CN102181559B

CN102181559B - 一种糙皮侧耳est-ssr分子标记特异引物体系及其应用

Info

Publication number: CN102181559B
Application number: CN 201110108721
Authority: CN
Inventors: 姚强; 宫志远; 高兴喜; 张雪梅; 韩建东; 任鹏飞; 万鲁长; 任海霞; 赵军胜; 李瑾; 曲玲
Original assignee: Institute of Agricultural Resources and Environment of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Agricultural Resources and Environment of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-04-28
Filing date: 2011-04-28
Publication date: 2013-02-06
Anticipated expiration: 2031-04-28
Also published as: CN102181559A

Abstract

本发明涉及糙皮侧耳EST-SSR分子标记特异引物体系及其应用，属于分子生物学技术领域。一种糙皮侧耳EST-SSR分子标记特异引物体系，它包括4对EST-SSR分子标记特异引物。本发明还提供EST-SSR分子标记特异引物体系在糙皮侧耳遗传多样性分析和种质资源鉴定方面的应用。本发明用于建立糙皮侧耳的核心种质库，使用方便，能简单快捷的进行种质资源的遗传多样性分析、种质资源鉴定、遗传图谱的构建和功能基因的研究；相较传统方法，可以大大缩短分析周期，提高研究效率。

Description

一种糙皮侧耳EST-SSR分子标记特异引物体系及其应用

技术领域

本发明涉及糙皮侧耳EST-SSR分子标记特异引物体系及其应用，属于分子生物学技术领域。

技术背景

糙皮侧耳是我国第一大食用菌栽培菌种。在人们长期的生产实践中，积累了丰富而珍贵的糙皮侧耳种质资源，特别是近年来，随着糙皮侧耳栽培产业的迅速发展，糙皮侧耳的种质资源也在不断扩大。据不完全统计，目前我国糙皮侧耳栽培品种(包括国外引进菌种)已达300多个。丰富的种质资源为糙皮侧耳品种改良、新品种选育以及遗传工程奠定了基础。然而，糙皮侧耳种质资源库不断扩大，对育种工作者来说，要想知道这些育种材料的详细信息，并进行深入细致的评价鉴定，变得越来越困难。特别是由于我国食药用菌品种登记制度尚未完善，糙皮侧耳的生产用菌种比较混乱，同种异名和同名异种现象在栽培生产上非常普遍，这就给育种工作者正确评价和鉴定这些种质资源带来很大的不便。因此，如何更有效地保存和开发利用现有糙皮侧耳种质资源，特别是对特异种质材料进行有效地筛选和挖掘，是当前迫切需要解决的问题。

目前，用于作物种质资源鉴定的分子标记主要有RFLP、RAPD、AFLP、SSR等，但对于核心种质构建、基因性状鉴定、品种指纹图谱建库等研究，SSR分子标记是公认的最佳方法。

开发SSR标记主要有构建与筛选基因组文库法、微卫星富集法、省略筛库法和数据库搜索法等。其中数据库搜索法，尤其是从表达序列标签(EST)数据库中搜索，开发EST-SSR标记，已经成为一种广为采用的方法。EST-SSR标记相对于基因组SSR标记而言，由于其来自于转录谱，能够反映出转录区的差异，使EST-SSR标记可以直接与目标性状(如高产或多抗)相联系，在分子标记辅助选择上具有更高的应用价值。

然而，由于食药用真菌基因组学研究的相对滞后，EST-SSR标记技术在食药用真菌中的研究很少，仅见在香菇和真姬菇中有研究报道，而在糙皮侧耳中尚未开展该方面的研究。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种糙皮侧耳EST-SSR分子标记特异引物体系及其应用。

