CN105567800A

CN105567800A - 一种真菌种属pcr鉴定方法

Info

Publication number: CN105567800A
Application number: CN201510801153.0A
Authority: CN
Inventors: 赵玉簪
Original assignee: Detection Of Technical Services (shanghai) Co Ltd Of Icas
Current assignee: Detection Of Technical Services (shanghai) Co Ltd Of Icas
Priority date: 2015-11-19
Filing date: 2015-11-19
Publication date: 2016-05-11

Abstract

本发明涉及生物物种鉴定，具体涉及真菌种属。一种真菌种属PCR鉴定方法，包括以下步骤：步骤一，菌株的培养与收集；步骤二，DNA提取；步骤三，DNA样品的检测；步骤四，PCR扩增；步骤五，测序；步骤六，序列分析。本发明通过步骤一～步骤六实现了对真菌种属的鉴定。

Description

一种真菌种属PCR鉴定方法

技术领域

本发明涉及生物物种鉴定，具体涉及真菌种属。

背景技术

真菌的分类鉴定过去一般采用的是形态学方法，主要按照真菌的形态特征、生长特征、生理生化特点、抗原构造等特征加以区分，尤其是以有性态的形态特征为主要依据。目前世界上使用最广泛的真菌分类系统是Ainsworth分类系统，它按真菌孢子的类型和有性态的有无，把真菌分为鞭毛菌、接合菌、子囊菌、担子菌和半知菌5个亚门。但真菌的种类多，形态和解剖结构复杂多变，少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定，且要获得其有性或无性器官需很长时间(某些真菌如半知菌亚门甚至不能形成有性态)，常会得出假阳性或假阴性结果，因此鉴定结果不是很准确。近年来，随着分子生物学的发展，其在真菌分类学中发挥了越来越大的作用，其中rDNA(核糖体DNA)序列分析被广泛使用。

真核生物的核糖体是80S型，包含大亚基60S与小亚基40S。大亚基60S是由25—28SrRNA、5.8SrRNA和5SrRNA及核糖体蛋白构成；小亚基40S则由18SrRNA与相关核糖蛋白构成。真核生物细胞中的25—28SrRNA、5.8SrRNA和18SrRNA基因串联构成一个转录本，初始转录的产物为35S-45SrRNA前体，35S-45SrDNA与5SrDNA串联形成一个重复单位，150—200个重复单位构成了rDNA簇。5.8S、25S和18S之间的内转录基因间隔序列为基因内部转录间隔序列(ITS)。

rDNA用以进行物种分类鉴定原理，主要是基于其独特的保守性和适当的进化速率，使得不同物种间产生相应的碱基差异，这些碱基差异可以通过相应的技术方法来分析，从而进行菌株的分类鉴定。序列分析、限制性片段长度多态性RFLP、单链构象多态性SSCP和末端限制性片段长度多态性T-RFLP等

为主要的技术方法，并且有日益完善的Internet数据库和序列分析软件作为支持。

研究表明26SrRNA可应用于系统发育分析和菌种鉴定。在大亚基的多态性研究中，其序列可为12个区域，其中D1和D2两个区域主要用于系统发育研究和菌种鉴定。26SrDNA的D1/D2区域位于大亚基的5′端，序列长度在600bp左右。种内序列变异≤1％，而种间序列差异＞1％。扩增常用通用引物为NL1:5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'和NL4:5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'，扩增出的序列结合序列分析、限制性片段多态性RFLP或单链构象多态性分析，对待测菌株进行分析。

内转录间隔区ITS与5.8SrDNA(internaltranscribedspacer,ITS)是rDNA上的一个非编码区域，由位于18SrDNA和5.8SrDNA之间的ITS1区及5.8SrDNA和28SrDNA之间的ITS2区构成，长度约为500bp。该区域受外界环境因素的影响较小，与编码区域相比具有进化速度快的特点，在种内的不同菌株之间高度保守，而在真菌种间存在极大的变化，表现出极大的序列多态性，可以为真菌学的研究提供丰富的遗传信息。研究时，通常采用ITS序列的通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')，扩增出包括ITS1、5.8S和ITS2的全长ITS区域序列，长度400～870bp，然后结合DNA序列测定分析和RFLP分析，对物种进行分类鉴定。由于ITS区不加入成熟核糖体,所以受到的选择压力较小,进化快,在绝大多数的真核生物中表现出很高的序列多态性，Renske等认为,真菌通过ITS区域比对,序列相似性大于99％,鉴别为同种。ITS序列间的趋异已经用于真菌中很多属的系统发育研究,已证明该序列在研究属内和关系较近的属间关系时是十分有价值的,尤其在近似种的区别中。

