CN106222248A - 一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的引物、探针、方法及试剂盒 - Google Patents

一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的引物、探针、方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，公开了一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的引物、探针、方法及试剂盒，采用Taqman探针实时荧光PCR法，分别针对femA、mecA核酸保守区设计引物和荧光标记探针，2个基因探针5’端均标记荧光报告基团FAM，3’端均标记荧光淬灭基团TAMRA。引物、探针配成PCR检测混合液后，加入酶与样本核酸，选用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，通过荧光信号的变化实现目的基因的检测。本试剂盒具有准确率高、特异性强、灵敏度高的特点，能够对临床样本中的金黄色葡萄球菌及MRSA进行快速、准确检测。

Description

一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的引物、探 针、方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的引物、探针、方法及试剂盒。
背景技术
近年来，金黄色葡萄球菌感染率呈不断上升的趋势，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus，MRSA)耐药性亦逐渐加强，其中MRSA位居院内感染病原菌之首。MRSA呈现高度耐药性和多重耐药性，除糖肽类抗生素外，对其他抗生素广泛耐药。目前MRSA感染与乙型病毒性肝炎、获得性免疫缺陷综合征被认为是世界上最难解决的三大感染性难题。我国医院MRSA占金葡菌的40％～90％，高发区在烧伤病房、外科病房重症监护病房，多见于皮肤组织、伤口感染，带机呼吸的下呼吸道感染、心内膜炎、菌血症等。因此，加强MRSA检测不仅有利于指导临床用药，而且有利于控制MRSA感染率和耐药率。
目前国内临床上对MRSA检测基本上是先进行分离培养，然后采用常规鉴定方法或法国生物-梅里埃公司的微生物自动鉴定仪鉴定分析，这种检测方法不仅操作繁琐、费时费力、灵敏度较低，重复性差，无法了解抗性引起的分子生物学机制。
发明内容
本发明提供一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的引物、探针、方法及试剂盒，解决现有技术中MRSA检测不仅操作繁琐、费时费力、灵敏度较低，重复性差，无法了解抗性引起的分子生物学机制的技术问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的引物和探针，检测金黄色葡萄球菌特异性基因femA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测金黄色葡萄球菌特异性基因femA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性耐药基因mecA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性耐药基因mecA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。
一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的方法，包括：
样本核酸制备，以获得核酸模板；
分别针对金黄色葡萄球菌特异性基因femA、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性耐药基因mecA设计特异性引物和荧光标记探针，其中，检测金黄色葡萄球菌特异性基因femA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测金黄色葡萄球菌特异性基因femA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性耐药基因mecA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性耐药基因mecA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；
取阳性对照品、阴性对照品置于离心管中，分别加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；
配置酶试剂，其中，所述酶由水生栖热菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)混合组成；
将femA基因核酸PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心处理；将mecA基因核酸PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心处理；
分别取加酶混匀后的PCR检测混合液置于荧光PCR管中，取样本核酸抽提上清液、阴性对照品核酸抽提上清液、阳性对照品核酸抽提上清液加入已有PCR检测混合液的荧光PCR管中，进行荧光PCR扩增，反应条件为：37℃×2min，94℃×2min，循环1次；93℃×15s，60℃×60s，循环40次；单点荧光检测在60℃，并在此采集荧光信号；
采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的试剂盒，包括核酸抽提液、第一引物探针混合液、第二引物探针混合液、PCR反应酶系、阴性对照品、阳性对照品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中，所述第一引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、femA基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成，所述第二引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、mecA基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成；
其中，检测金黄色葡萄球菌特异性基因femA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测金黄色葡萄球菌特异性基因femA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性耐药基因mecA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性耐药基因mecA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。
