CN109234430B

CN109234430B - 一种与菠菜果实形态相关的InDel分子标记及检测引物与应用

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Publication number: CN109234430B
Application number: CN201811003352.7A
Authority: CN
Inventors: 刘志远; 徐兆生; 钱伟; 张合龙; 王晓武; 武剑
Original assignee: China Vegetable Seed Technology Co ltd Beijing; Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: China Vegetable Seed Technology Co ltd Beijing; Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-08-30
Filing date: 2018-08-30
Publication date: 2021-08-17
Anticipated expiration: 2038-08-30
Also published as: CN109234430A

Abstract

本发明属于分子遗传育种技术领域，具体公开了一种与菠菜果实形态相关的InDel分子标记及检测引物与应用。所述分子标记位于菠菜全基因组的Chr3：54314645‑54314844，其分子标记存在7bp的片段插入/缺失，与菠菜果实表面是否有刺相关。本发明是基于序列的插入/缺失片段设计引物，用于鉴定菠菜果实形态。该技术可以高通量检测多个样本，并且操作简单，准确性高，缩短菠菜自交系选育时间，提高育种效率。

Description

一种与菠菜果实形态相关的InDel分子标记及检测引物与应用

技术领域

本发明属于分子遗传育种技术领域，具体地说，涉及一种与菠菜果实形态相关的InDel分子标记及检测引物与应用。

背景技术

菠菜(Spinacia oleracea L.)，别名波斯草、赤根菜，黎科菠菜属，二倍体(2n＝12)雌雄异株植物，栽培历史悠久，是我国重要的蔬菜作物之一。菠菜营养丰富，抗寒性强，适应性广，生产周期短，复种指数高，产量产值高，深受生产者和消费者欢迎。

菠菜生产中播种用的“种子”实为果实。菠菜果实形态是其重要的农艺性状之一，可分为有刺型和无刺型两种。菠菜原产于亚洲西部的伊朗，在引种传播过程中，由于生态条件、栽培方式、生活习惯的不同形成了有刺的东方类型和无刺的欧美类型。目前，国内外在菠菜杂交种子生产过程中，多采用果实无刺类型为母本，有刺类型为父本进行杂交制种。这种配组方式不仅杂种优势明显，且便于种子贮存、包装、运输、生产播种等操作(Sneep，1958)。菠菜为雌雄异株作物，果实形态受母本基因型控制，雄株携带的果实形态基因型只有在下一代采种时才能表现，因此在菠菜优良种质创制过程中，果实形态不易稳定纯化，给优良种质的纯化及品种选育造成了很大影响。

菠菜的果实在成熟过程中，果皮干燥不脱落包围着种子，形成胞果，子房仅有1个心室，内含胚珠1枚，受精后只形成1粒种子。按照果实是否有刺可以将菠菜分为有刺型菠菜和无刺型菠菜。有刺型菠菜的花萼发育成角状突起，俗称“刺”，一般有2～3个刺，少数有1个或4～6个刺，而无刺型菠菜的花萼不发育成角状突起(图1)。菠菜果实表面的刺由花萼发育而来，这也就决定了果实刺的有无由母本的基因型决定(即F1“种子”形态是由母本的基因型决定)。Sneep(1958)的研究表明，果实形态受单基因调控，其中有刺型对无刺型表现为显性性状。

尽管，目前已知菠菜的果实形态受单基因控制，但至今未见果实形态相关基因克隆或者分子标记的报道，严重影响了菠菜自交系的纯化和品种选育的进程。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供与菠菜果实形态相关的分子标记及检测引物与应用

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明首先提供一种与菠菜果实形态相关的分子标记，该分子标记为与菠菜果实形态紧密连锁的InDel标记YC15，可用于检测菠菜果实表面是否有刺。

基于序列的插入/缺失而开发的用于鉴定菠菜果实形态的InDel标记，其位点位置信息如表1所示。

表1

标记名称	染色体	扩增片段区域	插入/缺失片段大小
				YC15	Chr3	54314645-54314844	7bp

表1中的标记位置是根据Xu等(2017)发表的菠菜全基因组序列而确定的。(http://www.spinachbase.org/cgi-bin/spinach/index.cgi)

进一步地，本发明针对该分子标记，提供了检测所述分子标记的检测引物。

所述检测引物包括一条正向引物F和一条为反向引物R，具体信息如下：

正向引物F：5’-TTCCTCATTTGCTTCTTGTC-3’；

反向引物R：5’-GAAAGCATTGATGAGAGTGG-3’。

进一步地，本发明针对该分子标记，提供了其在检测菠菜果实形态方面的应用。

可选的，所述应用体现为一种检测菠菜果实形态的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测菠菜样品的DNA；

(2)利用普通Taq酶和前述检测引物对所述分子标记进行PCR扩增；

(3)PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

其中，检测方法中涉及的PCR反应体系为：

组分	体积(10μL)	体积(20μL)
			模板DNA	1	2
dNTP	1	2
			Buffer	1	2
正向引物F	0.25	0.5
			反向引物R	0.25	0.5
Taq酶	0.25	0.5
			ddH<sub>2</sub>0	6.25	12.5

涉及的PCR反应条件为：

94℃，5分钟；94℃，40秒；55℃，40秒；72℃，50秒；72℃，7分钟。

本发明是基于序列的插入/缺失片段设计引物，用于鉴定菠菜果实形态。该技术可以高通量检测多个样本，并且操作简单，准确性高，缩短菠菜自交系选育时间，提高育种效率。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

