KR100753676B1 - 배추과 작물의 품종 구분 및 유용표지인자 개발수단으로서의 왜성전이인자, 이를 이용한 ｄｎａ 표지인자제작용 프라이머, 및 이들을 이용한 배추과 작물의 품종구분방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 배추과 작물의 품종 구분 및 유용표지인자 개발 수단으로서의 왜성전이인자인 서열번호1 기재의 TRIM-Br1 또는 서열번호2 기재의 TRIM-Br2, 이를 이용한 배추과 작물의 품종 구분에 사용되는 DNA 표지인자 제작용 프라이머인 서열번호3~10 중 어느 하나의 서열을 갖는 Br1n2DP-R 또는 서열번호11~14 중 어느 하나의 서열을 갖는 Br1n2DP-L, 및 이를 이용한 배추과 작물의 품종 구분 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 배추과 작물의 유전육종 과정에서 유용한 표지인자를 탐색하거나 유전자 지도 작성 및 품종구분에 효율적으로 활용할 수 있는 것으로서 배추과 작물의 유전자 밀집지역 전반에 골고루 삽입되어 있는 TRIM-Br1 및 TRIM-Br2 전이인자, 상기 전이인자 TRIM-Br1 및 TRIM-Br2를 이용한 DNA 표지인자를 제작하는데 사용되는 프라이머, 및 TRIM-Br1 및 TRIM-Br2의 특이 염기서열을 이용한 배추과 작물의 품종 구분방법에 관한 것이다.

배추, 왜성 전이인자, TRIM-Br1, TRIM-Br2, TRIM 디스플레이

Description

배추과 작물의 품종 구분 및 유용표지인자 개발 수단으로서의 왜성전이인자, 이를 이용한 ＤＮＡ 표지인자 제작용 프라이머, 및 이들을 이용한 배추과 작물의 품종 구분방법{TRIM-Br1 and TRIM-Br2, DNA marker system using the same and classification method using the same}

도 1은 TRIM-Br1 및 TRIM-Br2의 삽입부위 및 품종간 삽입다양성 분석결과를 나타낸 도면이다.

도 2는 배추과 식물에 존재하는 Br1 및 Br2의 왜성전이인자의 탐색 및 비교를 위한 계통도이다.

도 3은 본 발명의 TRIM-Br1 및 TRIM-Br2의 염기서열을 나타낸 도면이다.

도 4는 본 발명의 TRIM-Br1 및 TRIM-Br2를 이용한 DNA 표지인자를 제작하는데 사용되는 프라이머를 제작하는 과정을 나타낸 도면이다.

도 5는 본 발명의 TRIM-Br1 및 TRIM-Br2의 특이 염기서열을 이용한 DNA 표지인자 시스템의 개요를 나타낸 도면이다.

도 6은 배추 및 무의 F1 품종간 다형성 조사를 위한 전기영동 결과물을 나타낸 도면이다.

도 7은 도 6의 본 발명의 DNA 표지인자 시스템을 설명하기 위한 전기영동 결과물로 얻어진 밴드의 일예를 나타낸 도면이다.

본 발명은 배추과 작물의 품종 구분 수단으로서의 왜성전이인자인 서열번호1 기재의 TRIM-Br1 또는 서열번호2 기재의 TRIM-Br2, 이를 이용한 DNA 표지인자를 제작하는데 사용되는 프라이머인 서열번호3~10 중 어느 하나의 서열을 갖는 Br1n2DP-R 및 서열번호11~14 중 어느 하나의 서열을 갖는 Br1n2DP-L, 및 이를 이용한 배추과 작물의 DNA 품종을 구분하는 방법에 관한 것이다.

배추속 작물은 분류학적으로 애기장대와 같은 배추과 작물로서, 유지공급원, 채소와 양념 등 다양한 범위의 용도를 가지고 있는 작물들이 포함되어 있어 작물로서 그 경제적 가치가 높다. 이들 배추속 작물들은 각각 극대화된 기관의 형태에 의해 분류되는데, 대표적으로 꽃봉오리가 발달한 꽃양배추(Brassica oleracea ssp. botrytis)와 브로콜리(B. oleracea spp. italica), 줄기조직이 발달한 콜라비(B. oleracea ssp. gongylodes), 뿌리 기관이 발달된 순무(B. rapa ssp. rapifera), 구불구불한 잎 조직이 발달한 박쵸이(B. rapa ssp. chinensis)와 배추(B. rapa ssp. pekinensis), 단일 정단 봉오리가 발달한 양배추(B. oleracea ssp. capitata) 및 다양한 측아조직이 발달된 방울다다기양배추(B. oleracea ssp. gemmifera) 등을 들 수 있다. 또한 겨자 양념으로 이용되는 흑겨자(B. nigra)도 배추속 작물에 속한다.