虽然种内26SD1/D2区碱基差异小于1％的标准已被普遍接受，然而此数值仍是一个试验的经验值。但真菌的种类非常复杂，不同种真菌的基因组的进化速率各不相同，跨物种的基因交流(重组、染色体重排、水平转移、基因渗透)可能会造成核糖体基因簇的某一区段适用于大多数的物种鉴定，却不能将亲缘关系较近的物种加以区分的现象，或者依赖于单一标记的分类结果可能无法正确反映该菌株的真实分类地位。有时具有相同D1/D2区序列的菌株，杂交遗传学和标准特征却表明它们不属于同一个种。

同时由于不同真菌的内转录间隔区ITS与5.8SrDNA序列存在差异，使用ITS序列的通用引物ITS1和ITS4有时无法扩增到ITS1、5.8S和ITS2的全长ITS区域序列，无法用于菌种鉴定。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种真菌种属PCR鉴定方法，解决以上技术问题。

本发明所解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现：

一种真菌种属PCR鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，菌株的培养与收集；

步骤二，DNA提取；

步骤三，DNA样品的检测；

步骤四，PCR扩增；

步骤五，测序；

步骤六，序列分析。

本发明通过步骤一～步骤六实现了对真菌种属的鉴定。

所述步骤一中，作为一种方案，所述菌株在一土豆培养基中进行培养，培养环境在25℃～30℃，光照12h，黑暗12h，培养2～5天后，所述菌株的菌丝长满所述土豆培养基的表面，直接从所述土豆培养基表面刮取所述菌丝作为样品；

所述土豆培养基是一固体培养基。

本发明通过在固体培养基上培养菌种能够便于观察菌落和便于分离菌丝。

所述步骤一中，作为一种方案，所述菌株在一土豆培养基中进行培养，培养环境在25℃～30℃，光照12h，黑暗12h，培养2～5天后，所述菌株的菌丝长满所述土豆培养基的表面；

将菌丝置于一液体土豆培养基中，保持所述液体土豆培养基内的环境在25℃～30℃，将所述液体土豆培养基以180r/min的速度进行高速离心5～10天，再收集菌丝作为样品。

本发明通过液体培养基高速离心能够使菌丝内的活性增强，扩大培养，增加溶解氧含量。

步骤2-1，将所述样品溶解在锥形瓶中形成菌液，抽取1ml～2ml菌液于一第一离心管中，将所述第一离心管以12000r/min离心3min～5min。

步骤2-2，在所述第一离心管中加入500μL十六烷基三甲基溴化铵，将所述第一离心管放入液氮中迅速制冷30s～40s，在将所述第一离心管迅速放入60℃～70℃温水中30s～40s，重复步骤2-2三～五次。

本发明通过十六烷基三甲基溴化铵能够对第一离心管内的核酸进行沉淀，便于收集DNA。

步骤2-3，在所述第一离心管中再加入所述第一离心管体积1/3的玻璃珠，将所述第一离心管放置在一漩涡振荡器进行高速震荡3min～8min。

本发明通过玻璃珠能够更好的将细胞压碎，便于收集DNA。

步骤2-4在所述第一离心管中再加入蛋白酶K，将所述第一离心管在60℃～65℃的水中保温30min并且每隔10min摇匀1次。

本发明通过蛋白酶K能对第一离心管内的蛋白质进行降解。

步骤2-5在所述第一离心管中加入体积比在20～30:20～25:0.5～1之间的酚、氯仿和异戊醇。

本发明通过酚、氯仿和异戊醇能够抽取DNA，苯酚的作用是使蛋白质变性，氯仿的作用是克服酚的缺点；加速有机相与液相分层.最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚.(酚易溶于氯仿中)。本发明通过这三者的结合能够使提取DNA的方法变得简单方便。

作为一种优选方案，步骤2-5在所述第一离心管中加入体积比25:24:1的酚、氯仿和异戊醇。

步骤2-6将所述第一离心管中的上清液移入到第二离心管中，在所述第二离心管中加入体积比24:1的氯仿和异戊醇，将所述第二离心管以12000r/min离心10～12min。

