CN101824470B - 基于ce-sscp的血液病原菌快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于CE-SSCP的血液病原菌快速检测方法，针对血液感染的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和肺炎链球菌的16SrRNA基因的保守区域，设计相应的PCR通用引物并荧光标记，然后采用PCR反应对血液样本中的病原菌进行扩增以及电泳检测，本检测方法所设计的通用引物长度与扩增跨度适宜，与待测血液样本中病原菌模板DNA的互补程度高，使得扩增产物的特异性好，对于不同菌株的同一类细菌皆有良好适用性，本方法重复性好，灵敏度高，能够检测痕量的病原菌基因组DNA，非常适合在临床上广泛应用。

Description

基于CE-SSCP的血液病原菌快速检测方法

技术领域

本发明涉及血液感染病原菌的检测方法，特别涉及一种基于CE-SSCP的血液病原菌快速检测方法。

背景技术

血液感染常发生在免疫功能低下或进行侵入性操作的高危住院患者中，感染后患者中毒症状严重，病死率高，在临床工作中十分棘手。传统对于血液感染病原菌的检测方法主要依靠直接培养后的生化鉴定。此方法需要对每种病原菌进行单独培养和鉴定，所需时间一般为3-5天，耗时较长，而且检测结果受采血剂量、送检时间和用药时机等因素影响较大。

毛细管电泳(CE)是从传统电泳发展而来的新型高效的分析分离技术，因具有分离操作时间短、分离效率高、样品用量少、容剂消耗少、环境污染小、操作自动化程度高以及可用计算机控制实现软件分析等诸多优点而被广泛应用于药物及临床分析。单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，利用空间构象有差异的单链DNA分子在介质中受排阻大小不同，通过毛细管电泳，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开，因为电泳过程中，具有不同序列的DNA分子将会在电泳介质中的不同位置停止迁移。

如今，CE-SSCP(毛细管电泳-单链构象多态性)技术在基因点突筛选、微生物分类、新种类鉴定及分子流行病学等领域广有应用，用于基因点突变筛选、常见病原菌检测已有所报道，但这种CE-SSCP技术的重复性和可信度很大程度上依赖于操作过程中各项指标的选择与设定，比如引物的设计、电泳电压强度等。

因此提供一种能够应用于临床的针对血液感染病原菌的CE-SSCP检测方法，不仅能够快速诊断出血液感染的病原菌而且重复性好、可信度高，就成为了亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种基于CE-SSCP的血液病原菌快速检测方法，利用PCR扩增片段的单链构象多态性(SSCP)将毛细管电泳技术应用于血液感染病原菌检测，不仅能够快速诊断出血液感染的病原菌而且重复性好、可信度高。

本发明所述的基于CE-SSCP的血液病原菌快速检测方法，包括如下步骤：

a.针对待测病原菌16SrRNA基因的保守区域设计通用引物并荧光标记；

所述病原菌包括：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和肺炎链球菌；

所述通用引物序列为：

上游引物：5’-TGGCGGCGTGCCTAATACATG-3’

下游引物：5’-CCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTC-3’；

b.提取待测血液样本细菌基因组DNA以该基因组DNA为模板采用步骤a所得通用引物进行PCR扩增，所得扩增产物进行CE-SSCP分析，得到待测血液样本的CE-SSCP电泳图；

c.将所得待测血液样本的CE-SSCP电泳图与七种病原菌标准菌株的CE-SSCP电泳图进行比对，根据不同病原菌的出峰时间不同检测血液感染病原菌。

进一步，所述七种病原菌标准菌株的CE-SSCP电泳图由如下方法获得：提取七种病原菌标准菌株的基因组DNA并按照步骤b所述条件分别进行PCR扩增和CE-SSCP分析，得到七种病原菌标准菌株基因组DNA的PCR扩增产物的CE-SSCP电泳图；