배추속 작물은 종간, 아종간, 아종내 다형성이 매우 높은데, 이는 식물 게놈내에 가장 빈번하면서 빠른 염색체 대단위 변화를 초래하는 현상을 다배체화 (polyploidy)에서 그 원인을 찾을 수 있다. 현재 존재하는 피자식물 중 80%가 넘는 식물종이 1회 또는 여러회 염색체의 배가가 이루어진 다배체화 게놈 형태인 것으로 알려져 있다(Masterson 1994; Stebbinson 1996). 다배체화는 광범위한 염색체 재구성(Ahn and Tanksley, 1993; Reinsch et al., 1994; Song et al., 1995a, 1995b; Lagercrantz and Lydiate, 1996; Bubaker et al., 1999) 및 레트로-트란스포존(retro-transposon) 증폭을 가능하게할 뿐만 아니라(Matzke and Matske, 1998; Zhao et al., 1998), 염색체간 유사한 영역을 공통으로 갖고 있어 세대를 거듭하고 진화함에 따라 상동성 있는 영역간 재조합을 일으키게 하고, 부가적인 유전자 중복을 가져오게 하여 더 복잡한 염색체 재구성의 기본 요인이 된다.

생물의 종 및 품종을 식별함에 있어서 종래에는 형태적, 이화학적 방법이 사용되어 왔으나, 상기 배추과 작물은 염색체 구성이 복잡하여 분속지표가 확립되기 어렵기 때문에 거의 주관적으로 품종 및 종 판별이 이루어지고 있는 실정에 있다. 최근에 핵산지문법(DNA fingerprint)에 의한 품종 및 종의 유전적 감식법이 광범위하게 이용되고 있는데, 핵산지문법에는 제한효소단편장다형(restriction fragment length polymorphism: RFLP)법과 PCR법이 있다. RFLP법은 제한효소(restriction enzyme)에 의해 DNA를 절단한 다음 절단 단편들을 나이론막에 전사한 후, 방사성 동위원소 등으로 표지한 프로브(probe)를 이용해 DNA 다형성을 검출하는 방법이고, PCR(polymerase chain reaction)법은 프라이머라고 불리는 10∼20bp로 구성된 특정 DNA 단편을 생물체로부터 분리한 게놈유전자(genomic DNA)에 접촉(annealing)시킨 후, 내열성 DNA 중합효소 (Taq polymerase)를 첨가하여 합성반응을 반복적으로 행 하여 프라이머가 결합된 영역을 증폭시킨 후, 그 PCR 증폭산물을 아가로스겔(agarose gel) 또는 아크릴아마이드겔(acrylamide gel)에서 전기영동하고, 에티듐브로마이드(ethidium bromide) 및 은염색(silver stain)으로 DNA를 염색하여 DNA 다형성을 검출하는 방법이다.

그러나 RFLP법은 다량의 게놈유전자(5㎍ 이상)가 필요하고, 다단계의 과정이 필요함에 따라 시간, 노력 및 비용이 소요되는 단점이 있고, PCR법은 사용되는 프라이머들이 10개의 염기로 구성된 10mer의 프라이머가 주종을 이루고 있기 때문에 37℃이하의 낮은 온도에서의 주형 DNA(template DNA)와의 접촉반응으로 특이적 접촉반응이 이루어지지 않으므로 비특이적 DNA 증폭산물의 검출로 재현성이 떨어지며, 생물종에 따라 수백에서 수천 종류의 프라이머 탐색이 이루어져야 하는 또다른 시간, 노력 및 비용손실이 요구된다는 문제가 있었다.