异戊醇的作用是调整极性，使氯仿更高效的萃取酚等有机物以及令蛋白质变性。

步骤2-7在所述第二离心管内加入比所述上清液体积大两倍的无水乙醇，所述无水乙醇是预冷过的无水乙醇，将所述第二离心管放在-20℃的环境中静置20min-30min并且以12000r/min离心10min～15min。

本发明通过预冷的无水乙醇能够使提取DNA更容易。

步骤2-8将所述第二离心管内的上清液倒掉留下沉淀，在所述沉淀中加70％的酒精200μL，再将沉淀在室温中进行干燥。

本发明通过70％的酒精对沉淀进行杀菌消毒。

步骤2-9在所述沉淀中加入100μL的TE缓冲液。

本发明通过TE缓冲液能溶解DNA，能稳定储存DNA。

步骤2-10在所述沉淀中加入浓度在10～12mg/mL的核糖核酸酶，在65℃环境下保温30min～50min。

本发明通过核糖核酸酶催化RNA降解为小片段。

步骤2-11，重复步骤2-7～2-9，最后使沉淀中的DNA物质溶于50μL的双蒸水中。

所述步骤2-1～所述步骤2-11具有先后顺序。

所述DNA物质溶于50μL的双蒸水形成DNA溶液，取5μLDNA溶液置于质量分数为2％的琼脂糖凝胶中，在电泳缓冲液为1×TBE，电压为120V的条件下电泳40min，用GoldView染色，在凝胶成像仪上观察DNA分子的大小、完整性及电泳条带的清晰度，进行拍照。

GoldView是一种可代替溴化乙锭(EB)的新型核酸染料，采用琼脂糖电泳检测DNA分子时，GoldView与核酸结合后能产生很强的荧光信号，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，而且也可用于染RNA。

使用紫外分光光度计检测提取所述DNA分子的吸光值A260和A280，其A260/A280比值应在1.7～2.0之间，按以下公式计算DNA浓度：

C＝A*N*50

C—DNA浓度，单位为ng/μL；

A—260nm处的吸光值

N—DNA稀释倍数

将DNA浓度稀释到100ng/μL。

本发明通过紫外分光光度计能够便于检测出DNA分子。

准备第一PCR反应管和第二PCR反应管，在所述第一PCR反应管中配置26SrDNA基因D1/D2区，在所述第二PCR反应管中配置26SrDNA基因ITS区。便于对DNA进行扩增。

所述26SrDNA基因D1/D2区的扩增引物为：

上游引物NL1:5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'

下游引物NL4:5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'；

所述26SrDNA基因ITS区的扩增引物为：

上游引物ITS3：5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'

下游引物ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

将6μL的DNA物质和25μL的2×TaqPCRMix试剂分别加入到所述第一PCR反应管和所述第二PCR反应管。本发明将DNA物质作为模板，2×TaqPCRMix能够简化扩增试验，提高实验结果的重现性。

将所述第一PCR反应管和第二PCR反应管分别PCR仪中，以95℃预变性3min～5min，95℃变性30s～40s，55℃退火30s～40s，72℃延伸40s～50s，72℃后延伸10min～12min，进行40次～50次循环，完成对DNA物质的扩增。

本发明按照上述环境对PCR反应管内的DNA物质进行扩增。

取5μL扩增后的DNA物质到质量分数为2％的琼脂糖凝胶，于5V/cm的电场中进行电泳，经GoldView染色后，于凝胶成像系统上观察拍照。

将扩增后的DNA物质放入DNA纯化试剂盒中进行进一步的纯化。

本发明通过纯化，能够使测序结果更加精确。

附图说明

图1为实施例1中菌株的提取DNA电泳图谱；

图2为实施例1中菌株的126SrDNA基因D1/D2区域扩增产物电泳图谱；

图3为实施例1中菌株的ITS2区域扩增产物电泳图谱；

图4为实施例2中菌株的提取DNA电泳图谱；

图5为实施例2中菌株的126SrDNA基因D1/D2区域扩增产物电泳图谱；

图6为实施例2中菌株的ITS2区域扩增产物电泳图谱；

图7为本发明流程框图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。

测试菌株1：黑曲霉Aspergillusniger菌株CMCC(F)98003(一).菌株的培养与收集将测试菌株1孢子接种到液体PDA培养基中，28℃180r/min震荡培养5天，高速离心后，收集干燥的菌丝。

