CN111118200B

CN111118200B - 一种区分香蕉枯萎病抗感品种的caps标记方法

Info

Publication number: CN111118200B
Application number: CN202010080929.5A
Authority: CN
Inventors: 王静毅; 王卓; 贾彩红; 刘菊华; 徐碧玉; 金志强; 张建斌; 苗红霞
Original assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2020-02-05
Filing date: 2020-02-05
Publication date: 2021-01-19
Anticipated expiration: 2040-02-05
Also published as: CN111118200A

Abstract

本发明提供了一种区分香蕉枯萎病抗感品种的CAPS标记方法，通过对中热1号和巴西蕉进行测序和分析，得到可用于区分中热1号和巴西蕉InDel突变，该突变导致基因序列对BclI内切酶消化的差异，基于此，设计了区分香蕉枯萎病抗感品种的CAPS标记方法，能直接反映植株的抗性，不存在由于遗传交换而造成的错误鉴定，可有效鉴别主栽品种巴西蕉及其辐射诱变育种选育出的抗病品种中热1号，极大地提高了抗性基因的选择效率，而且利用该标记方法在香蕉苗期鉴定不仅可以节约田间育种成本，还可以大大提高抗枯萎病香蕉品种的选择进程，为香蕉抗性突变育种奠定基础。

Description

一种区分香蕉枯萎病抗感品种的CAPS标记方法

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体而言，涉及一种区分香蕉枯萎病抗感品种的CAPS标记方法。

背景技术

酶切扩增多态性序列(Cleaved amplified polymorphic sequence,CAPS)是PCR反应和限制性内切酶酶切相结合产生的一种分子标记方法。其基本原理是先用已知位点的DNA序列设计一套特异性PCR引物，扩增后用一种专一性的限制性内切酶酶切所得的扩增产物进行限制性片段长度多态性分析。CAPS标记具有共显性、特异性、操作简单和成本低的特点，目前主要用于植物基因定位、分型、图位克隆和品种品系鉴定等方面的研究。

香蕉是一种重要的果粮兼备的热带经济作物。目前全世界有130多个国家种植香蕉。我国种植面积为41.28万公顷(不含台湾)，产量达1085万吨，产值为29.7亿美元，位居世界第二(FAOSTAT,2014)。香蕉产业已成为我国热带农业的支柱性产业，在南方热区经济和农村社会发展中发挥着十分重要的作用。目前，香蕉产业中面临的突出问题主要有：一是主栽品种单一，优良品种缺乏。无论我国还是其他各产蕉国，其主栽品种基本都以卡文迪许类的巴西、威廉斯为主，长期单一栽培和无性繁殖导致其种性退化。各产蕉区长期遭受各种病虫害的威胁，特别是香蕉枯萎病已给香蕉产业带来毁灭性的打击。二是育种手段匮乏，新品种选育困难。香蕉主栽品种为三倍体，育种方式难以采用杂交育种，而以辐射诱变为主的香蕉育种方式需要保持大量的筛选群体，且优株筛选多以形态标记为主，导致其育种存在筛选周期长，人工、土地等成本太高。

因此，香蕉生产上急需优良品种及开发可用于诱变后代早期选择的有效分子标记或手段。从基因水平解析香蕉优异性状相关基因的遗传机制，开发用于早期筛选鉴定的分子标记，对于香蕉分子育种辅助选择和品种选育具有重要指导和实践意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，基于中热1号香蕉和巴西蕉的InDel标记，提供了一种区分香蕉枯萎病抗感品种的CAPS标记方法，能够有效鉴别主栽品种巴西蕉及其辐射诱变育种选育出的抗病品种中热1号，可应用于香蕉抗感品种鉴定，为香蕉抗性突变育种奠定基础。

