JP2021090404A - パパイヤの結実特性に係る分子マーカー - Google Patents
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Abstract
【課題】パパイヤの結実特性に係る分子マーカーとその応用方法、特に雌雄同株パパイヤの結実特性の早期判別に用いる分子マーカー及び測定方法の提供。【解決手段】特定の塩基配列を有する雌雄同株パパイヤの結実特性を予め測定可能な分子マーカー、該マーカーの測定に用いるプローブ、該プローブを含む雌雄同株パパイヤの結実特性測定に用いるキット、並びに被測定物の雌雄同株パパイヤからゲノムDNAを得ること、及び前記ゲノムDNAに特定の塩基配列が存在するか分析することを含む、雌雄同株パパイヤの結実特性の測定方法。【選択図】なし
Description
本発明はパパイヤの結実特性に係る分子マーカーとその応用に関し、特に雌雄同株パパイヤの結実特性の早期判別に用いる分子マーカー及び測定方法に関するものである。
パパイヤ（Carica papaya L.）は重要な商品作物として広く栽培されており、雌株又は雄株の雌雄異株異花、及び雌雄同株同花の雌雄同株を同時に有する。栽培する際は、雌雄同株のすべての個体は自家受粉で結実できるため、コスト低下及び収穫量増加という観点において、結実できない雄株又は人工授粉が必要な雌株より優れている。幼体の外部形態のみではパパイヤの性別を判断できないことから、高い商品価値を有する雌雄同株を選別するためには、性別を区別可能な花器官が発生するまで、大量の時間と労力をかけて栽培する必要がある。
さらに、パパイヤ雌雄同株の結実特性は、花器官の先天的な安定性と関連がある。花器官の安定性が良いパパイヤ雌雄同株は、結実期に継続安定して結実する。しかし、花器官の安定性が良くないパパイヤ雌雄同株は、花器官が温度や土壌栄養などの環境要因の影響を受けて退化し、結実期に開花はするが結実しないか、又は単為結果となり小さな奇形果を結実する。このような二つの状況は収穫上の損失となる。
従来、組織培養、挿し木、接ぎ木等の無性生殖方法でパパイヤ種苗を所望の性別となるようにしているが、こうした方法はコストがかかる又は技術ハードルが高いという問題がある。近年、パパイヤ性別判別の効率を高めるため、目視で判別できないパパイヤ幼体に対して性別鑑定を行う技術手段であるRAPD、AFLP、RFLP及びSNP等分子マーカーの利用がされている。（特許文献1、2参照）。例えば、特許文献1及び2では、パパイヤ性別の判別に利用可能な分子マーカーが開示されている。しかし、まだ結実していないパパイヤ雌雄同株の結実特性をどのように予め測定することで、安定した結実特性（結実期間に結実に欠くことなく、かつ奇形果でもない）を有するパパイヤ雌雄同株品種の選種が可能となるのかという点について、現時点ではこの課題を解決するための技術手段は提供されていない。
本発明は上述の問題に鑑み、パパイヤの結実特性を予め測定可能な分子マーカー及びその関連測定方法を提供し、安定した結実特性を有する雌雄同株パパイヤ品種の選種を目的とする。
本発明は以下の技術手段を提供する。
（１）塩基配列がSEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：11からなる群より選ばれる、雌雄同株パパイヤの結実特性測定に用いる分子マーカー。
（２）項1に記載の分子マーカーの測定に用いる、雌雄同株パパイヤの結実特性測定に用いるプローブ。
（３）項２に記載のプローブを含む、雌雄同株パパイヤの結実特性測定に用いるキット。
（４）被測定物の雌雄同株パパイヤからゲノムDNAを得ること、
前記ゲノムDNAに以下からなる群より選ばれる塩基配列が存在するか分析すること、を含み、
（i）SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11
（ii) SEQ ID NO：9
（i）から選ばれる少なくとも一つの塩基配列が存在する場合は、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が不安定であることを示し、
（ii）から選ばれる少なくとも一つの塩基配列が存在する場合は、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が安定であることを示し、
前記結実特性の不安定とは、結実期間に欠果又は奇形果となることを指し、
前記結実特性の安定とは、結実期間に欠果とならず奇形果でもないことを指す、
雌雄同株パパイヤの結実特性を測定する方法。
前記ゲノムDNAに以下からなる群より選ばれる塩基配列が存在するか分析すること、を含み、
（i）SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11
（ii) SEQ ID NO：9
（i）から選ばれる少なくとも一つの塩基配列が存在する場合は、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が不安定であることを示し、
（ii）から選ばれる少なくとも一つの塩基配列が存在する場合は、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が安定であることを示し、
前記結実特性の不安定とは、結実期間に欠果又は奇形果となることを指し、
前記結実特性の安定とは、結実期間に欠果とならず奇形果でもないことを指す、
雌雄同株パパイヤの結実特性を測定する方法。
（５）前記分析は、高解像度融解曲線分析を使用し、
前記高解像度融解曲線分析は、以下からなる群より選ばれる少なくとも一対のプライマーを使用する、項4に記載の方法。
（a）SEQ ID NO：3を測定するプライマー：SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17
（b）SEQ ID NO：5を測定するプライマー：SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21