최근에 사용되는 다른 유전자 감식법으로 AFLP법 및 RAPD법이 있다. AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)법은 인식부위가 많지 않은 제한효소로 절단된 DNA의 단편들에 어댑터(임의로 합성한 DNA 조각)를 붙인 다음, 표식 부위의 DNA 염기서열을 바탕으로 작성한 프라이머를 PCR의 프라이머로 사용하여 특정 제한효소 단편을 증폭시켜 그 산물에서 얻어지는 밴드 차이의 유무를 비교하는 것이다. RAPD(Random Amplified Polymorphic DNAs)법은 PCR을 이용하는 방법으로서 종간 및 종 내의 유전적 근원관계를 연구하는데 많이 활용되는데, 대개 9~11bp의 짧은 임의의 프라이머(random primer)를 이용하여 2개의 염기서열(상보적인 염기서열)에 의해 맞추어지는 유전체 부위만을 증폭시켜 아가로스겔에 전기영동하여 단편 들의 형태를 분석하는 방법이다.

그러나, 상기 두가지 방법으로 나타나는 표지인자는 대부분이 유전자가 극히 드문 헤테로크로마틴(heterochromatin) 지역으로부터 생성되어 표지인자가 유전체 전반에 골고루 분포하지 못하고, 일부 지역으로만 편중되는 단점이 지적되어 새로운 표지인자의 개발이 필요하다는 문제가 있었다.

상기와 같은 문제를 해결하기 위하여 유전체의 SSR(simple sequence repeat)를 이용하는 SSR 표지인자의 사용이 제안되었다. SSR 표지인자를 사용하는 경우에는 AFLP나 RAPD의 단점을 극복할 수 있는 것으로 알려져 있었다. 그러나 상기 SSR 표지의 경우에는 단 한개의 유전자좌 위치만 나타내는 것이기 때문에 새로운 표지인자 개발을 할 수 없다는 한계점이 있었다.

본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여 신속하게 다량으로 유전자가 많이 분포하는 지역의 표지인자를 개발할 수 있을 뿐만 아니라, 시판 품종의 품종 동정 및 품종 보호 등에도 유용하게 활용될 수 있는 DNA 표지인자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 표지를 이용하여 배추과 작물의 DNA 품종을 구분하는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 하나의 측면에 따르면, 배추과 작물의 품종 구분 수단으로서의 왜성전이인자인 서열번호1 기재의 TRIM-Br1 또는 서열번호2 기재의 TRIM-Br2 서열을 제공한다.

본 발명의 발명자는 배추의 유전체 염기서열분석 및 해독 과정에서 새로운 왜성전이인자를 발견하여 TRIM-Br1 및 TRIM-Br2로 명명하였으며, 2004년 12월 29일에 Gene Bank에 등록하였다(TRIM-Br1은 KBrH012I15R(GeneBank 등록번호 CW986232)이고, TRIM-Br2는 KBrH080A08(GeneBank 등록번호 AC155344)). 상기 TRIM-Br1 및 TRIM-Br2는 배추과 식물의 유전체 전반에 다량 분포하며, 특히 중요한 채소 작물인 배추와 양배추의 유전체에는 약 600copy 이상 분포하는 것으로 분석되었으며, 많은 경우 유전자가 밀집되어 있는 지역에 골고루 분포하는 것으로 분석되었다(도2 참조). 또한 특정의 경우 유전자의 중간부위에 삽입되어 원래의 유전자 구조를 기능이 있는 새로운 유전자로 변형시킴을 발견하였다.

상기 TRIM-Br1 및 TRIM-Br2의 구조는 도3에 나타내었다. 상기 도면에 도시된 바와 같이, TRIM-Br1 및 TRIM-Br2은 약 120bp(119-125bp)의 동일 염기서열(terminal repeat:TR)이 약 130bp(125-135)의 내부 시퀀스(internal sequence) 양쪽에 위치하며, 전체 크기는 약 350bp로 구성되어 있다. TR 염기서열은 TA 혹은 TG로 시작되어 CA로 끝이 나며, 내부 시퀀스는 tRNA 메티오닌의 프라이머 결합위치(primer bonding site) 염기서열과 상보적인 염기서열로 시작되어 폴리퓨린트랙(polypurine tract) 염기서열로 끝이 난다. 또한 이 전이인자는 삽입과 동시에 5bp 의 염기서열을 삽입부위 양쪽에 복제하는 특징을 가지고 있어 기본적인 특징은 LTR(long terminal repeat) 레트로-트란스포존과 같다고 할 수 있으나, 보통의 LTR 레트로-트란스포존의 크기가 약 5,000bp 이상에서 20,000bp 미만인 반면 이 전이인자는 약 350bp로 매우 작은 왜성인자라고 할 수 있다. 이와 유사한 전이인자는 지금까지 2000년 국제학술지인 PNAS에 단 한편 발표되었으며, 이들 종류를 TRIM(terminal repeat retrotransposon in miniature)라고 명명한 바 있다. 또한 보고된 TRIM에 속하는 왜성전이인자는 일반적인 레트로-트란스포존들이 유전자가 적은 부위를 선호하여 삽입되는 것과 달리 유전자가 많은 부위를 선호하여 삽입된다는 사실을 확인한 바 있다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 배추과 작물의 품종 구분시에 사용되는 DNA 표지인자로서, 상기 TRIM-Br1 및 TRIM-Br2를 이용하여 DNA 표지인자를 제작하는데 사용되는 서열번호3~10의 프라이머 Br1n2DP-R 및 서열번호11~14의 Br1n2DP-L를 제공한다.

