CN105671141B - 一种基于23S-5S rRNA基因测序谱图分析法的铜绿假单胞菌分型鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于23S‑5S rRNA基因测序谱图分析法的铜绿假单胞菌分型鉴定方法，使用该方法不仅可以准确鉴定铜绿假单胞菌，还可以进行分子分型。针对铜绿假单胞菌的23S‑5S rRNA基因序列设计特异性引物，应用FTA卡‑SYBR Green I荧光PCR直接扩增该片段，再将PCR产物简单稀释后进行测序反应，分析经毛细管电泳后比对测序谱图及数据，没有重叠峰的直接读取序列，以序列比对和详图分析结果获得鉴定及分型结果，采用此方法，铜绿假单胞菌可分成a‑g共7种分子亚型。本发明提供的试剂和方法可对铜绿假单胞菌的23S‑5S rRNA基因进行正确测序，以序列比对和详图分析结果获得最终鉴定及分型结果，结合免费的公共基因数据库检索和7种亚型典型测序谱图，可准确地鉴定这种病原菌并进行分子分型。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种基于23S-5S rRNA基因测序谱图分析法的铜绿假单胞菌分型鉴定方法，可用于这种病原菌的鉴定和分子分型。
【背景技术】
随着分子生物学技术的兴起，使得在分子水平上鉴别细菌的方法更为深入与准确，测序法则是其中之一。原核生物rRNA基因5’端至3’端依次为：5’-16S(1540bp)-ITS-23S(2900bp)-ITS-5S(120bp)-3’。其中，16S rRNA因其含有较多的变异区和保守区，且分子大小适宜，其序列分析作为微生物系统分类的主要依据已得到了广泛的应用，技术已较为成熟，数据库已较为完善，但对于相近种及种内株间的区分力度尚缺。16S-23S rRNA、23SrRNA、5S rRNA等片段虽然均被用于微生物鉴定，但各有优缺点，也并非理想细菌鉴定遗传标记。而目前为止，国内外对23S-5S区间序列在鉴定微生物方面的研究报导寥寥可数，几近空白。铜绿假单胞菌是一种重要的致病菌，为医院感染中的主要致病菌之一。为控制医院感染，有必要对医院感染事件中的致病菌进行溯源，但铜绿假单胞菌的溯源方法不多，操作比较复杂，对基层医疗机构可行性不强。本研究针对铜绿假单胞菌的23S-5S rRNA基因序列设计特异性引物，应用FTA卡-SYBR Green I荧光PCR直接扩增该片段并进行测序，成功进行铜绿假单胞菌进行鉴定和基因分型，可应用于铜绿假单胞菌的同源性分析和分子溯源。
【发明内容】
一种基于23S-5S rRNA基因测序谱图分析法的铜绿假单胞菌分型鉴定方法。使用该方法不仅可以准确鉴定铜绿假单胞菌，还可以进行分子分型。针对铜绿假单胞菌的23S-5S rRNA基因序列设计特异性引物，应用FTA卡-SYBR Green I荧光PCR直接扩增该片段，再将PCR产物简单稀释后进行测序反应，分析经毛细管电泳后比对测序谱图及数据，没有重叠峰的直接读取序列，提交由美国国家生物技术中心(NCBI)网站BLAST在线软件比对以确定细菌种类，有重叠峰的人工辨认重叠起始处往后两种序列各15个bp的测序结果，以序列比对和详图分析结果获得鉴定及分型结果，采用此方法，铜绿假单胞菌可分成a-g共7种分子亚型。
用于铜绿假单胞菌23S-5S rRNA基因测序鉴定法的引物序列
基于上述目的，本发明采用以下具体实施方案：
采用FTA卡核酸保存病原菌核酸、实时荧光PCR技术扩增目标片段，上机进行双脱氧测序。
基于本发明研制的荧光PCR快速测序试剂套装包括下列试剂：
1)FTA卡1片。
2)PCR反应液1管，内装SYBR GREEN荧光PCR反应液，包括Taq酶、dNTP、含Mg2+的Buffer、SYBR GREEN溶液。
3)上下游引物各1管，内装目标序列扩增及测序引物。
4)双脱氧测序试剂一套，包括BigDye Terminator v3.1 Sequencing Buffer(5×),BigDye Mix。
5)测序产物纯化试剂一套，包括XTerminator solution、SAM solution各1管。
