CN103013986B

CN103013986B - 利用est序列的冗余性开发辣椒ssr标记及其方法

Info

Publication number: CN103013986B
Application number: CN201110279445.4A
Authority: CN
Inventors: 邹学校; 孔秋生; 陈文超; 张竹青; 张广平
Original assignee: INST OF VEGETABLES HUNAN PROV; Huazhong Agricultural University
Current assignee: INST OF VEGETABLES HUNAN PROV; Huazhong Agricultural University
Priority date: 2011-09-20
Filing date: 2011-09-20
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2031-09-20
Also published as: CN103013986A

Abstract

本发明属于分子标记开发技术领域。具体涉及一种利用EST序列的冗余性开发辣椒SSR标记及其制备方法。本发明是利用公共序列数据库中EST来源的异质性和冗余性的特点，以冗余的辣椒EST为研究对象，通过对冗余EST序列的比对，鉴定出多态性的EST-SSR位点并实验验证其多态性。本发明获得33个辣椒EST-SSR标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1-66所示。本发明不仅效率高，而且开发了大量低重复次数的SSR标记，显著地增加了SSR标记的数量，为辣椒遗传育种研究提供了有力的遗传工具。

Description

利用EST序列的冗余性开发辣椒SSR标记及其方法

技术领域

本发明属于植物分子标记开发技术领域，具体涉及到利用公共序列数据库中EST序列的冗余性开发辣椒SSR标记的方法，所开发的标记可用于辣椒分子标记辅助选择育种等研究。

背景技术

SSR(simple sequence repeats，简单序列重复)标记因具有数量丰富、多态性高、重复性好、呈共显性遗传等优良特性，而被广泛地应用于高密度连锁图谱的构建、基因定位和分子标记辅助选择等研究。但按照传统的方法，SSR标记的开发需要构建基因组文库和筛选阳性克隆等操作，不仅费时费力而且成本高。

对于有一定数量DNA序列信息的物种来讲，一个实用、经济和直接的方法是利用已有的DNA序列搜寻SSR位点。

随着测序技术的发展，全基因组测序的速度越来越快，成本也在逐渐降低，已有一些具有重要经济价值的作物被测序。利用全基因组序列可以开发大量的SSR标记，从而避免传统的SSR标记开发所需的复杂操作(Ren Y，Zhang ZH，Liu JH，Staub JE，Han YH，Cheng ZC，Li XF，Lu JY，Miao H，Kang HX，Xie BY，GuXF，Wang XW，Du YC，Jin WW，Huang SW.Integrated Genetic and Cytogenetic Map of the Cucumber Genome.Plos One.2009，4(6)：e5795)。但目前仅有一些模式作物和主要的农作物完成了基因组测序，对于大多数农作物而言，尚无全基因组序列可以利用。

当前，开发SSR标记的另一个序列来源是EST(expressed sequence tags，表达序列标签)。随着功能基因组学的发展，EST被大规模测序，并存放在公共序列数据库中。利用EST序列，采用in silico的方法筛选SSR已经成为一个简单易行的开发SSR标记的方法。目前已开发出多种软件可用于SSR位点的鉴定，极大地提高了SSR标记的开发效率。因此，采用数据挖掘技术，利用公共序列数据库中丰富的EST序列鉴定和开发SSR标记，已经成为当前开发SSR标记的主要方法。

利用EST序列开发SSR标记的主要障碍是EST序列的冗余性，即在基因组上同一个位点可能产生多个重复的SSR标记。冗余性是EST序列的特征之一，其产生的原因主要是很多EST可能是来自于同一个高丰度表达的基因。因此，为克服EST序列的冗余性，避免同一位点的SSR标记被重复开发，在鉴定SSR位点之前需要对EST序列进行拼接，产生一致的基因序列，即Unigene，然后再基于Unigene来开发SSR标记，则可以克服EST序列冗余性的缺点(Kong Q，Xiang C，Yu Z.2006.Development of EST-SSRs in Cucumis sativusfrom sequence database.Molecular Ecology Notes，6：1234-1236；王长彪等，一种SSR分子标记冗余性的生物信息学分析方法.专利申请号：201010601582.0)。