一种糙皮侧耳EST-SSR分子标记特异引物体系，它包括4对核苷酸序列如下所示的EST-SSR分子标记特异引物：

GL1F：ctgctcgttgtacacgcttc(SEQ ID NO.1)，GL1R：gaaagacagacgcgggatta；(SEQ ID NO.2)；

GL2F：ggtaatctcggcttcacgat(SEQ ID NO.3)，GL2R：ttgagaatcttcggcacctc(SEQ ID NO.4)；

GL4F：gagcaggcgatctctttcaa(SEQ ID NO.5)，GL4R：gcgaagggagtggtacacat(SEQ ID NO.6)；

GL19F：agtacgtagctgccgtccag(SEQ ID NO.7)，GL19R：cctgatacgtcccgtaacca(SEQ ID NO.8)。

上述体系，还包括核苷酸序列如下所示的EST-SSR分子标记特异引物：

GL26F：tatgggcatgatgaagaacg(SEQ ID NO.9)，GL26R：cgacgacgacgactatgaga(SEQ ID NO.10)。

GL38F：tctttacatccacgccatga(SEQ ID NO.11)，GL38R：caaagtgaaggtgagcgaca(SEQ IDNO.12)。

上述EST-SSR分子标记特异引物体系在糙皮侧耳遗传多样性分析和种质资源鉴定方面的应用。

上述应用，步骤如下：

(1)提取样品DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用EST-SSR分子标记特异引物体系中的成对引物分别PCR扩增EST-SSR分子标记，得PCR产物；

(3)将步骤(2)制得的得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并对结果进行遗传多样性分析和多态性统计分析。

所述步骤(1)提取样品DNA，步骤如下：

(i)刮取菌丝用液氮研磨，加入CTAB及RNA酶于60-65℃水浴1-2h；

(ii)4℃ 12000rpm离心10min，取上清加入等体积的氯仿异戊醇混合液(氯仿与异戊醇体积比24∶1)，混匀后，4℃ 12000rpm离心10min；

(iii)重复步骤(ii)；

(iv)取上清加入2倍体积的无水乙醇于-20℃静置2h；

(v)4℃ 8000rpm离心10min，弃上清，用70％乙醇洗2-3次，倒置晾干，加入适量TE溶解，即得样品DNA。

所述步骤(2)的PCR扩增，反应体系为：

糙皮侧耳基因组DNA 50-100ng，10×缓冲液2.5μL，2.5mmol的dNTPs 2μL，2.5U·μL^-1Taq酶0.25μL，浓度为10μM·L^-1的正向引物溶液1μL，浓度为10μM·L^-1的反向引物溶液1μL，添加ddH₂O至体系体积为25μL；

PCR反应程序为：94℃预变性5min后进入循环；94℃变性30s；53～56℃复性45s；72℃延伸1min，反应35个循环；72℃延伸10min。

所述步骤(3)的琼脂糖凝胶电泳为2％的琼脂糖凝胶电泳。

所述步骤(3)的遗传多样性分析是根据EST-SSR分子标记特异引物体系中的特异引物在糙皮侧耳样品DNA的扩增结果，经过统计清晰稳定的条带后，应用非加权类平均聚类方法对糙皮侧耳样品进行聚类分析。可参考(Sokal R R，Michener C D.A statistical method forevaluating systematic relationships.Univ Kansas Sci Bull，1958，28：1409-1438)或(Sneath P H，Sokal R R.Numerical Taxonomy：The Principal and Practice of Numerical Classification.SanFrancisco：W.H.Freeman and Company，1973)中的记载。

所述步骤(3)的多态性统计分析是根据统计在同一电泳迁移位置扩增条带的有无，有扩增条带的记为1，没有扩增条带的记为0，生成分子数据矩阵；然后，利用NTSYS2.1软件的非加权平均数法(UPMGA)进行了聚类分析。可参考(Sokal R R，Michener C D.Astatistical method for evaluating systematic relationships.Univ Kansas Sci Bull，1958，28：1409-1438)或(Sneath P H，Sokal R R.Numerical Taxonomy：The Principal and Practice ofNumerical Classification.San Francisco：W.H.Freeman and Company，1973)中的记载。