进一步，所述PCR扩增的循环参数为：

94℃预变性5min；

94℃变性40s，58℃退火45s，72℃延伸40s，共30个循环；

72℃终延伸5min，结束PCR扩增；

进一步，CE-SSCP分析所用筛分介质为POP-7或CAP胶，CE-SSCP分析过程中的电泳参数为：进样电压15.0KV，电泳电压13.0KV，电泳温度35℃。

需要说明的是：本发明中，所述待测血液样本的CE-SSCP电泳图皆表示待测血液样本细菌基因组DNA的PCR扩增产物的CE-SSCP电泳图，所述七种病原菌标准菌株的CE-SSCP电泳图皆表示七种病原菌标准菌株各自基因组DNA的PCR扩增产物的CE-SSCP电泳图。

本发明的有益效果是：

本发明的基于CE-SSCP的血液病原菌快速检测方法针对血液感染的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和肺炎链球菌的16SrRNA基因的保守区域，设计相应通用引物并荧光标记，然后采用PCR反应体系对待测血液样本细菌基因组DNA进行PCR扩增以及CE-SSCP分析，再将待测血液样本的CE-SSCP电泳图与七种病原菌标准菌株的CE-SSCP电泳图进行比对，通过出峰时间不同得到血液感染病原菌的检测结果；本检测方法所设计的通用引物长度与扩增跨度适宜，与待测血液样本中病原菌模板DNA的互补程度高，使得扩增产物的特异性好，对于不同菌株的同一类细菌皆有良好适用性，本方法检测速度快、重复性好，灵敏度高，能够检测样本中痕量的细菌基因组DNA，非常适合在临床上针对所述七种病原菌对血液进行快速检测。

本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。

附图说明

图1七种病原菌标准菌株基因组DNA的PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中M：Marker，1：金黄色葡萄球菌，2：大肠埃希菌，3：铜绿假单胞菌，4：表皮葡萄球菌，5：肺炎克雷伯菌，6：粪肠球菌7：肺炎链球菌，8：空白对照；

图2为7种病原菌标准菌株的CE-SSCP电泳图：A：金黄色葡萄球菌(4082)；B：大肠埃希菌(3999)；C：铜绿假单胞菌(3958)；D：表皮葡萄球菌(4063)；E：肺炎克雷伯菌(3980)；F：粪肠球菌(4166)；G：肺炎链球菌(4220)；

图3七种病原菌总DNA的PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中M：Marker，1：金黄色葡萄球菌，2：大肠埃希菌，3：铜绿假单胞菌，4：表皮葡萄球菌，5：肺炎克雷伯菌，6：粪肠球菌7：肺炎链球菌，8：空白对照；

图4为7种病原菌总DNA的PCR扩增产物的CE-SSCP电泳图，图中横坐标代表出峰时间，纵坐标代表荧光信号强度；

图5为待检测血液样本的CE-SSCP电泳图。

具体实施方式

以下将对本发明的优选实施例进行详细的描述。应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。

本实施例的基于CE-SSCP的血液病原菌快速检测方法，包括如下步骤：

(一)设计金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和肺炎链球菌的通用引物，操作如下：分别查询所述七种病原菌16S rDNA基因的序列，利用ClustalX 1.81软件进行多重序列比对，查找所述7种病原菌的保守区域，然后利用Primer Premier 5.0设计通用引物并进行荧光标记，通用引物序列为：上游引物：5’-FAM-TGGCGGCGTGCCTAATACATG-3’，下游引物：5’-CCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTC-3’；

(二)制作七种病原菌标准菌株的CE-SSCP电泳图，操作如下：

①挑取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和肺炎链球菌的标准菌株，分别用生理盐水稀释至浓度为0.5麦氏单位，然后采用试剂盒(天根生化科技公司产品)并按试剂盒说明提取各标准菌株的基因组DNA；用紫外分光光度计分别测定所得七种病原菌标准菌株基因组DNA的A₂₆₀/A₂₈₀吸光度比值，结果均大于1.8，显示纯度好；