（c）SEQ ID NO：10を測定するプライマー：SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31
（d）SEQ ID NO：11を測定するプライマー：SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33
（e）SEQ ID NO：9を測定するプライマー：SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29
前記高解像度融解曲線分析は、以下からなる群より選ばれる少なくとも一対のプライマーを使用する、項4に記載の方法。
（a）SEQ ID NO：3を測定するプライマー：SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17
（b）SEQ ID NO：5を測定するプライマー：SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21
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（６）被測定物の雌雄同株パパイヤからゲノムDNAを得ること、
前記ゲノムDNAは少なくとも一つのホモ接合体を含み、かつ前記ホモ接合体は以下からなる群より選ばれるDNA塩基配列を有するか否かを分析すること、を含み、
（i）SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4
（ii） SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8
前記ゲノムDNAが少なくとも一つの前記ホモ接合体を含み、前記ホモ接合体が前記（i)のDNA塩基配列を有する場合は、被測定物の雌雄同株パパイヤは結実特性が不安定であることを示し、
前記ゲノムDNAが少なくとも一つの前記ホモ接合体を含み、前記ホモ接合体が前記（ii)のDNA塩基配列を有する場合は、被測定物の雌雄同株パパイヤは結実特性が安定であることを示し、
前記結実特性の不安定とは、結実期間に欠果又は奇形果となることを指し、
前記結実特性の安定とは、結実期間に欠果とならず奇形果でもないことを指す、
雌雄同株パパイヤの結実特性を測定する方法。
前記ゲノムDNAは少なくとも一つのホモ接合体を含み、かつ前記ホモ接合体は以下からなる群より選ばれるDNA塩基配列を有するか否かを分析すること、を含み、
（i）SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4
（ii） SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8
前記ゲノムDNAが少なくとも一つの前記ホモ接合体を含み、前記ホモ接合体が前記（i)のDNA塩基配列を有する場合は、被測定物の雌雄同株パパイヤは結実特性が不安定であることを示し、
前記ゲノムDNAが少なくとも一つの前記ホモ接合体を含み、前記ホモ接合体が前記（ii)のDNA塩基配列を有する場合は、被測定物の雌雄同株パパイヤは結実特性が安定であることを示し、
前記結実特性の不安定とは、結実期間に欠果又は奇形果となることを指し、
前記結実特性の安定とは、結実期間に欠果とならず奇形果でもないことを指す、
雌雄同株パパイヤの結実特性を測定する方法。
（７）前記分析は、高解像度融解曲線分析を使用し、
前記高解像度融解曲線分析は、以下からなる群より選ばれる少なくとも一対のプライマーを使用する、項６に記載の方法。
（a）SEQ ID NO：1を測定するプライマー：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13
（b）SEQ ID NO：2を測定するプライマー：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15
（c）SEQ ID NO：4を測定するプライマー：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19
（d）SEQ ID NO：6を測定するプライマー：SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23
（e）SEQ ID NO：7を測定するプライマー：SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25
（f）SEQ ID NO：8を測定するプライマー：SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27
前記高解像度融解曲線分析は、以下からなる群より選ばれる少なくとも一対のプライマーを使用する、項６に記載の方法。
（a）SEQ ID NO：1を測定するプライマー：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13
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（f）SEQ ID NO：8を測定するプライマー：SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27
（８）以下からなる群より選ばれる少なくとも一対のプライマーを含む、雌雄同株パパイヤの結実特性測定に用いる高解像度融解曲線分析キット。
（a）SEQ ID NO：1を測定するプライマー：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13
（b）SEQ ID NO：2を測定するプライマー：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15
（c）SEQ ID NO：3を測定するプライマー：SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17
（d）SEQ ID NO：4を測定するプライマー：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19
