TW202124729A - 一種與番木瓜結果性相關之分子標記 - Google Patents

一種與番木瓜結果性相關之分子標記 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種可預先檢測番木瓜兩性株結果特性的分子標記，其特徵係前述分子標記選自由以下所組成之群的核苷酸序列：SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：11。本發明亦提供一種使用前述分子標記檢測番木瓜兩性株結果特性的方法。

Description

一種與番木瓜結果性相關之分子標記
本發明關於一種與番木瓜結果特性相關之分子標記及其應用，特別是有關於一種用於早期鑑別番木瓜兩性株結果特性之分子標記及檢測方法。
番木瓜(Carica papaya L.)為一被廣泛種植的重要經濟作物，其同時具有雌雄異株異花分別為雌株、雄株，及雌雄同株同花之兩性株。種植時，在降低成本並增加收成之觀點上，由於兩性株所有植株皆可自花授粉結果，因此優於不結果的雄株或需人工授粉的雌株。由於無法藉由外部型態判斷番木瓜幼珠的性別，為了挑選出較具商業價值的兩性株，必須付出大量的時間勞力栽培植株，直到植株具有可區分其性別的花器。
進一步地，番木瓜兩性株的結果特性，又與其花器先天的穩定性有關。花器穩定的番木瓜兩性株在結果期會持續穩定結果。花器不穩定的番木瓜兩性株，由於其花器會被溫度或土壤營養等環境因子影響而發生退化，因此結果期會開花但不結果，或僅單偽結果而結果成較小的畸形果，這兩種狀況都會導致收成上的損失。
傳統上係使用組織培養、扦插、嫁接等無性繁殖方法來確保 番木瓜種苗為所期望之性別，但此等方法有成本高或技術門檻高之問題。近年來，為了進一步提升番木瓜性別辨識的效率，已發展出利用RAPD、AFLP、RFLP及SNP等分子標記，對尚無法以目視辨識性別的番木瓜幼株進行性別鑑定的技術手段(參照專利文獻1及2)。例如，專利文獻1及2係分別揭露了一種可用於鑑別番木瓜性別的分子標記。然而，對於如何預先檢測尚未結果之番木瓜兩性株的結果特性，從而選育出具有結果特性穩定(即結果期間不缺結果，且非畸形果)之兩性番木瓜品種，目前並未有可充分解決此課題的技術手段。
【先前技術文獻】 【專利文獻】
【專利文獻1】中華民國專利公開案第201823470號
【專利文獻2】中華民國專利公開案第201825683號
本發明鑑於上述問題，目的在於提供一種可預先檢測番木瓜結果特性的分子標記及其相關檢測方法，從而可選育出具有穩定結果特性之兩性番木瓜品種。
本發明係提供以下技術手段：
(1)一種用於檢測番木瓜兩性株結果特性的分子標記，其特徵係前述分子標記選自由以下所組成之群的核苷酸序列：SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：11。
(2)一種用於檢測番木瓜兩性株結果特性的探針，其特徵係該探針用於檢測如第1項所記載之分子標記。
(3)一種用於檢測番木瓜兩性株結果特性的套組，其特徵係該套組包含如第2項所記載之探針。
(4)一種檢測番木瓜兩性株結果特性的方法，其特徵係其包含：由待測番木瓜兩性株取得基因體DNA；分析前述基因體DNA是否存在選自以下所組成之群組的核苷酸序列：
(i)SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11；
(ii)SEQ ID NO：9；
至少一個選自(i)之核苷酸序列之存在，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為不穩定；
至少一個選自(ii)之核苷酸序列之存在，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為穩定；
前述結果特性不穩定，係指於結果期間出現缺果，或結畸形果
前述結果特性穩定，係指於結果期間未出現缺果，且結果非畸形果。
(5)如第2項所記載之方法，其中，
前述分析係使用高解析度熔解分析
前述高解析度熔解分析係使用選自以下所組成之群組的至少一對引子對：
(a)檢測SEQ ID NO：3之引子對：SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：17
(b)檢測SEQ ID NO：5之引子對：SEQ ID NO：20及SEQ ID NO：21
(c)檢測SEQ ID NO：10之引子對：SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：31
(d)檢測SEQ ID NO：11之引子對：SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：33
(e)檢測SEQ ID NO：9之引子對：SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：29。
(6)一種檢測番木瓜兩性株結果特性的方法，其特徵係其包含：由待測番木瓜兩性株取得基因體DNA；分析前述基因體DNA是否包含至少一對純合對偶基因，且前述純合對偶基因係具有選自以下所組成群組的核苷酸序列，其中，前述特定核苷酸序列係選自：
(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4；
(ii)SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8；
若包含至少一對前述純合對偶基因，且前述純合對偶基因具有(i)之核苷酸序列，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為不穩定；
若包含至少一對前述純合對偶基因，且前述純合對偶基因具有(ii)之核苷酸序列，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為穩定；
前述結果特性不穩定，係指於結果期間出現缺果，或結畸形果
前述結果特性穩定，係指於結果期間未出現缺果，且結果非畸形果。
(7)如第6項所記載之方法，其中，
前述分析係使用高解析度熔解分析；
前述高解析度熔解分析係使用選自以下所組成之群組的至少一對引子對：
(a)檢測SEQ ID NO：1之引子對：SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13
(b)檢測SEQ ID NO：2之引子對：SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15
(c)檢測SEQ ID NO：4之引子對：SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：19
(d)檢測SEQ ID NO：6之引子對：SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：23
