CN112877457B - 一种真姬菇hm6菌种的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用 - Google Patents
一种真姬菇hm6菌种的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112877457B CN112877457B CN202110158808.2A CN202110158808A CN112877457B CN 112877457 B CN112877457 B CN 112877457B CN 202110158808 A CN202110158808 A CN 202110158808A CN 112877457 B CN112877457 B CN 112877457B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- strain
- ssr
- hypsizigus marmoreus
- band
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 title abstract description 7
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 title description 32
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 13
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 abstract description 3
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 34
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241001534815 Hypsizygus marmoreus Species 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108020000949 Fungal DNA Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 101001122597 Homo sapiens Ribonuclease P protein subunit p20 Proteins 0.000 description 2
- 102100028674 Ribonuclease P protein subunit p20 Human genes 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 235000014102 seafood Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 2
- 241000222485 Agaricales Species 0.000 description 1
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 1
- 241000726811 Carpinus betulus Species 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241000222589 Lyophyllaceae Species 0.000 description 1
- 241000218378 Magnolia Species 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000004579 marble Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种真姬菇HM6菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用，包括该指纹图谱由6对SSR标记组成。构建方法包括：(1)菌丝培养；(2)基因组DNA的提取；(3)SSR分子标记的检测；(4)毛细管电泳检测。应用包括：对真姬菇菌种进行SSR标记扩增，将得到的带型与指纹图谱对照，与该组指纹图谱一致即为真姬菇HM6菌种。本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，在收集的国内外56个真姬菇栽培主栽菌种中具有真姬菇HM6菌种的专一性。
Description
技术领域
本发明属于真姬菇菌种的检测技术领域，具体涉及一种真姬菇HM6菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用。
背景技术
真姬菇(拉丁文名Hypsizygus marmoreus(Peck)H.E.Bigelow)属担子菌门、伞菌纲、伞菌目、离褶伞科，因其菌盖表面的大理石斑纹而得名。其外形美观、质地脆嫩、具有独特的海鲜味且价格经济，受到广大消费者喜爱。真姬菇不仅含有丰富维生素和18种氨基酸，近年研究还发现真姬菇中所含的小分子化合物、多糖和多肽等成分具有溶血、抗氧化、抑制白血病和淋巴瘤细胞、降血脂、抗炎和抗氧化等功能，是一种经济价值很高的食药兼用菌。自从2001年我国第一家真姬菇工厂化栽培企业成立以来，真姬菇成为了我国市场发展较快的新型食用真菌之一。2019年中国真姬菇工厂化总产量为32.8万吨，较2018年同比增长58.63％，占食用菌工厂化总产量的9.6％，在我国工厂化栽培食用真菌生产总量中排名第三。
优质菌种在真姬菇的工厂化栽培中起着举足轻重的作用。目前，我国工厂化生产企业使用的真姬菇菌种主要为日本引入菌种或在其基础上进一步杂交选育而成，栽培后子实体为棕色的称为蟹味菇，子实体为白色的又称白玉菇或玉龙菇。尽管工厂化生产的产量逐年提升，但部分菌种仍存在栽培周期长、单产低、单根子实体外观整齐度差和易出现瘤盖等问题，这些缺陷都可能导致生产成本的增加，降低产品的市场竞争力。另一方面，由于真姬菇工厂化生产菌株的多样性不高，产品外观近似，无法满足市场消费者多样化的需求。我国有着丰富的真姬菇野生和自然栽培资源，高效利用这些优质的资源，拓展菌株的遗传基础，有利于国内高产、优质、特色真姬菇菌株的选育。