（e）SEQ ID NO：5を測定するプライマー：SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21
（f）SEQ ID NO：6を測定するプライマー：SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23
（g）SEQ ID NO：7を測定するプライマー：SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25
（h）SEQ ID NO：8を測定するプライマー：SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27
（i）SEQ ID NO：9を測定するプライマー：SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29
（j）SEQ ID NO：10を測定するプライマー：SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31
（k）SEQ ID NO：11を測定するプライマー：SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33
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（k）SEQ ID NO：11を測定するプライマー：SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33
（９）雌雄同株パパイヤの結実特性を測定する分子マーカー11個からなり、前記雌雄同株パパイヤの結実特性を測定する分子マーカー11個はそれぞれSEQ ID NO：1からSEQ ID NO：11のDNA塩基配列を有する、雌雄同株パパイヤの結実特性を測定するシステム。
（１０）項1に記載の雌雄同株パパイヤの結実特性測定に用いる分子マーカーを含む、組換えベクター。
さらに、本発明は雌雄同株パパイヤの結実特性を測定する一塩基多型（SNP)マーカーを提供し、前記一塩基多型マーカーは下記からなる群より選ばれる。
SNP1：SEQ ID NO：1の位置31の"A"、被測定物の雌雄同株パパイヤが該SNPマーカーを含み、かつホモ接合型（homozygous）であれば、該被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が不安定であることを示す。
SNP2：SEQ ID NO：2の位置29の"T"、被測定物の雌雄同株パパイヤが該SNPマーカーを含み、かつホモ接合型であれば、該被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が不安定であることを示す。
SNP3：SEQ ID NO：3の位置61の"G"、被測定物の雌雄同株パパイヤが該SNPマーカーを含めば、ホモ接合型又はヘテロ接合型であることを問わず、該被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が不安定であることを示す。
SNP4：SEQ ID NO：4の位置46の"T"、被測定物の雌雄同株パパイヤが該SNPマーカーを含み、かつホモ接合型であれば、該被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が不安定であることを示す。
SNP5：SEQ ID NO：5の位置24の"A"、被測定物の雌雄同株パパイヤが該SNPマーカーを含めば、ホモ接合型又はヘテロ接合型であることを問わず、該被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が不安定であることを示す。
SNP6：SEQ ID NO：6の位置33の"T"、被測定物の雌雄同株パパイヤが該SNPマーカーを含み、かつホモ接合型であれば、該被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が安定であることを示す。
SNP7：SEQ ID NO：6の位置57の"T"、被測定物の雌雄同株パパイヤが該SNPマーカーを含み、かつホモ接合型であれば、該被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が安定であることを示す。
SNP8：SEQ ID NO：7の位置61の"T"、被測定物の雌雄同株パパイヤが該SNPマーカーを含み、かつホモ接合型であれば、該被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が安定であることを示す。
SNP9：SEQ ID NO：8の位置27の"A"、被測定物の雌雄同株パパイヤが該SNPマーカーを含み、かつホモ接合型であれば、該被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が安定であることを示す。
SNP10：SEQ ID NO：8の位置51の"C"、被測定物の雌雄同株パパイヤが該SNPマーカーを含み、かつホモ接合型であれば、該被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が安定であることを示す。
SNP11：SEQ ID NO：9の位置42の"T"、被測定物の雌雄同株パパイヤが該SNPマーカーを含めば、ホモ接合型又はヘテロ接合型であることを問わず、該被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が安定であることを示す。
SNP12：SEQ ID NO：10の位置24の"G"、被測定物の雌雄同株パパイヤが該SNPマーカーを含めば、ホモ接合型又はヘテロ接合型であることを問わず、該被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が不安定であることを示す。