(e)檢測SEQ ID NO：7之引子對：SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：25
(f)檢測SEQ ID NO：8之引子對：SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：27
(8)一種用於檢測番木瓜兩性株結果特性的高解析度熔解分析套組，其特徵係前述套組包含選自以下所組成之群組的至少一對引子對：
(a)檢測SEQ ID NO：1之引子對：SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13
(b)檢測SEQ ID NO：2之引子對：SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15
(c)檢測SEQ ID NO：3之引子對：SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：17
(d)檢測SEQ ID NO：4之引子對：SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：19
(e)檢測SEQ ID NO：5之引子對：SEQ ID NO：20及SEQ ID NO：21
(f)檢測SEQ ID NO：6之引子對：SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：23
(g)檢測SEQ ID NO：7之引子對：SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：25
(h)檢測SEQ ID NO：8之引子對：SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：27
(i)檢測SEQ ID NO：9之引子對：SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：29
(j)檢測SEQ ID NO：10之引子對：SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：31
(k)檢測SEQ ID NO：11之引子對：SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：33。
(9)一種用於檢測番木瓜兩性株結果特性的系統，其特徵係前述系統由11個檢測番木瓜兩性株結果特性的分子標記組成，且前述11個檢測番木瓜兩性株結果特性的分子標記分別具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：11的核苷酸序列。
(10)一種重組載體，其特徵係其包含如第1項所記載之檢測番木瓜兩性株結果特性的分子標記。
進一步地，本發明亦提供用於檢測番木瓜兩性株結果特性的單核苷酸多態性(SNP)標記，前述單核苷酸多態性標記係選自：
SNP1：SEQ ID NO：1之位置31之"A"，若待測番木瓜兩性株具有該SNP標記且為純合子型(homozygous)，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為不穩定。
SNP2：SEQ ID NO：2之位置29之"T"，若待測番木瓜兩性株具有該SNP標記且為純合子型，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為不穩定。
SNP3：SEQ ID NO：3之位置61之"G"，若待測番木瓜兩性株具有該SNP標記，不論其為雜合子型或純合子型，皆表示該待測番木瓜兩性株結果特性為不穩定。
SNP4：SEQ ID NO：4之位置46之"T"，若待測番木瓜兩性株具有該SNP標記且為純合子型，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為不穩定
SNP5：SEQ ID NO：5之位置24之"A"，若待測番木瓜兩性株具有該SNP標記，不論其為雜合子型或純合子型，皆表示該待測番木瓜兩性株結果特性為不穩定。
SNP6：SEQ ID NO：6之位置33之"T"，若待測番木瓜兩性株具有該SNP標記且為純合子型，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為穩 定。
SNP7：SEQ ID NO：6之位置57之"T"，若待測番木瓜兩性株具有該SNP標記且為純合子型，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為穩定。
SNP8：SEQ ID NO：7之位置61之"T"，若待測番木瓜兩性株具有該SNP標記且為純合子型，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為穩定。
SNP9：SEQ ID NO：8之位置27之"A"，若待測番木瓜兩性株具有該SNP標記且為純合子型，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為穩定。
SNP10：SEQ ID NO：8之位置51之"C"，若待測番木瓜兩性株具有該SNP標記且為純合子型，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為穩定。
SNP11：SEQ ID NO：9之位置42之"T"，若待測番木瓜兩性株具有該SNP標記，不論其為雜合子型或純合子型，皆表示該待測番木瓜兩性株結果特性為穩定。
SNP12：SEQ ID NO：10之位置24之"G"，若待測番木瓜兩性株具有該SNP標記，不論其為雜合子型或純合子型，皆表示該待測番木瓜兩性株結果特性為不穩定。
SNP13：SEQ ID NO：11之位置30之"C"，若待測番木瓜兩性株具有該SNP標記，不論其為雜合子型或純合子型，皆表示該待測番木瓜兩性株結果特性為不穩定。
本發明亦提供一種用於檢測番木瓜兩性株結果特性的SNP標記探針，其特徵係該探針用於檢測前述單核苷酸多態性(SNP)標記。
本發明亦提供一種用於檢測番木瓜兩性株結果特性的套組，其特徵係該套組用於檢測前述單核苷酸多態性(SNP)標記。
藉由本發明，可於木瓜尚未發育花器或結果的發育早期，鑑測番木瓜結果特性，以有效、快速且準確的方式，選育出結果特性為穩定的兩性番木瓜品種，該品種具有：於結果期間不缺果，且非畸形果等之穩定結果表現。進而可在番木瓜的品種改良上縮短育種過程，減少生產成本。
【圖1】例示番木瓜不同結果特性之圖。圖1A及圖1D表示穩定結果情形。圖1B及1E表示結畸形果之情形。圖1C及圖1F表示結果期間缺果之情形。
【圖2】使用分子標記S1(SEQ ID NO：1)的高解析度熔解曲線例示圖。