本发明有益效果为：准确率高，临床试验结果与DNA测序结果总符合率99％以上；特异性强，与痰液和咽拭子中常见致病菌白喉杆菌、流感嗜血杆菌、变形杆菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、酪(铅)黄肠球菌、鹑鸡肠球菌、血链球菌、甲氧西林敏感表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌甲氧西林敏感株、大肠埃希菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯菌、洋葱伯尔德菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌均无交叉反应；灵敏度高，按照质粒拷贝数确定的最低检测限为103copies/mL，按照菌培养法确定的最低检测限为103CFU/mL。本产品用于体外定性检测人痰液和咽拭子样本中金黄色葡萄球菌特异性基因femA和耐甲氧西林基因mecA，为临床确定MRSA感染提供辅助诊断方法，为临床医生用药提供参考。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例四的金黄色葡萄球菌感染样本的荧光定量PCR曲线图；
图2为本发明实施例四的耐甲氧西林表皮葡萄球菌感染样本的荧光定量PCR曲线图；
图3为本发明实施例四的MRSA感染样本的荧光定量PCR曲线图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例一
本发明实施例提供了一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的引物和探针，检测金黄色葡萄球菌特异性基因femA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测金黄色葡萄球菌特异性基因femA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性耐药基因mecA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性耐药基因mecA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；
其中，femA基因设计的特异性引物的序列如下：
上游引物P-femA-F：5’-TCTATACCTACATATCGATCC-3’
下游引物P-femA-R：5’-TTCAAATCCTAAGTTACTCA-3’
针对femA基因的TaqMan荧光标记探针序列如下：
T-femA：5’-FAM-ATTACAGGTAATGCTGGTAATGATTGGTT-TAMRA-3’
针对mecA基因设计的特异性引物的序列如下：
上游引物P-mecA-F：5’-CTGTACTGGGTTAATCAGTA-3’
下游引物P-mecA-R：5’-GAAGATATACCAAGTGATTA-3’
针对mecA基因的TaqMan荧光标记探针序列如下：
T-mecA：5’-FAM-TTGTCCGTAACCTGAATCAGCTAAT-TAMRA-3’
其中，femA、mecA基因探针的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为TAMRA。
实施例二
本发明实施例中又提供了一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的方法，包括：
步骤101、样本核酸制备，以获得核酸模板；
步骤102、分别针对金黄色葡萄球菌特异性基因femA、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性耐药基因mecA设计特异性引物和荧光标记探针；
其中，检测金黄色葡萄球菌特异性基因femA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测金黄色葡萄球菌特异性基因femA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性耐药基因mecA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性耐药基因mecA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；
步骤103、取阳性对照品、阴性对照品置于离心管中，分别加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；
步骤104、配置酶试剂；
其中，所述酶由水生栖热菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)混合组成；
步骤105、将femA基因核酸PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心处理；将mecA基因核酸PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心处理；
步骤106、分别取加酶混匀后的PCR检测混合液置于荧光PCR管中，取样本核酸抽提上清液、阴性对照品核酸抽提上清液、阳性对照品核酸抽提上清液加入已有PCR检测混合液的荧光PCR管中，进行荧光PCR扩增；
反应条件为：37℃×2min，94℃×2min，循环1次；93℃×15s，60℃×60s，循环40次；单点荧光检测在60℃，并在此采集荧光信号
步骤107、采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
其中，检测结果根据CT值进行判定，仪器CT栏显示Undet.(ABI StepOnePlus)或不显示CT值(Eppendorf Mastercycler ep realplex荧光定量PCR检测系统)，表示检测样品低于检测限，报告为阴性；待检样品CT≤35，检测结果报告为阳性；待检样品CT显示在35～40之间，需重复测定，CT显示仍在35～40之间，且扩增曲线呈S型，则判断为阳性；若扩增结果为一直线，则判断为阴性。
本发明采用Taqman探针实时荧光PCR法，在同源性比对金黄色葡萄球菌特异性基因femA、耐甲氧西林基因mecA序列的基础上，选取保守片段分别设计针对这2个基因的特异性引物和特异性的荧光标记探针。探针5’端标记FAM荧光素为荧光报告基团(用R表示)，3’端标记TAMRA荧光素为荧光淬灭基团(用Q表示)，它在近距离内能吸收5’端荧光报告基团发出的荧光信号。PCR反应进入退火阶段时，探针先与模板上的目的基因结合，随后引物与目的基因结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团吸收，仪器检测不到荧光信号；当反应进行到延伸阶段时，Taq DNA聚合酶的5’→3’的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的的荧光信号没被Q基团吸收，检测器能检测到荧光信号。随着PCR反应的进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。通过荧光信号增长曲线，实现目的基因的检测。
实施例三