(二).DNA提取(改良CTAB法)1、取1.5mL菌液，12000rpm离心3min，用灭菌的MQ洗2遍2、加入500μL5×CTAB(含1％β-巯基乙醇),液氮中速冷30s,立即65℃30s,反复3次3、加入1/3体积的玻璃珠,漩涡振荡器上高速振荡4min～5min4、加入蛋白酶K，65℃保温30min,每隔10min摇匀1次5、加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1,V/V/V),12000r/min离心10min6、将上清液移入到新的离心管中,加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1,V/V),12000r/min离心10min。7、在上清中加入2倍体积预冷的无水乙醇,-20℃静置20min-30min,12000r/min离心10min。8、倒掉上清,加70％的酒精200μL洗沉淀,室温干燥9、加入100μLTE使DNA完全溶解10、加入RNaseA(10mg/mL),65℃保温30min以上11、重复步骤7～9，最后DNA溶于50μLddH2O中。

(三).DNA样品的检测1、取5ulDNA溶液到质量分数为2％的琼脂糖凝胶中，在电泳缓冲液为1×TBE，电压为120V的条件下电泳40min，用GoldView染色，在凝胶成像仪上观察DNA分子的大小、完整性及电泳条带的清晰度，进行拍照(参见图1)。2、使用紫外分光光度计检测提取的DNA的吸光值A260和A280，其A260/A280比值为1.85/1.89，按以下公式计算DNA浓度：C＝A*N*50

C—DNA浓度，单位为ng/μL；

A—260nm处的吸光值

N—DNA稀释倍数

获得DNA产物浓度为321ng/μL和343ng/μL，DNA浓度稀释到100ng/μL。

(四).PCR扩增

分别扩增测试菌株1的26SrRNAD1/D2区和ITS2区序列

1、PCR反应管中加入反应体系：2×TaqPCRMix………25μl

上游引物10μM…………1μl

下游引物10μM…………1μl

DNA模版…………………6μl

ddH2O至50μl…………17μl

扩增时，应设立空白对照(不含DNA模板，以水代替)。

2、将PCR反应管放入PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，72℃后延伸10min，40个循环。

3、PCR反应结束后，取5μl扩增产物到质量分数为2％的琼脂糖凝胶，于5V/cm的电场中进行电泳，经GoldView染色后，于凝胶成像系统上观察拍照。(26SrRNAD1/D2区扩增产物电泳图参见图2；ITS2区序列扩增产物电泳图参见图3)

(五).测序

1、将PCR扩增产物分别使用DNA纯化试剂盒进一步纯化，纯化后的DNA产物送DNA测序公司进行测序。测序引物为PCR扩增引物。

2、26SrDNA基因D1/D2区域扩增产物序列Seq1如下：

GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACCGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAAATTTGAAAGCTGGCTCCTTCGGAGTCCGCATTGTAATTTGCAGAGGATGCTTTGGGTGCGGCCCCCGTCTAAGTGCCCTGGAACGGGCCGTCAGAGAGGGTGAGAATCCCGTCTTGGGCGGGGTGTCCGTGCCCGTGTAAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGTGGTAAATTTCATCTAAAGCTAAATACTGGCCGGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCGACCAGACTCGCCCGCGGGGTTCAGCCGGCATTCGTGCCGGTGTACTTCCCCGTGGGCGGGCCAGCGTCGGTTTGGGCGGCCGGTCAAAGGCCCCTGGAATGTAGTACCCTCCGGGGTACCTTATAGCCAGGGGTGCAATGCGGCCAGCCTGGACCGAGGAACGCGCTTCGGCACGGACGCTGGCATAATGGTCGTAAACGACCCGTCTTGAAACACGGACC

3、ITS2区扩增产物序列Seq2如下：

GCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGCCGTCCCCCTCTCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACATGCTCTGTAGGATTGGCCGGCGCCTGCCGACGTTTTCCAACCATTCTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA

(六).序列分析

1、将测试菌株1的26SrDNA基因D1/D2区域扩增产物序列Seq1提交到GenBank基因序列数据库，与库中所有真菌的同源序列进行相似性比较。与其相似度最高的菌种有：Aspergillusniger、Aspergillusochraceus、Aspergillustubingensis和Aspergillusheteromorphus，且相似度都是100％。

2、再将测试菌株2的ITS2区扩增产物序列Seq2提交到GenBank基因序列数据库，与这几种菌种的同源序列进行相似性比较。比对结果为只与Aspergillusniger的相似度最高，为100％，鉴定结果正确。