【圖3】使用分子標記S2(SEQ ID NO：2)的高解析度熔解曲線例示圖。
【圖4】使用分子標記S3(SEQ ID NO：3)的高解析度熔解曲線例示圖。
【圖5】使用分子標記S4(SEQ ID NO：4)的高解析度熔解曲線例示圖。
【圖6】使用分子標記S5(SEQ ID NO：5)的高解析度熔解曲線例示圖。
【圖7】使用分子標記S6(SEQ ID NO：6)的高解析度熔解曲線例示圖。
【圖8】使用分子標記S7(SEQ ID NO：7)的高解析度熔解曲線例示圖。
【圖9】使用分子標記S8(SEQ ID NO：8)的高解析度熔解曲線例示圖。
【圖10】使用分子標記S9(SEQ ID NO：9)的高解析度熔解曲線例示圖。
【圖11】使用分子標記S10(SEQ ID NO：10)的高解析度熔解曲線例示圖。
【圖12】使用分子標記S11(SEQ ID NO：11)的高解析度熔解曲線例示圖。
本發明中所記載之番木瓜以及番木瓜之兩性株的品種，可列舉例如台農1號、台農2號、紅福、綠福、SINTA、圓葉、Tn6、Hong Kong、Eksotika2、印尼種、吉隆坡瓜、Hawaiian Solo Sunset、Papaya Linda、Solo sunrise improve、Red Maradol、Maradol Raja。
本發明中所記載之「結果特性」，係指番木瓜兩性株成熟而進入結果期間是否缺果，或所結果實是否為畸形果的相關表現。在本發明中，若根據本發明檢測番木瓜兩性株且檢測結果為「結果特性穩定」，可預測該番木瓜兩性株在結果期不缺果且所結果實非畸形果(如圖1A、圖1D所示)。若根據本發明檢測番木瓜兩性株且檢測結果為「結果特性不穩定」，可預測該番木瓜兩性株在結果期間出現缺果(如圖1C、圖1F中圓圈標示處所示)，或所結果實為畸形果。
其中，前述「缺果」，係指開花處在結果期未結成果實之現象，包含整株開花處皆未結果之情形，以及僅部分開花處未結果之情形。
其中，前述畸形果，一般而言，係指因單偽結果造成的較小 的番木瓜果實或變形的番木瓜果實。(如圖1B、圖1E照片中圓圈標示處所示)
本發明中所記載之「對偶基因(alleles)」，係指在基因體DNA或特定染色體DNA中的特定序列片段具有二種或多種不同序列形式，使彼此之間互為對偶基因。不同序列形式，係指彼此在一個或更多位置具有序列差異。因此，本發明中所記載之「純合對偶基因(homozygous alleles)」，係指在相對染色體DNA中的相對應之特定序列片段僅具有一種序列形式，彼此無序列差異。
本發明所記載之「探針」係指任何可用於檢測本發明分子標記的物質。因此，探針可為與本發明分子標記之核苷酸序列進行專一性雜化的寡核苷酸。該寡核苷酸可進一步與發光團等分子共價結合。該探針亦可為一PCR引子對，用於擴增本發明分子標記之核苷酸序列。
本發明中，對基因體DNA核苷酸序列之分析，可適宜地選用相關技術上習知方法，例如桑格氏定序法、PCR-RFLP、TaqMan探針、高解析度熔解分析(High Resolution Melting，HRM)等。
本發明中，待測之番木瓜兩性株基因體DNA是否包含目標純合對偶基因之分析，可適宜地選用相關技術上習知方法，例如，與該對偶基因之核苷酸序列專一性雜化之寡核苷酸探針、高解析度熔解分析(High Resolution Melting，HRM)等。
於一實施方式中，本發明所記載之「基因體DNA」係包含番木瓜X染色體DNA及Yh染色體DNA。
於一實施方式中，本發明之套組可進一步包含用於從待測番 木瓜兩性株收集核酸樣本的工具及/或試劑，本發明之套組亦可進一步包含用於從核酸樣本製備基因體DNA的工具及/或試劑。
於一實施方式中，本發明之套組可進一步包含以下所組成之群組的至少一對引子對，該引子對係用於聚合酶連鎖反應，可擴增本發明各分子標記之核酸：
(a)檢測SEQ ID NO：1之引子對：SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13
(b)檢測SEQ ID NO：2之引子對：SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15
(c)檢測SEQ ID NO：3之引子對：SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：17
(d)檢測SEQ ID NO：4之引子對：SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：19
(e)檢測SEQ ID NO：5之引子對：SEQ ID NO：20及SEQ ID NO：21
(f)檢測SEQ ID NO：6之引子對：SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：23
(g)檢測SEQ ID NO：7之引子對：SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：25
(h)檢測SEQ ID NO：8之引子對：SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：27
(i)檢測SEQ ID NO：9之引子對：SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：29
(j)檢測SEQ ID NO：10之引子對：SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：31
(k)檢測SEQ ID NO：11之引子對：SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：33。
於一實施方式中，本發明用於檢測番木瓜兩性株結果特性的探針，其長度並無特別限制，只要涵蓋本發明所記載之任一分子標記之核苷酸序列(SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：11)即可。
以下揭示實施例，而詳細說明本發明，惟本發明係並非限定於此等之實施例者。下述記載係用於闡釋本發明之詳細內容與實施之效果。
下述實施例1~11中，例示了利用本發明11個分子標記(SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：11之核苷酸序列，以下簡稱為S1~S11)檢測番木瓜兩性株樣本，並以高解析度熔解分析獲得檢測結果的實施方式。
從12個已知結果性狀的番木瓜兩性株樣本抽取基因體DNA，編號及已知的品種資訊如表1所示。抽取基因體DNA的方法為本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者所習知，此處不另贅述。
Figure 108145572-A0101-12-0012-1