SNP13：SEQ ID NO：11の位置30の"C"、被測定物の雌雄同株パパイヤが該SNPマーカーを含めば、ホモ接合型又はヘテロ接合型であることを問わず、該被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が不安定であることを示す。
本発明は、前記一塩基多型（SNP)マーカーの測定に用いる、雌雄同株パパイヤの結実特性測定に用いるSNPマーカープローブを提供する。
本発明は、前記一塩基多型（SNP)マーカーの測定に用いる、雌雄同株パパイヤの結実特性測定に用いるキットを提供する。
本発明によると、パパイヤの花器官が発育していない時期又は結実していない発育早期に、パパイヤの結実特性を測定することが可能となり、有効、迅速かつ確実な方法で、安定した結実特性を有する雌雄同株パパイヤ品種を選種することができる。該品種は、結実期間に欠果とならず奇形果でもない、安定した結実表現を有する。さらに、パパイヤの品種改良における育種過程にかかる期間を短縮させ、生産コストを削減することができる。
本発明に記載のパパイヤ及び雌雄同株パパイヤの品種としては、例えば、台農1号、台農2号、紅福、緑福、SINTA、円葉、Tn6、Hong Kong、Eksotika2、インドネシア種、クアラルンプル瓜、Hawaiian Solo Sunset、Papaya Linda、Solo sunrise improve、Red Maradol及びMaradol Rajaを挙げることができる。
本発明に記載の「結実特性」とは、雌雄同株パパイヤが成熟して結実期間に入った際に欠果となるか又は果実が奇形果であるか否かの関連表現を指す。本発明において、本発明に基づいて雌雄同株パパイヤを測定した結果が「結実特性安定」であれば、その雌雄同株パパイヤは結実期間において欠果とならず果実が奇形果でもないと予測することができる（図1A、図1D参照）。本発明において、本発明に基づいて雌雄同株パパイヤを測定した結果が「結実特性不安定」であれば、その雌雄同株パパイヤは結実期間において欠果となるか（図1C、図1Fにおいて丸で囲んだ箇所に示す）又は果実が奇形果であると予測することができる。
前記「欠果」とは、結実期間において着花処に果実を結ばない現象を指し、着花箇所全体に果実を結ばない場合及び着花箇所部分的に果実を結ばない場合を含む。
前記「奇形果」とは、一般的に、単為結果による小さなパパイヤ果実又は変形したパパイヤ果実を指す（図1B、図1Eにおいて丸で囲んだ箇所に示す）。
本発明に記載の「対立遺伝子（alleles)」とは、ゲノムDNA又は特定の染色体DNAにおける特定配列が、2種類又は多種の異なる配列形式を有し、互いに対立遺伝子となることを指す。異なる配列形式とは、その配列の一つ又は二つ以上の位置に配列変異が存在することである。これより、本発明に記載の「ホモ接合体（homozygous alleles)」とは、対立染色体DNA同士の対応する特定位置に1種類の配列形式のみを含み、互いに配列変異は存在しない。
本発明に記載の「プローブ」とは、本発明の分子マーカーを測定することができるいかなる物質をも指す。よってプローブは、本発明の分子マーカーの塩基配列と特異性ハイブリダイゼーションを行うことができるオリゴヌクレオチドであってもよい。該オリゴヌクレオチドは、さらに発色団などの分子と共有結合することができる。該プローブは、本発明の分子マーカーの塩基配列の増幅に用いる、PCRのプライマーであってもよい。
本発明において、ゲノムDNAの塩基配列に対する分析は、関連技術における公知の方法から適宜選択することができる。例えば、サンガー法シーケンシング、PCR-RFLP、TaqManプローブ、高解像度融解曲線分析（High Resolution Melting，HRM）などを挙げることができる。
本発明において、被測定物の雌雄同株パパイヤのゲノムDNAがターゲットのホモ接合体を含むか否かについての分析は、関連技術における公知の方法から適宜選択することができる。例えば、該対立遺伝子の塩基配列と特異性ハイブリダイゼーションを行うことができるオリゴヌクレオチドプローブ、高解像度融解曲線分析（High Resolution Melting，HRM）などを挙げることができる。
実施形態の一つにおいて、本発明に記載の「ゲノムDNA」は、パパイヤX染色体DNA及びYh染色体DNAを含む。
実施形態の一つにおいて、本発明のキットは、被測定物の雌雄同株パパイヤから核酸サンプルを収集することに用いる工具及び／又は試薬を含んでもよい。実施形態の一つにおいて、本発明のキットは、核酸サンプルからゲノムDNAを調製することに用いる工具及び／又は試薬を含んでもよい。
実施形態の一つにおいて、本発明のキットは、以下からなる群より選ばれる少なくとも一対のプライマーを含むことができ、該プライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に使用し、本発明の分子マーカーの核酸を増幅することができる。
（a)SEQ ID NO：1を測定するプライマー：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13
（b)SEQ ID NO：2を測定するプライマー：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15
（c)SEQ ID NO：3を測定するプライマー：SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17
（d)SEQ ID NO：4を測定するプライマー：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19
（e)SEQ ID NO：5を測定するプライマー：SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21
（f)SEQ ID NO：6を測定するプライマー：SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23
（g)SEQ ID NO：7を測定するプライマー：SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25