附图说明

图1为菠菜果实外形(A)及解剖面(B)。

图2为利用SLAF-BSA法对控制菠菜形态基因进行快速定位的结果。

图3为YC15分子标记扩增BC1亲本及14个子代的结果；其中，M：Marker I:P1：12S3；P2：12S4；1-14为BC1单株；P：果实形态。

图4为YC15分子标记检测20份高代自交系菠菜的结果；其中，M：Marker I；R1-R20为20份高代自交系材料。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明所用引物在上海捷瑞生物工程有限公司合成。

本发明所用菠菜品种均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所菠菜课题组提供。

实施例1利用SLAF_BSA方法确定与菠菜果实形态相关基因的候选区域及连锁标记的开发

1、菠菜遗传群体的构建

利用高代自交系无刺型菠菜12S3和有刺型菠菜12S4进行杂交得到了F₁代，将F₁代的雌株与回交亲本12S3的雄株进行回交获得BC₁群体。

2、基因组DNA的提取以及SLAF文库的构建

采用CTAB法提取亲本和BC₁群体的基因组DNA。

SLAF文库的构建流程如下：

1)参考基因组的确定

选用菠菜基因组，实际基因组大小为989Mb，组装出的基因组大小为493.771Mb，GC含量为38.00％，下载地址：

ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA_000510995.2_Spinach-1.0.3。

2)酶切方案的确定

利用软件对参考基因组进行酶切预测，选择最适酶切方案，最终选用的酶为RsaI+HaeIII酶。

3)建库测序

经酶切后，对得到的酶切片段进行3’端加A处理，连接Dual-index测序接头、PCR扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后用IlluminaHiseqTM 2500进行测序。

3、SLAF-seq数据分析、构建混池及关联分析

基于BC₁群体果实形态的调查结果，分别调取20个有刺型菠菜及20个无刺型菠菜的SLAF测序数据，以SLAF标签中SNP数据作为混池测序的SNP，进行数据混池分析，利用欧氏距离(Euclidean distance，ED)算法进行关联分析，ED的的公式如下：

其中Aaa，Gaa，Caa，Taa分别代表有刺型混池中碱基A，G，C，T的深度，Aab，Gab，Cab，Tab分别代表无刺型混池中碱基A，G，C，T的深度。

4、果实形态基因的初定位

基于关联分析的结果并以此评估与菠菜果实形态相关联的区域。根据计算得到关联阈值为0.168，结合菠菜高密度遗传图谱，将控制果实形态基因定位在连锁群LG1的两个区域内，这两个区间的遗传距离大小为3.77cM和4.32cM，对应于菠菜染色体上为chr3的40697932-94115929区间(图2)。

5、果实形态基因的精细定位及连锁标记的开发

为了缩小初定位区域大小，结合菠菜基因组的数据，在初定位区域内设计40个KASP标记，并利用这些标记在BC1群体筛选重组交换单株，以期缩小候选区域，最终将果实形态基因定位到40698365-61682044之间，进一步通过对2份无刺型菠菜(12S1，12S3)和3份有刺型菠菜(10S2，12S2和12S3)进行重测序，在候选区域内设计20个InDel标记，其中InDel(YC15)与菠菜果实形态连锁强度最高。

6、YC15标记引物的合成

依据SNP突变信息特点，设计特异性PCR引物，包括正向引物和反向引物。

引物序列如下：

正向引物F：5’-TTCCTCATTTGCTTCTTGTC-3’；

反向引物R：5’-GAAAGCATTGATGAGAGTGG-3’。

上述引物序列均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

实施例2YC15分子标记检测BC1群体以及两个亲本

检测方法如下：

1)提取植物基因组DNA

取待测菠菜叶片，采用CTAB法提取全基因组DNA。本次中BC1群体中随机选取14株进行检测。

2)利用普通Taq酶对YC15标记进行PCR扩增，扩增体系如下表：

3)PCR反应程序如下：

4)利用聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行检测

聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶检测扩增产物，若扩出了的200bp的条带，则果实为无刺型，若扩出207bp的条带，则果实为有刺型，若扩出200bp和207bp的两条带，则果实为有刺型(图3)。

实施例3YC15分子标记检测高代自交系菠菜材料

检测方法如下：

在菠菜高代自交系中，随机挑选20份材料，利用按照实施例2中的方法提取DNA，使用YC15标记进行基因分型检测，待材料产生果实后，鉴定其果实形态是否与YC15标记分型一致。PCR反应体系和程序均同实施例2中所描述。

结果分析：通过以上检测，YC15标记分型结果与田间调查结果完全一致(图4)，结果表明YC15标记可准确区分果实的有刺型和无刺型，且速度快，效率高。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所中蔬种业科技（北京）有限公司

<120> 一种与菠菜果实形态相关的InDel分子标记及检测引物与应用

<141> 2018-07-19

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttcctcattt gcttcttgtc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaagcattg atgagagtgg 20

Claims

1.用于检测菠菜果实表面是否有刺的检测引物，其特征在于，所述检测引物包括：

正向引物F：5’- TTCCTCATTTGCTTCTTGTC-3’；

反向引物R：5’-GAAAGCATTGATGAGAGTGG-3’。

2.权利要求1所述的检测引物在鉴定菠菜果实表面是否有刺方面的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，利用所述检测引物对待测菠菜样品的全基因组DNA进行PCR扩增，根据PCR扩增产物的片段大小鉴定菠菜果实表面是否有刺。

4.一种鉴定菠菜果实表面是否有刺的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）提取待测菠菜样品的全基因组DNA；

（2）以步骤（1）提取的DNA为模板，利用Taq酶和权利要求1所述的检测引物进行PCR扩增；

（3）PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。