藉由上述對應本發明各分子標記的引子對(a)~(k)，以高解析度熔解分析對上述12個樣本進行分析。隨著結果特性不同，各樣本基因體DNA的基因體DNA會具有本發明之分子標記的核苷酸序列的至少一種，或包含至少一對之具有本發明之分子標記之核苷酸序列的純合對偶基因。單一核苷酸序列的差異即會造成熔解曲線形狀和位置的差異，且純合對偶基因與雜合對偶基因亦會呈現不同曲線型態。因此，可藉由曲線型態差異，判斷待測基因體DNA是否具有本發明之分子標記，從而鑑定其結果特性。以下分別針對各分子標記的熔解曲線結果進行說明。
實施例1：分子標記S1(SEQ ID NO：1)
當待測番木瓜兩性株基因體DNA包含一對純合對偶基因，且前述純合對偶基因具有分子標記S1之核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為不穩定；當待測番木瓜兩性株僅包含一個，或不包含具有分子標記S1之核苷酸序列之對偶基因，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為穩定。以引子對(a)(SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13)進行HRM分析，如圖2所示，包含一對具有分子標記S1之核苷酸序列的純合對偶基因時，熔解曲線的曲線型態及波峰位置會類似「不穩定」箭頭所標記之曲線。僅包含一個，或不包含具有分子標記S1之核苷酸序列之對偶基因時，熔解曲線的曲線型態及波峰位置會類似「穩定」箭頭所標記之曲線。
實施例2：分子標記S2(SEQ ID NO：2)
當待測番木瓜兩性株基因體DNA包含一對純合對偶基因，且前述純合對偶基因具有分子標記S2之核苷酸序列(SEQ ID NO：2)，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為不穩定；當待測番木瓜兩性株僅包含一個，或不包含具有分子標記S2之核苷酸序列之對偶基因，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為穩定。以引子對(b)(SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15)進行HRM分析，如圖3所示，包含一對具有分子標記S2之核苷酸序列的純合對偶基因時，熔解曲線的曲線型態及波峰位置會類似「不穩定」箭頭所標記之曲線。僅包含一個，或不包含具有分子標記S2之核苷酸序列之對偶基因時，熔解曲線的曲線型態及波峰位置會類似「穩定」箭頭所標記之曲線。
實施例3：分子標記S3(SEQ ID NO：3)
當待測番木瓜兩性株基因體DNA具有分子標記S3之核苷酸序列(SEQ ID NO：3)，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為不穩定；當待測番木瓜不具有分子標記S3之核苷酸序列，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為穩定。以引子對(c)(SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：17)進行HRM分析，如圖4所示，具有分子標記S3之核苷酸序列時，熔解曲線的曲線型態及波峰位置會類似「不穩定」箭頭所標記之曲線。不具有分子標記S3之核苷酸序列時，熔解曲線的曲線型態及波峰位置會類似「穩定」箭頭所標記之曲線。
實施例4：分子標記S4(SEQ ID NO：4)
當待測番木瓜兩性株基因體DNA包含一對純合對偶基因，且前述純合對偶基因具有分子標記S4之核苷酸序列(SEQ ID NO：4)，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為不穩定；當待測番木瓜兩性株僅包含一個，或不包含具有分子標記S4之核苷酸序列之對偶基因，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為穩定。以引子對(d)(SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：19)進行HRM分析，如圖5所示，包含一對具有分子標記S4之核苷酸序列的純合對偶基因時，熔解曲線的曲線型態及波峰位置會類似「不穩定」箭頭所標記之曲線。僅包含一個，或不包含具有分子標記S4之核苷酸序列之對偶基因時，熔解曲線的曲線型態及波峰位置會類似「穩定」箭頭所標記之曲線。
實施例5：分子標記S5(SEQ ID NO：5)
當待測番木瓜兩性株基因體DNA具有分子標記S5之核苷 酸序列(SEQ ID NO：5)，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為不穩定；當待測番木瓜不具有分子標記S5之核苷酸序列，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為穩定。以引子對(e)(SEQ ID NO：20及SEQ ID NO：21)進行HRM分析，如圖6所示，具有分子標記S5之核苷酸序列時，熔解曲線的曲線型態及波峰位置會類似「不穩定」箭頭所標記之曲線。不具有分子標記S5之核苷酸序列時，熔解曲線的曲線型態及波峰位置會類似「穩定」箭頭所標記之曲線。
實施例6：分子標記S6(SEQ ID NO：6)
當待測番木瓜兩性株基因體DNA包含一對純合對偶基因，且前述純合對偶基因具有分子標記S6之核苷酸序列(SEQ ID NO：6)，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為穩定；當待測番木瓜兩性株僅包含一個，或不包含具有分子標記S6之核苷酸序列之對偶基因，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為不穩定。以引子對(f)(SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：23)進行HRM分析，如圖7所示，包含一對具有分子標記S6之核苷酸序列的純合對偶基因時，熔解曲線的曲線型態及波峰位置會類似「穩定」箭頭所標記之曲線。僅包含一個，或不包含具有分子標記S6之核苷酸序列之對偶基因時，熔解曲線的曲線型態及波峰位置會類似「不穩定」箭頭所標記之曲線。
實施例7：分子標記S7(SEQ ID NO：7)
當待測番木瓜兩性株基因體DNA包含一對純合對偶基因，且前述純合對偶基因具有分子標記S7之核苷酸序列(SEQ ID NO：7)，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為穩定；當待測番木瓜兩性株僅包含一個， 或不包含具有分子標記S7之核苷酸序列之對偶基因，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為不穩定。以引子對(g)(SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：25)進行HRM分析，如圖8所示，包含一對具有分子標記S7之核苷酸序列的純合對偶基因時，熔解曲線的曲線型態及波峰位置會類似「穩定」箭頭所標記之曲線。僅包含一個，或不包含具有分子標記S7之核苷酸序列之對偶基因時，熔解曲線的曲線型態及波峰位置會類似「不穩定」箭頭所標記之曲線。