有益效果：

1、本发明初步构建了糙皮侧耳的EST-SSR分子标记特异引物体系，该体系为建立糙皮侧耳的核心种质库、提高整个种质库的管理和利用水平，特别是为采用一系列先进手段和方法有目的、有重点地进行重要性状遗传规律的研究提供了新的手段，具有重要的学术意义和实用价值。

2、本发明用于建立糙皮侧耳的核心种质库，使用方便，能简单快捷的进行种质资源的遗传多样性分析、种质资源鉴定、遗传图谱的构建和功能基因的研究；相较传统方法，可以大大缩短分析周期，提高研究效率。

3、本发明中的特异引物的退火温度非常接近，有利于其使用分析自动化的实现。

附图说明

图1、糙皮侧耳EST-SSR分子标记特异引物体系中引物GL4在16株糙皮侧耳菌株中的扩增结果；

图2、糙皮侧耳EST-SSR分子标记特异引物体系中引物GL2在16株糙皮侧耳菌株中的扩增结果；

图3、糙皮侧耳EST-SSR分子标记特异引物体系中引物GL1在16株糙皮侧耳菌株中的扩增结果；

图4、糙皮侧耳EST-SSR分子标记特异引物体系中引物GL19在16株糙皮侧耳菌株中的扩增结果；

图5、16株糙皮侧耳菌株基于EST-SSR分子标记特异引物体系中引物扩增结果的聚类树状图；

图6、糙皮侧耳EST-SSR分子标记特异引物体系中引物GL26在16株糙皮侧耳菌株中的扩增结果；

图7、糙皮侧耳EST-SSR分子标记特异引物体系中引物GL38在16株糙皮侧耳菌株中的扩增结果；

图8、实施例2中16株糙皮侧耳菌株基于EST-SSR分子标记特异引物体系中引物扩增结果的聚类树状图；

图9、实施例3中16株糙皮侧耳菌株基于EST-SSR分子标记特异引物体系中引物扩增结果的聚类树状图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图，对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中所用的糙皮侧耳菌株均购自中国农业科学院农业资源与农业区划研究所公开销售的菌种。

实施例1：EST-SSR引物的筛选。

1、SSR位点的来源与筛选

从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中搜索并下载(以FASTA格式)已有的糙皮侧耳EST序列，采用EST-trimmer软件除去5’或3’端的polyA或polyT，除去长度小于100bp的EST序列，对于长度大于700bp的EST则保留其5’端的700bp；再利用CAP3软件进行片段重叠群分析和聚类，拼接时设定的初始装配参数均为默认值，得到高质量的Unigenes，利用SSR Finder软件在其中搜索SSR，搜索标准为：单、二、三、四、五、六核苷酸的最少重复次数分别为12、6、5、5、5、5次，同时也包括中间被一段序列打断(不超过10bp)的不完全重复SSR。

2、EST-SSR标记引物的设计

利用引物设计软件primer3.0在含有SSR位点的序列中设计引物。对于EST-SSR引物设定参数为：(1)GC含量为45％～60％；(2)退火温度为55～65℃；(3)预期片段长度在150～300bp之间；(4)引物长度在18～27bp之间。

3、引物的优化

不同引物根据不同的Tm值进行优化，扩增反应用BioRad PCR仪，PCR反应程序为：94℃预变性5min后进入循环；94℃变性30s；50～65℃复性45s；72℃延伸1min，反应进行35个循环；72℃延伸10min。反应体系为(25μL)：10×缓冲液2.5μL，2.5mmol的dNTPs 2μL，2.5U·μL^-1Taq酶0.25μL，正反向引物各1μL，模板为50-100ng。模板是随机的4个糙皮侧耳菌株。扩增得到的产物用2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，然后再凝胶成像系统下观察记录成像结果，选取杂带少、条带清晰稳定多态性好的PCR对应的温度作为最佳的退火温度。