中热1号是采用巴西蕉通过⁶⁰Coγ射线辐射诱变定向选育获得的香蕉抗枯萎病新品种，已于2017年04月05日申报植物新品种权保护，申请号20172338.6。

本发明的第一个方面是提供一种区分香蕉枯萎病抗感品种的CAPS标记方法，包括以下步骤：

(1)提取待测香蕉基因组DNA；

(2)以待测香蕉基因组DNA为模板，利用特异性引物对进行PCR扩增反应，所述特异性引物对为：

正向引物G0629F2：5'-TAGCAAAATACATGAACTTTTGGA-3'，

反向引物G0629R2：5'-TCCTCACGACAACAACGAGAAAAAG-3'；

(3)将扩增产物用BclI限制性内切酶进行酶切，获得酶切产物，并对酶切产物凝胶电泳，若获得两条片段，则为巴西蕉，若获得三条片段，则为中热1号香蕉。

其中，步骤(3)中，若获得大小分别为447bp和196bp的两条片段，则为巴西蕉，若获得大小分别为447bp、129bp和77bp的三条片段，则为中热1号香蕉。

本发明的第二个方面是提供一种用于CAPS标记方法的引物对，所述引物对为：正向引物G0629F2：5'-TAGCAAAATACATGAACTTTTGGA-3'，反向引物G0629R2：5'-TCCTCACGACAACAACGAGAAAAAG-3'。

本发明的第三个方面是提供一种区分香蕉枯萎病抗感品种的InDel分子标记，所述InDel分子标记位于香蕉钙依赖蛋白激酶基因启动子的128bp位置，其序列为CATCATTCTTG，中热1号香蕉为CATCATTCTTG的插入，巴西蕉为CATCATTCTTG的缺失。

本发明的第四个方面是提供如本发明第三个方面所述的InDel分子标记在区分香蕉枯萎病抗感品种中的应用。

本发明的第五个方面是提供可识别本发明的第三个方面所述的InDel分子标记的引物对在制备区分香蕉枯萎病抗感品种试剂中的应用。

本发明通过对中热1号和巴西蕉进行测序和分析，得到可用于区分中热1号和巴西蕉InDel突变，该突变导致基因序列对Bcl I内切酶消化的差异，基于此，设计了区分香蕉枯萎病抗感品种的CAPS标记方法，能直接反映植株的抗性，不存在由于遗传交换而造成的错误鉴定，可有效鉴别主栽品种巴西蕉及其辐射诱变育种选育出的抗病品种中热1号，极大地提高了抗性基因的选择效率，而且利用该标记方法在香蕉苗期鉴定不仅可以节约田间育种成本，还可以大大提高抗枯萎病香蕉品种的选择进程，为香蕉抗性突变育种奠定基础。

附图说明

图1为香蕉钙依赖蛋白激酶基因启动子区序列扩增及突变位点分析图。

图2为香蕉钙依赖蛋白激酶基因启动子区变异位点CAPS分析及扩增序列内切酶位点分析：A为启动子区变异位点的CAPS分析；B为启动子区扩增序列的酶切位点分析。

图3为香蕉钙依赖蛋白激酶基因启动子的PCR扩增和酶切图谱：A为巴西和中热1号PCR扩增电泳图，B为巴西和中热1号PCR产物酶切带型图，其中，M为DL2000 marker，1-3为巴西蕉PCR扩增和酶切样品；4-6为中热1号PCR扩增和酶切样品。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

1、基因组DNA提取

分别随机选取巴西蕉和中热1号香蕉健康植株各4株，以幼嫩卷筒叶为材料，利用北京天根生化科技有限公司的多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒(DP360)提取基因组DNA，1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

2、SNP及InDel突变位点的鉴定

本实验室前期抗感品种中热1号和巴西蕉重测序及转录组测序结果显示，一个抗性相关基因--钙依赖蛋白激酶基因(CDPK,Ma04t06290.1)在2个香蕉品种中的表达存在显著差异，提示该基因可能与枯萎病抗性相关。提取该基因的启动子区序列，设计引物对(G0629F1：5'-TAGCAAAATACATGAACTTTTGGAG-3'和G0629R1：5'-GGTCTTTTACCAACCAAAAATAAGC-3')，对中热1号和巴西蕉的基因组DNA进行PCR扩增。

PCR扩增体系包含1.0μl DNA模板、2.0μl 10×Ex Taq Buffer、1.0μL TaKaRa ExTaq、10μM上下游引物各1.0μl、14.0μl H2O。反应程序94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。