實施例8：分子標記S8(SEQ ID NO：8)
當待測番木瓜兩性株基因體DNA包含一對純合對偶基因，且前述純合對偶基因具有分子標記S8之核苷酸序列(SEQ ID NO：8)，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為穩定；當待測番木瓜兩性株僅包含一個，或不包含具有分子標記S8之核苷酸序列之對偶基因，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為不穩定。以引子對(h)(SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：27)進行HRM分析，如圖9所示，包含一對具有分子標記S8之核苷酸序列的純合對偶基因時，熔解曲線的曲線型態及波峰位置會類似「穩定」箭頭所標記之曲線。僅包含一個，或不包含具有分子標記S8之核苷酸序列之對偶基因時，熔解曲線的曲線型態及波峰位置會類似「不穩定」箭頭所標記之曲線。
實施例9：分子標記S9(SEQ ID NO：9)
當待測番木瓜兩性株基因體DNA具有分子標記S9之核苷酸序列(SEQ ID NO：9)，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為穩定；當待測番木瓜不具有分子標記S9之核苷酸序列，表示該待測番木瓜兩性株結果 特性為不穩定。以引子對(i)(SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：29)進行HRM分析，如圖10所示，具有分子標記S9之核苷酸序列時，熔解曲線的曲線型態及波峰位置會類似「穩定」箭頭所標記之曲線。不具有分子標記S9之核苷酸序列時，熔解曲線的曲線型態及波峰位置會類似「不穩定」箭頭所標記之曲線。
實施例10：分子標記S10(SEQ ID NO：10)
當待測番木瓜兩性株基因體DNA具有分子標記S10之核苷酸序列(SEQ ID NO：10)，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為不穩定；當待測番木瓜不具有分子標記S10之核苷酸序列，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為穩定。以引子對(j)(SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：31)進行HRM分析，如圖11所示，具有分子標記S10之核苷酸序列時，熔解曲線的曲線型態及波峰位置會類似「不穩定」箭頭所標記之曲線。不具有分子標記S10之核苷酸序列時，熔解曲線的曲線型態及波峰位置會類似「穩定」箭頭所標記之曲線。
實施例11：分子標記S11(SEQ ID NO：11)
當待測番木瓜兩性株基因體DNA具有分子標記S11之核苷酸序列(SEQ ID NO：11)，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為不穩定；當待測番木瓜不具有分子標記S11之核苷酸序列，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為穩定。以引子對(k)(SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：33)進行HRM分析，如圖12所示，具有分子標記S11之核苷酸序列時，熔解曲線的曲線型態及波峰位置會類似「不穩定」箭頭所標記之曲線。不具有分子標記S11之核苷酸序列時，熔解曲線的曲線型態及波峰位置會類似「穩定」箭頭所 標記之曲線。
上述實施例證實，藉由本發明所記載之分子標記，配合如實施例所例示之HRM分析等分析方法，可快速、精準地檢測不同品種的番木瓜兩性株的結果性狀。藉由早期進行此檢測，可篩選結果性狀穩定的番木瓜兩性株，有助於減少缺果及畸形果的發生。
【產業應用性】
木瓜作為經濟作物，結果特性為重要的育種性狀。本發明應用於木瓜種苗產業，可藉由篩選木瓜品種的穩定結果兩性株，提升所育種之木瓜種苗的競爭力。 
<110>  國立屏東科技大學
				<120>  一種與番木瓜結果性相關之分子標記
				<160>  33    
				<170>  PatentIn version 3.5
				<210>  1
				<211>  79
				<212>  DNA
				<213>  Carica papaya
				<400>  1
				catgcatgcc aatatcgata atcattcctc ataactatta cgttataagt aaaataacta       60
				aacaattacg ttagttcat                                                    79
				<210>  2
				<211>  67
				<212>  DNA
				<213>  Carica papaya
				<400>  2
				ttaatgagaa gaccatttgt caagaaaatt gtatgttgtt cgaagattac attaacaaga       60
				gagatgc                                                                 67
				<210>  3
				<211>  87
				<212>  DNA
				<213>  Carica papaya
				<400>  3
				catcttgtat cataggttgt gctggcgttt tcatgccttt gttgtgttct gtgtttggtt       60
				gcaaattata taagtaacat ttcaggt                                           87
				<210>  4
				<211>  80
				<212>  DNA
				<213>  Carica papaya
				<400>  4
				taggtataaa tggtgtaggt aaatcaattt ttgtactacc accacttttt ttcgcaatga       60
				tgataaatag gggtcagtcc                                                   80
