：反应体系30μl，模板DNA4μl、10×TaqMan缓冲液5μl、5mmol/LMgCl22μl、2.5mmol/L dNTPs3μl、TaqMan探针20μmol/l各1μl（包括femA、mecA、nuc基因的探针各1μl，共3μl）、引物20μmol/l各1μl（包括femA、mecA、nuc基因的检测引物共6条引物，共6μl）、UNG酶0.55U0.2μl、Taq聚合酶2.5U/μl3μl、去离子水3.8μl。实时荧光PCR反应参数为95℃30s、95℃5s、60℃30s、40个循环。
检测结果如图1所示，从图1中可以看出，经本实施例的实时荧光PCR扩增，同时出现了femA、mecA、nuc基因扩增曲线，femA、mecA、nuc三个扩增曲线指数期明显，扩增曲线之间互不干扰，ct值为小于35，则判断为阳性，表明测试菌株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，这与MRSA标准菌株ATCC33591的本身性质是相符的。由此表明本发明的测试方法是可行的。
经平板菌落计数，原始浓度为2.2×107cfu/mL的MRSA标准菌株ATCC33591培养液，进行10倍梯度稀释,从每个稀释度中取1mL培养液，按照上述方法提取DNA，并且按照上述方法中的三重荧光PCR反应体系进行荧光PCR扩增。实时荧光PCR仪上选择标准品模式，仪器自动绘制标准曲线。每个稀释液均用平板分离法进行对照。
结果如图2和表2所示，MRSA初始模板浓度与Ct值之间也出现良好的线性关系，femA、mecA、nuc的线性系数为别为0.999、0.994、0.998，扩增效率分别为104%、90.3%、98%，最低检测浓度达到220cfu/mL（图2、表2）。表明设计的引物和探针特异较高，扩增体系优化效果也较佳。
表2：三重荧光PCR扩增体系评价
Figure BDA00003640240100081
二、特异性实验
1、特异性实验1：
阴性对照菌株14株，分别为表皮葡萄球菌AT CC14990、肺炎克雷伯氏菌CMCC46102、粪链球菌ATCC2921、阪崎肠杆菌ATCC29544、大肠杆菌ATCC25922、伤寒沙门氏菌CMCC50071、鲍氏志贺氏菌CMCC51582、宋内氏志贺氏菌CMCC51334、痢疾志贺氏菌NICPBP51252、福氏志贺氏菌NICPBP51571、小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC52221、假结核耶尔森氏菌CMCC53510、单增李斯特氏菌ATCC19115、藤黄微球菌CMCC2800，购自中国食品药品检定所、中国普通微生物菌种保藏中心。所有菌株经VITEK2进行确证。
分别参照实施例1的方法对上述菌株提取DNA，再进行三重实时荧光PCR扩增。
实时荧光PCR扩增体系：反应体系30μl，模板DNA4μl、10×TaqMan缓冲液5μl、5mmol/LMgCl22μl、2.5mmol/L dNTPs3μl、TaqMan探针20μmol/l各1μl（包括femA、mecA、nuc基因的探针各1μl，共3μl）、引物20μmol/l各1μl（包括femA、mecA、nuc基因的检测引物共6条引物，共6μl）、UNG酶0.55U0.2μl、Taq聚合酶2.5U/μl3μl、去离子水3.8μl。实时荧光PCR反应参数为95℃30s、95℃5s、60℃30s、40个循环。
结果显示上述14株阴性对照菌株扩增结果阴性。
2、特异性实验2：
临床分离的金黄色葡萄球菌9株，由华南理工大学食品学院赠送；不同食品中分离的金黄色葡萄球菌60株，是中国检验检疫科学研究院食品所和广东检验检疫技术中心保存菌株。所有菌株经VITEK2进行确证。
分别参照实施例1的方法对上述菌株提取DNA，再进行三重实时荧光PCR扩增。
实时荧光PCR扩增体系：反应体系30μl，模板DNA4μl、10×TaqMan缓冲液5μl、5mmol/LMgCl22μl、2.5mmol/L dNTPs3μl、TaqMan探针20μmol/l各1μl（包括femA、mecA、nuc基因的探针各1μl，共3μl）、引物20μmol/l各1μl（包括femA、mecA、nuc基因的检测引物共6条引物，共6μl）、UNG酶0.55U0.2μl、Taq聚合酶2.5U/μl3μl、去离子水3.8μl。实时荧光PCR反应参数为95℃30s、95℃5s、60℃30s、40个循环。
结果显示，9株临床分离的金黄色葡萄球菌扩增出femA、mecA和nuc扩增曲线，60株食源性分离的金黄色葡萄球菌扩增出femA和nuc扩增曲线，未扩增出mecA基因。69株分离株中femA、nuc基因阳性率为100%，mecA基因阳性率为13.04%。
采用NCCLS推荐的琼脂平皿对倍稀释法。MIC判定标准参照NCCLS2004常规标准,MIC≤2ug/mL为甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(methicillin-sensitive Staphylococcus aureua,MSSA)，苯唑西林MIC≥4ug/mL者为甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌(methicillin-r esistantStaphylococcus aureus,MRSA)，其中MIC≥64ug/mL者为高耐菌株。