用1％的琼脂糖凝胶电泳回收纯化PCR产物，回收片段连接pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆测序，巴西蕉钙依赖蛋白激酶基因启动子区序列如SEQ ID NO:1所示，中热1号钙依赖蛋白激酶基因启动子区序列如SEQ ID NO:2所示。把测序所得到的序列用DNAMAN软件进行序列比对，鉴定两个抗感不同的品种之间的SNP及InDel位点。通过序列比对发现(图1)：在两品种中均扩增到约1130bp清晰单一序列，并在该扩增序列的128bp处有1个长度为11bp的InDel位点(CATCATTCTTG)，同时在该区域还存在10个碱基的突变，分别在该序列的第147、155、185、277、291、315、317、359、428和726bp位点处。

3、CAPS标记的开发

针对在这两个品种中出现的变异位点，进行生物信息学分析，发现第128位点的InDel插入突变在抗性品种中产生了一个Bcl I限制性内切酶位点(T^GATCA)。因此我们在包含该InDel突变位点区域的两侧设计CAPS引物(G0629F2：5'-TAGCAAAATACATGAACTTTTGGA-3'和G0629R2：5'-TCCTCACGACAACAACGAGAAAAAG-3')，利用该引物序列进行PCR扩增及酶切后产物片段大小见表1。25.0μl酶切反应体系包括：PCR产物5.0μl，10×酶切反应缓冲液2.5μl，内切酶0.5μl，水17.0μl。37℃下反应1h。用2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。

扩增结果如图2A所示，在巴西蕉和中热1号两个品种中可分别扩增出643bp和654bp的片段，对扩增出的这段序列进行测序分析发现：除该变异位点含有1个BclI切点，这个序列在非变异区仍然含有1个BclI切点，这样就使得中热1号在该序列片段中含有2个BclI酶切点，而巴西蕉为1个Bcll酶切点(图2B)。因此，对巴西蕉和中热1号进行扩增后酶切电泳，在巴西蕉中可获得大小分别为447bp和196bp的两条片段，而在中热1号中可获得大小分别为447bp、129bp和77bp的三条片段(图3)。

表1 G0629PCR产物及酶切产物

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120> 一种区分香蕉枯萎病抗感品种的CAPS标记方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1129