상기 전이인자, 특이 프라이머인 Br1n2DP-R과 Br1n2DP-L은 TRIM-Br1과 TRIM-Br2 전이인자들의 TR 염기서열 중 원형이 상당히 유지되는 부위를 택하여 제작된다. Br1n2DP-L은 전이인자의 왼쪽 방향으로 진행하며, 이의 염기서열은 gcttccaac(T or C)(T or C)aa aaccaattgg이고, Br1n2DP-R은 오른쪽 방향으로 진행하며, 이의 염기서열은 attggtttt(A or G) (A or G)gttggaagc(C or T)cat이다.

도4에 본 발명의 프라이머인 상기 Br1n2DP-R 및 Br1n2DP-L를 각각 나타내었위를 인지하여 오른쪽 방향을 증폭하는 프라이머이고, Br1n2DP-L은 TR의 약 110bp 부위를 인지하여 왼쪽 방향으로 증폭하는 프라이머이다.
서열번호 3~10의 프라이머 Br1n2DP-R 및 서열번호11~14의 프라이머 Br1n2DP-L의 구체적인 염기서열은 다음의 표 1에 나타내었다.

서열번호	염기서열
서열번호 3	5'-attggtttta agttggaagc ccat-3'
서열번호 4	5'-attggtttta agttggaagc tcat-3'
서열번호 5	5'-attggtttta ggttggaagc ccat-3'
서열번호 6	5'-attggtttta ggttggaagc tcat-3'
서열번호 7	5'-attggttttg agttggaagc ccat-3'
서열번호 8	5'-attggttttg agttggaagc tcat-3'
서열번호 9	5'-attggttttg ggttggaagc ccat-3'
서열번호 10	5'-attggttttg ggttggaagc tcat-3'
서열번호 11	5'-gcttccaact taaaaccaat tgg-3'
서열번호 12	5'-gcttccaact caaaaccaat tgg-3'
서열번호 13	5'-gcttccaacc taaaaccaat tgg-3'
서열번호 14	5'-gcttccaacc caaaaccaat tgg-3'

본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 왜성전이인자인 및 상기 프라이머를 이용한 배추과 작물의 품종 구분방법을 제공한다.

본 발명의 서열번호1 기재의 TRIM-Br1 전이인자 또는 서열번호2 기재의 TRIM-Br2 전이인자의 특이 염기서열을 이용한 배추과 작물의 품종 구분방법은 다음 단계들을 포함하여 구성된다:

(1) 게놈 DNA를 절단한 다음, 절단된 게놈 DNA 단편들의 말단에 연결될 수 있는 어댑터를 부착하는 단계;

(2) 상기 단계 (1)에서 얻어진, 어댑터가 부착된 게놈 DNA 단편들의 한쪽에는 어댑터 염기서열과 어닐링(annealing)되는 프라이머를 사용하고, 다른 한쪽에는 서열번호 3~10 중 어느 하나의 서열을 갖는 Br1n2DP-R 프라이머 또는 서열번호11~14 중 어느 하나의 서열을 갖는 Br1n2DP-L 프라이머를 사용하여 1차 PCR 하는 단계;
(3) 상기 단계 (2)에서 얻어진 1차 PCR 산물들 중, 상기 단계 (2)에서 사용되는 어댑터 염기서열과 어닐링되는 프라이머의 3' 말단에 인접한 첫 번째 염기가 A, T, G 및 C 중 어느 하나인 1차 PCR 산물을 선택적으로 각각 증폭하기 위하여 2차 PCR하는 단계; 및

(4) 상기 단계 (3)에서 얻어진 PCR 산물들을 전기영동하고, 밴드들의 디스플레이(display) 양상을 비교하므로써 배추과 작물의 품종을 구분하는 단계.

