CN102250888A - 与陆地棉棉籽油份含量主效qtl紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种与陆地棉棉籽油份含量主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用。所说的与陆地棉棉籽油份含量主效QTL紧密连锁的分子标记，是TMB1216。可将分子标记TMB1216用于陆地棉品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系油份含量的大小。本发明采用分子标记TMB1216辅助选择不仅准确性高，加快选择进度，同时也将大大减少了育种的工作量，提高了育种效率，克服了常规育种周期长、后期筛选工作量大、对品种或品系进行鉴定的效率低等缺陷和不足。

Description

与陆地棉棉籽油份含量主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种与陆地棉棉籽油份含量主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用，属于棉花育种和分子生物学领域。

背景技术

棉籽作为棉纤维生产中的副产品，也是很好的油料资源。在食用油中，亚油酸含量最高的莫过于棉籽油(邱新棉等，1999)。棉籽油的亚油酸含量高达55.6％，是一种亚油酸含量极高的高级保健油(陈旭升等，2003)。同时作为生物柴油的原料，棉籽油有以下几个优势：(1)石化柴油的碳链分布长度在C15-C18，而棉籽油中脂肪酸的碳链长度99％集中在C16和C18，因此棉籽油具有生物柴油的良好化学基础；(2)与油菜、大豆相比，棉籽油的价格较低，利用棉籽油生产生物柴油在经济上更有利；(3)对棉花而言，皮棉是主产品，棉籽是副产品，用棉籽油生产生物柴油可最大限度地利用资源，提高棉副产品利用率。

目前国内外对棉籽油份含量的遗传基础研究不多，棉籽油份含量的遗传一般表现为数量遗传，受许多微效基因控制。但由于所采用的试验材料和设计方法的不同，获得的结论也不完全一致，表明棉籽油份含量的遗传方式是比较复杂的。王国印等(1991)、季道藩等(1988)、Singh等(1985)均认为棉籽油份含量主要受显性效应控制，Kohel等(1980)、Ramous等(1986)认为棉籽的油份含量还受显著的加性效应的影响。Boghra等(1985)的研究结果表明油份含量的非加性基因作用类型比较普遍。Dani等(1989)、Ye等(2003)认为油份含量的遗传还存在母体效应和上位性效应。

关于棉籽油份含量QTL的研究还鲜有报道。Song等(2007)对棉籽油份含量进行QTL分析，通过两年的重复的田间实验，定位到油份含量主效QTL。棉籽油分含量QTL位于D8(Chr.24)上的BNL3860-NAU1369标记区间，可以解释29.35％的表型变异。但所用材料为海岛棉与陆地棉组合Hai7124×TM-1。海岛棉虽具有良好的营养品质，但产量等主要农艺性状较差，种间杂交的疯狂分离使得利用海岛棉优良的基因位点存在一定困难。从陆地棉基因组中挖掘并转育高油份含量等位基因是改良棉籽营养品质快速有效的途径。但目前有关陆地棉分析棉籽油份含量QTL的研究还未见报道。

发明内容

本发明的一个目的在于，提供陆地棉棉籽油份含量主效QTL的分子标记及其在棉籽营养品质育种中的应用。

一种与陆地棉棉籽油份含量主效QTL紧密连锁的分子标记，是TMB1216。

所述的与陆地棉棉籽油份含量主效QTL紧密连锁的分子标记，是通过以下方法确定的：

a)以高油份陆地棉品种DPLSR3为母本和低油份陆地棉品种为父本杂交，得到杂交种F₁；

b)由杂交种F₁自交获得F₂群体；

c)分离各个F₂单株叶片的DNA，采用简单重复序列标记(SSR)引物进行PCR扩增，扩增产物在12％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，获得分子标记资料；

d)基于遗传连锁交换定律，对分子标记分析资料构建陆地棉种内遗传连锁图谱；

e)用近红外分析方法测量F₂各单株、F_2∶3各家系的棉籽油份含量；

f)结合F₂、F_2∶3两个世代群体棉籽油份含量的测定结果，利用软件QTLcartographer V2.5(Wang et al.2001)，采用复合区间作图法(Composite intervalmapping)(Zeng，1994)筛选与陆地棉棉籽油份含量紧密连锁的QTL位点。筛选到在F₂和F_2∶3两个世代均能稳定表达的棉籽油份含量主效QTL，确定与该主效QTL连锁的分子标记为TMB1216。

所述的与陆地棉棉籽油份含量主效QTL紧密连锁的分子标记通过下述方法获得：用陆地棉DPLSR3叶片分离的DNA，采用引物5’AATTTAGTTTCATACACAC3’和5’TGGTCACCCATCGTTAAC3’进行PCR扩增，扩增产物在12％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，获得分子标记TMB1216，大小为190bp。