苯唑西林药敏结果，69株金黄色葡萄球菌分离株中，9株临床分离的金黄色葡萄球菌MIC值在23.70ug/mL～97.10ug/mL，60株食源性分离的金黄色葡萄球菌MIC值在0.03～0.25ug/mL之间。因此,耐甲氧西林的基因mecA与耐甲氧西林表型表型符合率为100%。这个结果也与利用本发明的检测方法检测的结果一致。
Figure IDA00003640241000011
Figure IDA00003640241000021
Figure IDA00003640241000031

Claims (7)

1.一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：
针对nuc基因：5`-GATACACCTGAAACAAAGCATCC-3`；
5`-GACCTTTGTCAAACTCGACTTC-3`；
针对mecA基因：5`-GAAGGTGTGCTTACAAGTGC-3`；
5`-TCAACTAACTATTGATGCTAAAGTTCAA-3`；
针对femA基因：5`-GCCACTATGAGTTAAAGCTTGC-3`；
5`-TCACTGGACCGCGATTTG-3`。
2.一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：
nuc基因的探针：5`-AGGTGTAGAGAAATATGGCCCTGAAGC-3`；
mecA基因的探针：5`-TTATGGCTCAGGTACTGCTATCCACCC-3`；
femA基因的探针：5`-ACGAGGTCATTGCAGCTTGCTTACT-3`；
探针的5`端标记有荧光报告基团，3`端标记有荧光淬灭基团，三探针的5`端标记的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。
3.根据权利要求2所述的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的荧光报告基团为TET、HEX或FAM，所述的荧光淬灭基团为BHQ1。
4.一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，
所述的检测引物包括三对：
针对nuc基因：5`-GATACACCTGAAACAAAGCATCC-3`；
5`-GACCTTTGTCAAACTCGACTTC-3`；
针对mecA基因：5`-GAAGGTGTGCTTACAAGTGC-3`；
5`-TCAACTAACTATTGATGCTAAAGTTCAA-3`；
针对femA基因：5`-GCCACTATGAGTTAAAGCTTGC-3`；
5`-TCACTGGACCGCGATTTG-3`；
所述的检测探针包括：
nuc基因的探针：5`-AGGTGTAGAGAAATATGGCCCTGAAGC-3`；
mecA基因的探针：5`-TTATGGCTCAGGTACTGCTATCCACCC-3`；
femA基因的探针：5`-ACGAGGTCATTGCAGCTTGCTTACT-3`；
探针的5`端标记有荧光报告基团，3`端标记有荧光淬灭基团，三探针的5`端标记的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。
5.一种非疾病的诊断和治疗目的的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板；
（2）使用权利要求1所述的针对nuc基因、mecA基因和femA基因的检测引物和权利要求2所述的针对nuc基因、mecA基因和femA基因的检测探针，与实时荧光PCR扩增用的反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；
（3）将扩增反应体系在荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录各检测样品的PCR扩增循环次数（Ct）；
（4）根据各样品的Ct值，按照建立的判断标准，判断样品中是否含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤（2）的扩增反应体系为：
模板DNA 4μL 10×TaqMan缓冲液 5μL 5mmol/L MgCl2 2μL 2.5mmol/L dNTPs 3μL 20μmol/L TaqMan探针 三种探针各1μL（共3μL） 20μmol/L检测引物 六条引物各1μL（共6μL） 0.55U UNG酶 0.2μL 2.5U/μL Taq聚合酶 3μL 去离子水 3.8μL
。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）的进行实时荧光PCR反应，其反应参数为：95℃30s、95℃5s、60℃30s、40个循环。
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