본 발명의 상기 배추과 작물의 품종구분방법을 도5에 나타내었다.

상기 단계(1)에 있어서, 게놈 DNA를 절단하는데 사용되는 제한효소로는 AFLP 기술에서 사용된 것과 같이 네 개의 염기를 인지하는 MseI 또는 BfaI를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 상기 단계(1)에 있어서 게놈 DNA 특이적 어댑터로는 5'-GACGATGAGTCCTGAG-3'(서열번호 15) 와 5'-TACTCAGGACTCAT-3'(서열번호 16) 을 95℃에서 5분간 변성시키고, 실온에서 5분간 부착시킨후 사용하는 것이 바람직하다.

상기 단계(2)에 있어서, 어댑터 시퀀스를 기반으로 한 프라이머는 Mse I 제한효소를 처리한 경우 5'-GACGATGAGTCCTGAGTAA-3'(서열번호 17) 이고, Bfa I 제한효소를 처리한 경우 5'-GACGATGAGTCCTGAGTAG-3'(서열번호 18)이다.

상기 단계(2) 및 단계(3)에서 행하는 PCR은, 예를 들어 1차증폭(preamplification)에서 72℃ 2분, 94℃ 5분 반응 후, 94℃/58℃/72℃를 각각 30초/30초/60초 동안 30회 반복한 다음, 72℃에서 2분간 반응시키고, 2차증폭(selectiveamplification)에서 94℃ 5분 반응 후, 94℃/58℃/72℃를 한회 반복시 부착(annealing)온도를 1℃씩 낮추면서 30초/30초/60초 동안 30회 반복한 다음, 72℃에서 5분간 반응시킨다.

상기 단계(4)에 있어서, 특히 본 발명의 실시예에서는 생성된 밴드의 유무를 스코어(score) 1 또는 0으로 표기하므로써, 각 샘플이 갖는 밴드의 유무의 차이로 샘플간의 유전적 차이를 규명하였다.

상기 방법을 보다 상세하게 설명하면, 먼저, 전기영동 한 후 도7과 같은 밴드를 얻었다면, 이를 관찰하여 품종간 밴드의 차이를 보이는 밴드를 선택한다. 도7에 있어서, 전체 밴드의 수는 12개이고, 품종간 밴드의 차이를 보이는 밴드의 수는2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11번 화살표와 같이 모두 9개이다. 먼저, 차이를 보이는 밴드를 가지는 품종의 경우 스코어 1을 주고, 밴드를 가지지 않는 품종의 경우 스코어 0을 주어 이러한 차이를 보이는 밴드들에 대해서 사용된 품종에 대해 모두 1 또는 0으로 표기한다. 예컨대, 2번 밴드의 경우 1, 0, 0, 1이 되고, 3번 밴드의 경우 0, 1, 1, 0 으로 표기된다. 도7에서는 차이를 보이는 밴드가 9개이므로 품종마다 9개의 밴드에 대해 밴드의 있고 없음이 1 혹은 0으로 표기된다. 이렇게 얻은 결 과를 각 마커에 대해 정리하고, 이 자료는 프로그램을 통해 품종간 유전적인 다양성 결과에 이용하게 된다.

또한, 상기와 같이 정리된 1 혹은 0의 패턴을 품종별로 비교하여 보았을 때, 비교한 품종의 밴드 패턴이 같은 패턴을 보인 경우는 품종간 차이를 보이지 않는 마커라고 할 수 있으며, 서로 다른 패턴을 보인 경우는 비교한 품종간의 차이를 규명할 수 있는 마커라고 할 수 있다. 예컨대, 도7의 A,B,C,D 품종이 갖는 밴드의 패턴이 다르다. 네 개의 품종은 다형성 밴드를 보이는 밴드들의 조합에 의해 뚜렷하게 구분될 수 있다. 즉 2, 5 및 9번의 다형성밴드를 모두 가지고 있는 것은 A품종, 3, 4 및 8번의 다형성 밴드를 모두 가지는 것은 B품종, 3 및 9번 밴드를 모두 가지는 품종은 C품종, 2, 7 및 10번 밴드를 모두 가지는 것은 D품종이라고 판별할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.

