BR112013004924B1 - método de identificar uma planta de soja que compreende um genótipo associado a um fenótipo sem flash - Google Patents

Abstract

MARCADORES MOLECULARES ASSOCIADOS A FLASH AMARELO EM SOJAS TOLERANTES A GLIFOSATO. A presente invenção refere-se a métodos e composições para a identificação e seleção de locais que modulam expressão fenotípica de um traço de tolerância a herbicida em criação de plantas. Além disso, são fornecidos métodos para classificar entradas de germoplasma para o desempenho e a expressão deste traço.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] A presente invenção reivindica o benefício do pedido provisional US 61/380.024, depositado em 3 de setembro de 2010 e incorporado aqui a título de referência na íntegra.

Incorporação de listagem de sequências

[0002] Uma listagem de sequências contendo o arquivo denominado "46_21_54534_SeqListing.txt"que tem 19.743 bytes (medido em MS-Windows®) e criada em 26 de agosto de 2011, compreende 32 sequências de nucleotídeos, é depositada com a presente e é pela presente incorporada a título de referência na íntegra. Também são incorporadas aqui a título de referência 32 sequências de nucleotídeos e informações de identificação pertinentes na Listagem de sequências contendo o arquivo denominado "46_21_54534.txt"que tem 18477 bytes (medido em MS-Windows®), criado em 30 de agosto de 2010 e depositado com o pedido provisional US 61/380.024 em 3 de setembro de 2010.

Incorporação da tabela 2

[0003] Uma listagem de vários marcadores de grupo de ligação de soja L (cromossomo 19) é fornecida com o presente no Relatório descritivo como Tabela 2. Também é incorporada aqui a título de referência a listagem de vários marcadores do grupo de ligação de soja L (cromossomo 19) que foi fornecida no documento "Appendix to the Specification as Table 2"que tinha 4541064 bytes (como medido em MS-Windows®), depositado com o pedido provisional norte-americano no. De série 61/380.024 em 3 de setembro de 2010. A tabela 2 aparece nas páginas finais do relatório descritivo.

Antecedentes da invenção

[0004] "Flash amarelo" é um fenótipo indesejável observado em certas variedades de soja que compreende um transgene que confere tolerância ao herbicida de espectro amplo glifosato. Após aplicação de glifosato, ou aplicações de glifosato sob certas condições ambientais como temperatura elevada, as folhas de certas variedades de planta de soja compreendendo o transgene que confere tolerância a glifosato podem apresentar uma cor amarelada (consequentemente, o termo "Flash amarelo"). O fenótipo de Flash amarelo pode ser observado aproximadamente uma semana após aplicação de herbicida em certas variedades de soja compreendendo o transgene que confere tolerância a glifosato. O fenótipo de flash amarelo é indesejável visto que leva a uma cor de folha amarela do tipo visualmente desagradável em plantas de soja expostas a glifosato.

Sumário da invenção

[0005] Embora o fenótipo de Flash amarelo possa ser observado aproximadamente uma semana após aplicação de herbicida em certas variedades de soja compreendendo o transgene que confere tolerância a glifosato, variedades de soja distintas que compreendem o mesmo transgene tolerante a glifosato integrado no mesmo local cromossômico (isto é, o mesmo evento transgênico) pode mostrar vários graus de flash amarelo após exposição a doses elevadas de glifosato. Algumas variedades compreendendo a inserção de transgene tolerante a glifosato são altamente resistentes a dosagens elevadas de glifosato, não mostrando fenótipo de flash amarelo; (isto é, um "fenótipo sem flash"), enquanto outras variedades compreendendo a mesma inserção de transgene tolerante a glifosato são altamente suscetíveis a dosagens elevadas de glifosato, mostrando um fenótipo de flash amarelo severo. São fornecidas aqui plantas de soja que compreendem uma região genômica introgredida associada a um fenótipo sem flash. São também fornecidos aqui marcadores que residem fora de uma região genômica associada a um fenótipo sem flash e que facilitam atividades de criação que incluem, porém não são limitadas a, introgressão dessa região genômica. Marcadores e alelos específicos dos mesmos que são associados a um fenótipo sem flash são também fornecidos. Os métodos de obter uma planta de soja que apresente um fenótipo sem flash e métodos de obter uma planta de soja compreendendo em seu genoma pelo menos um local sem flash são também fornecidos. Os métodos que fornecem a introgressão de uma região genômica associada a um fenótipo sem flash em germoplasma de soja que tem uma região genômica associada a um fenótipo de flash amarelo. A identificação de marcadores moleculares associados a locais que conferem o fenótipo sem flash tem valor econômico significativo. Por utilizar marcadores associados a traço sem flash, produtores podem selecionar variedades de soja com os alelos favoráveis (isto é, alelos que não são associados ao traço de flash amarelo) para uso em integração de traço. Eles também podem utilizar os marcadores para ajudar os mesmos a eliminar alelos desfavoráveis (isto é, alelos que são associados ao traço de flash amarelo) em alelo desfavorável de soja. A presente invenção provê desse modo linhagens de soja transgênica comercialmente desejáveis que carreguem uma região genômica que é associada a um fenótipo "sem flash" e toleram altas dosagens de glifosato.