				<210>  5
				<211>  58
				<212>  DNA
				<213>  Carica papaya
				<400>  5
				ttagcatcaa gtcctcaaga gagaaaggga atccaagaat ccaaggtagt ttggccaa         58
				<210>  6
				<211>  90
				<212>  DNA
				<213>  Carica papaya
				<400>  6
				gatcggtctg aaactcttga tattattggc cctaatgatt tttgggataa aaatcataaa       60
				agtagagttg atgaatttaa taaaagaagc                                        90
				<210>  7
				<211>  90
				<212>  DNA
				<213>  Carica papaya
				<400>  7
				agaagaggca ccattcacca agatagcaaa agatgacata aaaatacata ccctaatcca       60
				tttcctccac ttctctccaa accaagtctc                                        90
				<210>  8
				<211>  81
				<212>  DNA
				<213>  Carica papaya
				<400>  8
				tgacaatagg tgagatggaa gcaaaaaata tatatctacc aaagatctgg cacacatggc       60
				atgtctaaag cttgagctgg c                                                 81
				<210>  9
				<211>  67
				<212>  DNA
				<213>  Carica papaya
				<400>  9
				ctttctcttt caggtatcag tcaaaaagtt ctctctaaac ctacctcaaa tcacttccct       60
				agcgttt                                                                 67
				<210>  10
				<211>  66
				<212>  DNA
				<213>  Carica papaya
				<400>  10
				aagatcacgc aggaaagaga cctggtagaa gaagagcccg cggggagagg tatccgagag       60
				gaagaa                                                                  66
				<210>  11
				<211>  79
				<212>  DNA
				<213>  Carica papaya
				<400>  11
				caatggaagg gactagaaga tagtaaagac cacctggaaa gatactcggt atttaaagta       60
				gcagttccct catataaac                                                    79
				<210>  12
				<211>  18
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成序列
				<400>  12
				catgcatgcc aatatcga                                                     18
				<210>  13
				<211>  26
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>   合成序列
				<400>  13
				atgaactaac gtaattgttt agttat                                            26
				<210>  14
				<211>  24
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成序列
				<400>  14
				ttaatgagaa gaccatttgt caag                                              24
				<210>  15
				<211>  25
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成序列
				<400>  15
				gcatctctct tgttaatgta atctt                                             25
				<210>  16
				<211>  22
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成序列
				<400>  16
				catcttgtat cataggttgt gc                                                22
				<210>  17
				<211>  27
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成序列
				<400>  17
				acctgaaatg ttacttatat aatttgc                                           27
				<210>  18
				<211>  26
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成序列
				<400>  18
				taggtataaa tggtgtaggt aaatca                                            26
				<210>  19
				<211>  22
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成序列