TMB1216作为陆地棉棉籽油份含量主效QTL紧密连锁的分子标记的应用还包括：将分子标记TMB1216用于陆地棉品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系油份含量的大小：

a)以陆地棉品种DPLSR3及其衍生品种或品系为父本或母本与其它陆地棉品种杂交并繁衍至F₂代及以上；

b)对通过步骤a)获得的陆地棉单株，分离叶片DNA，检测分离的DNA中是否存在棉籽油份含量主效QTL相连锁的分子标记；存在所述分子标记的陆地棉品种DPLSP3的衍生品种或品系的棉籽油份含量显著高于不存在所述分子标记的陆地棉品种DPLSP3的衍生品种或品系。

所用陆地棉品种DPLSR3衍生品种或品系是指以陆地棉品种DPLSR3为亲本，通过常规杂交、或采用组织培养、遗传转化方法获得的陆地棉衍生品种或品系。

本发明的优点在于：充分发挥分子标记TMB1216辅助选择的特长，利用分子标记TMB1216辅助选择不受环境条件的影响的特点，通过检测分子标记可以预测棉籽油份含量的大小，在低世代就可以对陆地棉新品系的棉籽油份含量进行选择。采用分子标记TMB1216辅助选择不仅准确性高，加快选择进度，同时也将大大减少了育种的工作量，提高了育种效率，克服了常规育种周期长、后期筛选工作量大、对品种或品系进行鉴定的效率低等缺陷和不足。

附图说明

图1是F₂、F₃世代在13号染色体上棉籽油份含量主效QTL分析的LOD值分布图。注：实线表示F₂世代的LOD值分布，虚线表示F₃世代的LOD值分布。

图2是部分单株分子标记鉴定电泳图。

具体实施方式

实施例1

与陆地棉棉籽油份含量主效QTL紧密连锁的分子标记是通过以下方法获得的：

(1)群体的构建及棉籽油份含量的测定：

以高油份陆地棉品种DPLSR3为母本，以低油份陆地棉品种盐城115为父本，2008年于江苏省农业科学院溧水植物实验基地配置杂交组合，同年年底海南南繁F₁，自交产生F₂。2009年在江苏省农业科学院溧水植物基地种植F₂及亲本，共151个F₂单株，收获F₂种子，对F₂种子脱绒并烘干，用近红外分析方法(徐鹏，等2010)测量F₂的油份含量。2010年种植F_2∶3株行，按株行收种，同样对种子进行脱绒并烘干，用近红外分析方法测量F_2∶3的油份含量。

(2)遗传图谱构建及QTL定位

采用SSR标记进行棉籽油份含量QTL的筛选，首先用覆盖整个棉花基因组的1221对SSR引物对亲本进行多态性筛选，SSR引物序列可从http://www.cottonmarker.org网站上获得。这些SSR引物中，其中以BNL编号的引物为布鲁克海文国家实验室(美国)开发，用NAU编号的为南京农业大学(中国)开发，CIR编号的为国际农业研究发展中心(法国)开发，JESPR编号的为德州农工大学(美国)开发，以TMB编号的为美国农业部农业研究所服务署开发，DPL编号的为Delta and Pine Land公司(美国)开发。引物由上海英俊公司合成。SSR扩增反应体系为10ul，其中10×Buffer 1.5ul，Mg²⁺1ul，10mM dNTP0.5ul，10uM引物1ul，模板DNA 1ul，taq酶0.1ul，超纯水4.4ul。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。扩增产物在12％的聚丙烯凝胶中(100ml聚丙烯酰胺胶溶液中含有11.6克丙烯酰胺和0.4克甲叉双丙烯酰胺)电泳，凝胶银染，记录结果。利用MapMaker/EXP 3.0b(Lander et al.1987)软件构建遗传连锁图谱，采用Kosambi作图函数(Kosambi，1944)。结合F₂、F_2∶3两个世代群体棉籽油份含量的测定结果，利用软件QTL cartographer V2.5(Wang et al.2001)，采用复合区间作图法(Composite interval mapping)(Zeng，1994)筛选与陆地棉棉籽油份含量紧密连锁的QTL位点。walk speed＝2cM，采用模型6分析，对每个性状进行1000次permutation test，以确定每个性状的LOD阈值(显著水平0.05)。筛选到在F₂和F_2∶3两个世代均能稳定表达的棉籽油份含量主效QTL确定与该主效QTL连锁的分子标记为TMB1216，两个世代中LOD值分别为3.1、3.9，分别可以解释9.21％、12.01％的表型变异。