[실시예]

[실시예1:TRIM-Br1 및 TRIM-Br2의 삽입부위 및 PCR을 이용한 품종간 삽입다양성 확인]

왜성전이인자인 TRIM-Br1 및 TRIM-Br2의 새로운 발견은 도 1에서와 같이 유전체의 동형 염기서열간 비교를 통하여 이루어 졌다. 약 350bp의 전이인자가 삽입된 주변 염기서열(80A08 도 1a)과 동형이며, 전이인자가 삽입되지 않은 4D11과 애기장대(Arabidopsis) 5번 염색체(At#5) 염기서열(도1a)을 비교하여 전이인자의 삽 입으로 생성하는 5bp 복제염기서열(tagtc)을 확인하므로써 이것이 전이인자임을 확인할 수 있었다. 또한 삽입부위의 양쪽 주변에 공통으로 존재하는 염기서열을 이용한 프라이머를 활용하여 여러 다양한 품종들간 PCR을 하였을때 전이인자가 삽입된 부위는 약 350bp가 더 큰 밴드를 생성하며, 삽입이 되지 않은 부위는 원래의 작은 밴드를 생성하는 것으로 전이인자의 삽입을 확인할 수 있었다. 80A08에 Br2 전이인자가 삽입된 부위는 도1b에서 위의 595bp 밴드를 생성하지만 Br2가 삽입되지 않은 부위는 205bp의 밴드를 생성한다. Br2가 삽입된 부위는 B.rapa(A 게놈)와 A 게놈이 다른 B, C 게놈과 새로 합성된 B.juncea(AB 게놈)와 B.napus(AC 게놈)에만 특이하게 존재하여 이 전이인자는 배추(A 게놈)가 양배추(C 게놈)와 약 4백만년전에 종의 분화를 겪은 후, 그리고 AB, AC 게놈이 새로 합성된 약 만년전보다는 그 이전에 배추에 특이적으로 삽입되었다는 사실을 알 수 있었다. 반면에 Br1-12I15는 배추 품종 중에서도 특정품종(A1)에만 유일하게 삽입되어 있고(도1c의 (A)), 현재 재배되고 있는 배추 시판품종 19개 중 5개 품종에만 존재하는 것을 알 수 있었다(도1c의 (B)). Br2-06P20의 경우에는 배추와 양배추에 공통으로 존재하는데(도1c의 (C)), 이는 배추와 양배추가 분화되기 전의 원시게놈에 삽입되었고, 이 삽입체가 지금까지의 진화과정에 대부분의 배추와 무 품종에 유전되어 오고 있음을 나타내준다(도1c의 (D)). 실험에 사용된 배추과 식물 17종은 도 1c의 오른쪽 표에 명시되어 있다. 여기에서, 국내시판 배추 F1 품종으로는, 1. 금빛, 2. 노란자, 3. 노랑김장, 4. 만점, 5. 매력, 6. 불암2, 7. 샛노랑, 8. 서울, 9. 스피드60일, 10. 신춘, 11. 쌈맛, 12. 장미배추, 13. 장원, 14. 정상, 15. 한여름배추, 16. 황성, 17. 흑진주, 18. CR으뜸, 19. CR하계를 사용하였고, 국내시판 무우 F1 품종으로는, 20. 서호무, 21. 일학미농무, 22. 진주대평무를 사용하였다.

[실시예2:배추과 식물에 존재하는 TRIM-Br1 및 TRIM-Br2의 삽입부위 및 염기서열]

- TRIM-Br1 및 TRIM-Br2(도3)는 배추(지부 계통 배추)의 거대 DNA 단편 은행인 BAC(Bacterial Artificial Chromosome) 클론의 양말단 염기서열과 완전염기서열을 분석한 후 이들 염기서열정보를 해독하는 과정에서 발견하였으며 이들 중 두개의 전이인자를 포함하고 있는 염기서열은 도3과 같으며, 이들은 진뱅크에 등록되어있다. 전체 게놈 염기서열 중 전이인자는 굵은 글씨로 강조되었으며, 전이인자의 삽입에 의해 생성된 동일 5bp 복제 염기서열(Target site duplication: TSD)은 붉은 이탤릭 글씨로 강조되었다. 전이인자는 내부의 IS(Internal sequence)(초록 글씨) 주변으로 TR(Terminal repeat )(파랑 글씨)로 구성되어 있음을 알 수 있었다.