②采用步骤(一)所得通用引物分别对步骤①所得七种病原菌标准菌株的基因组DNA进行PCR扩增并得到七种病原菌基因组DNA的PCR扩增产物，所述PCR扩增的反应体系为25μl体系并包括10×buffer 2.5μl，dNTP(2.5mM)2.5μl，Mg²⁺(25mM)1.5μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.25μl，通用引物的上、下游引物(4μM)各1μl，模板1μl，用灭菌去离子水补足至25μl；PCR扩增的循环参数为：94℃预变性5min，然后94℃变性40s，58℃退火45s，72℃延伸40s，共30个循环，72℃终延伸5min后，结束扩增；

③取七种病原菌标准菌株基因组DNA的PCR扩增产物5μl并分别与1μl上样缓冲液(上样缓冲液中所含组分及相应组分在溶液中的质量分数分别为0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯氰和40％蔗糖)混匀后，在含有溴化乙锭的浓度为1％(W/V)的琼脂糖凝胶上电泳(电压100V，40min)，得到凝胶电泳图-如图1，根据图1可见七种病原菌标准菌株基因组DNA的PCR扩增产物纯度好，未见非特异扩增条带及引物二聚体，所述琼脂糖凝胶中溴化乙锭浓度为0.5μg/ml；

④对步骤②所得的七种病原菌标准菌株基因组DNA的PCR扩增产物进行CE-SSCP分析，操作如下：分别将七种病原菌标准菌株基因组DNA的PCR扩增产物用无菌去离子水稀释20倍后，取1μl稀释液加入9μl去离子甲酰胺，0.5μlNaOH(3M)和0.5μl ROX 500的内参照品，95℃变性5mi n，再迅速置于冰水混合物中10min并得到七种病原菌的分析样品，分析样品的CE-SSCP分析在AB IPrism 3130genetic analyzer上通过软件Gene Mapper完成，最后得到七种病原菌标准菌株的CE-SSCP电泳图，如图2；本实施例中，CE-SSCP分析所用毛细管规格为47cm×50μm，筛分介质为POP-7^TM(ABI分离胶)，当然，所述筛分介质也可以是CAP胶，；CE-SSCP分析的条件如下：进样电压15.0KV，电泳电压13.0KV，电泳温度35℃，分析时FAM荧光分子的最大吸收波长为495nm，最大激发波长为520nm。

(三)对七种病原菌总DNA的PCR扩增结果的准确性进行验证，操作如下：

I.将七种病原菌标准菌株的基因组DNA混合，得病原菌总DNA；

II.以步骤I所得病原菌总DNA作为模板进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系及循环参数均与步骤②相同，得到病原菌总DNA的PCR扩增产物；

III.将所得病原菌总DNA的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳得到凝胶电泳图，如图4，琼脂糖凝胶电泳条件与步骤③相同，根据图4可见病原菌总DNA的PCR扩增产物纯度好；

IV.再对步骤II所得的病原菌总DNA的PCR扩增产物进行CE-SSCP分析，得到病原菌总DNA的PCR扩增产物的CE-SSCP电泳图-如图3；本步骤CE-S SCP分析的操作步骤及条件步骤④相同；

IV.将图2与图3进行比对，可见本发明的检测方法检测结果准确可靠。

(四)待测血液样本中的病原菌检测，操作如下：

(1)取血培养标本0.5ml，加入1.5ml EP管中，加入1ml碱裂解液(所述碱裂解液所含组分及相应组分在溶液中的浓度分别为0.5M NaOH和0.05M柠檬酸钠)并于室温下混合10mi n，得混合物；

(2)步骤(1)所得混合物在4℃、13000g转速下离心5min，弃去上清液后加入0.5mlTris-Hcl(浓度为0.5M，PH＝8.0)，4℃13000g转速下离心5min，弃去上清液后再按照本步骤前述操作重复两次，得沉淀；