随着《国际植物新品种保护法》的颁布实施，建立成熟、快速、精准的分子生物学鉴定技术体系成为保护食用菌品种知识产权的有力手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种真姬菇“HM6”菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用，该指纹图谱与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。
真姬菇(Hypsizygus marmoreus)HM6，于2020年12月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No:61411。
本发明的一种真姬菇“HM6”菌种的SSR标记指纹图谱，该指纹图谱由6对SSR标记组成，是基于真姬菇基因组简单重复序列片段开发SSR引物，扩增带型好，重复性高的SSR引物，标记详细信息如表1：
表1 SSR标记详细信息列表
本发明的一种真姬菇“HM6”菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，包括：
(1)菌丝培养：将真姬菇菌种转接到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，22℃培养10-14d后收集菌丝；
(2)基因组DNA的提取：利用真菌DNA提取试剂盒，按照试剂盒实验步骤提取基因组DNA，并取2μL DNA进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；
(3)SSR分子标记引物开发：根据真姬菇菌株的基因组重测序结果，选取多态性序列设计SSR引物并合成；
(4)SSR分子标记的检测：对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增；
(5)电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物与甲酰胺加样缓冲液混匀，变性，上机检测；
(6)GeneMapper数据分析。
所述的真姬菇HM6菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)基因组DNA的提取，其具体方法包括：
(1)将真菌样本加入液氮充分研磨；
(2)向研磨好的粉末中迅速加入360μlBufferSTE和40μl Buffer SDS，迅速涡旋混匀后，将离心管放在65℃水浴15min，水浴过程中颠倒离心管以混合样本数次；
(3)加入5μL RNase Solution至裂解液中，涡旋混匀，室温静置15-30min；
(4)加入140μL Buffer PS，涡旋震荡30s，冰上放置10min；
(5)室温下，13000g离心5min，小心转移400μL上清液至新的离心管中；
(6)加入600μL Buffer PBD至样品中，涡旋混匀30s；
(7)把DNA结合柱装在收集管，转移一半混合液至柱子中，8000g离心1min；
(8)倒弃滤液把柱子装回收集管，转移剩余混合液至柱子中，8000g离心1min；
(9)倒弃滤液把柱子装回收集管，加入600μL Buffer GW2至柱子中，8000g离心1min；
(10)重复步骤9；
(11)倒弃滤液把柱子装回收集管，10000g离心2min去除柱子中残留的乙醇；
(12)将柱子转移至新的1.5ml离心管中，加入30μL预热至65℃的Buffer AE至柱子的膜中央，室温静置2min，10000g离心1min；
(13)取2μL DNA用于1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，取2μL DNA用于NanoDrop分光光度计测浓度，剩余DNA保存于-20℃。
所述步骤(3)中的PCR扩增体系为：总体积10μL，包括：10×PCR buffer1μL，2.5mmol/L dNTP 0.8μL，5U/μL TAKARA HSTaq酶0.1μL，5μmol/L TP-M130.5μL,5μmol/LSSR标记特异引物总体积各0.6μL，浓度20ng～30ng/μL提取的模板DNA 1.2μL，ddH2O 5.2μL；
PCR反应条件：95℃5min；95℃30second，58℃30second，72℃30second，30个循环；95℃5min；95℃30second，53℃30second，72℃30second，10个循环；60℃30min。
所述步骤(5)中的加样缓冲液为分子量内标和甲酰胺混合液(0.5：8.5)9μL；PCR扩增产物加样量1μL。
所述步骤(5)中的变性的具体工艺为于95℃变性3min，结束后置于冰水混合物中冷却3min。
所述步骤(5)中的电泳的工艺参数为：变性聚丙烯酰胺凝胶为商用POP7胶，电泳缓冲液为3730buffer EDTA，注入电压2000V，运行电压15000V，进样时间10s，温度60℃，毛细管长度50cm，功率200W，电泳20min，电流和功率均为动态。
所述步骤(6)中的数据分析具体为：将检测得到的原始数据文件导入到分析软件GeneMapper ID3.2中，运用POPGENE、NTSYS等软件进行群体结构分析、聚类及杂合度的分析，核心种质资源计算分析。分析等位基因数(Na，Ne)、Nei’s遗传多样性指数(He)、shannon’s多样性信息指数(I)和基因观测杂合度(Ho)。
表2 SSR引物扩增的等位片段信息汇总表
本发明的一种真姬菇“HM6”菌种的SSR标记指纹图谱的应用，是利用真姬菇基因组简单重复序列片段开发的6对SSR引物，本发明对大量的SSR引物进行了筛选，通过对收集的56份真姬菇主要栽培品种的SSR引物带型扩增，确定了6对SSR引物在各个真姬菇栽培品种中扩增出的等位片段的数量并编号(表2)，通过不同SSR等位位点的编号组合能够在所收集的56份主栽品种中有效识别“HM6”菌种。通过毛细管电泳结合软件分析可确定各SSR引物扩增的等位位点的相对分子量，存在“HM6”菌种特异SSR等位片段组合的菌种即是真姬菇“HM6”菌种，该菌种的编号组合为：(9+12)/(2+4)/(1+3)/(1+4)/(4+7)/(4+6)。