[0006] Os métodos de identificar uma planta de soja que compreende um genótipo associado a um fenótipo sem flash são desse modo fornecidos. Em certas modalidades, os métodos de identificar uma planta de soja que compreende um genótipo associado a um fenótipo sem flash, compreendendo: detectar na planta de soja um alelo pelo menos em um local de marcador de flash amarelo associado ao fenótipo sem flash em que o local marcador de flash amarelo está em uma região genômica do grupo de ligação L flanqueada por locais BG406195 (SEQ ID NO: 13) e BU082700 (SEQ ID NO:14), e indicando que a planta compreende um genótipo associado a um fenótipo sem flash. Em certas modalidades, os métodos compreendem ainda a etapa de selecionara planta indicada de uma população de plantas. Em certas modalidades de quaisquer dos métodos acima mencionados, a planta indicada compreende um transgene que confere tolerância a glifosato são fornecidos. Em certas modalidades onde a planta indicada compreende um transgene que confere tolerância a glifosato, a planta de soja ou progénie da mesma é exposta a uma dosagem de glifosato suficiente para causar flash amarelo em uma variedade suscetível. Em certas modalidades dos métodos acima mencionados, uma planta que apresenta um fenótipo sem flash é selecionada. Em certas modalidades dos métodos acima mencionados, o genótipo associado a um fenótipo sem flash compreende pelo menos um alelo polimórfico de pelo menos um marcador em uma primeira sub-região da região do grupo de ligação L que é flanqueada por locais BG406195 (SEQ ID NO: 13) e BU551345 (SEQ ID NO: 16) e/ou pelo menos um alelo polimórfico de pelo menos um marcador em uma segunda sub-região da região de grupo de ligação L que é flanqueada por locais TA14086_34305 (SEQ ID NO: 15) e BU082700 (SEQ ID NO: 14). Em certas modalidades dos métodos acima mencionados, o genótipo associado a um fenótipo sem flash compreende pelo menos um alelo polimórfico de pelo menos um marcador na região do grupo de ligação L selecionado do grupo que consiste em M0129138 (SEQ ID NO:4), M0101742 (SEQ ID NO:5), M0093116 (SEQ ID NO:6), e M0129925 (SEQ ID NO:7) que é associado a um fenótipo sem flash.

[0007] São também fornecidos métodos para obter uma planta de soja que compreende em seu genoma pelo menos um local sem flash. Em certas modalidades, um método para obter uma planta de soja compreendendo em seu genoma pelo menos um local sem flash, compreendendo as etapas de: a. genotipar uma pluralidade de plantas de soja com relação à pelo menos um local de flash amarelo em uma primeira região genômica do grupo de ligação L flanqueada por locais BG406195 (SEQ ID NO: 13) e BU082700 (SEQ ID NO:14); e, b. selecionar uma planta de soja compreendendo em seu genoma pelo menos um local sem flash compreendendo um genótipo associado a fenótipo sem flash é fornecido. Em certas modalidades desses métodos, o genótipo associado a um fenótipo sem flash compreende pelo menos um alelo polimórfico de pelo menos um marcador em uma primeira sub- região da região do grupo de ligação L que é flanqueada por locais BG406195 (SEQ ID NO: 13) e BU551345 (SEQ ID NO: 16); e/ou pelo menos um alelo polimórfico de pelo menos um marcador em uma segunda sub-região da região do grupo de ligação L que é flanqueada por locais TA14086_34305 (SEQ ID NO: 15) e BU082700 (SEQ ID NO: 14). Em certas modalidades dos métodos acima mencionados, o genótipo associado a um fenótipo sem flash compreende pelo menos um alelo polimórfico de pelo menos um marcador na primeira região de grupo de ligação L, a primeira sub-região, ou a segunda sub-região, em que o marcador é selecionado do grupo que consiste em M0129138 (SEQ ID NO:4), M0101742 (SEQ ID NO:5), M0093116 (SEQ ID NO:6), e M0129925 (SEQ ID NO:7). Em certas modalidades, a pluralidade de plantas de soja compreende uma população que é obtida por: i) cruzar uma planta parental compreendendo pelo menos um local sem flash com uma planta parental que compreende pelo menos um local de flash amarelo; ou ii) obter semente ou progénie de uma planta parental que segrega para pelo menos um local sem flash. Em certas modalidades, a população contém plantas que compreendem um transgene que confere tolerância a glifosato. Em certas modalidades, os métodos acima mencionados podem compreender ainda a etapa de ensaiar em relação à presença de pelo menos um marcador adicional, em que o marcador adicional é ligado ou não ligado à região genômica do grupo de ligação L. em certas modalidades dos métodos acima mencionados, a pluralidade de plantas de soja, a planta de soja, e/ou progénie da mesma são expostas a uma dosagem de glifosato suficiente para causar flash amarelo em uma variedade suscetível. Em certas modalidades dos métodos acima mencionados, uma planta que apresenta um fenótipo sem flash é selecionada.