				<400>  19
				ggactgaccc ctatttatca tc                                                22
				<210>  20
				<211>  21
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成序列
				<400>  20
				ttagcatcaa gtcctcaaga g                                                 21
				<210>  21
				<211>  18
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成序列
				<400>  21
				ttggccaaac taccttgg                                                     18
				<210>  22
				<211>  20
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成序列
				<400>  22
				gatcggtctg aaactcttga                                                   20
				<210>  23
				<211>  27
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成序列
				<400>  23
				gcttctttta ttaaattcat caactct                                           27
				<210>  24
				<211>  18
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成序列
				<400>  24
				agaagaggca ccattcac                                                     18
				<210>  25
				<211>  20
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成序列
				<400>  25
				gagacttggt ttggagagaa                                                   20
				<210>  26
				<211>  21
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成序列
				<400>  26
				tgacaatagg tgagatggaa g                                                 21
				<210>  27
				<211>  18
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成序列
				<400>  27
				gccagctcaa gctttaga                                                     18
				<210>  28
				<211>  23
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成序列
				<400>  28
				ctttctcttt caggtatcag tca                                               23
				<210>  29
				<211>  20
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成序列
				<400>  29
				aaacgctagg gaagtgattt                                                   20
				<210>  30
				<211>  19
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成序列
				<400>  30
				aagatcacgc aggaaagag                                                    19
				<210>  31
				<211>  20
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成序列
				<400>  31
				tttcttcctc tcggatacct                                                   20
				<210>  32
				<211>  23
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成序列
				<400>  32
				caatggaagg gactagaaga tag                                               23
				<210>  33
				<211>  23
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成序列
				<400>  33
				gtttatatga gggaactgct act                                               23

Claims (10)

  1. 一種用於檢測番木瓜兩性株結果特性的分子標記，其特徵係前述分子標記選自由以下所組成之群的核苷酸序列：SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：11。
  2. 一種用於檢測番木瓜兩性株結果特性的探針，其特徵係該探針用於檢測如申請專利範圍第1項所記載之分子標記。
  3. 一種用於檢測番木瓜兩性株結果特性的套組，其特徵係該套組包含如申請專利範圍第2項所記載之探針。
  4. 一種檢測番木瓜兩性株結果特性的方法，其特徵係其包含：由待測番木瓜兩性株取得基因體DNA；分析前述基因體DNA是否存在選自以下群組的核苷酸序列：
    (i)SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11；