（h)SEQ ID NO：8を測定するプライマー：SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27
（i)SEQ ID NO：9を測定するプライマー：SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29
（j)SEQ ID NO：10を測定するプライマー：SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31
（k)SEQ ID NO：11を測定するプライマー：SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33
（a)SEQ ID NO：1を測定するプライマー：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13
（b)SEQ ID NO：2を測定するプライマー：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15
（c)SEQ ID NO：3を測定するプライマー：SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17
（d)SEQ ID NO：4を測定するプライマー：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19
（e)SEQ ID NO：5を測定するプライマー：SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21
（f)SEQ ID NO：6を測定するプライマー：SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23
（g)SEQ ID NO：7を測定するプライマー：SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25
（h)SEQ ID NO：8を測定するプライマー：SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27
（i)SEQ ID NO：9を測定するプライマー：SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29
（j)SEQ ID NO：10を測定するプライマー：SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31
（k)SEQ ID NO：11を測定するプライマー：SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33
実施形態の一つにおいて、本発明の雌雄同株パパイヤの結実特性の測定に用いるプローブは、長さは特に制限されず、本発明に記載されている何れか1つの分子マーカーの塩基配列（SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：11）を含めばよい。
以下、実施例を示して本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。下記に記載する内容は本発明の詳細内容と実施の効果を示すためのものである。
下記実施例1〜11は、本発明の分子マーカー11個（SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：11の塩基配列、以下「S1〜S11」と略す）を利用して雌雄同株パパイヤサンプルを測定し、高解像度融解曲線分析により測定結果を得た実施形態である。
既知の結実形質の雌雄同株パパイヤのサンプル１２個からゲノムDNAを抽出した。番号と既知の品種情報を表1に示す。ゲノムDNAの抽出方法は、属する技術分野の通常知識を有する如何なる者に知られているものであり、ここでの説明は省略する。
上記本発明の各分子マーカーに対応するプライマー（a）〜（k)により、高解像度融解曲線分析を用いて上記サンプル１２個を分析した。結実特性の相違により、各ゲノムDNAサンプルのゲノムDNAは、本発明の分子マーカーの塩基配列を少なくとも１種有するか、又は本発明の分子マーカーの塩基配列を有するホモ接合体を少なくとも一つ含む。１つの塩基配列の差異により高解像度融解曲線の形状および位置が変化し、またホモ接合体とヘテロ接合体も異なる曲線形態を示すようになる。よって曲線形態の相違により、ゲノムDNAが本発明の分子マーカーを有するか否かを判断し、結実特性を鑑定する。以下、各分子マーカーの高解像度融解曲線結果について説明する。
実施例１：分子マーカーS1(SEQ ID NO:1)
被測定物の雌雄同株パパイヤゲノムDNAがホモ接合体を含み、かつ前記ホモ接合体は分子マーカーS1の塩基配列（SEQ ID NO:1）を有する場合、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が不安定であることを示す。被測定物の雌雄同株パパイヤが分子マーカーS1の塩基配列を有する対立遺伝子を一つのみ含む又は含まない場合、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が安定であることを示す。プライマー（a）（SEQ ID NO：12及びSEQ ID NO：13）でHRM分析を行ったところ、図２に示すように、分子マーカーS1の塩基配列を有するホモ接合体を含む場合、融解曲線の曲線形態とピーク位置は矢印「不安定」が指す曲線と類似する。分子マーカーS1の塩基配列を有する対立遺伝子を一つのみ含む又は含まない場合、融解曲線の曲線形態とピーク位置は矢印「安定」が指す曲線と類似する。
実施例２：分子マーカーS2(SEQ ID NO:2)