本发明实施例提供了一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的试剂盒，包括核酸抽提液、第一引物探针混合液、第二引物探针混合液、PCR反应酶系、阴性对照品、阳性对照品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中，所述第一引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、femA基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成，所述第二引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、mecA基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成；
其中，检测金黄色葡萄球菌特异性基因femA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测金黄色葡萄球菌特异性基因femA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性耐药基因mecA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性耐药基因mecA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。
所述核酸抽提液由2％(M/V)Chelex-100、1％(V/V)Tris-HCl，1M，pH8.0组成。
所述第一引物探针混合液由5μL 10×PCR Buffer、4μL25mmol/LMgCl2、3μL2.5mmol/L dN(U)TP、1μL 10μmol/L引物、0.3μL 10μmol/L探针和21.3μL灭菌纯化水组成；所述第二引物探针混合液由5μL 10×PCR Buffer、4μL25mmol/LMgCl2、4μL 2.5mmol/L dN(U)TP、0.8μL 10μmol/L引物、0.1μL 10μmol/L探针和21.9μL灭菌纯化水组成。
PCR反应酶系由5U/μL Taq DNA聚合酶和2U/μL UNG酶按体积比3∶1比例混合组成。
PCR扩增的条件为：37℃×2min，94℃×2min，循环1次；93℃×15s，60℃×60s，循环40次；单点荧光检测在60℃，采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增。
所述阳性对照品为含有灭活的E-femA菌和E-mecA菌的混合液，菌浓度106CFU/mL；阴性对照品为含有灭活的大肠杆菌溶液，菌浓度106CFU/mL，E-femA菌为含有femA基因片段的工程菌，E-mecA菌为合有mecA基因片段的工程菌。
本试剂盒具有准确率高，临床试验结果与DNA测序结果总符合率99％以上；特异性强，与痰液和咽拭子中常见致病菌白喉杆菌、流感嗜血杆菌、变形杆菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、酪(铅)黄肠球菌、鹑鸡肠球菌、血链球菌、甲氧西林敏感表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌甲氧西林敏感株、大肠埃希菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯菌、洋葱伯尔德菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌均无交叉反应；灵敏度高，按照质粒拷贝数确定的最低检测限为103copies/mL，按照菌培养法确定的最低检测限为103CFU/mL。本产品用于体外定性检测人痰液和咽拭子样本中金黄色葡萄球菌特异性基因femA和耐甲氧西林基因mecA，为临床确定MRSA感染提供辅助诊断方法，为临床医生用药提供参考。
实施例四
收集临床样本，经细菌培养鉴定与药敏试验法确定为金黄色葡萄球菌感染、耐甲氧西林表皮葡萄球菌感染、MRSA感染、阴性样本各3例，采用本发明实施例三中的试剂盒进行检测，统计结果符合率。
1、样本核酸制备
(1)咽拭子：取1mL标本，12,000rpm 2min；弃去上清，沉淀中直接加入100μL核酸抽提液，充分混匀，沸水浴10min(误差不超过1min)。12,000rpm 5min，取上清4μL做PCR反应。
(2)痰液：取痰液加入4倍体积的4％NaOH(自备)，摇匀，室温下放置30min液化，取0.5mL样品至1.5mL离心管中，再加入0.5mL 4％NaOH室温放置10min后12,000rpm 5min。沉淀加无菌生理盐水1mL打匀，12,000rpm 5min；在重复洗涤一次。去尽上清，沉淀中直接加入50μL核酸抽提液，充分混匀，沸水浴10min(误差不超过1min)。12,000rpm 5min，取上清4μL做PCR反应。
2、对照品准备
取阳性对照品、阴性对照品各100μL分别置于1.5mL(或0.5mL)离心管中(冻存试剂融解后震荡混匀10s)，分别加入核酸抽提液50μL充分混匀，98℃ 10min，然后12,000rpm5min，取上清4μL做PCR反应。
3、酶试剂配制
取n×36μL耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)耐药基因核酸荧光PCR检测混合液与n×0.4μL酶(Taq+UNG)，震荡混匀数秒，3000rpm离心数秒。取n×36μL金黄色葡萄球菌核酸荧光PCR检测混合液与n×0.4μL酶(Taq+UNG)，震荡混匀数秒，3000rpm离心数秒。
4、加样
分别取上述混合液36μL置于PCR管中，然后将阴性对照品、样本和阳性对照品的处理上清液各4μL分别加入各个已有混合液的PCR管中，盖好管盖，立即进行荧光PCR扩增反应。
5、PCR扩增
反应管置于荧光PCR仪上，推荐循环参数设置：
37℃×2min，94℃×2min，循环1次；93℃×15sec，60℃×60s，循环40次；单点荧光检测在60℃，反应体系为40μL。
荧光通道检测选择：选用FAM通道。
6、结果判定
检测结束后，基线调整取6-15个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品检测荧光曲线的最高点。仪器CT栏显示Undet.(ABI StepOnePlus)或不显示CT值(Eppendorf Mastercycler ep realplex)荧光定量PCR检测系统)，表示检测样品低于检测限，报告为阴性；待检样品CT≤35，检测结果报告为阳性；待检样品CT显示在35～40之间，需重复测定，CT显示仍在35～40之间，且扩增曲线呈S型，则判断为阳性；若扩增结果为一直线，则判断为阴性。
7、检测结果检验
本发明的检测结果与细菌培养鉴定与药敏试验结果一致，荧光PCR检测结果如图1-3所示，图1为金黄色葡萄球菌感染样本的荧光定量PCR曲线图，可见随着PCR反应的进行，femA基因对应的PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系，可判断femA基因为阳性，mecA基因为阴性。图2为耐甲氧西林表皮葡萄球菌感染样本的荧光定量PCR曲线图，可判断mecA基因为阳性，femA基因为阴性。图3为MRSA感染样本的荧光定量PCR曲线图，femA基因和mecA基因均为阳性。
