CN104711348B - 与菠菜性别基因y共分离的分子标记s9.5及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了与菠菜性别基因Y共分离的分子标记S9.5及其应用,属于植物分子遗传育种领域。本发明提供的分子标记S9.5在菠菜雄株里可以扩出了119bp的特异条带,在雌株里没有扩出条带,扩增其的引物序列如SEQ ID NO.2‑3所示。本发明提供的分子标记S9.5与菠菜性别基因共分离,可以在苗期进行菠菜性别鉴定,提前对菠菜雌雄株进行筛选,大大提升育种效率,在菠菜生产实践、育种中具有重要的价值。
Description
技术领域
本发明属于植物分子遗传育种领域,具体涉及与菠菜性别基因Y共分离的的分子标记S9.5及其应用。
背景技术
菠菜(Spinacia oleracea L.),别名波斯草、赤根菜,黎科菠菜属作物,栽培历史悠久,是我国重要的蔬菜作物之一。菠菜营养丰富,抗寒性强,适应性广,生产周期短,复种指数高,产量产值高,深受生产者和消费者欢迎。
菠菜一般是雌雄异株作物,少量植株表现为雌雄同株。菠菜性型受遗传因素和环境因素的影响。Rosa等(1925)认为菠菜性型主要受遗传因子控制,并不受土壤肥力、株间距离、光照强弱、种植期等外界因素的影响。Nicolaisen等(1940)报道菠菜性型受外界环境因素的影响,在瘠薄土地上生长时多雄株,夏播比秋播多雌株。Janick等(1955)研究表明菠菜性型受环境条件的影响,高温短日照能使雄性增强雌性减弱,日温26.6℃、夜温24℃比日温21℃、夜温18℃有增加雄性的趋势;不论温度高低,在15~18h光照下都比在12h光照下多雌株雌花,但是温度愈高则长短日之间的差异愈小。George(1985)研究表明少数菠菜品种性型仅受遗传因子的控制,而不受其他环境因子的控制。徐跃进等(1996)对65个菠菜品种的性型表现进行调查分析,植株群体雌雄比约为1:1,但是有1/3的品种雌雄之比不符合1:1,进一步对其中的4个品种进行分析,其中潍坊尖叶的性型表现仅受遗传因子控制,而其它3个品种的性型既受遗传因子控制,也受环境因子影响。
国内外学者普遍认为菠菜的性型遗传主要受存在于性染色体上的一对X和Y基因的控制,菠菜植株群体中雌雄比约为1:1,但是可能同时还受其它的基因控制,据此提出了不同的假说,但是至今还没有一种得到普遍认同。Janick等(1954)经过研究认为性基因型为XX的植株表现为雌株,XY型的植株为能结少量或不结种子的雄株,YY型的植株为不能结籽的雄株。Janick等(1955,1961,1963)还认为雌雄同株性别受另一个与X及Y等位的基因Xm控制,另有一些修饰基因影响雌花和雄花的比例,即雌雄同株性状是由Xm基因控制的,Xm和X和Y是等位基因,XmXm的表型是雌雄异花同株而多雄花,XmX为雌雄异花同株而多雌花,XX为雌株(谭其猛,1980)。Bemis和Wilson(1953)经过研究提出性别连锁基因平衡假说,认为除性染色体(X/Y)外,在常染色体上还存在二对强连锁的性平衡基因Aa和Gg,A能使XX株表现为雌两性株,G能使XY株表现为雄两性株。当二对基因呈平衡状态时,如AG/AG或AG/ag或ag/ag时,XX为纯雌株,XY为纯雄株。但在发生交叉、互换破坏平衡后,就产生两性株。白密斯等的假说,虽大体上能解释一些遗传现象,但缺乏充分的后代验证(谭其猛,1980)。
菠菜在苗期难以区分雌雄株,菠菜只有生长至抽薹期时,性型表型才能有效区分,因此为更早对菠菜植物性型进行鉴定及提升育种效率,国内外针对菠菜性型进行分子标记研究,获得了一些与性型基因连锁的分子标记。Akamatsu(1998)开发与菠菜X/Y位点连锁的分子标记T11A、V20A,可用于鉴别菠菜雌雄植株。Khattak等(2006)认为菠菜性型受X/Y位点控制,用AFLP和SSR技术构建菠菜的七个遗传连锁图,总长为580cM,标记间平均距离为5.18cM,X/Y位点被定位在连锁群3上较小的遗传区域内,与SSR标记SO4相距1.9cM。Onodera等(2011)利用BSA法筛选到10个AFLP标记与菠菜X/Y位点紧密连锁,4个标记与Y位点共分离;验证已发表的与Y位点连锁的SSR标记T11A、V20A,其均于Y位点连锁;发现了一个单独的、不完全显性的强雄两性基因,其与X/Y位点连锁标记SO4相距4.3cM,证实雌雄同株决定基因不是X/Y位点的等位基因,但是与X/Y位点紧密连锁。目前国内外已发表的菠菜性别基因Y连锁标记有4个,第一个是T11A、V20A与菠菜性别基因Y共分离,但是在大群体验证时V20A扩增效果不够稳定,T11A与Y共分离;第二个是SO4,其与菠菜性别基因Y相距4.3cM,在群体中验证时不连锁,在该基因片段上开发另外的SSR进行分析,遗传距离约为11cM;第三个为杨金华(2009)通过ISSR分析,筛选到一个与雌性相关的标记,全长1176bp,并将其转化为SCAR标记,该标记在群体中验证时不连锁。