6)去离子水1管，内装无DNA酶的灭菌去离子水。
基于本发明建立的基于荧光PCR的快速测序方法，按下列步骤进行：
1)FTA样品卡的制备
细菌悬液经适当稀释后(大约6×104至6×107CFU/mL)，吸取100ul滴于FTA卡上，室温晾干备用。
2)SYBR Green实时荧光PCR直接扩增目标片段
配制反应体系：按常规配制SYBR Green实时荧光PCR反应体系，加入上下游引物的终浓度均为100ng/uL，用打孔器在FTA卡打出直径0.5mm的纸片加入体系，终体积为20uL。荧光PCR直接扩增：使用荧光定量PCR仪进行扩增，扩增反应条件为，95℃2min，[95℃10s，51℃20S，72℃40S(荧光采集)]35次循环，72℃10min。PCR扩增效果评价：荧光PCR产物合格的标准为Cp(或Ct)值小于30且熔解曲线显示有一个或多个明显主峰为合格，没有峰或全部峰Tm值<76℃为扩增产物不合格。
3)测序PCR反应
如果荧光PCR扩增产物合格，将PCR产物依据Cp值大小稀释5-10倍，取已稀释的产物1ul置于PCR管中，再加4ul BigDye Terminator v3.1 Sequencing Buffer(5×),测序引物(上游或下游引物)的终浓度为100ng/uL，终体积为10uL，使用梯度PCR仪进行扩增。扩增条件为：98℃2min，(96℃10S，50℃5s，60℃4min)25次循环。
4)产物纯化、毛细管电泳和序列读取、分析和比对
在96孔板中加入产物1uL，SAM solution 9uL，BigDye XTerminator solution2uL。震荡5min，2000g离心2min，盖上测序用硅胶封盖，用基因分析仪进行毛细管电泳，电泳完毕机器自动根据测序谱图并进行序列读取，可获得目标片段基因序列。分析经毛细管电泳后比对测序谱图及数据，没有重叠峰的直接读取序列，使用NCBI网站上的“nucleotideblast”功能进行序列比对，数据库选用“Nucleotide collection(nr/nt)”，选取比对结果匹配率最高的一项(一般为首项)作为最终的细菌鉴定结果；有重叠峰的人工辨认重叠起始处往后两种序列各15个bp的测序结果，以序列比对和详图分析结果获得最终鉴定及分型结果。根据测序结果及谱图的综合分析情况，可将铜绿假单胞菌分为a-g共7种亚型，详见图1。
【本发明的优点】
1.本发明提供的试剂和方法可对铜绿假单胞菌的23S-5S rRNA基因进行正确测序，以序列比对和详图分析结果获得最终鉴定及分型结果，结合免费的公共基因数据库检索和7种亚型典型测序谱图，可准确地鉴定这种病原菌并进行分子分型。
2.本发明提供的试剂和方法对铜绿假单胞菌进行鉴定和分子分型，是一种新型的分型方法，增加细菌鉴定的准确度和判别力，并有助于同源性分析和分子溯源。
3.铜绿假单胞菌的23S-5S rRNA基因测序鉴定和分子分型方法的发明，使得在基层实验室推广基因测序法鉴定致病菌并进行同源性分析和分子溯源成为可能。
【附图说明】
图1是利用本发明涉及的试剂和方法进行铜绿假单胞菌进行鉴定和分子分型基因测序的7种亚型及对应的典型谱图。
其中a.其中重叠序列头15个bp为(信号强的序列在前)AAACCTTGAAATCCC/CCCCTTGAAATCAAA；b.重叠序列头15个bp为(信号强的序列在前)ACACCTTG AAATCCC/CCCCTTGAAATCAAA；c.重叠序列头15个bp为(信号强的序列在前)ACACCTTGAAATCACAT/CACCTTGAAATCACA；d.重叠序列头15个bp为(信号强的序列在前)CACCTTGAAATCACA/ACACCTTGAAATCACAT；e.重叠序列头15个bp为(信号强的序列在前)AAACCTTGAAATCCC/CACCTTGAAATCAAA；f.无重叠序列，且包含“GCAAACACCTTGAAATCAC”序列；g.无重叠序列，且包含“GCAAAACACCTTGAAATCAC”序列。
【具体实施方式】
【实施例】