TRIM 전이인자는 모델 식물체인 애기장대의 유전체 전반에 골고루 분포하고 있음을 확인하였으며, 또한 많은 경우 유전자가 많은 지역에 삽입되어 있는 것을 확인하였으며, 배추의 경우에도 도3의 Br2는 MI-1-P 유전자의 중간에 삽입되어 유전자의 구조를 변경시킴을 확인하였다.

[실시예3:TRIM-Br1 및 TRIM-Br2를 이용하여 프라이머 제작]

TRIM-Br1 및 TRIM-Br2 전이인자들의 TR 염기서열 중 원형이 상당히 유지되는 부위를 택하여 가능하면 유사 전이인자가 모두 인지될 수 있도록 Br1과 Br2를 특이하게 인지하는 프라이머 Br1n2DP-R과 Br1n2DP-L을 제작하였다. 도4에 도시된 바와 같이 Br1n2DP-R은 오른쪽 방향으로 진행하며, 이의 염기서열은 attggtttt(A or G) (A or G)gttggaagc(C or T)cat이고, Br1n2DP-L은 전이인자의 왼쪽 방향으로 진행하며 이의 염기서열은 gcttccaac(T or C)(T or C)aa aaccaattgg이다.

[실시예4:TRIM-Br1 및 TRIM-Br2 특이 표지인자 시스템을 이용한 배추, 무 F1 품종간 다형성 조사]

본 실시예는 본 발명의 상기 TRIM-Br1 및 TRIM-Br2 특이 표지인자 시스템을 이용한 DNA 표지인자 시스템을 이용하여, 시판되고 있는 대표 배추 F1 품종 19개와 무 F1 품종 3개를 비교 분석하였다.

먼저 국내시판 배추 F1 품종으로는, 1. 금빛, 2. 노란자, 3. 노랑김장, 4. 만점, 5. 매력, 6. 불암2, 7. 샛노랑, 8. 서울, 9. 스피드60일, 10. 신춘, 11. 쌈맛, 12. 장미배추, 13. 장원, 14. 정상, 15. 한여름배추, 16. 황성, 17. 흑진주, 18. CR으뜸, 19. CR하계를 사용하였고, 국내시판 무우 F1 품종으로는, 20. 서호무, 21.일학미농무, 22. 진주대평무 종자를 이용하여 1개월간 재배한 후 잎을 채취하여 DNA 시료를 준비하였다. 상기 DNA 시료에서 얻은 100-200ng의 게놈 DNA를 제한효소 Bfa I (혹은 MseI) 으로 37℃에서 3시간이상 처리한 후 아가로스 전기영동을 통해 제한효소 절단 정도를 확인한 다음, 상기 절단된 DNA에 어뎁터를 붙였다. 이때, 반응조건은 5uM 어뎁터, 1x 리가아제 완충 용액, 10Unit T4 리가아제를 넣고 16℃에서 8시간 이상 반응시켰다. 상기 절단된 DNA에 붙이는 어댑터는 5'-GACGATGAGTCCTGAG-3'(서열번호 15)과 5'-TACTCAGGACTCAT-3'(서열번호 16)을 합성하여 90℃에서 5분간 처리하여 실온에 10분 방치하여 완성하였다. 상기 단계에서 리게이션된 DNA 용액을 10배 희석하여 0.3uM Bfa I +0 프라이머, 1uM Br1n2 프라이머, 1x PCR 완충 용액, 2.5mM MgCl2 용액, 0.2mM dNTP 용액, 그리고 2.5U Taq 중합효소를 넣고 PCR 증폭하였다. 이때, PCR 증폭 조건은 72℃ 2분, 94℃ 5분 반응 후 94℃/58℃/72℃를 각각 30초/30초/60초 동안 30회 반복하고, 72℃에서 2분간 반응하였다.