    (ii)SEQ ID NO：9；
    至少一個選自(i)群組之核苷酸序列之存在，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為不穩定；
    至少一個選自(ii)群組之核苷酸序列之存在，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為穩定；
    前述結果特性不穩定，係指於結果期出現缺果，或結畸形果；
    前述結果特性穩定，係指於結果期未出現缺果，且結果非畸形果。
  5. 如申請專利範圍第4項所記載之方法，其中，
    前述分析係使用高解析度熔解分析
    前述高解析度熔解分析係使用選自以下所組成之群組的至少一對引子對：
    (a)檢測SEQ ID NO：3之引子對：SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：17
    (b)檢測SEQ ID NO：5之引子對：SEQ ID NO：20及SEQ ID NO：21
    (c)檢測SEQ ID NO：10之引子對：SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：31
    (d)檢測SEQ ID NO：11之引子對：SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：33
    (e)檢測SEQ ID NO：9之引子對：SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：29。
  6. 一種檢測番木瓜兩性株結果特性的方法，其特徵係其包含：由待測番木瓜兩性株取得基因體DNA；分析前述基因體DNA是否包含至少一對純合對偶基因，且前述純合對偶基因係具有選自以下群組的核苷酸序列：
    (i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4；
    (ii)SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8；
    若包含至少一對前述純合對偶基因，且前述純合對偶基因具有(i)群組之核苷酸序列，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為不穩定；
    若包含至少一對前述純合對偶基因，且前述純合對偶基因具有(ii)群組之核苷酸序列，表示該待測番木瓜兩性株結果特性為穩定；
    前述結果特性不穩定，係指於結果期間出現缺果，或結畸形果
    前述結果特性穩定，係指於結果期間未出現缺果，且結果非畸形果。
  7. 如申請專利範圍第6項所記載之方法，其中，
    前述分析係使用高解析度熔解分析
    前述高解析度熔解分析係使用選自以下所組成之群組的至少一對引子對：
    (a)檢測SEQ ID NO：1之引子對：SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13
    (b)檢測SEQ ID NO：2之引子對：SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15
    (c)檢測SEQ ID NO：4之引子對：SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：19
    (d)檢測SEQ ID NO：6之引子對：SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：23
    (e)檢測SEQ ID NO：7之引子對：SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：25
    (f)檢測SEQ ID NO：8之引子對：SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：27。
  8. 一種用於檢測番木瓜兩性株結果特性的高解析度熔解分析套組，其特徵係前述套組包含選自以下所組成之群組的至少一對引子對：
    (a)檢測SEQ ID NO：1之引子對：SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13
    (b)檢測SEQ ID NO：2之引子對：SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15
    (c)檢測SEQ ID NO：3之引子對：SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：17
    (d)檢測SEQ ID NO：4之引子對：SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：19
    (e)檢測SEQ ID NO：5之引子對：SEQ ID NO：20及SEQ ID NO：21
    (f)檢測SEQ ID NO：6之引子對：SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：23
    (g)檢測SEQ ID NO：7之引子對：SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：25
    (h)檢測SEQ ID NO：8之引子對：SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：27
    (i)檢測SEQ ID NO：9之引子對：SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：29
    (j)檢測SEQ ID NO：10之引子對：SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：31
    (k)檢測SEQ ID NO：11之引子對：SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：33。
  9. 一種用於檢測番木瓜兩性株結果特性的系統，其特徵係前述系統由11個檢測番木瓜兩性株結果特性的分子標記組成，且前述11個檢測番木瓜兩性株結果特性的分子標記分別具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：11的核 苷酸序列。
  10. 一種重組載體，其特徵係其包含如申請專利範圍第1項所記載之檢測番木瓜兩性株結果特性的分子標記。
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