被測定物の雌雄同株パパイヤゲノムDNAがホモ接合体を含み、かつ前記ホモ接合体は分子マーカーS2の塩基配列（SEQ ID NO:2）を有する場合、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が不安定であることを示す。被測定物の雌雄同株パパイヤが分子マーカーS2の塩基配列を有する対立遺伝子を一つのみ含む又は含まない場合、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が安定であることを示す。プライマー（ｂ）（SEQ ID NO：14及びSEQ ID NO：15）でHRM分析を行ったところ、図３に示すように、分子マーカーS2の塩基配列を有するホモ接合体を含む場合、融解曲線の曲線形態とピーク位置は矢印「不安定」が指す曲線と類似する。分子マーカーS2の塩基配列を有する対立遺伝子を一つのみ含む又は含まない場合、融解曲線の曲線形態とピーク位置は矢印「安定」が指す曲線と類似する。
実施例３：分子マーカーS3(SEQ ID NO:3)
被測定物の雌雄同株パパイヤゲノムDNAが、分子マーカーS3の塩基配列（SEQ ID NO:3）を有する場合、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が不安定であることを示す。被測定物の雌雄同株パパイヤが、分子マーカーS3の塩基配列を有さない場合、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が安定であることを示す。プライマー（ｃ）（SEQ ID NO：16及びSEQ ID NO：17）でHRM分析を行ったところ、図４に示すように、分子マーカーS3の塩基配列を有する場合、融解曲線の曲線形態とピーク位置は矢印「不安定」が指す曲線と類似する。分子マーカーS3の塩基配列を有さない場合、融解曲線の曲線形態とピーク位置は矢印「安定」が指す曲線と類似する。
実施例４：分子マーカーS4(SEQ ID NO:4)
被測定物の雌雄同株パパイヤゲノムDNAがホモ接合体を含み、かつ前記ホモ接合体は分子マーカーS4の塩基配列（SEQ ID NO:4）を有する場合、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が不安定であることを示す。被測定物の雌雄同株パパイヤが分子マーカーS4の塩基配列を有する対立遺伝子を一つのみ含む又は含まない場合、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が安定であることを示す。プライマー（ｄ）（SEQ ID NO：18及びSEQ ID NO：19）でHRM分析を行ったところ、図５に示すように、分子マーカーS4の塩基配列を有するホモ接合体を含む場合、融解曲線の曲線形態とピーク位置は矢印「不安定」が指す曲線と類似する。分子マーカーS4の塩基配列を有する対立遺伝子を一つのみ含む又は含まない場合、融解曲線の曲線形態とピーク位置は矢印「安定」が指す曲線と類似する。
実施例５：分子マーカーS5(SEQ ID NO:5)
被測定物の雌雄同株パパイヤゲノムDNAが、分子マーカーS5の塩基配列（SEQ ID NO:5）を有する場合、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が不安定であることを示す。被測定物の雌雄同株パパイヤが分子マーカーS5の塩基配列を有さない場合、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が安定であることを示す。プライマー（e）（SEQ ID NO：20及びSEQ ID NO：21）でHRM分析を行ったところ、図６に示すように、分子マーカーS5の塩基配列を有する場合、融解曲線の曲線形態とピーク位置は矢印「不安定」が指す曲線と類似する。分子マーカーS5の塩基配列を含まない場合、融解曲線の曲線形態とピーク位置は矢印「安定」が指す曲線と類似する。
実施例６：分子マーカーS6(SEQ ID NO:6)
被測定物の雌雄同株パパイヤゲノムDNAがホモ接合体を含み、かつ前記ホモ接合体は分子マーカーS6の塩基配列（SEQ ID NO:6）を有する場合、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が安定であることを示す。被測定物の雌雄同株パパイヤが分子マーカーS6の塩基配列を有する対立遺伝子を一つのみ含む又は含まない場合、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が不安定であることを示す。プライマー（ｆ）（SEQ ID NO：22及びSEQ ID NO：23）でHRM分析を行ったところ、図７に示すように、分子マーカーS6の塩基配列を有するホモ接合体を含む場合、融解曲線の曲線形態とピーク位置は矢印「安定」が指す曲線と類似する。分子マーカーS6の塩基配列を有する対立遺伝子を一つのみ含む又は含まない場合、融解曲線の曲線形態とピーク位置は矢印「不安定」が指す曲線と類似する。
実施例７：分子マーカーS7(SEQ ID NO:7)
被測定物の雌雄同株パパイヤゲノムDNAがホモ接合体を含み、かつ前記ホモ接合体は分子マーカーS7の塩基配列（SEQ ID NO:7）を有する場合、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が安定であることを示す。被測定物の雌雄同株パパイヤが分子マーカーS7の塩基配列を有する対立遺伝子を一つのみ含む又は含まない場合、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が不安定であることを示す。プライマー（ｇ）（SEQ ID NO：24及びSEQ ID NO：25）でHRM分析を行ったところ、図８に示すように、分子マーカーS7の塩基配列を有するホモ接合体を含む場合、融解曲線の曲線形態とピーク位置は矢印「安定」が指す曲線と類似する。分子マーカーS7の塩基配列を有する対立遺伝子を一つのみ含む又は含まない場合、融解曲線の曲線形態とピーク位置は矢印「不安定」が指す曲線と類似する。
実施例８：分子マーカーS8(SEQ ID NO:8)