以上对本发明进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (9)

1.一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的引物和探针，其特征在于，检测金黄色葡萄球菌特异性基因femA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测金黄色葡萄球菌特异性基因femA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性耐药基因mecA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性耐药基因mecA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。
2.根据权利要求1所述的检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的引物和探针，其特征在于，femA、mecA基因探针的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为TAMRA。
3.一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的方法，其特征在于，包括：
样本核酸制备，以获得核酸模板；
分别针对金黄色葡萄球菌特异性基因femA、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性耐药基因mecA设计特异性引物和荧光标记探针，其中，检测金黄色葡萄球菌特异性基因femA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测金黄色葡萄球菌特异性基因femA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性耐药基因mecA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性耐药基因mecA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；
取阳性对照品、阴性对照品置于离心管中，分别加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；
配置酶试剂，其中，所述酶由水生栖热菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)混合组成；
将femA基因核酸PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心处理；将mecA基因核酸PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心处理；
分别取加酶混匀后的PCR检测混合液置于荧光PCR管中，取样本核酸抽提上清液、阴性对照品核酸抽提上清液、阳性对照品核酸抽提上清液加入已有PCR检测混合液的荧光PCR管中，进行荧光PCR扩增，反应条件为：37℃×2min，94℃×2min，循环1次；93℃×15s，60℃×60s，循环40次；单点荧光检测在60℃，并在此采集荧光信号；
采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
4.一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的试剂盒，其特征在于，包括核酸抽提液、第一引物探针混合液、第二引物探针混合液、PCR反应酶系、阴性对照品、阳性对照品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中，所述第一引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、femA基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成，所述第二引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、mecA基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成；
其中，检测金黄色葡萄球菌特异性基因femA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测金黄色葡萄球菌特异性基因femA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性耐药基因mecA的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性耐药基因mecA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。
5.根据权利要求4所述的检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的试剂盒，其特征在于，所述核酸抽提液由2％(M/V)Chelex-100、1％(V/V)Tris-HCl，1M，pH8.0组成。
6.根据权利要求4所述的检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的试剂盒，其特征在于，所述第一引物探针混合液由5μL 10×PCR Buffer、4μL25mmol/LMgCl2、3μL2.5mmol/L dN(U)TP、1μL 10μmol/L引物、0.3μL 10μmol/L探针和21.3μL灭菌纯化水组成；所述第二引物探针混合液由5μL 10×PCR Buffer、4μL25mmol/LMgCl2、4μL 2.5mmol/L dN(U)TP、0.8μL 10μmol/L引物、0.1μL 10μmol/L探针和21.9μL灭菌纯化水组成。
7.根据权利要求4所述的检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的试剂盒，其特征在于，PCR反应酶系由5U/μL Taq DNA聚合酶和2U/μL UNG酶按体积比3∶1比例混合组成。
8.根据权利要求4所述的检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的试剂盒，其特征在于，PCR扩增的条件为：37℃×2min，94℃×2min，循环1次；93℃×15s，60℃×60s，循环40次；单点荧光检测在60℃，采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增。
9.根据权利要求4所述的检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含有灭活的E-femA菌和E-mecA菌的混合液，菌浓度106CFU/mL；阴性对照品为含有灭活的大肠杆菌溶液，菌浓度106CFU/mL，E-femA菌为含有femA基因片段的工程菌，E-mecA菌为含有mecA基因片段的工程菌。
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