目前利用公共序列数据库中的EST开发EST-SSR的一般程序是：获得EST序列，对EST序列进行拼接处理获得Unigene，消除序列冗余性并延长转录片段长度，然后利用SSR位点搜寻软件以一定的标准(通常是5次以上重复)在Unigene上鉴定SSR位点，最后用实验验证SSR位点的多态性(Kong Q，XiangC，Yu Z.2006.Development of EST-SSRs in Cucumis sativus from sequence database.Molecular Ecology Notes，6：1234-1236.)。这一方法虽然可以大量地鉴定出SSR位点，但通常获得的多态性的SSR位点的比率比较低。因为很多基于序列特征被鉴定出来的SSR位点，可能是基因组上特有的序列结构，并不具有SSR的变异性。此外，以往的研究很少去开发5次重复以下的SSR位点。

公共序列数据库具有开放性的特点，这一特点也使得数据库中的序列来源具有高度异质性，即这些序列是不同实验室、利用不同基因型的材料所获得的，同时，这也是EST序列产生冗余性的原因之一。因此，冗余序列可能含有SSR长度多态性的信息。而这些信息当前都被忽略了，因为SSR鉴定前通常要消除序列的冗余性。

李文滨等(李文滨等，一种获得EST-SSR标记的方法.专利申请号：200910090407.7)也曾考虑到将含有相同SSR重复单元的EST序列进行拼接，然后在重叠群中寻找重复单元数目有变异的EST序列用来开发SSR标记，这种方法显著提高了多态性EST-SSR效率。但这种方面也有着明显的缺陷：首先，该方法是在鉴定出潜在的SSR位点基础上，再来拼接寻找有变异的位点，这样SSR位点的鉴定还是受限于鉴定最初寻找含有SSR位点的EST序列时所采用的标准，不容易发现更低重复次数的SSR位点；其次，这种方法需要先手工挑出含有相同重复单元的EST序列，然后再进行EST序列拼接，操作比较复杂，效率低，无法实现自动化的高通量操作，因此，无法适应目前处理海量EST序列的要求。

辣椒(Capsicum annuum L.)是主要的蔬菜作物之一，具有重要的经济价值。开发辣椒的SSR标记，对于辣椒的遗传育种研究具有非常重要的意义。目前利用基因组文库或公共数据库中的序列信息，在辣椒上总共开发了500多个SSR标记(Huang S，Zhang B，Milbourne D，Cardle L，Yang G，Guo J.2000.Development of pepper SSR markers from sequence databases.Euphytica，117：163-167；Lee J M，Nahm S H，Kim Y M，Kim B D.2004.Characterization and molecular genetic mapping of microsatellite loci in pepper.Theoretical and Applied Genetics，108：619-627；Minamiyama Y，Tsuro M，Hirai M.2006.An SSR-based linkage map of Capsicum annuum.Molecular Breeding 18：157-169；Yi G.B，Lee J M，Lee S，Choi D，Kim B D.2006.Exploitation of pepper EST-SSRs and an SSR-based linkage map.Theoretical and Applied Genetics 114，113-130.；Nagy I，Stagel A，Sasvari Z，Roder M，Ganal M.2007.Development，characterization，and transferability to other Solanaceae of microsatellite markers in pepper(Capsicum annuum L.).Genome，50，668-688；Portis E，Nagy I，Sasvari Z，Stagel A，Barchi L，Lanteri S.2007.The design of Capsicum spp.SSR assays via analysis of in silico DNA sequence，and their potential utility for genetic mapping.Plant Science，172：640-648.；李晶晶，王述彬，刘金兵，潘宝贵，陈劲枫.2008.辣椒EST-SSR标记的开发.分子植物育种，6(6)：1219-1222；Ince A G，Karaca M，Onus A N.2010.Polymorphic Microsatellite Markers Transferable Across Capsicum Species.Plant Molecular Biology Reporter 28，285-291.)。但这些标记开发时利用的EST序列数量都非常有限，最多的也只用了2万多条，而且都是利用去除EST序列冗余性后的Unigene开发的。辣椒具有相对比较大的基因组，辣椒属不同种的基因组大小在3753～4763Mb之间，而辣椒栽培种内DNA水平上的多态性也比较低。因此，已有的辣椒SSR标记，还远不能满足辣椒高密度作图的需要。

目前在GenBank数据库中保存的辣椒EST序列已经超过了11万条，这些序列为辣椒SSR标记的开发提供了丰富的资源，但绝大部分序列尚没有被用来开发SSR标记，尤其是低重复次数的SSR标记。

本发明利用公共序列数据库中EST来源的异质性和冗余性的特点，另辟蹊径地通过对冗余性EST进行序列比对分析，鉴定出多态性SSR位点，然后再实验验证该位点的多态性，显著地提高了多态性EST-SSR标记的开发效率。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种利用EST序列的冗余性开发的辣椒SSR标记及其制备方法。