待测序鉴定病原菌4株：来自临床标本分离菌株，为斜面生长菌苔。已经经过传统的生化反应鉴定为铜绿假单胞菌。
检测步骤：应用上述试剂和方法进行检测。
1)样品的处理与DNA模板的提取
上述分离菌株细菌悬液经适当稀释后(大约6×104至6×107CFU/mL)，吸取100ul滴于FTA卡上，室温晾干备用。
2)SYBR Green实时荧光PCR反应体系配制
将SYBR Green实时荧光PCR从冰箱取出后，置室温融化，2000rpm离心10sec。按下表计算试剂用量。
表2 SYBR Green实时荧光PCR反应体系配制表
将45μL PCR反应液、4.5μL上游引物、4.5μL下游引物、36μL灭菌去离子水、分别加入1.5mL离心管中，混匀后，2000rpm离心10sec，分别向设定的阳性反应孔、阴性反应孔和样品反应孔中加入20μL/孔。
3)加样
用打孔器在FTA卡打出直径0.5mm的纸片1片加入体系，用反应膜封住反应孔，置于荧光PCR仪上检测。
4)反应参数及PCR扩增效果评价
荧光PCR仪选择FAM通道，扩增反应条件为，95℃2min，[95℃10s，51℃20S，72℃40S(荧光采集)]35次循环，72℃10min。PCR扩增效果评价：荧光PCR产物合格的标准为Cp(或Ct)值小于30且熔解曲线显示有一个或多个明显主峰为合格，没有峰或全部峰Tm值<76℃为扩增产物不合格。
5)测序PCR反应
如果荧光PCR扩增产物合格，将PCR产物依据Cp值大小稀释5-10倍，取已稀释的产物1ul置于PCR管中，再加4ul BigDye Terminator v3.1 SequencingBuffer(5×),测序引物(上游或下游引物)的终浓度为100ng/uL，终体积为10uL，使用梯度PCR仪进行扩增。扩增条件为：98℃2min，(96℃10S，50℃5s，60℃4min)25次循环。
6)产物纯化、毛细管电泳、序列读取、分析和比对
在96孔板中加入产物1uL，SAM solution 9uL，BigDye XTerminator solution2uL。震荡5min，2000g离心2min，盖上测序用硅胶封盖，用基因分析仪进行毛细管电泳，电泳完毕机器自动根据测序谱图并进行序列读取，可获得目标片段基因序列。分析经毛细管电泳后比对测序谱图及数据，没有重叠峰的直接读取序列，使用NCBI网站上的“nucleotideblast”功能进行序列比对，数据库选用“Nucleotide collection(nr/nt)”，选取比对结果匹配率最高的一项(一般为首项)作为最终的细菌鉴定结果；有重叠峰的人工辨认重叠起始处往后两种序列各15个bp的测序结果，以序列比对和详图分析结果获得最终鉴定及分型结果。根据测序结果及谱图的综合分析情况，对照图1典型谱图，可确定铜绿假单胞菌的分子亚型。
<110> 汕头国际旅行卫生保健中心
<120>一种基于23S-5S rRNA基因测序谱图分析法的铜绿假单胞菌分型鉴定方法
<160> 3
<210> 序列标识符（与说明书中SEQ ID NO：冒号后的数字对应）
<211> 序列的长度
<212> LNA RNA
<213> 未知
<400>
| Sequence (5'->3') | Length | Tm | GC% | Selfcomplementarity | Self 3'complementarity | |
| Forwardprimer | F:5’-TAACCGCAAAGCATCT-3’ | |||||
| Reverseprimer | R:5’-TCTGAGTTCGGGAAGGGA-3’ |
序列：
其中a. AAACCTTGAAATCCC/CCCC TTGAAATCAAA；
b. ACACCTTGAAATCCC/CCC CTTGAAATCAAA；
c.ACACCTTGAAATCACAT/C ACCTTGAAATCACA；
d. CACCTTGAAATCACA/ACA CCTTGAAATCACAT；
e. AAACCTTGAAATCCC/CAC CTTGAAATCAAA；