4、EST-SSR引物的确定

根据上面筛选出的Tm值选取16个糙皮侧耳菌株检测这些EST-SSR标记的多态性。

PCR反应程序为：94℃预变性5min后进入循环；94℃变性30s，53～56℃复性45s，72℃延伸1min，反应进行35个循环；72℃延伸10min。

反应体系为(25μL)：10×缓冲液2.5μL，2.5mmol的dNTPs 2μL，2.5U·μL^-1Taq酶0.25μL，正反向引物各1μL，模板为50-100ng。

PCR扩增得到的产物用2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，然后在凝胶成像系统下观察记录成像结果，分析确定多态性，最后选出6对特异引物可作为糙皮侧耳EST-SSR标记，6对特异引物如表1所示。

表1、开发获得的4对可适用于糙皮侧耳的EST-SSR标记

经实验，将特异引物GL1、特异引物GL2、特异引物GL4和特异引物GL19经PCR扩增后的结果进行分析后，即可初步达到建立糙皮侧耳的核心种质库、提高整个种质库的管理和利用水平的目的。因此，基于特异引物GL1、特异引物GL2、特异引物GL4和特异引物GL19构建了EST-SSR分子标记特异引物体系。

实施例2

实施例1所述的EST-SSR分子标记特异引物体系在糙皮侧耳遗传多样性分析和种质资源鉴定方面的应用，步骤如下：

1、提取糙皮侧耳的DNA

选取购自中国农业科学院农业资源与农业区划研究所的糙皮侧耳002号菌种、糙皮侧耳091号菌种、糙皮侧耳095号菌种、糙皮侧耳149号菌种、糙皮侧耳278号菌种、糙皮侧耳A184号菌种、糙皮侧耳A228号菌种、糙皮侧耳004号菌种、糙皮侧耳265号菌种、糙皮侧耳279号菌种、糙皮侧耳A247号菌种、糙皮侧耳208号菌种、糙皮侧耳230号菌种、糙皮侧耳A289号菌种、糙皮侧耳A240号菌种、糙皮侧耳A242号菌种，使用PDA固体培养基，在25℃恒温培养8d。提取DNA的步骤为：(1)刮取0.2g菌丝用液氮研磨，加入600μL的CTAB及小量RNA酶于65℃水浴1h；(2)4℃12000rpm离心10min，取上清加入等体积的氯仿异戊醇(氯仿与异戊醇体积比为24∶1)颠倒混匀后，4℃12000rpm离心10min；(3)重复步骤(2)；(4)取上清加入2倍体积的无水乙醇于-20℃静置2h；(5)4℃8000rpm离心10min，弃上清，用70％乙醇洗2-3次，倒置晾干，加入适量TE溶解。

2、PCR扩增

用糙皮侧耳EST-SSR分子标记特异引物体系中4对特异引物GL1、特异引物GL2、特异引物GL4和特异引物GL19分别对16个糙皮侧耳菌株进行PCR扩增，PCR反应条件是：

50ng糙皮侧耳基因组DNA，10×缓冲液2.5μL，2.5mmol的dNTPs 2μL，2.5U·μL^-1Taq酶0.25μL，浓度为10μM·L^-1的正向引物溶液1μL，浓度为10μM·L^-1的反向引物溶液1μL，添加ddH₂O至体系体积为25μL。

3、电泳检测

PCR扩增得到的产物用2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，然后再凝胶成像系统下观察记录成像结果，如图1、图2、图3、图4所示。

4、遗传多样性分析

根据4对糙皮侧耳EST-SSR分子标记特异引物GL1、特异引物GL2、特异引物GL4和特异引物GL19在16个糙皮侧耳菌株上的扩增结果，统计清晰稳定的条带应用非加权类平均聚类方法对16个糙皮侧耳菌株进行了聚类分析。

5、多态性统计分析

统计在同一电泳迁移位置扩增条带的有无：有扩增条带的记为1，没有扩增条带的记为0，生成分子数据矩阵。利用NTSYS2.1软件的非加权平均数法(UPMGA)进行了聚类分析。结果如图5所示。由图可以看出该方法可以很好的应用于糙皮侧耳的遗传多样性分析、种质资源鉴定等。