本发明的有益效果：本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。检测所需的操作时间在24h以内(包括提取基因组DNA、PCR扩增、电泳分析、数据分析)，而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间，出菇试验则需要至少3个月的时间；本发明方法在所收集的56个市售真姬菇主栽培菌种中具有“HM6”菌种的专一性，具有良好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为引物HMSSR5分别在所选真姬菇栽培材料“HM6”和几种主栽商业品种中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；
图2为引物HMSSR18分别在所选真姬菇栽培材料“HM6”和几种主栽商业品种中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；
图3为引物HMSSR22分别在所选真姬菇栽培材料“HM6”和几种主栽商业品种中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；
图4为引物HMSSR32分别在所选真姬菇栽培材料“HM6”和几种主栽商业品种中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；
图5为引物HMSSR35分别在所选真姬菇栽培材料“HM6”和几种主栽商业品种中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；
图6为引物HMSSR38分别在所选真姬菇栽培材料“HM6”和几种主栽商业品种中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1：
(1)菌丝培养：将真姬菇菌种转接到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，22℃培养10d后收集菌丝；
(2)基因组DNA的提取：利用真菌DNA提取试剂盒，按照试剂盒实验步骤提取基因组DNA，并取2μL DNA进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；
CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括：
①将真菌样本加入液氮充分研磨；
②向研磨好的粉末中迅速加入360μL BufferSTE和40μL Buffer SDS，迅速涡旋混匀后，将离心管放在65℃水浴15min，水浴过程中颠倒离心管以混合样本数次；
③加入5μL RNase Solution至裂解液中，涡旋混匀，室温静置15-30min；
④加入140μL Buffer PS，涡旋震荡30s，冰上放置10min；
⑤室温下，13000g离心5min，小心转移400μL上清液至新的离心管中；
⑥加入600μL Buffer PBD(已用无水乙醇稀释)至样品中，，涡旋混匀30s；
⑦把DNA结合柱装在收集管，转移一半混合液至柱子中，8000g离心1min；
⑧倒弃滤液把柱子装回收集管，转移剩余混合液至柱子中，8000g离心1min；
⑨倒弃滤液把柱子装回收集管，加入600μL Buffer GW2(已用无水乙醇稀释)至柱子中，8000g离心1min；
⑩重复步骤9；
(3)SSR分子标记的检测：对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增；
PCR扩增体系为：总体积10μL，包括：10×PCR buffer 1μL，2.5mmol/L dNTP 0.8μL，5U/μL TAKARA HSTaq酶0.1μL，5μmol/L TP-M130.5μL,5μmol/L SSR标记特异引物总体积各0.6μL，浓度20ng～30ng/μL提取的模板DNA 1.2μL，ddH2O 5.2μL；
PCR反应条件：95℃5min；95℃30second，58℃30second，72℃30second，30个循环；95℃5min；95℃30second，53℃30second，72℃30second，10个循环；60℃30min。
(4)电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物1μL与9μL加样缓冲液混匀，95℃变性3min，结束后置于冰水混合物中冷却3min；点样3μL于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，变性聚丙烯酰胺凝为商用POP7胶，电泳缓冲液为3730buffer EDTA，注入电压2000V，运行电压15000V，进样时间10s，温度60℃，毛细管长度50cm，功率200W，电泳20min，电流和功率均为动态，
(5)结果分析
采用6对SSR引物对真姬菇菌株进行PCR扩增和毛细管电泳，通过分析等位基因数(Na，Ne)、Nei’s遗传多样性指数(He)、shannon’s多样性信息指数(I)和基因观测杂合度(Ho)，结合等位位点的相对分子量峰图，找到符合编号组合为：HMSSR5、HMSSR18、HMSSR22、HMSSR32、HMSSR35、HMSSR38，相应带型为：(9+12)/(2+4)/(1+3)/(1+4)/(4+7)/(4+6)的菌种，即可确定该菌种为真姬菇“HM6”菌种。为保证鉴定的准确性，建议进行三次重复实验。
以几种主栽商业品种为例，给出6对引物依次检测得到的等位位点相对分子量峰图，如图1～6所示(依次为①HM6②K③B2④15-X2⑤14-X1⑥13-X6⑦H2⑧BS027⑨X5⑩DTG
B4)。
本发明所述指纹图谱，是指所述引物及其带型组合。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种真姬菇HM6菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用