被測定物の雌雄同株パパイヤゲノムDNAがホモ接合体を含み、かつ前記ホモ接合体は分子マーカーS8の塩基配列（SEQ ID NO:8）を有する場合、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が安定であることを示す。被測定物の雌雄同株パパイヤが分子マーカーS8の塩基配列を有する対立遺伝子を一つのみ含む又は含まない場合、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が不安定であることを示す。プライマー（ｈ）（SEQ ID NO：26及びSEQ ID NO：27）でHRM分析を行ったところ、図９に示すように、分子マーカーS8の塩基配列を有するホモ接合体を含む場合、融解曲線の曲線形態とピーク位置は矢印「安定」が指す曲線と類似する。分子マーカーS8の塩基配列を有する対立遺伝子を一つのみ含む又は含まない場合、融解曲線の曲線形態とピーク位置は矢印「不安定」が指す曲線と類似する。
実施例９：分子マーカーS9(SEQ ID NO:9)
被測定物の雌雄同株パパイヤゲノムDNAが、分子マーカーS9の塩基配列（SEQ ID NO:9）を有する場合、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が安定であることを示す。被測定物の雌雄同株パパイヤが分子マーカーS9の塩基配列を有さない場合、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が不安定であることを示す。プライマー（i）（SEQ ID NO：28及びSEQ ID NO：29）でHRM分析を行ったところ、図１０に示すように、分子マーカーS9の塩基配列を有する場合、融解曲線の曲線形態とピーク位置は矢印「安定」が指す曲線と類似する。分子マーカーS9の塩基配列を有さない場合、融解曲線の曲線形態とピーク位置は矢印「不安定」が指す曲線と類似する。
実施例１０：分子マーカーS10(SEQ ID NO:10)
被測定物の雌雄同株パパイヤゲノムDNAが、分子マーカーS10の塩基配列（SEQ ID NO:10）を有する場合、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が不安定であることを示す。被測定物の雌雄同株パパイヤが、分子マーカーS10の塩基配列を有さない場合、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が安定であることを示す。プライマー（j）（SEQ ID NO：30及びSEQ ID NO：31）でHRM分析を行ったところ、図１１に示すように、分子マーカーS10の塩基配列を有する場合、融解曲線の曲線形態とピーク位置は矢印「不安定」が指す曲線と類似する。分子マーカーS10の塩基配列を有さない場合、融解曲線の曲線形態とピーク位置は矢印「安定」が指す曲線と類似する。
実施例１１：分子マーカーS11(SEQ ID NO:11)
被測定物の雌雄同株パパイヤゲノムDNAが、分子マーカーS11の塩基配列（SEQ ID NO:11）を有する場合、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が不安定であることを示す。被測定物の雌雄同株パパイヤが、分子マーカーS11の塩基配列を有さない場合、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が安定であることを示す。プライマー（k）（SEQ ID NO：32及びSEQ ID NO：33）でHRM分析を行ったところ、図１２に示すように、分子マーカーS11の塩基配列を有する場合、融解曲線の曲線形態とピーク位置は矢印「不安定」が指す曲線と類似する。分子マーカーS10の塩基配列を有さない場合、融解曲線の曲線形態とピーク位置は矢印「安定」が指す曲線と類似する。
上記の実施例から、本発明に記載の分子マーカーによって、実施例で例示したHRM分析等の分析方法と合わせて、異なる品種の雌雄同株パパイヤの結実特性を速やかに、性格に測定することができる。このような測定を早期に行うことで、結実形質特性が安定した雌雄同株パパイヤを選別することができ、欠果及び奇形果の発生を減少させることができる。
パパイヤは商品作物として、その結実特性は重要な育種形質である。本発明をパパイヤ種苗産業に応用することで、結実特性が安定したパパイヤ品種の雌雄同株を選別することが可能となり、育種されるパパイヤ種苗の競争力の向上につながる。
Claims (10)
- 塩基配列がSEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：11からなる群より選ばれる、雌雄同株パパイヤの結実特性測定に用いる分子マーカー。
- 請求項１に記載の分子マーカーの測定に用いる、雌雄同株パパイヤの結実特性測定に用いるプローブ。
- 請求項２に記載のプローブを含む、雌雄同株パパイヤの結実特性測定に用いるキット。
- 被測定物の雌雄同株パパイヤからゲノムDNAを得ること、
前記ゲノムDNAに以下からなる群より選ばれる塩基配列が存在するか分析すること、を含み、
（i）SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11
（ii) SEQ ID NO：9
（i）から選ばれる少なくとも一つの塩基配列が存在する場合は、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が不安定であることを示し、
（ii）から選ばれる少なくとも一つの塩基配列が存在する場合は、被測定物の雌雄同株パパイヤの結実特性が安定であることを示し、
前記結実特性の不安定とは、結実期間に欠果又は奇形果となることを指し、
前記結実特性の安定とは、結実期間に欠果とならず奇形果でもないことを指す、
雌雄同株パパイヤの結実特性を測定する方法。 - 前記分析は、高解像度融解曲線分析を使用し、
前記高解像度融解曲線分析は、以下からなる群より選ばれる少なくとも一対のプライマーを使用する、請求項４に記載の方法。