实施例2：

与陆地棉棉籽油份含量主效QTL紧密连锁的分子标记在遗传群体中得验证：

利用大小为190bp的分子标记TMB1216对陆地棉品种DPLSR3的衍生品系进行棉籽油份含量进行筛选：

鉴定对象：

采用陆地棉品种DPLSR3与盐城115杂交，繁衍到F₃代，将它们作为棉籽油份含量大小的鉴定对象。

鉴定过程

a)利用与陆地棉棉籽油份含量主效QTL紧密连锁的分子标记进行鉴定

先从各鉴定对象的叶片采用CTAB提取方法进行分离提取获得的DNA，然后用分子标记TMB1216的引物5’AATTTAGTTTCATACACAC3’(SEQ ID NO：1)和5’TGGTCACCCATCGTTAAC3’(SEQ ID NO：2)分别对这些DNA进行聚合酶链式反应(PCR)，分离提取DNA以及PCR扩增和电泳分离过程与实施例1相同。当PCR扩增、电泳分离后存在相应的分子标记时，记录为“+”，否则记录为“-”(图2)。

b)将经过分子标记鉴定的株系，后续两年田间试验：

将以上鉴定材料分别于2009、2010年种植于江苏省农科院溧水植物基地。在所有鉴定株系中，32个“+”型条带的株系，平均棉籽油份含量为32.10％，37个“-”型条带的株系，平均棉籽油份含量为28.98％，F测验分析表明油份含量差异显著。因此，当PCR扩增、电泳分离后存在分子标记TMB1216时，该株系棉籽油份含量显著大于当PCR扩增时电泳分离后不存在分子标记TMB1216的株系。棉籽油份含量测量结果与分子标记鉴定对应的记录在表1中。

以上各实施例不是对本发明的具体限制，只要在权利要求的限定范围内，结合本领域的基本常识(例如鉴定对象是通过以陆地棉品种DPLSR3为亲本，通过常规杂交、或采用组织培养、遗传转化方法获得的陆地棉衍生品种或品系等)，运用本发明的公开的分子标记，借助本发明公开的方法对陆地棉品种DPLSR3的衍生品种或品系的基因型检测以判断该衍生品种或品系棉籽油份含量的大小，都属于本发明的保护范畴。

表1 DPLSP3和盐城115的F₂后代的植株棉籽油份含量测量结果

SEQUENCE LISTING

 

<110>  江苏省农业科学院

 

<120>  与陆地棉棉籽油份含量主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用

 

<130> 

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

aatttagttt catacacac                                                  19

 

 

<210>  2

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

tggtcaccca tcgttaac                                                   18

Claims (5)

1.一种与陆地棉棉籽油份含量主效QTL紧密连锁的分子标记，是TMB1216。

2.一种与陆地棉棉籽油份含量主效QTL紧密连锁的分子标记，是通过以下方法确定的：

a)以高油份陆地棉品种DPLSR3为母本和低油份陆地棉品种为父本杂交，得到杂交种F₁;

b)由杂交种F₁自交获得F₂群体；

c)分离各个F₂单株叶片的DNA，采用简单重复序列标记（SSR）引物进行PCR扩增，扩增产物在12％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，获得分子标记资料；

d)基于遗传连锁交换定律，对分子标记资料分析构建陆地棉种内遗传连锁图谱；

e)用近红外分析方法测量F₂各单株、F_2:3各家系的棉籽油份含量；

f) 结合F₂、F_2:3两个世代群体棉籽油份含量的测定结果，利用软件QTL cartographer V2.5，采用复合区间作图法筛选与陆地棉棉籽油份含量紧密连锁的QTL位点；筛选到在F₂和 F_2:3两个世代均能稳定表达的棉籽油份含量主效QTL，确定与该主效QTL连锁的分子标记为TMB1216。

3.权利要求1所述的与陆地棉棉籽油份含量主效QTL紧密连锁的分子标记，其特征在于，用陆地棉DPLSR3叶片分离的DNA，采用引物5’ AATTTAGTTTCATACACAC3’ 和5’ TGGTCACCCATCGTTAAC3’ 进行PCR扩增，扩增产物在12%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，获得分子标记TMB1216，大小为190bp。

4.如权利要求1所述的与陆地棉棉籽油份含量主效QTL紧密连锁的分子标记应用，其特征在于：

a)以DPLSR3及其衍生品种或品系为父本或母本与其它陆地棉品种杂交并繁衍至F₂代及以上；

b)对通过步骤a)获得的陆地棉单株，分离叶片DNA，检测分离的DNA中是否存在于棉籽油份含量主效QTL相连锁的分子标记；存在所述分子标记的陆地棉品种DPLSP3的衍生品种或品系的棉籽油份含量显著高于不存在所述分子标记的陆地棉品种DPLSP3的衍生品种或品系。

5.根据权利要求4所述的分子标记的应用，其特征在于：将分子标记用于陆地棉品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系棉籽油份含量的大小。

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