发明内容
本发明目的在于提供一种与菠菜性别基因Y共分离的分子标记。
本发明另一目的是提供一种利用分子标记鉴别菠菜性别的方法。
为实现本发明的目的,首先利用菠菜杂交一代商业品种冬绿1号(F1)中的雌株×雄株构建F2群体,提取343个F2单株的基因组DNA,研究菠菜性别基因的遗传基础,利用SRAP标记筛选与性别基因连锁的分子标记,对连锁的特异片段进行克隆测序,并将其转化成SCAR标记,利用转化成功的SCAR标记在菠菜其他7个群体中进行雌雄性别鉴定,分子标记鉴定结果与表型鉴定结果一致。
本发明提供的与菠菜性别基因Y共分离的分子标记为SCAR标记S9.5,在菠菜雄株里可以扩出了119bp的特异条带,在雌株里没有扩出条带。性别基因Y位于菠菜Y染色体上,SCAR标记S9.5与Y基因共分离,处在Y染色体特异片段上。
进一步地,本发明的SCAR标记S9.5通过以下特异性引物对扩增获得:
上游引物F:5′-TGAGTCCAAACCGGATGTCGCCTG-3′
下游引物R:5′-TGACTGCGTACGAATTAACTGTGG-3′。
本发明提供了用于检测SCAR分子标记S9.5的特异性引物对,其为:
上游引物F:5′-TGAGTCCAAACCGGATGTCGCCTG-3′(SEQ ID NO.2)
下游引物R:5′-TGACTGCGTACGAATTAACTGTGG-3′(SEQ ID NO.3)。
本发明提供了含有上述特异性引物对的试剂盒。
本发明提供了分子标记S9.5在菠菜性别鉴定中的应用。
本发明提供了分子标记S9.5在菠菜分子标记辅助育种中的应用。
本发明提供了SEQ ID NO.2-3所示的特异性引物对或含有该特异性引物对的试剂盒在菠菜性别鉴定中的应用。
本发明提供了SEQ ID NO.2-3所示的特异性引物对或含有该特异性引物对的试剂盒在菠菜分子标记辅助育种中的应用。
本发明还提供了一种鉴定菠菜性别的方法,包括以下步骤:
(1)提取待测菠菜的基因组DNA;
(2)以待测菠菜的基因组DNA为模板,利用SEQ ID NO.2-3所示的特异性引物对进行PCR扩增反应;
(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物,若扩出了119bp的特异条带,则为雄性,若无扩增条带,则为雌性。
上述方法中,步骤(2)中PCR扩增反应10μL体系为:20-25ng/μL DNA 2μL,10μM上、下游引物各0.2μL,10×PCR buffer 1μL,2.5mM dNTP 0.8μL,Taq酶0.1μL,ddH2O 5.7μL;
PCR扩增反应程序为:94℃5min;94℃30s,58℃30s,72℃30s,共35个循环;72℃延伸7min。
步骤(3)中119bp的特异条带的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
步骤(3)中聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物的检测条件为160V,1.5h。优选地,聚丙烯酰胺凝胶中聚丙烯酰胺浓度为8%。
本发明提供了上述鉴定菠菜性别的方法在菠菜育种中的应用。
本发明提供的鉴定菠菜性别的分子标记克服了现有技术中只能在抽薹期才能区分菠菜雌雄株而带来的育种效率低下的问题,实现在苗期就能进行菠菜性别鉴定的技术效果。通过利用本发明提供的特异性引物对采用PCR方法检测待测菠菜的基因组DNA,扩增SCAR分子标记S9.5,当扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳中出现119bp的特异条带时,可判定待测菠菜为雄性,若无该条带,则待测菠菜为雌性,可以准确对菠菜进行性别鉴定,用于筛选植株,大大提升了菠菜的育种效率。相对于国内外已发现的其它标记,本发明标记S9.5与菠菜性别基因共分离,为该Y基因的克隆和测序奠定基础,在菠菜生产实践、育种中具有非常重要的价值。