实施例2

测试菌株2：来自皮衣上生长的霉菌

(一).菌株的培养与收集

将皮衣上的真菌孢子接种到PDA平板上活化培养4～5天，温度25℃，光照12L∶12D。挑选单菌落到新的PDA平板上继续培养4～5天。当菌丝长满培养基表面并未产孢时，直接从平板上刮取菌丝。

(二).DNA提取(改良CTAB法)

1、将菌丝用MQ液洗2遍

2、加入500μL5×CTAB(含1％β-巯基乙醇),液氮中速冷30s,立即65℃30s,反复3次

3、加入1/3体积的玻璃珠,漩涡振荡器上高速振荡4min～5min

4、加入蛋白酶K，65℃保温30min,每隔10min摇匀1次

5、加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1,V/V/V),12000r/min离心10min

6、将上清液移入到新的离心管中,加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1,V/V),12000r/min离心10min。

7、在上清中加入2倍体积预冷的无水乙醇,-20℃静置20min-30min,12000r/min离心10min。

8、倒掉上清,加70％的酒精200μL洗沉淀,室温干燥

9、加入100μLTE使DNA完全溶解10、加入RNaseA(10mg/mL),65℃保温30min以上11、重复步骤7～9，最后DNA溶于50μLddH2O中。

(三).DNA样品的检测

1、取5ulDNA溶液到质量分数为2％的琼脂糖凝胶中，在电泳缓冲液为1×TBE，电压为120V的条件下电泳40min，用GoldView染色，在凝胶成像仪上观察DNA分子的大小、完整性及电泳条带的清晰度，进行拍照(参见图4)。

2、使用紫外分光光度计检测提取的DNA的吸光值A260和A280，其A260/A280比值为1.83/1.82，按以下公式计算DNA浓度：

C＝A*N*50

C—DNA浓度，单位为ng/μL；

A—260nm处的吸光值

N—DNA稀释倍数

获得DNA产物浓度为245ng/μL和296ng/μL，DNA浓度稀释到100ng/μL。

(四).PCR扩增

分别扩增测试菌株2的26SrRNAD1/D2区和ITS2区序列

1、PCR反应管中加入反应体系：2×TaqPCRMix………25μl

上游引物10μM…………1μl

下游引物10μM…………1μl

DNA模版…………………6μl

ddH2O至50μl…………17μl

扩增时，应设立空白对照(不含DNA模板，以水代替)。

3、PCR反应结束后，取5μl扩增产物到质量分数为2％的琼脂糖凝胶，于5V/cm的电场中进行电泳，经GoldView染色后，于凝胶成像系统上观察拍照。(26SrRNAD1/D2区扩增产物电泳图参见图5；ITS2区序列扩增产物电泳图参见图6)

(五).测序

2、26SrDNA基因D1/D2区域扩增产物序列Seq3如下：GGAAAAGAAACCAACCGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAAATTTGAAATCTGGCCCCTCCGGGGTCCGAGTTGTAATTTGCAGAGGATGCTTCGGGTGCGGCCCCTGTCTAAGTGCCCTGGAACGGGCCGTCAGAGAGGGTGAGAATCCCGTCTTGGGCAGGGTGCCCGTGCCCGTGTGAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAAATGGGTGGTAAATTTCATCTAAAGCTAAATACCGGCCGGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCAACCAGACTCGGCCTCGGGGTTCAGCCAGCATTCGTGCTGGTGTACTTCCCCGGGGCCGGGCCAGCGTCGGTTTGGGCGGCCGGTCAAAGGCCCCAGGAATGTATCGTCCTCCGGGACGTCTTATAGCCTGGGGTGCAATGCGGCCAGCCTGGACCGAGGAACGCGCTTCGGCACGGACGCTGGCGTAATGGTCGCAAACGACCCGTCTTGAAA

3、ITS2区扩增产物序列Seq4如下：GCATCGATGAAGAACGCAGCGAACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGTGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCGACTAGGGCCGGCCGGGCGCCAGCCGACGTCTCCAACCATTTTTCTTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGGCGG

(六).序列分析1、将测试菌株1的26SrDNA基因D1/D2区域扩增产物序列Seq3提交到GenBank基因序列数据库，与库中所有真菌的同源序列进行相似性比较。与其相似度100％的菌种有：Aspergillusprotuberus、Magnaporthegrisea、Aspergillussydowii和Aspergilluscaesiellus。2、再将测试菌株2的ITS2区扩增产物序列Seq4提交到GenBank基因序列数据库，与这4种菌种的同源序列进行相似性比较。比对结果为只与聚多曲霉Aspergillussydowii的相似度为100％。所以测试菌株的菌种为Aspergillussydowii。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