本发明是利用公共序列数据库中EST来源的异质性和冗余性的特点，以冗余的EST为研究对象，通过对冗余EST序列的比对，鉴定多态性的EST-SSR位点并实验验证其多态性，为辣椒遗传育种研究提供有力的遗传工具。

本发明的总体技术方案如下所示(本发明的技术流程图见图1)：

(1)从NCBI数据库中检索并下载辣椒的EST序列；

(2)对辣椒EST序列进行拼接；

(3)拼接后产生的Contig(重叠群)含有所有冗余的EST序列，在Contig序列比对结果中，用office软件提供的查找功能，以“--”为检索符，查找序列比对结果中的序列缺失部分(gap)，再分析其紧邻的非缺失序列是否具有SSR特征。SSR位点的判断标准为：重复基序长度为2-6bp，重复次数＞2。如没有SSR特征，则放弃该序列；如果有SSR特征，则被认为是一个潜在的多态性EST-SSR位点；

(4)利用拼接所产生一致性序列，设计多态性EST-SSR位点侧翼引物；

(5)从不同基因型的辣椒材料的嫩绿叶片中提取总DNA；

(6)用步骤(4)的侧翼引物分别扩增步骤(5)所述的材料，验证EST-SSR位点的多态性，具有多态性的EST-SSR位点的引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1-66所示；

(7)计算每对引物的多态性信息含量，并对EST-SSR标记进行功能注释。

本发明的具体实施方案如下所示：

1.辣椒EST序列的获得：登录NCBI的主页(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，在All database数据库中，利用“capsicum annuum[orgn]and EST”词条检索来自辣椒的EST序列。获得检索结果后，将辣椒的EST序列下载到本地计算机中。

2.辣椒EST序列的拼接：利用CAP3(Huang X，Madan A.1999.CAP 3：a DNA sequence assembly program.Genome Research，9：868-877.)软件对EST序列进行拼接。CAP3的参数取默认值，其中，重叠一致百分比域值(Overlap percent identity cutoff)N＞80；重叠长度域值(Overlap length cutoff)N＞40。

3.多态性EST-SSR位点的鉴定：在CAP3软件产生的CAP3out文件中提取“detailed display ofcontigs”比对的结果，用office软件提供的查找功能，以“--”为检索符，查找序列比对和拼接结果中的序列缺失部分(gap)，再分析其紧邻的非缺失序列是否具有SSR特征。SSR位点的判断标准为：重复基序长度为2-6bp，重复次数＞2。如没有SSR特征，则放弃该序列；如果有SSR特征，则被认为是一个潜在的多态性EST-SSR位点。

4.EST-SSR引物的设计：对含有多态性EST-SSR的位点，以CAP3软件产生的一致性序列为基础，利用Primer3(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)软件设计SSR位点两侧引物，软件参数设置为：引物最适长度为20bp，退火温度为58℃，扩增产物大小为100-300bp。

5.供试材料：用从市场上购买的31份辣椒商品品种为植物材料，验证EST-SSR位点的多态性。按照常规方法将所购买的辣椒品种种植于田间，在辣椒4叶幼苗期，采集其嫩叶，用天根生化科技(北京)有限公司生产的DNA Isolation Kit试剂盒(按照说明书上描述的方法)提取辣椒基因组DNA，用NARODROP2000(Thermo公司产品)检测DNA浓度和纯度。将A260与A280比值大于1.8的高质量DNA样本，稀释成20ng/μL工作液，用于PCR扩增。

6.PCR扩增和电泳：PCR反应的总体积为10μL，含有1x Buffer，2mM MgCl₂，200μM dNTPs，0.2μM引物，0.5U Taq酶，20ng DNA。PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s 72℃45s，35个循环；72℃5min；12℃保存。PCR反应产物采用8％非变性PAGE胶检测，电泳在DYCZ-30型电泳仪(北京市六一仪器厂产品)上进行，以120V恒压电泳2h，银染染色。

7.多态性信息含量的计算：根据下列公式计算EST-SSR标记的多态性信息含量(Polymorphic Information Content，PIC)，PIC是度量标记多态性检测能力的一个工具，PIC值越高，表明该位点的多态性越高。