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

tagcaaaata catgaacttt tggagaacaa cattaatttt aaaactgaga taaatgatta 60

atattctttg taaggaggca tccctctctt tcgaagttat gggatatttc gtcgagttct 120

tcgtgattat tgattagttt ttataaaaaa aaatcaaact aaattaagat ttttattttt 180

tcatcaaaat tgatcaaaca taattccatc aagtcggaca caatcgatgt ctcacgagtc 240

caattgccat cggtcacttt ccgtctttca ctgtcattag taatattgca tgtgacgtat 300

aatgtacagt gaacgatcaa atacgacgtt ccgatttcga ttagaatata agaactatat 360

tttgagtagg aagtcgtcaa cacatccctt ctgcttaaat caatacggta cttctcttgt 420

cccgctgaag tcgcgtatga atcggtcaag tctggcgtcc aaatgcatct tggagcgcag 480

gcgaagaggg acacgttggt catcacgaac tccgttagat ttccgacgag cgaggagaaa 540

cgatcgcgtg tttcttgtga tgctgttttg actattacaa cccaagaaag aaggcggttt 600

ttgcttctcg tttggcttct ttttctcgtt gttgtcgtga ggagctggtg ggagggaggg 660

gagaagagag tcggaagctt tgacgctctc ttctcacgac attgggctca ttcgaccctc 720

ctgctcttga ttggaattcg aaatcttttg ttccaatccg tttgttttct tctcgcgcgg 780

accctttgtt tgacttctta cgtcgtaaaa attcgtactt tgccgctgtt gccgttcgag 840

ttgagagaat ccgagagggg aggagataac agaggggtgc ggaagctcgg attctcgttt 900

ttggaagaag aacggaggaa agaagcaggc gaattgagac aaggaaagaa aaacacaagg 960

gttcctgttc tcgtttctct tgtcttcgtt cctttcaatt cgaggagttc cgtattcgtt 1020

tagatatccc aaacggtctc taatttggag aggcattttg gttcccatac gttctcttgg 1080

aatttcaagc tgtcgagctt gatcgcttat ttttggttgg taaaagacc 1129

<210> 2

<211> 1139

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 2

tagcaaaata catgaacttt tggagaacaa cattaatttt aaaactgaga taaatgatta 60

atattctttg taaggaggca tccctctctt tcgaagttat gggatatttc gtcgagttct 120

tcgtgatcat cattcttgta tagattaatt tttattaaaa aaaatcaaac taaattaaga 180

tttttgtttt ttcatcaaat tgatcaaaca taattccatt aagtcggaca caatcgatgt 240

ctcacgagtc caattgccat cggtcacttt ccgtctatca ctgtcattag aaatattgca 300

tgtgacgtat aatgcatagt gaacgatcaa atacgacgtt ccgatttcga ttagaataaa 360

agaactatat tttgagtagg aagtcgtcaa cacatccctt ctgcttgaat cgatacggta 420

cttctctcgt cccgctgaag tcgcgtatga atcggtcaag tctggcgtac aaatgcatct 480

tggagcgcag gcgaagaggg acacgttggt catcacgaac tccgttagat ttccgacgag 540

cgaggagaaa cgatcgcgtg tttcttgtga tgctgttttg actattacaa cccaagaaag 600

aaggcggatt ttgcttctcg tttggcttct ttttctcgtt gttgtcgtga ggagctggtg 660

ggagggaggg gagaagagag tcggaagctt tgaccctctc ttctcacgac attgggctca 720

ttcgatcctc ctgctcttga ttggaattcg aaatcttttg ttccaatccg tttgttttct 780

tctcgcgcgg tccctttgtt tgactcctta cctcgtaaaa attcgtactt tgccgctgtt 840

gccgttcgag ttgagagaat ccgagagggg aggagacagc agaggggtgc ggaagctcgg 900

attctcgttt ttggaagaag aacggaggaa agaagcaggc gaattgagac aaggaaagaa 960

aaacacaagg gttcctgttc tcgtttctct tgtcttcgtt cctttcaatt cgaggagttc 1020

cgtattcgtt tagatatccc aaacggtctc taatttggag aggcattttg gttcccatac 1080

gttctcttgg aatttcaagc tgtcgagctt gatcgcttat ttttggttgg taaaagacc 1139

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 3

tagcaaaata catgaacttt tggag 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 4

ggtcttttac caaccaaaaa taagc 25

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 5

tagcaaaata catgaacttt tgga 24

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 6

tcctcacgac aacaacgaga aaaag 25

Claims

1.一种区分巴西蕉和中热1号香蕉的CAPS标记方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测香蕉基因组DNA，所述待测香蕉基因组DNA来源于中热1号香蕉或巴西蕉；

正向引物G0629F2：5 '-TAGCAAAATACATGAACTTTTGGA-3 '，

反向引物G0629R2：5 '-TCCTCACGACAACAACGAGAAAAAG-3 '；

(3)将扩增产物用Bcll限制性内切酶进行酶切，获得酶切产物，并对酶切产物凝胶电泳，若获得两条片段，则为巴西蕉，若获得三条片段，则为中热1号香蕉。

2.根据权利要求1所述的CAPS标记方法，其特征在于，步骤(3)中，若获得大小分别为447bp和196bp的两条片段，则为巴西蕉，若获得大小分别为447bp、129bp和77bp的三条片段，则为中热1号香蕉。

3.一种用于区分巴西蕉和中热1号香蕉的CAPS标记方法的引物对，其特征在于，所述引物对为：

正向引物G0629F2：5 '-TAGCAAAATACATGAACTTTTGGA-3 '，

反向引物G0629R2：5 '-TCCTCACGACAACAACGAGAAAAAG-3 '。

4. 一种区分巴西蕉和中热1号香蕉的InDel分子标记，其特征在于，所述InDel分子标记位于SEQ ID NO:2所示序列的128-138bp处，其序列为CATCATTCTTG，中热1号香蕉为CATCATTCTTG的插入，巴西蕉为CATCATTCTTG的缺失。

5.检测如权利要求4所述的InDel分子标记的试剂在区分巴西蕉和中热1号香蕉中的应用。

6.可识别权利要求4所述的InDel分子标记的引物对在制备区分巴西蕉和中热1号香蕉试剂中的应用。