(3)将沉淀用0.1ml的Tris-EDTA溶液(Tris-EDTA溶液中所含组分及相应组分在该溶液中的浓度分别为10mM Tris-Hcl和1mM EDTA，PH＝8.0)重悬后于100℃煮沸1h，然后迅速冰浴5min，再煮沸2min，再重复本步骤前述操作2次，最后4℃、13000g转速下离心15min，所得上清液于-20℃保存备用；

(4)从步骤(3)所得上清液中提取待测血液样本的细菌基因组DNA并以该基因组DNA为模板并采用步骤(一)所得通用引物进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系及循环参数与步骤②相同，得待测血液样本细菌基因组DNA的PCR扩增产物；

(5)将步骤(4)所得PCR扩增产物进行CE-SSCP分析并得到待检测血液样本的CE-SSCP电泳图-如图5；本步骤CE-SSCP分析的操作步骤及条件步骤④相同；

(7)将图2与图5进行比对，根据不同病原菌的出峰时间不同检测出血液样本感染病原菌为：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和肺炎链球菌。

常规血液病原菌检测方法一般是将血培养标本送检后，立即放入培养箱培养，显示阳性后，再接种血平板培养18-24h，然后挑取标准菌株进行生化鉴定。相对于常规方法而言，本发明的方法大大提高了检测速度，并且重复性好、检测灵敏度高，能够用于检测痕量的模板DNA，非常适合临床应用。

因模板DNA扩增过程中，扩增循环参数对于扩增产物特异性有着重要影响，变性温度低，或者会因解链不完全而导致PCR扩增失败，或者会造成扩增时间延长，而温度过高会对酶的活性有影响，退火温度与复性温度影响PCR扩增产物特异性，延伸温度的选择影响引物和模板的结合，本实施例设计的PCR扩增的循环参数为：94℃预变性5min；94℃变性40s，58℃退火45s，72℃延伸40s，共30个循环；72℃终延伸5min，PCR扩增结束；使得扩增产物的特异性较高，方法的重复性较好。

本实施例中，CE-SSCP分析过程中的电泳参数为：进样电压15.0KV，电泳电压13.0KV，电泳温度35℃，使DNA分子泳动速率更快，分辨率更高，带型更整齐。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学第一附属医院

<120>基于CE-SSCP的血液病原菌快速检测方法

<160>2

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物

<400>1

tggcggcgtg cctaatacat g    21

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物

<400>2

cccgtaggag  tctggaccgt  gtc    23

Claims (2)

1.一种非诊断目的的基于CE-SSCP的血液病原菌快速检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

a.针对待测病原菌16SrRNA基因的保守区域设计通用引物并荧光标记；

所述病原菌包括：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和肺炎链球菌；

所述通用引物序列为：

上游引物：5’-TGGCGGCGTGCCTAATACATG-3’

下游引物：5’-CCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTC-3’；

b.提取待测血液样本细菌基因组DNA以该基因组DNA为模板采用步骤a所得通用引物进行PCR扩增，所得扩增产物进行CE-SSCP分析，得到待测血液样本的CE-SSCP电泳图；所述PCR扩增的循环参数为：94℃预变性5min；94℃变性40s，58℃退火45s，72℃延伸40s，共30个循环；72℃终延伸5min，结束PCR扩增；所述CE-SSCP分析所用筛分介质为POP-7或CAP胶，CE-SSCP分析过程中的电泳参数为：进样电压15.0KV，电泳电压13.0KV，电泳温度35℃；

c.将所得待测血液样本的CE-SSCP电泳图与七种病原菌标准菌株的CE-SSCP电泳图进行比对，根据不同病原菌的出峰时间不同检测血液感染病原菌。

2.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的基于CE-SSCP的血液病原菌快速检测方法，其特征在于：所述七种病原菌标准菌株的CE-SSCP电泳图由如下方法获得：分别提取七种病原菌标准菌株的基因组DNA并按照步骤b所述条件进行PCR扩增和CE-SSCP分析，得到七种病原菌标准菌株的CE-SSCP电泳图。

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