PIC = 1 - Σ_{i = 1}^{k} P_{i}^{2}

式中k是一个SSR所检测到的等位基因的数量，P_l是第i个等位基因的频率。

同时，利用POPGENE1.32软件(Yeh F C，Boyle T J B.1997.Population genetic analysis ofco-dominant and dominant markers and quantitative traits.Belgian Journal of Botany，129：157.)计算每个EST-SSR的观测杂合度、期望杂合度。

8.EST-SSR标记的功能注释：对具有多态性的SSR位点，将其所在的EST序列用Blastx(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastx&BLAST_PROGRAMS＝blastx&PAGE_TYPE＝BlastSearch&SHOW_DEFAULTS＝on&LINK_LOC＝blasthome)工具，以E值＜10^-7为标准搜寻NCBI的非冗余蛋白质数据库(Non-redundant protein sequences(nr))，对含有多态性EST-SSR位点序列进行功能注释。

本发明的特点在于：利用公共序列数据库中EST来源的异质性和冗余性，通过对冗余序列的比对，直接获得多态性EST-SSR位点。

本发明的优点在于：

1.新颖性。在利用EST序列开发EST-SSR标记的过程中，EST序列的冗余性是一把双刃剑。早期利用EST序列开发SSR标记时，并不对EST序列进行拼接处理，也就无法排除EST冗余性的影响，导致同一SSR位点被重复开发。而后随着EST序列数量的急剧增长和EST处理软件的不断完善和应用，人们在利用EST序列时，通常都会对EST序列进行处理和拼接，以去除载体序列的污染和消除EST序列的冗余性，然后利用一致性序列开发EST-SSR标记，这种方法提高了EST-SSR标记开发的准确性，但忽略了冗余性EST中所含有的多态性信息。本发明利用公共数据库中冗余的EST序列来开发SSR标记，大大地提高了EST-SSR标记开发的成功率，具有方法上的新颖性。

本发明对118,060条来自NCBI的辣椒EST序列进行处理和拼接，获得了12,292个重叠群(contig)和18,467个singleton，覆盖基因组的长度为23.12Mbp。对含有冗余EST序列的contig进行搜索，鉴定出68个多态性的SSR位点，其中有65个位点可以设计引物。

2.高效性。利用一致性序列(即去除冗余性以后的序列)开发SSR标记的方法当前被广泛使用，这种方法具有高通量的特点，一次能鉴定和开发出大量的EST-SSR标记。但是由于有些被鉴定出来的串联重复序列本身就是基因组上的序列结构，并不具有SSR位点的可变性，因此，利用这种方法开发出来的多态性EST-SSR位点的比率通常都不高。而公共序列数据库中的EST序列具有高度的异质性和冗余性，即由不同实验室利用不同基因型材料测序获得，本发明直接利用公共序列数据库中EST序列的这一特点，通过对冗余的EST序列比对，直接而高效地鉴定多态性EST-SSR位点。与传统的开发EST-SSR标记的方法相比，本研究所利用的这种方法虽不具有高通量的特点，但却显著地提高了多态性EST-SSR位点的开发效率。

本发明利用31份辣椒材料对65个可设计引物的EST-SSR位点的多态性进行实验验证，获得了33个多态性EST-SSR标记，其基序重复次数分布在2-10次之间，重复次数在5次以下的多态性EST-SSR位点有18个，占总数的55％。

因此，本发明为在辣椒和其它作物上进一步挖掘公共序列数据库中的序列信息，开发低重复次数的SSR标记提供了一种高效的实验方法。

3.实用性。通常对EST序列的处理都需要用专业的生物信息学软件，或者专业人员通过自编程序来完成，这极大限制了育种家对EST-SSR标记的开发和利用。本发明利用常用的文字处理软件的查找功能，鉴定多态性SSR位点，具有简单实用的特点。

4.前瞻性。随着转录组测序技术的大规模应用和测序成本的降低，EST序列的数量已经呈现出爆炸式的增长，公共序列数据库中EST序列的冗余量也会越来越丰富。而本发明所采用的利用EST的冗余性开发EST-SSR标记的优势逐渐会得到体现，可以预见随着EST序列数量的增多，本方法将来可能会成为开发EST-SSR标记的主要方法之一。

附图说明

序列表SEQ IDNO：1-66是本发明开发的EST-SSR标记引物的核苷酸序列。

图1：利用序列数据库中EST序列的冗余性开发辣椒SSR标记的流程图。

图2：利用EST序列的冗余性开发辣椒CAK6标记举例。A：Contig中序列比对的结果；B：多态性验证的电泳结果。图中：箭头标注的地方为引物结合位点，方框标注地方为多态性SSR位点，重复基序为(GCC)3-(GCC)6。

图3CAK6在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图4CAK7在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图5CAK10在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图6CAK12在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图7CAK13在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图8CAK14在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图9CAK15在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图10CAK18在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图11CAK18在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图12CAK20在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图13CAK21在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图14CAK22在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图15CAK24在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图16CAK28在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图17CAK30在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图18CAK31在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图19CAK33在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图20CAK35在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图21CAK36在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图22CAK40在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图23CAK41在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图24CAK43在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图25CAK45在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图26CAK46在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图27CAK47在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图28CAK52在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图29CAK54在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图30CAK55在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图31CAK56在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图32CAK58在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图33CAK59在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图34CAK61在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

图35CAK64在31份辣椒种质上的扩增结果(图中：1-31对应的是表2中的辣椒品种，M：是Marker)。

具体实施方式：

实施例1

(1)辣椒EST序列的获得和拼接：登录NCBI的主页(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，在All database数据库中，利用“capsicum annuum[orgn]and EST”词条检索来自辣椒的EST序列。获得检索结果后，将辣椒的EST序列下载到本地计算机。截止到2011年3月31日，在NCBI数据库中共检索到118,060条来自辣椒的EST序列。利用CAP3软件对来自于辣椒的EST序列进行拼接，产生了30,759个Unigene，其中包括12,292个contig和18,467个singleton，覆盖基因组的长度为23.12Mbp。

(2)多态性EST-SSR位点的鉴定：在CAP3软件产生的CAP3out文件中提取“detailed display of contigs”比对的结果，用office软件提供的查找功能，以“--”为检索符，查找序列比对和拼接结果中的序列缺失部分(gap)，再分析其紧邻的非缺失序列是否具有SSR特征。SSR位点的判断标准为：重复基序长度为2-6bp，重复次数＞2。如没有SSR特征，则放弃该序列；如果有SSR特征，则被认为是一个潜在的多态性EST-SSR位点。共鉴定出68个含有多态性SSR位点的contig。

(3)引物设计：对含有多态性EST-SSR的位点，以CAP3软件产生的一致性序列为基础，利用Primer3(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)软件设计SSR位点两侧引物。引物设计参数设定为：引物最适长度为20bp，退火温度为58℃，扩增产物大小为100-300bp。在鉴定出的68个多态性SSR位点中，有65个位点可以设计引物。65个EST-SSR位点的特征及引物序列信息见表1。

表1从辣椒冗余EST序列中鉴定出来的多态性EST-SSR位点信息及其引物核苷酸序列

(4)多态性EST-SSR位点特征分析：在可设计引物的多态性位点中，基序的长度分布范围为2-6bp。其中，含有2bp基序的位点有11个，含有3bp基序的位点有23个，含有4bp基序的位点有9个，含有5bp基序的位点有7个，含有6bp基序的位点有15个。不同长度基序位点数量分布较为均匀。基序的重复次数分布范围为2-14bp。出现最多的是2次和3次重复，都有14个位点。5次重复以下的位点有38个，占总数的58.5％。10次重复以下的位点数有62个，占总数的95.5％。13次和14次重复的位点数分别出现了1次和2次。

(5)辣椒基因组DNA的提取：用从市场上(武汉市武昌区盛华种业经营部)购买的不同基因型的31份辣椒商品种(见表2)为提取辣椒基因组DNA的材料，验证EST-SSR位点的多态性。取种植于田间的辣椒4叶期幼苗嫩叶提取总DNA(采用北京天根公司生产的DNA Isolation Kit试剂盒提取，按试剂盒说明书的方法操作)，采用Thermo公司生产的分光光度计(仪器型号：NARODROP2000)检测提取的DNA浓度和纯度。将A260与A280比值大于1.8的高质量DNA样本，稀释成20ng/μL工作液，用于PCR扩增。

表2提辣椒取基因组DNA并用于EST-SSR分析的辣椒品种名称

编号	品种名称	编号	品种名称	编号	品种名称
						1	鸡爪椒	12	湘研19号	23	云干椒3号
2	伏地尖	13	苏椒五号	24	秀丽202
						3	红丰404	14	郑椒505	25	茄门甜椒
4	博辣红玉	15	湘早秀	26	川椒子弹头
						5	福湘秀丽	16	福湘迎春	27	湘研166
6	副湘碧秀	17	博辣红帅	28	干鲜二号
						7	兴蔬201	18	博辣红秀	29	湘研159
8	兴蔬绿燕	19	博辣红牛	30	早椒王
						9	福湘佳玉	20	兴蔬301	31	遵义子弹头
10	福湘探春	21	湘研808
						11	兴蔬16号	22	兴蔬羽燕

(6)PCR扩增和电泳：PCR反应的总体系为10μL，含有1x Buffer，2mM MgCl₂，200μM dNTPs，0.2μM primer，0.5U Taq酶，20ng DNA。PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s 72℃45s，35个循环；72℃5min；12℃保存。

PCR反应产物采用8％非变性PAGE胶检测，电泳在DYCZ-30型电泳仪(购自北京市六一仪器厂)上进行，以120V恒压电泳2h，银染染色。在65个EST-SSR位点中，有2个位点无扩增产物，8个EST-SSR位点有非特异性扩增产物，有3个EST-SSR位点，的扩增产物大于预期片段，有52个位点扩增出了目标特异性片段。扩增出的等位基因数量范围为1-6个，平均每个位点扩增出2.15个等位基因。有19个位点的扩增产物在31份辣椒材料中表现出了单态性。有33个EST-SSR位点在31份辣椒种质材料中表现出了多态性。共扩增出91个等位基因，平均每个位点扩增出2.76个等位基因。检测到等位基因最多的是CAK33，共检测出6个等位基因。33个多态性EST-SSR位点的引物序列信息见SEQ ID NO：1-66和表3所示。

表3经验证具有多态性的辣椒EST-SSR位点及引物序列信息

(7)辣椒EST-SSR标记的多态性信息含量：EST-SSR位点的平均多态性信息含量(PIC)为0.38，其中CAK13位点的多态性信息含量最低，为0.03；CAK30的多态性信息含量最高，为0.74。此外，33个多态性EST-SSR位点的平均观测杂合度为0.28，EST-SSR位点的平均期望杂合度为0.39。

(8)辣椒EST-SSR标记的功能注释：用Blastx对非冗余蛋白序列数据库的比对发现，在33个多态性EST-SSR位点中，除CAK22、CAK40、CAK43、CAK46、CAK47和CAK54外，其它27个位点都与已知功能基因高度同源，这些功能基因涉及到种子成熟(CAK6)、逆境响应(CAK58)等众多生理过程，这些功能注释为以后开发SSR功能标记提供了非常有用的信息。此外，多数位点多个位点，如CAK21、CAK24、CAK55、CAK64，都与家族基因高度同源，这也可能是这些位点产生多态性的原因。33个EST-SSR标记在31份辣椒种质中扩增的多态性及功能注释见表4。

表4EST-SSR标记在31份辣椒种质中扩增的多态性及功能注释

Claims

1.如序列表SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列作为辣椒EST-SSR标记的应用。

2.一种利用EST序列的冗余性开发辣椒SSR标记的方法，其特征在于下述步骤：

（1）从NCBI数据库中检索并下载辣椒的EST序列；

（2）利用CAP3软件对辣椒EST序列进行拼接；

（3）对拼接后产生的重叠群（Contig）含有所有冗余的EST序列，在Contig序列比对结果中，用office软件提供的查找功能，以“--”为检索符，查找序列比对结果中的序列缺失部分（gap），再分析其紧邻的非缺失序列是否具有SSR特征，SSR位点的判断标准为：重复基序长度为2-6bp，重复次数>2，如没有SSR特征，则放弃该序列；如果有SSR特征，则被认为是一个潜在的多态性EST-SSR位点；

（4）利用拼接所产生一致性序列，设计多态性EST-SSR位点侧翼引物；

（5）从不同基因型的辣椒材料的嫩绿叶片中提取总DNA；

（6）用步骤（4）的侧翼引物分别扩增步骤（5）所述的材料，验证EST-SSR位点的多态性，具有多态性的EST-SSR位点的引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1-66所示；

（7）计算每对引物的多态性信息含量，并对EST-SSR标记进行功能注释；

其中

步骤（6）的扩增条件如下：

PCR反应的总体积为10μL，含有1x Buffer，2mM MgCl₂，200μM dNTPs，0.2μM引物，0.5U Taq酶，20ng DNA；

PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，35个循环；

72℃5min；12℃保存；

其中步骤（7）的计算公式如下：

式中：

k是一个SSR所检测到的等位基因的数量，

Pi是第i个等位基因的频率。