Claims

1.一种真菌种属PCR鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，菌株的培养与收集；

步骤二，DNA提取；

步骤三，DNA样品的检测；

步骤四，PCR扩增；

步骤五，测序；

步骤六，序列分析。

2.根据权利要求1所述的一种真菌种属PCR鉴定方法，其特征在于：所述菌株在一土豆培养基中进行培养，培养环境在25℃～30℃，光照12h，黑暗12h，培养2～5天后，所述菌株的菌丝长满所述土豆培养基的表面，直接从所述土豆培养基表面刮取所述菌丝作为样品；

所述土豆培养基是一固体培养基。

3.根据权利要求1所述的一种真菌种属PCR鉴定方法，其特征在于：所述步骤一中，所述菌株在一土豆培养基中进行培养，培养环境在25℃～30℃，光照12h，黑暗12h，培养2～5天后，所述菌株的菌丝长满所述土豆培养基的表面；

4.根据权利要求2或3所述的一种真菌种属PCR鉴定方法，其特征在于：步骤2-1，将所述样品溶解在锥形瓶中形成菌液，抽取1ml～2ml所述菌液于一第一离心管中，将所述第一离心管以12000r/min离心3min～5min；

步骤2-2，在所述第一离心管中加入500μL十六烷基三甲基溴化铵，将所述第一离心管放入液氮中迅速制冷30s～40s，在将所述第一离心管迅速放入60℃～70℃温水中30s～40s，重复步骤2-2三～五次；

步骤2-3，在所述第一离心管中再加入所述第一离心管体积1/3的玻璃珠，将所述第一离心管放置在一漩涡振荡器进行高速震荡3min～8min；

5.根据权利要求4所述的一种真菌种属PCR鉴定方法，其特征在于：步骤2-5在所述第一离心管中加入体积比在20～30:20～25:0.5～1之间的酚、氯仿和异戊醇；

步骤2-6将所述第一离心管中的上清液移入到第二离心管中，在所述第二离心管中加入体积比24:1的氯仿和异戊醇，将所述第二离心管以12000r/min离心10～12min；

6.根据权利要求5所述的一种真菌种属PCR鉴定方法，其特征在于：步骤2-8将所述第二离心管内的上清液倒掉留下沉淀，在所述沉淀中加70％的酒精200μL，再将沉淀在室温中进行干燥；

步骤2-9在所述沉淀中加入100μL的TE缓冲液；

步骤2-10在所述沉淀中加入浓度在10～12mg/mL的核糖核酸酶，在65℃环境下保温30min～50min；

步骤2-11，重复步骤2-7～2-9，最后使所述沉淀中的DNA物质溶于50μL的双蒸水中。

7.根据权利要求6所述的一种真菌种属PCR鉴定方法，其特征在于：所述DNA物质溶于50μL的双蒸水形成DNA溶液，取5μLDNA溶液置于质量分数为2％的琼脂糖凝胶中，在电泳缓冲液为1×TBE，电压为120V的条件下电泳40min，用GoldView染色，在凝胶成像仪上观察DNA分子的大小、完整性及电泳条带的清晰度，进行拍照。

8.根据权利要求1所述的一种真菌种属PCR鉴定方法，其特征在于：使用紫外分光光度计检测提取所述DNA分子的吸光值A260和A280，其A260/A280比值应在1.7～2.0之间，按以下公式计算DNA浓度：

C＝A*N*50

C—DNA浓度，单位为ng/μL；

A—260nm处的吸光值

N—DNA稀释倍数

将DNA浓度稀释到100ng/μL。

9.根据权利要求1所述的一种真菌种属PCR鉴定方法，其特征在于：准备第一PCR反应管和第二PCR反应管，在所述第一PCR反应管中配置26SrDNA基因D1/D2区，在所述第二PCR反应管中配置26SrDNA基因ITS区。

10.根据权利要求9所述的一种真菌种属PCR鉴定方法，其特征在于：所述26SrDNA基因D1/D2区的扩增引物为：

上游引物NL1:5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'

下游引物NL4:5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'；

所述26SrDNA基因ITS区的扩增引物为：

上游引物ITS3：5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'

下游引物ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。