f. GCAAACACCTTGAAATCAC” ；
g. GCAAAACACCTTGAAATCAC”。
Claims (1)
1.一种非疾病诊断和治疗目的的基于23S-5S rRNA基因测序谱图分析法的铜绿假单胞菌分型鉴定方法，使用该方法不仅可以准确鉴定铜绿假单胞菌，还可以进行分子分型，针对铜绿假单胞菌的23S-5S rRNA基因序列设计特异性引物，应用FTA卡-SYBR Green I荧光PCR直接扩增该片段，再将PCR产物简单稀释后进行测序反应，分析经毛细管电泳后比对测序谱图及数据，没有重叠峰的直接读取序列，提交由美国国家生物技术中心NCBI网站BLAST在线软件比对以确定细菌种类，有重叠峰的人工辨认重叠起始处往后两种序列各15个bp的测序结果，以序列比对和详图分析结果获得鉴定及分型结果，采用此方法，铜绿假单胞菌可分成a-g共7种分子亚型；
用于铜绿假单胞菌23S-5S rRNA基因测序鉴定法的引物序列为：
所述铜绿假单胞菌分型鉴定方法为：采用FTA卡核酸保存病原菌核酸、实时荧光PCR技术扩增目标片段，上机进行双脱氧测序；
所述实时荧光PCR技术使用的荧光PCR快速测序试剂套装包括下列试剂：
FTA卡1片；
PCR反应液1管，内装SYBR GREEN荧光PCR反应液，包括Taq酶、dNTP、含Mg2+的Buffer、SYBR GREEN溶液；
上下游引物各1管，内装目标序列扩增及测序引物；
双脱氧测序试剂一套，包括BigDye Terminator v3.1 Sequencing 5×Buffer,BigDyeMix；
测序产物纯化试剂一套，包括XTerminator solution、SAM solution各1管；
去离子水1管，内装无DNA酶的灭菌去离子水；
所述铜绿假单胞菌分型鉴定方法按下列步骤进行：
1)FTA样品卡的制备
细菌悬液经稀释至6×104-6×107CFU/mL，吸取100ul滴于FTA卡上，室温晾干备用；
2)SYBR Green实时荧光PCR直接扩增目标片段
配制反应体系：按常规配制SYBR Green实时荧光PCR反应体系，加入上下游引物的终浓度均为100ng/uL，用打孔器在FTA卡打出直径0.5mm的纸片加入体系，终体积为20uL；
荧光PCR直接扩增：使用荧光定量PCR仪进行扩增，扩增反应条件为，95℃2min；95℃10s、51℃20s、72℃40s,35次循环；72℃10min；
PCR扩增效果评价：荧光PCR产物合格的标准为Cp或Ct值小于30且熔解曲线显示有一个或多个明显主峰为合格，没有峰或全部峰Tm值<76℃为扩增产物不合格；
3)测序PCR反应
如果荧光PCR扩增产物合格，将PCR产物依据Cp值大小稀释5-10倍，取已稀释的产物1ul置于PCR管中，再加4ul BigDye Terminator v3.1 Sequencing 5×Buffer,测序引物的终浓度为100ng/uL，终体积为10uL，使用梯度PCR仪进行扩增；
扩增条件为：98℃2min；96℃10s、50℃5s、60℃4min，25次循环；
4)产物纯化、毛细管电泳和序列读取、分析和比对
在96孔板中加入产物1uL，SAM solution 9uL，BigDye XTerminator solution 2uL；
震荡5min，2000g离心2min，盖上测序用硅胶封盖，用基因分析仪进行毛细管电泳，电泳完毕机器自动根据测序谱图并进行序列读取，可获得目标片段基因序列；
分析经毛细管电泳后比对测序谱图及数据，没有重叠峰的直接读取序列，使用NCBI网站上的“nucleotide blast”功能进行序列比对，数据库选用“Nucleotide collection(nr/nt)”，选取比对结果匹配率最高的一项作为最终的细菌鉴定结果；
有重叠峰的人工辨认重叠起始处往后两种序列各15个bp的测序结果，以序列比对和详图分析结果获得最终鉴定及分型结果；
根据测序结果及谱图的综合分析情况，可将铜绿假单胞菌分为a-g共7种亚型。
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