<130> 2021020402-zf-wjn
<141> 2021-02-04
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacaccttac gaggtgagca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgtttgatgt tagccgaacg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaggattgaa gggactgtcg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctcatcctc cgactctacg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgctggtgag tgagttggag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acggcgacat aatctgctct 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aacctccagt cacaacctgc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccttgcttct tgtcggatgt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tccgtgagag gacggagtag 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctcagcaacg acgaacaacc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcttcttgtt cggcggtatc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atccggcaca ggtaaagatg 20
Claims (2)
1.一种真姬菇HM6菌种的SSR标记的指纹图谱鉴定方法，其特征在于：所述指纹图谱由6个SSR标记位点组成，其对应的6对引物的具体序列如下：
HMSSR5正向引物：CACACCTTACGAGGTGAGCA；
反向引物：TGTTTGATGTTAGCCGAACG；
HMSSR18正向引物：GAGGATTGAAGGGACTGTCG；
反向引物：CCTCATCCTCCGACTCTACG；
HMSSR22正向引物：TGCTGGTGAGTGAGTTGGAG；
反向引物：ACGGCGACATAATCTGCTCT；
HMSSR32正向引物：AACCTCCAGTCACAACCTGC；
反向引物：CCTTGCTTCTTGTCGGATGT；
HMSSR35正向引物：TCCGTGAGAGGACGGAGTAG；
反向引物：CTCAGCAACGACGAACAACC；
HMSSR38正向引物：TCTTCTTGTTCGGCGGTATC；
反向引物：ATCCGGCACAGGTAAAGATG；
相应带型编号组合为：(9+12)/(2+4)/(1+3)/(1+4)/(4+7)/(4+6)；
其中，引物HMSSR5对应的带型编号为9+12，其中编号9对应的等位基因片段的条带大小为207~207.99bp，编号12对应的等位基因片段的条带大小为237~237.99bp；
引物HMSSR18对应的带型编号为2+4，其中编号2对应的等位基因片段的条带大小为256~256.99bp，编号4对应的等位基因片段的条带大小为262~262.99bp；
引物HMSSR22对应的带型编号为1+3，其中编号1对应的等位基因片段的条带大小为174~174.99bp，编号3对应的等位基因片段的条带大小为189~189.99bp；
引物HMSSR32对应的带型编号为1+4，其中编号1对应的等位基因片段的条带大小为224~224.99bp，编号4对应的等位基因片段的条带大小为230~230.99bp；
引物HMSSR35对应的带型编号为4+7，其中编号4对应的等位基因片段的条带大小为127~127.99bp，编号7对应的等位基因片段的条带大小为130~130.99bp；
引物HMSSR38对应的带型编号为4+6，其中编号4对应的等位基因片段的条带大小为177~177.99bp，编号6对应的等位基因片段的条带大小为180~180.99bp；
所述真姬菇HM6菌种的保藏编号为GDMCC No:61411。
2.权利要求 1 所述的真姬菇HM6菌种的SSR标记的指纹图谱的应用，其特征在于：所述真姬菇HM6菌种的SSR标记的指纹图谱用于鉴定真姬菇HM6菌种的特异等位变异，和/或鉴定真姬菇HM6菌种的特异性。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110158808.2A CN112877457B (zh) | 2021-02-04 | 2021-02-04 | 一种真姬菇hm6菌种的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110158808.2A CN112877457B (zh) | 2021-02-04 | 2021-02-04 | 一种真姬菇hm6菌种的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112877457A CN112877457A (zh) | 2021-06-01 |
| CN112877457B true CN112877457B (zh) | 2023-03-24 |
Family
ID=76057389
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110158808.2A Active CN112877457B (zh) | 2021-02-04 | 2021-02-04 | 一种真姬菇hm6菌种的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112877457B (zh) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101684487B (zh) * | 2008-09-24 | 2013-11-06 | 上海市农业科学院 | 一种真姬菇工厂化栽培菌株的ssr分子标记鉴别方法 |