상기 PCR을 통하여 증폭된 산물을 또 다시 10배 희석하여 준비한 DNA 6ul와 0.5uM Bfa I +A(5'-GACGATGAGTCCTGAGTAGA-3')(서열번호 19) 혹은 Bfa I +T(5'-GACGATGAGTCCTGAGTAGT-3')(서열번호 20), Bfa I +G(5'-GACGATGAGTCCTGAGTAGG-3')(서열번호 21), Bfa I +C(5'-GACGATGAGTCCTGAGTAGC-3')(서열번호 22) 프라이머, 0.2uM Br1n2 프라이머, 1x PCR 완충 용액, 2.5mM MgCl2 용액, 0.2mM dNTP 용액, 그리고 1.0U Taq 중합효소를 넣고 PCR 증폭하였다. 이때 PCR 증폭 조건은 94℃ 5분 반응 후 94℃/58℃/72℃를 한회 반복시 부착(annealing)온도를 1℃씩 낮추면서 30초/30초/60초 동안 30회 반복하고, 72℃에서 5분간 반응하였다.

전기영동

상기 PCR 산물에 포름아미드가 들어있는 염색용액을 넣어 전기영동 준비를 하였다. 요소가 들어있는 6% 아크릴아미드/비스아크릴아미드 용액으로 변성 겔을 만들고, 겔이 완성되면 전기영동 셀에 만들어진 변성겔을 조립한 후 1,500V에서 50 분 가량 예열시킨 후, 상기에서 준비된 PCR 산물을 90℃에서 5분간 가열 후 냉동보관하였다. 이렇게 준비된 시료를 겔에 로딩하여 100분 동안 전기 영동한 다음 염색하여 도6a 및 도6b에 나타내었다.

도6a 및 도6b에 도시된 바와 같이 본 발명의 상기 TRIM-Br1 및 TRIM-Br2 특이 표지인자 시스템을 이용하여 다양한 종류의 DNA 프로필을 획득할 수 있으며, 두개 혹은 세 개의 프라이머 조합만 사용하더라도 공시된 모든 품종을 동정할 수 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명에 의한 DNA 표지인자 시스템은 새로운 품종의 동정 및 품종등록시 DUS 테스트 등에 실용화될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 TRIM-Br1 및 TRIM-Br2는 배추과 작물의 전반에 걸쳐 유전자 밀집지역 전반에 골고루 삽입되어 있기 때문에, DNA 표지인자로서 상기 TRIM-Br1 및 TRIM-Br2를 이용하면 신속하게 배추과 작물의 품종 구분 및 동정을 용이하게 행할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (3)

1. 삭제
2. 배추과 작물의 품종 구분을 위한 DNA 표지인자를 제작하는데 사용되는 서열번호3~10 중 어느 하나의 서열을 갖는 Br1n2DP-R 프라이머 또는 서열번호11~14 중 어느 하나의 서열을 갖는 Br1n2DP-L 프라이머.
3. 다음 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 서열번호1 기재의 TRIM-Br1 전이인자 또는 서열번호2 기재의 TRIM-Br2 전이인자의 특이 염기서열을 이용한 배추과 작물의 품종 구분방법:

   (1) 게놈 DNA를 절단한 다음, 절단된 게놈 DNA 단편들의 말단에 연결될 수 있는 어댑터를 부착하는 단계;

   (2) 상기 단계 (1)에서 얻어진, 어댑터가 부착된 게놈 DNA 단편들의 한쪽에는 어댑터 염기서열과 어닐링(annealing)되는 프라이머를 사용하고, 다른 한쪽에는 서열번호3~10중 어느 하나의 서열을 갖는 Br1n2DP-R 프라이머 또는 서열번호11~14 중 어느 하나의 서열을 갖는 Br1n2DP-L 프라이머를 사용하여 1차 PCR 하는 단계;

   (3) 상기 단계 (2)에서 얻어진 1차 PCR 산물들 중, 상기 단계 (2)에서 사용되는 어댑터 염기서열과 어닐링되는 프라이머의 3' 말단에 인접한 첫 번째 염기가 A, T, G 및 C 중 어느 하나인 1차 PCR 산물을 선택적으로 각각 증폭하기 위하여 2차 PCR하는 단계; 및

   (4) 상기 단계 (3)에서 얻어진 PCR 산물들을 전기영동하고, 밴드들의 디스플레이(display) 양상을 비교하므로써 배추과 작물의 품종을 구분하는 단계.

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