实施例3

如实施例2所述的应用，不同之处在于，PCR扩增步骤增加了特异引物GL26在16个糙皮侧耳菌株上的扩增结果，结果如图6所示。经遗传多样性分析和多态性统计分析，结果如图8所示。

实施例4

如实施例3所述的应用，不同之处在于，PCR扩增步骤增加了特异引物GL38在16个糙皮侧耳菌株上的扩增结果，结果如图7所示。经遗传多样性分析和多态性统计分析，结果如图9所示。

Claims

1.一种糙皮侧耳EST-SSR分子标记特异引物组，它包括4对核苷酸序列如下所示的EST-SSR分子标记特异引物：

GL1F：ctgctcgttgtacacgcttc，GL1R：gaaagacagacgcgggatta；

GL2F：ggtaatctcggcttcacgat，GL2R：ttgagaatcttcggcacctc；

GL4F：gagcaggcgatctctttcaa，GL4R：gcgaagggagtggtacacat；

GL19F：agtacgtagctgccgtccag，GL19R：cctgatacgtcccgtaacca。

2.如权利要求1所述的特异引物组，其特征在于，还包括核苷酸序列如下所示的EST-SSR分子标记特异引物：

GL26F：tatgggcatgatgaagaacg，GL26R：cgacgacgacgactatgaga。

3、如权利要求1所述的特异引物组，其特征在于，还包括核苷酸序列如下所示的EST-SSR分子标记特异引物：

GL38F：tctttacatccacgccatga，GL38R：caaagtgaaggtgagcgaca。

4、权利要求1所述EST-SSR分子标记特异引物组在糙皮侧耳遗传多样性分析和种质资源鉴定方面的应用。

5、如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤如下：

（1）提取样品DNA；

（2）以步骤（1）提取的DNA为模板，利用EST-SSR分子标记特异引物组中的成对引物分别PCR扩增EST-SSR分子标记，得PCR产物；

（3）将步骤（2）制得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并对结果进行遗传多样性分析和多态性统计分析。

6、如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）提取样品DNA，步骤如下：

（i）刮取菌丝用液氮研磨，加入CTAB及RNA酶于60-65 ℃水浴1-2 h；

（ii）4 ℃ 12000 rpm离心10 min，取上清加入等体积的氯仿异戊醇混合液，混匀后，4 ℃ 12000 rpm离心10 min；

（iii）重复步骤（ii）；

（iv）取上清加入2倍体积的无水乙醇于-20 ℃静置2 h；

（v）4 ℃ 8000 rpm离心10 min，弃上清，用70 %乙醇洗2-3次，倒置晾干，加入适量TE溶解，即得样品DNA。

7、如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）的PCR扩增，反应体系为：

糙皮侧耳基因组DNA 50-100 ng，10×缓冲液2.5 μL，2.5 mmol的dNTPs 2 μL，2.5 U·μL^-1Taq 酶0.25 μL，浓度为10 μmol·L^-1的正向引物溶液1 μL，浓度为10 μmol·L^-1的反向引物溶液1 μL，添加ddH₂O至体系体积为25 μL；

PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min后进入循环；94 ℃变性30s；53～56 ℃复性45 s；72 ℃延伸1 min，反应35个循环；72 ℃延伸10 min。

8、如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）的琼脂糖凝胶电泳为2 %的琼脂糖凝胶电泳。

9、如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）的遗传多样性分析是根据EST-SSR分子标记特异引物组中的特异引物在糙皮侧耳样品DNA的扩增结果，经过统计清晰稳定的条带后，应用非加权类平均聚类方法对糙皮侧耳样品进行聚类分析。

10、如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）的多态性统计分析是根据统计在同一电泳迁移位置扩增条带的有无，有扩增条带的记为1，没有扩增条带的记为0，生成分子数据矩阵；然后，利用NTSYS 2. 1 软件的非加权平均数法进行了聚类分析。