| CN102181559B (zh) * | 2011-04-28 | 2013-02-06 | 山东省农业科学院农业资源与环境研究所 | 一种糙皮侧耳est-ssr分子标记特异引物体系及其应用 |
-
2021
- 2021-02-04 CN CN202110158808.2A patent/CN112877457B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112877457A (zh) | 2021-06-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112746125A (zh) | 一种真姬菇沪华8号菌种的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用 | |
| CN113005219A (zh) | 一种真姬菇荣白001(f)菌种的ssr标记指纹图谱鉴定方法及其构建方法与应用 | |
| CN112877457B (zh) | 一种真姬菇hm6菌种的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用 | |
| CN112708696B (zh) | 一种真姬菇Finc-F-4菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用 | |
| CN112795681B (zh) | 一种真姬菇hm18菌种的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用 | |
| CN112813182B (zh) | 一种真姬菇沪真23号菌种的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用 | |
| CN112695129B (zh) | 一种真姬菇沪真12号菌种的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用 | |
| CN112695130B (zh) | 一种真姬菇沪真22号菌种的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用 | |
| CN112760406B (zh) | 一种真姬菇hm22菌种的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用 | |
| CN112795687B (zh) | 一种真姬菇hm21菌种的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用 | |
| CN112877458B (zh) | 一种真姬菇hm36菌种的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用 | |
| CN112795688B (zh) | 一种真姬菇hm13菌种的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用 | |
| CN112746126B (zh) | 一种真姬菇Finc-B-7菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用 | |
| CN112708694B (zh) | 一种真姬菇Finc-B-3菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用 | |
| CN112813183B (zh) | 一种真姬菇Finc-B-6菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用 | |
| CN112795680B (zh) | 一种真姬菇Finc-N-11菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用 | |
| CN112795686B (zh) | 一种真姬菇沪真18号菌种的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用 | |
| CN112708695B (zh) | 一种真姬菇Finc-W-247菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用 | |
| CN112695131B (zh) | 一种真姬菇沪真29号菌种的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用 | |
| CN112746128B (zh) | 一种真姬菇hm3菌种的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用 | |
| CN112980991B (zh) | 一种真姬菇沪真30号菌种的ssr标记指纹图谱的鉴定方法及其构建方法与应用 | |
| CN112760407A (zh) | 一种真姬菇hm37菌种的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用 | |
| CN112795685A (zh) | 一种真姬菇沪真11号菌种的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用 | |
| CN112695132A (zh) | 一种真姬菇沪真27号菌种的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用 | |
| CN112695127A (zh) | 一种真姬菇沪华2号菌种的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |