CN101020924A - 一种海岛棉est－ssr标记的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于棉花育种领域，涉及一种海岛棉EST－SSR引物序列的制备技术及应用，利用这些引物进行棉花遗传多样性的评价、分子遗传连锁构建和棉花重要性状的QTL定位。步骤包括：1)建立海岛棉品系Pima3－79纤维发育的cDNA文库，从单一序列中挑出占其中富含二、三、四、五或六核苷酸重复且长度≥10碱基的EST；2)设计SSR侧翼引物；3)从田间取基因型为AA、DD和AADD的棉种材料和亲本鄂棉22、Pima3－79以及BC₁群体植株的嫩绿叶片提取其总DNA；4)用设计的SSR引物扩增步骤3)所示的材料和群体；5)计算每对引物的多态性信息含量，并对步骤3)所示的基因型棉种材料作聚类和主坐标分析；6)将BC₁作图群体扩增的EST－SSR整合到种间遗传连锁图谱相应的连锁群上，并作棉花重要性状的QTL定位。结果显示，位于连锁群15的引物HAU033与籽指性状连锁，位于连锁群29的引物HAU100与单株铃数性状连锁；分别贡献了表型变异的7.41％和5.95％。

Description

一种海岛棉EST-SSR标记的制备方法及应用

技术领域

本发明属于棉花育种技术领域，具体涉及一种海岛棉EST-SSR引物序列的制备技术及应用，具体涉及利用这些引物序列进行棉花遗传多样性的评价、分子遗传连锁构建和棉花重要性状的QTL定位。

背景技术

简单序列重复(简称SSR)标记具有重复性好、多态性高、呈共显性遗传、数量丰富和遍布整个基因组等优点，这些优点使得SSR标记成为广泛使用的分子标记之一，然而按照传统的方法开发SSR标记不仅费时费力而且效率低。

随着功能基因组学的发展，表达序列标签(EST)因为可以用于新基因的发现、基因表达调控研究和基因芯片的底物而被大量测序，并保存在公共序列数据库中，这些EST为SSR等分子标记的开发提供了丰富的序列资源。基于EST序列开发的EST-SSR标记与传统的SSR标记相比有很多优点，如：EST-SSR标记在相关物种之间具有很高的可转移性；EST-SSR标记通常都代表着某种功能，这种功能可以通过序列同源性比对获得；由于利用的是公共序列，EST-SSR标记的开发过程简单，成本低；EST-SSR能够反映出转录区的差异，这使得EST-SSR在种质遗传多样性分析、分子标记辅助选择和比较作图等研究中具有更高的使用价值。

目前，Genbank的EST数据库中已经积累了30多万条EST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/dbEST_summary.html)。这些丰富的EST资源为棉花EST-SSR的发展奠定了基础。目前，已经从亚洲棉和陆地棉的EST中开发了2201对EST-SSR，占棉花SSR总量的40.1％(http://www.mainlab.clemson.edu/cmd/Primer.shtml)。这些标记一经公布，立即被广大研究者应用。目前主要用于遗传连锁图的构建中(Han Z G等，Geneticmapping of EST-derived microsatellites from the diploid Gossypium arboreumin allotetraploidcotton.Mol Gen Genom，，2004，272：308-327；Han Zhiguo，等，Characteristics，development andmapping of Gossypium hirsutum derived EST-S SRs in allotetraploid cotton.Theor Appl Genet，2006，112：430-439；Park Y H等，Genetic mapping of new cotton fiber loci using EST-derivedmicrosatellites in an interspecific recombinant inbred line cotton population.Molecular Geneticsand Genomics，2005，274：428-441)，以及棉花纤维品质性状的QTL定位中(Park Y H等，Genetic mapping of new cotton fiber loci using EST-derived microsatellites in an interspecificrecombinant inbred line cotton populaion.Molecular Genetics and Genomics，2005，274：428-441；He D H等，QTL mapping for economic traits based on a dense genetic linkage map of cotton withPCR-based markers using the interspecific cross of Gossypium hirsutum/Gossypium barbadense.Euphytica，2006，DOI：10.1007/s10681-006-9254-9)。

从Genbank的数据库来看，陆地棉的EST数量最大，其次是雷蒙德式棉和亚洲棉，而目前的EST-SSR都是来自这些数据。而栽培种的非洲棉和海岛棉的数据量较少，目前尚没有这两个棉种ESR-SSR的报道。众所周知，四大栽培棉种中，陆地棉和海岛棉分别贡献了世界棉花产量的90％和5％左右。陆地棉因其产量高、适应性强而被广泛种植，也毫无争议地成为棉花研究的首选。海岛棉虽然种植面积远远少于陆地棉，但其纤维品质优良，抗病性强，仍有相当面积的种植，并是主要优质棉纤维产源。海岛棉与陆地棉可以有性杂交，并且二者产量和品质性状互补，海岛棉一直是改良陆地棉品质和抗病性的重要基因源。加强对海岛棉的研究具有重要的理论意义和实践应用价值。

为了发掘海岛棉优质纤维基因，申请人构建了海岛棉品种Pima3-79的纤维发育的cDNA文库，并从中开发EST-SSR引物序列，并明确了这些EST-SSR的特征及其在棉花遗传多样性、图谱构建和QTL定位中的应用。

发明内容

本发明需要解决的问题是建立海岛棉EST-SSR标记引物序列，并将其在棉花遗传多样性、遗传连锁图谱构建以及在QTL定位中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

1、适用于基因型为AA、DD和AADD的来源于海岛棉的EST-SSR标记的制备方法，按照下列步骤制备：

1)建立海岛棉品系Pima3-79纤维发育的cDNA文库，从单一序列中挑出占其中富含二、三、四、五或六核苷酸重复且长度≥10碱基的EST；

2)设计SSR侧翼引物，所述的引物如附图1所示；

3)从田间取如附图2所示的基因型为AA、DD和AADD的棉种材料和亲本鄂棉22、Pima3-79以及BC₁群体植株的嫩绿叶片提取其总DNA；

4)用所设计的SSR引物扩增步骤3)所示的材料和群体；

5)计算每对引物的多态性信息含量，并对步骤3)所示的三个基因型的棉种材料进行遗传多样性的聚类分析和主坐标分析；

6)将BC₁作图群体扩增的EST-SSR标记整合到种间遗传连锁图谱相应的连锁群上，并进行棉花重要性状的QTL定位。

在本发明中，步骤1)的引物长度为18-25bp，退火温度为55-63℃，GC含量为40-65％，PCR扩增产物的长度为100-300bp。

优选地，本发明的步骤1)的最适引物长度为20bp，退火温度为57℃，GC含量为50％，PCR扩增产物长度为200bp。

附图说明

图1：是本发明中设计的海岛棉EST-SSR引物序列；

图2：是本发明中实施例1从嫩绿叶片提取其总DNA进行分析的棉花品系和材料；

图3：是本发明的引物HAU042对36个棉花品系的扩增图，M为100bp ladder；

图4：是本发明的引物分析的36个棉花品系的相似系数聚类图；

图5：是本发明的引物分析的36个棉花品系的Principle Coordinate Analysis的三维散点图；

图6：是本发明的引物HAU035对亲本鄂棉22、Pima3-79、F₁和69个BC₁单株的扩增图，

图中：M为100bp ladder；

图7：是本发明的引物在连锁群上的分布，并用下划线标出；

以下结合说明书及附图对本发明作进一步描述：

1、供试材料：选自36份棉种材料(其中基因型为AA的材料13个，基因型为DD的材料11个，基因型为AADD的材料12个；如图2所示)及亲本鄂棉22、Pima3-79和BC₁群体植株的嫩绿叶片提取其总DNA。

2、总DNA提取方法：从所述的田间材料中取所述亲本和BC₁群体植株的嫩绿叶片提取其总DNA，具体方法参照1994年Paterson等(Paterson A H，Curt L B，Wendel J F，A rapidmethod for extraction of cotton(Gossypium spp.)genomic DNA suitable for RFLP and PCRanalysis.Plant Mol Bil Rep，1993，11：112-127)报道的方法提取。

3、PCR扩增反应体系为20μL：25ng DNA，4μmol上游引物，4μmol下游引物，1×buffer(10mM Tris-Hcl，50mM Kcl，pH8.3)，2mmol Mg2+，0.25mmol dNTPs，以及0.8 U Taqpolymerase。

PCR扩增反应程序如下：94℃变性3min，然后是34个循环(94℃变性50秒，57℃复性45秒，72℃延伸1分钟)，最后72℃延伸10分钟，15℃保存。PCR扩增在PTC-100 thermocycler(MJResearch，Watertown，MA，USA)上进行。

PCR产物通过6％常规聚丙烯酰胺-尿素凝胶电泳按分子量大小分离，电泳在EC160 DNASequencing System(Thermo EC)上进行1800V 80W 1.5～2.0h。电泳后的凝胶用常规的银染染色，有带或无带分别记录为1或0。

4、数据整理及分析：各引物的多态性信息含量(polymorphism information content，PIC)根据以下公式计算： $\mathrm{PIC}=1-\underset{i=1}{\overset{k}{\mathrm{\Σ}}}{P_i}^2.$ 其中k是一个SSR所检测到的等位基因的数量，P_i是第i个等位基因的频率。

利用NTSYS-pc 2.10e软件(Rohlf F.J.(2000)NTSYS-pc：Numerical Taxonomy andMultivariate Analysis System，Version 2.1，User Guide.Exeter Software，New York)进行聚类分析和主坐标分析。对EST-SSR标记获得的原始0、1矩阵用SimQual程序求Jaccard、SM和Dice相似系数，并获得相似系数矩阵。用SHAN程序中的不加权成对群算术平均数方法UPGMA进行系统聚类分析，并通过Tree plot模块生成聚类图。用Cophenetic Values程序将聚类结果转换为协表征矩阵，用Mxcopm对协表征矩阵和原始相似系数矩阵的相关性进行Mantel检验，求得相关系数r，选用r值最大的相似系数矩阵获得最终聚类分析结果。用DCENTER程序对Jaccard相似系数矩阵进行转换，再用EIGEN程序求特征值和特征向量，并作主坐标之间的三维图。

BC₁群体分子标记的记录采用Mapmaker软件(Lincoln S，Daly M，Lander E S.Constructiongenetic maps with MAPMAKER/EXP 3.0.In：Whitehead Institute Technical Report，2nd ed.Cambridge：Whitehead Institute，1992)记录方法。用“A”表示鄂棉22亲本的纯合带型；用“B”表示Pima3-79亲本的纯合带型；“H”表示两亲本的杂合带型；缺失数据用“-”表示。

利用MAPMAKER/EXP.3.0(Lincoln S，Daly M，Lander E S.Construction genetic maps withMAPMAKER/EXP 3.0.In：Whitehead Institute Technical Report，2nd ed.Cambridge：WhiteheadInstitute，1992)为作图软件，先用Group和Order命令进行标记间连锁分析(LOD＝5.0，r＝0.4)，对未进入连锁群的标记用Try命令连到相应连锁群上，最后用Ripple命令确定最佳排列顺序，构建棉花分子标记连锁图。利用Kasambi函数将重组率转换为遗传图距(cM)。用WinQtlCart2.5(Wang S，Basten C J，and Zeng Z B.2006，Windows QTL Cartographer 2.5.Department ofStatistics，North Carolina State University，Raleigh，NC)对性状进行QTL扫描。

本发明的效果：

1、在对36个棉种材料进行遗传多样性分析时，75对引物可以成功地扩增，得到312个等位基因，最多一对引物检测到了13个等位基因，平均每对引物能够检测到4.16个等位基因，检测到的PIC值范围为0.17～0.95，平均PIC值为0.53。聚类分析表明36份材料两两之间的Jaccard相似系数范围为0.149～0.991，并且很明显地将它们分为AA、DD、和AADD三个组。

2、75对特异性的有扩增产物的引物中，有33对(44.0％)在E22和Pima 3-79之间有多态性，其中21对在BC₁[(鄂棉22×Pima 3-79)×鄂棉22]作图群体中扩增得到24个多态性位点，有6对在亲本间有多态性而在群体中表现为杂合体与纯合体一致的带型。通过连锁分析可将BC₁作图群体141单株扩增得到的24个多态性位点中的21个整合到本实验室构建的种间遗传连锁图谱上，其平均分布于13个连锁群。

具体实施方式

实施例1：

1、取36份棉种材料(如图2所示)，其基因型为AA13个，DD11个AAD12个)作为遗传多样性分析的材料，并将所述的材料种植于田间；

2、从所述的田间材料植株上取嫩绿叶片提取其总DNA，具体方法参照1994年Paterson等(Paterson A H，Curt L B，Wendel J F，A rapid method for extraction of cotton(Gossypium spp.)genomic DNA suitable for RFLP and PCR analysis.Plant Mol Bil Rep，1993，11：112-127)报道的方法提取；

3、利用本发明中的海岛棉EST-SSR引物序列进行分析，具体步骤如下：

3.1 HAU引物标记分析：

PCR扩增反应体系为20μL：25ng DNA，4μmol上游引物，4μmol 下游引物，1×buffer(10mM Tris-Hcl，50mM Kcl，pH8.3)，2mmol Mg2⁺，0.25mmol dNTPs，以及0.8 U Taq polymerase。

PCR扩增反应程序如下：94℃变性3min，然后是34个循环(94℃变性50秒，57℃复性45秒，72℃延伸1分钟)，最后72℃延伸10分钟，15℃保存。PCR扩增在PTC-100 thermocycler(MJResearch，Watertown，MA，USA)上进行。

PCR产物通过6％常规聚丙烯酰胺-尿素凝胶电泳按分子量大小分离，电泳在EC160 DNASequencing System(Thermo EC)上进行1800V 80W 1.5～2.0h。电泳后的凝胶用常规银染染色，有带或无带分别记录为1或0。

3.2数据整理及连锁分析：

各引物的多态性信息含量(polymorphism information content，PIC)根据以下公式计算： $\mathrm{PIC}=1-\underset{i=1}{\overset{k}{\mathrm{\Σ}}}{P_i}^2.$ 其中k是一个SSR所检测到的等位基因的数量，P_i是第i个等位基因的频率。

利用NTSYS-pc 2.10e软件进行聚类分析和主坐标分析。对EST-SSR标记获得的原始0、1矩阵用SimQual程序求Jaccard、SM和Dice相似系数，并获得相似系数矩阵。用SHAN程序中的不加权成对群算术平均数方法UPGMA进行系统聚类分析，并通过Tree plot模块生成聚类图。用Cophenetic Values程序将聚类结果转换为协表征矩阵，用Mxcopm对协表征矩阵和原始相似系数矩阵的相关性进行Mantel检验，求得相关系数r，选用r值最大的相似系数矩阵获得最终聚类分析结果。用DCENTER程序对Jaccard相似系数矩阵进行转换，再用EIGEN程序求特征值和特征向量，并作主坐标之间的三维图。

3.3 HAU引物扩增情况：

44对(36.9％)引物在所有DNA中无任何扩增产物，在36个材料中扩增75对引物，得到312个等位基因，最多一对引物检测到了13个等位基因，平均每对引物能够检测到4.16个等位基因(图3)。

3.4多态性信息含量PIC

75对EST-SSR在36份材料上检测到的PIC值范围为0.17～0.95，平均PIC值为0.53。

其中PIC值最大(0.95)的引物是HAU072，PIC值最小(0.17)的引物是HAU100。

3.5聚类及系统进化分析

36份材料两两之间的Jaccard相似系数范围为0.149～0.991，其中最小相似系数0.149产生于WZXH与G.THUR之间，最大相似系数0.991产生于Hai7124与Pima3-79之间。并且很明显地将它们分为AA、DD、和AADD三个组(见图4和图5)。

实施例2：

1、亲本鄂棉22、Pima3-79(中国农业科学院棉花研究所提供)和BC₁群体作为遗传连锁图构建的起始材料，并将所述的材料种植于田间；

2、从所述的田间材料植株上的嫩绿叶片中提取其总DNA；

3、利用本发明中的海岛棉EST-SSR引物序列进行分析，具体步骤如下：

3.1 HAU引物标记分析：

PCR扩增反应体系为20μL：25ng DNA，4μmol上游引物，4μmol下游引物，1×buffer(10mM Tris-Hcl，50mM Kcl，pH8.3)，2mmol Mg2+，0.25mmol dNTPs，以及0.8 U Taqpolymerase。

PCR扩增反应程序如下：94℃变性3min，然后是34个循环(94℃变性50秒，57℃复性45秒，72℃延伸1分钟)，最后72℃延伸10分钟，15℃保存。PCR扩增在PTC-100 thermocycler (MJResearch，Watertown，MA，USA)上进行。

PCR产物通过6％聚丙烯酰胺-尿素凝胶电泳按分子量大小分离，电泳在EC160 DNASequencing System(Thermo EC)上进行1800V 80W 1.5～2.0h。电泳后的凝胶用银染染色。

3.2数据整理及连锁分析：

BC₁群体分子标记的记录采用Mapmaker软件记录方法。用“A”表示鄂棉22亲本的纯合带型；用“B”表示Pima3-79亲本的纯合带型；“H”表示两亲本的杂合带型；缺失数据用“-”表示。

利用MAPMAKER/EXP.3.0为作图软件，先用Group和Order命令进行标记间连锁分析(LOD＝5.0，r＝0.4)，对未进入连锁群的标记用Try命令连到相应连锁群上，最后用Ripple命令确定最佳排列顺序，构建棉花分子标记连锁图。利用Kasambi函数将重组率转换为遗传图距(cM)。用WinQtlCart 2.5对性状进行QTL扫描。

3.3 HAU引物亲本多态性的筛选：

75对特异性的有扩增产物的引物中，有33对(44.0％)在E22和Pima 3-79之间有多态性，其中21对在BC1[(Emian 22×Pima 3-79)×Emian 22]作图群体中扩增得到24个多态性位点，33对引物中有六对在亲本间有多态性而在群体中表现为杂合体与纯合体一致的带型(图6)。

3.4多态性信息含量PIC

75对EST-SSR在36份材料上检测到的PIC值范围为0.17～0.95，平均PIC值为0.53。

其中PIC值最大(0.95)的引物是HAU072，PIC值最小(0.17)的引物是HAU100。

3.5遗传连锁图的构建：

通过连锁分析可将BC₁作图群体141单株扩增得到的24个多态性位点中的21个整合到本实验室构建的种间遗传连锁图谱(未发表)上，其平均分布于13个连锁群。该连锁图的标记数增加到666个，图谱长度由原来的4284.2cM增加到4601cM(图7)。

3.6重要农艺性状的QTL定位：

QTL分析结果显示，位于连锁群15的引物HAU033与籽指性状连锁，位于连锁群29的引物HAU100与单株铃数性状连锁；分别贡献了表型变异的7.41％和5.95％(见表1)。

表1本发明的部分标记对海岛棉重要农艺性状的QTL定位分析应用

性状	连锁群	标记	LOD值	贡献率
					籽指	15	HAU033	3.2	7.41％
单株铃数	29	HAU100	2.5	5.95％

Claims (3)

1、适用于基因型为AA、DD和AADD的来源于海岛棉的EST-SSR标记的制备方法，按照下列步骤：

1)建立海岛棉品系Pima3-79纤维发育的cDNA文库，从单一序列中挑出占其中富含二、三、四、五或六核苷酸重复且长度≥10碱基的EST；

2)设计SSR侧翼引物，所述的引物如附图1所示；

3)从田间取如附图2所示的基因型为AA、DD和AADD的棉种材料和亲本鄂棉22、Pima3-79以及BC₁群体植株的嫩绿叶片提取其总DNA；

4)用所设计的SSR引物扩增步骤3)所示的材料和群体；

5)计算每对引物的多态性信息含量，并对步骤3)所示的三个基因型的棉种材料进行遗传多样性的聚类分析和主坐标分析；

6)将BC₁作图群体扩增的EST-SSR标记整合到种间遗传连锁图谱相应的连锁群上，并进行棉花重要性状的QTL定位。

2、根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤1)的引物长度为18-25bp，退火温度为55-63℃，GC含量为40-65％，PCR扩增产物的长度为100-300 bp。

3、根据权利要求1或2所述的制备方法，其中：步骤1)的最适引物长度为20bp，退火温度为57℃，GC含量为50％，PCR扩增产物长度为200bp。

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