附图说明
图1为菠菜F2群体中雌株。植株高大,生长旺盛,基生叶及茎生叶均较发达;雌花簇生于茎生叶的叶腋中,无花柄或有长短不等的花柄,无花瓣,有雌蕊1枚,柱头4~6个;花萼2~4裂,包被着子房;箭头所指为雌花。
图2为菠菜F2群体中雄株。植株较矮,基生叶较少,茎生叶不发达或呈鳞片状;花茎上仅生雄花;雄花无花瓣,花萼4~5裂,雄蕊数与花萼相同;花丝短,花药黄色;箭头所指为雄花。
图3为S9.5标记检测菠菜性别的电泳图,M为marker 1,由6条DNA片段组成,从下到上依次是100、200、300、400、500、600bp。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1与菠菜性别基因Y共分离的分子标记S9.5的获得
1、菠菜遗传群体的构建
利用菠菜杂交一代商业品种冬绿1号(F1)中的雌株×雄株构建F2群体。F2群体长至花期进行性状调查(图1,图2),F2群体共343株,其中雌株189株,雄株154株,经卡方检测符合1:1,菠菜性别受性别基因X/Y控制。
2、基因组DNA的提取和雌雄池构建
采用CTAB法提取343个F2单株的基因组DNA。
分别取F2中10个雌株、10个雄株构建用于分离群体分组分析(Bulk SegregatingAnalysis,BSA)的雌、雄池,DNA检测仪(NanoDrop Spectrophotometer)机测DNA的浓度,用灭菌蒸馏水分别稀释到相同的浓度200ng/μL,10个雌株各取100μL,10个雄株各取100μL,分别按照各自性别混合构成雌雄基因池(F池,M池)
3、SRAP连锁标记筛选
利用已公布的256对SRAP标记(表1),任一me引物和任一em引物进行组合,在雌雄池之间进行PCR扩增和多态性筛选,共筛选到99对具有多态性的标记,利用筛选到的多态性标记在F2群体里的32个单株中进行验证,进一步筛选8对与性别基因连锁的分子标记,其中发现SRAP9.5与雌雄性别共分离。
10μL PCR反应体系为:20-25ng/μL DNA 2μL,10μM引物上下游各0.2μL,10×PCRbuffer 1μL,2.5mM dNTP 0.8μL,Taq酶0.1μL,ddH2O 5.7μL。
PCR扩增程序94℃3min;94℃1min,35℃1min,72℃1min,共5个循环;94℃1min,50℃1min,72℃1min,共35个循环;72℃10min。
表1SRAP标记引物序列
4、SCAR标记转化
对筛选到的SRAP连锁标记SRAP9.5扩增的特异条带进行切胶回收,克隆测序。根据特异条带的序列设计SCAR标记。将SRAP9.5扩增特异条带序列分别与目前已公布的菠菜参考基因组序列(http://bvseq.molgen.mpg.de/index.shtml)进行比对。SRAP9.5特异序列不能比对到菠菜参考基因组。因此进一步根据SRAP9.5特异序列设计SCAR引物(SEQ IDNO.2-3),对雌雄株进行PCR扩增,在菠菜雄株里可以扩出了119bp的特异条带,在雌株里没有扩出条带,对扩增的条带进行克隆测序,测序结果如SEQ ID NO.1所示。经SRAP9.5转化成功的SCAR标记S9.5检测F2群体,检测结果与SRAP9.5一致,与性别基因共分离,可用于分子标记辅助选择。
实施例2分子标记S9.5的应用
利用已转化成功的SCAR标记S9.5,在菠菜其它7个群体【群体说明:菠菜杂交一代商业品种菠菲特(F1)中的雌株×雄株构建F2群体,F2群体中的雌株×雄株构建F3群体,选取其中的4个F3群体进行分子标记性别鉴定(即实验群体编号分别为48,50,52,53);同理,菠菜杂交一代商业品种黑强(F1)中的雌株×雄株构建F2群体,F2群体中的雌株×雄株构建F3群体,选取其中的3个F3群体进行分子标记性别鉴定(即实验群体编号分别为54,58,59)】中进行雌雄性别鉴定,分子标记鉴定结果与表型鉴定结果一致,结果见图3,因此可以用于分子标记辅助选择育种。
分子标记S9.5鉴定方法为:(1)提取待测菠菜的基因组DNA;