[0008] São também fornecidos métodos para produzir uma planta de soja que compreende em seu genoma pelo menos um local sem flash introgredido. Em certas modalidades, um método para produzir uma planta de soja compreendendo em seu genoma pelo menos um local sem flash introgredido compreendendo as etapas de: a. cruzar uma primeira planta de soja sem flash com uma segunda planta de soja compreendendo: um local de flash amarelo em uma primeira região genômica de grupo de ligação L flanqueada por locais BG406195 (SEQ ID NO: 13) e BU082700 (SEQ ID NO: 14), e pelo menos um local polimórfico ligado não presente na primeira planta de soja sem flash para obter uma população que segrega para os locais sem flash e o local polimórfico ligado; b. detectar pelo menos dois ácidos nucleicos polimórficos em pelo menos uma planta de soja a partir da população, em que pelo menos um dos ácidos nucleicos polimórficos é localizado na primeira região de grupo de ligação Leem que pelo menos um dos aminoácidos polimórficos é um local polimórfico ligado não presente na primeira planta de soja sem flash; e c. selecionar uma planta de soja compreendendo um genótipo associado a um fenótipo sem flash e pelo menos um marcador ligado encontrado na segunda planta de soja compreendendo um local de flash amarelo porém não na primeira planta de soja sem flash, desse modo obtendo uma planta de soja que compreende em seu genoma pelo menos um local sem flash introgredido são fornecidos. Em certas modalidades dos métodos, pelo menos uma das primeira e segunda plantas de soja compreende um transgene que confere tolerância a glifosato. Em certas modalidades dos métodos, a população, a planta de soja selecionada, e/ou progénie de planta de soja selecionada é exposta a uma dosagem de glifosato suficiente para causar flash amarelo em uma variedade suscetível. Em certas modalidades, o local de flash amarelo compreende pelo menos um alelo polimórfico de pelo menos um marcador em uma primeira sub- região da região do grupo de ligação L que é flanqueada por locais BG406195 (SEQ ID NO: 13) e BU551345 (SEQ ID NO: 16); e/ou pelo menos um alelo polimórfico de pelo menos um marcador em uma segunda sub-região da região do grupo de ligação L que é franqueada por locais TA14086_34305 (SEQ ID NO: 15) e BU082700 (SEQ ID NO: 14). Em certas modalidades dos métodos acima mencionados, o ácido nucleico polimórfico detectado na etapa (b) é detectado com pelo menos um marcador selecionado do grupo que consiste em M0129138 (SEQ ID NO:4), M0101742 (SEQ ID NO:5), M0093116 (SEQ ID NO:6), e M0129925 (SEQ ID NO:7). Em certas modalidades dos métodos acima mencionados, o ácido nucleico polimórfico detectado na etapa (b) é detectado com pelo menos um marcador selecionado do grupo que consiste em M0101742 (SEQ ID NO:5) e M0129925 (SEQ ID NO:7). Em certas modalidades dos métodos acima mencionados, os ácidos nucleicos polimórficos são detectados com marcador M0101742 (SEQ ID NO:5) e com marcador M0129925 (SEQ ID NO:7). Em certas modalidades dos métodos acima mencionados, o local polimórfico ligado é detectado com um marcador genotípico, um marcador fenotípico ou ambos. Em certas modalidades dos métodos, o local polimórfico ligado é detectado com um marcador que é localizado em aproximadamente 1000, 500, 100, 40, 20, 10, ou 5 quilobases (Kb) do local sem flash. Em certas modalidades dos métodos, o local polimórfico ligado é detectado com pelo menos um marcador selecionado do grupo que consiste em M0205928 (SEQ ID N0:3), M0205537 (SEQ ID N0:8), M0202715 (SEQ ID N0:9), M0206286 (SEQ ID NQ:10), M0206054 (SEQ ID N0:11) e M0205375 (SEQ ID NO: 12). São também fornecidas aqui plantas de soja compreendendo um local sem flash introgredido feito pelos métodos acima mencionados. Em certas modalidades, uma planta de soja compreendendo um local sem flash introgredido e um ou mais locais polimórficos compreendendo alelos ou combinações de alelos que não são encontrados em uma variedade de soja sem flash e que são ligados a local sem flash introgredido, em que a planta é produzida pelos métodos acima mencionados são fornecidas.