（a）SEQ ID NO：3を測定するプライマー：SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17
（b）SEQ ID NO：5を測定するプライマー：SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21
（c）SEQ ID NO：10を測定するプライマー：SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31
（d）SEQ ID NO：11を測定するプライマー：SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33
（e）SEQ ID NO：9を測定するプライマー：SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29 - 被測定物の雌雄同株パパイヤからゲノムDNAを得ること、
前記ゲノムDNAは、少なくとも一つのホモ接合体を含み、かつ前記ホモ接合体は、以下からなる群より選ばれるDNA塩基配列を有するか否かを分析すること、を含み、
（i）SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4
（ii） SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8
前記ゲノムDNAが少なくとも一つの前記ホモ接合体を含み、前記ホモ接合体が前記（i)のDNA塩基配列を有する場合は、被測定物の雌雄同株パパイヤは結実特性が不安定であることを示し、
前記ゲノムDNAが少なくとも一つの前記ホモ接合体を含み、前記ホモ接合体が前記（ii)のDNA塩基配列を有する場合は、被測定物の雌雄同株パパイヤは結実特性が安定であることを示し、
前記結実特性の不安定とは、結実期間に欠果又は奇形果となることを指し、
前記結実特性の安定とは、結実期間に欠果とならず奇形果でもないことを指す、
雌雄同株パパイヤの結実特性を測定する方法。 - 前記分析は、高解像度融解曲線分析を使用し、
前記高解像度融解曲線分析は、以下からなる群より選ばれる少なくとも一対のプライマーを使用する、請求項６に記載の方法。
（a)SEQ ID NO：1を測定するプライマー：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13
（b)SEQ ID NO：2を測定するプライマー：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15
（c)SEQ ID NO：4を測定するプライマー：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19
（d)SEQ ID NO：6を測定するプライマー：SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23
（e)SEQ ID NO：7を測定するプライマー：SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25
（f)SEQ ID NO：8を測定するプライマー：SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27 - 以下からなる群より選ばれる少なくとも一対のプライマーを含む、雌雄同株パパイヤの結実特性測定に用いる高解像度融解曲線分析キット。
（a)SEQ ID NO：1を測定するプライマー：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13
（b)SEQ ID NO：2を測定するプライマー：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15
（c)SEQ ID NO：3を測定するプライマー：SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17
（d)SEQ ID NO：4を測定するプライマー：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19
（e)SEQ ID NO：5を測定するプライマー：SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21
（f)SEQ ID NO：6を測定するプライマー：SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23
（g)SEQ ID NO：7を測定するプライマー：SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25
（h)SEQ ID NO：8を測定するプライマー：SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27
（i)SEQ ID NO：9を測定するプライマー：SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29
（j)SEQ ID NO：10を測定するプライマー：SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31
（k)SEQ ID NO：11を測定するプライマー：SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33 - 雌雄同株パパイヤの結実特性を測定する分子マーカー11個からなり、前記雌雄同株パパイヤの結実特性を測定する分子マーカー11個はそれぞれSEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：11のDNA塩基配列を有する、雌雄同株パパイヤの結実特性を測定するシステム。
- 請求項１に記載の雌雄同株パパイヤの結実特性測定に用いる分子マーカーを含む、組換えベクター。
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