(2)以待测菠菜的基因组DNA为模板,利用SEQ ID NO.2-3所示的特异性引物对进行PCR扩增反应;
(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶检测扩增产物,若扩出了119bp的特异条带,则为雄性,若无扩增条带,则为雌性。
上述方法中,步骤(2)中PCR扩增反应10μL体系为:20-25ng/μL DNA 2μL,10uM上、下游引物各0.2μL,10×PCR buffer 1μL,2.5mM dNTP 0.8μL,Taq酶0.1μL,ddH2O 5.7μL;
PCR扩增反应程序为:94℃5min;94℃30s,58℃30s,72℃30s,共35个循环;72℃延伸7min。
扩出了119bp的特异条带的序列如SEQ ID NO.1所示。
步骤(3)中8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳扩增产物的条件为160V,1.5h。
表27个群体分子鉴定结果与田间鉴定结果
品种 | 分子鉴定结果 | 田间鉴定结果 | 品种 | 分子鉴定结果 | 田间鉴定结果 |
48(10) | ♀ | ♀ | 48(8) | ♂ | ♂ |
50(5) | ♀ | ♀ | 50(8) | ♂ | ♂ |
52(5) | ♀ | ♀ | 52(5) | ♂ | ♂ |
53(9) | ♀ | ♀ | 53(11) | ♂ | ♂ |
54(7) | ♀ | ♀ | 54(10) | ♂ | ♂ |
58(10) | ♀ | ♀ | 58(3) | ♂ | ♂ |
59(9) | ♀ | ♀ | 59(12) | ♂ | ♂ |
注:所有品种名称均以实验室编号给出:“♀”代表雌株;“♂”代表雄株。“()”里代表单株数。
经7个群体的验证,该S9.5标记对菠菜性别的鉴定结果与田间鉴定结果吻合率100%,具有很好的应用价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.与菠菜性别基因Y共分离的分子标记,其特征在于,其为SCAR标记S9.5,在菠菜雄株里可以扩出了119bp的特异条带,在雌株里没有扩出条带;
所述SCAR标记S9.5通过以下特异性引物对扩增获得:
上游引物F:5′-TGAGTCCAAACCGGATGTCGCCTG-3′,
下游引物R:5′-TGACTGCGTACGAATTAACTGTGG-3′。
2.用于检测权利要求1所述分子标记的特异性引物对,其特征在于,其为:
上游引物F:5′-TGAGTCCAAACCGGATGTCGCCTG-3′,
下游引物R:5′-TGACTGCGTACGAATTAACTGTGG-3′。
3.含有权利要求2所述特异性引物对的试剂盒。
4.权利要求1所述的分子标记在菠菜性别鉴定中的应用。
5.权利要求1所述的分子标记在菠菜分子标记辅助育种中的应用。
6.权利要求2所述的特异性引物对或权利要求3所述的试剂盒在菠菜性别鉴定中的应用。
7.权利要求2所述的特异性引物对或权利要求3所述的试剂盒在菠菜分子标记辅助育种中的应用。
8.一种鉴定菠菜性别的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)提取待测菠菜的基因组DNA;
(2)以待测菠菜的基因组DNA为模板,利用权利要求2所述的特异性引物对进行PCR扩增反应;
(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物,若扩出了119bp的特异条带,则为雄性,若无扩增条带,则为雌性。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,步骤(2)所述的PCR扩增反应,其10μL体系为:20-25ng/μL DNA 2μL,10uM上、下游引物各0.2μL,10×PCR buffer 1μL,2.5mM dNTP 0.8μL,Taq酶0.1μL,ddH2O 5.7μL;
PCR扩增反应程序为:94℃5min;94℃30s,58℃30s,72℃30s,共35个循环;72℃延伸7min。
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