[0009] São também fornecidas plantas de soja compreendendo um local sem flash introgredido e um ou mais locais polimórficos ou combinações de alelos que não são encontrados em uma variedade de soja sem flash e que são ligados ao local sem flash introgredido.

[00010] São também fornecidas moléculas de ácido nucleico substancialmente purificadas compreendendo uma molécula de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em M0129138 (SEQ ID NO:4), M0101742 (SEQ ID NO:5), M0093116 (SEQ ID NO:6), e M0129925 (SEQ ID NO:7), ou um fragmento do mesmo que contém um variante alélico específico de M0129138 (SEQ ID NO:4), M0101742 (SEQ ID NO:5), M0093116 (SEQ ID NO:6), ou M0129925 (SEQ ID NO:7). Em certas modalidades, o fragmento que contém a variante alélica é pelo menos 15, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 22, pelo menos 25 ou pelo menos 30 nucleotídeos de comprimento.

[00011] Em certas modalidades, os métodos para obter uma planta de soja que apresenta um fenótipo sem flash compreendendo as etapas de: a) cruzar uma planta de soja que apresenta um fenótipo sem flash com uma planta de soja que apresenta um fenótipo de flash amarelo, em que pelo menos uma das plantas de soja compreende um transgene que confere tolerância a glifosato, e b) selecionar uma planta de progénie do cruzamento, em que a planta de progénie compreende o transgene que confere tolerância a glifosato e em que a planta de progénie apresenta um fenótipo sem flash são fornecidos. Em certas modalidades dos métodos, a seleção na etapa b pode compreender: i) genotipar a planta de progénie com relação a um local de flash amarelo em uma região genômica de grupo de ligação L flanqueada por locais BG406195 (SEQ ID NO: 13) e BU082700 (SEQ ID NO: 14); e/ou ii) expor a planta de progénie a glifosato e marcar a planta para um fenótipo sem flash. Em certas modalidades dos métodos, uma planta de soja que apresenta um fenótipo de flash amarelo compreende pelo menos um marcador ligado ou não ligado não presente na primeira planta de soja sem flash. Em certas modalidades, a planta de progénie é adicionalmente selecionada em relação à presença do marcador ligado ou não ligado.

[00012] São também fornecidos métodos de produzir plantas de soja compreendendo as etapas de: a. selecionar uma primeira planta de soja compreendendo um genótipo na região genômica de grupo de ligação L flanqueada por locais BG406195 (SEQ ID NO: 13) e BU082700 (SEQ ID NO: 14) que é associada a um fenótipo sem flash de uma população de plantas de soja que está segregando para o genótipo; e b) cruzar a planta de soja selecionada com uma segunda planta de soja. Em certas modalidades desses métodos, uma ou ambas as plantas de soja compreende um transgene que confere tolerância a glifosato.

[00013] Áreas adicionais de aplicabilidade se tornarão evidentes a partir da descrição fornecida aqui. Deve ser entendido que a descrição e exemplos específicos são destinados para fins de ilustração somente e não pretendem limitar o escopo da presente descrição.

Descrição detalhada da invenção I. Definições

[00014] Como utilizado aqui, um "alelo" se refere a duas ou mais formas alternativas de uma sequência genômica em um dado local em um cromossomo. Quando todos os alelos presentes em um dado local em um cromossomo são iguais, aquela planta é homozigota naquele local. Se os alelos presentes em um dado local em um cromossomo diferirem, aquela planta é heterozigota naquele local.

[00015] Como utilizado aqui, o termo "indicar" quando utilizado em referência a um genótipo de planta se refere a qualquer método pelo que uma planta é indicada para ter certo genótipo. Tais indicações de certo genótipo incluem, porém não são limitadas a qualquer método onde uma planta é fisicamente marcada ou etiquetada. Marcações físicas ou etiquetas que podem ser utilizadas incluem, porém não são limitadas a um código de barras, uma identificação de radiofrequência (RFID), um rótulo ou similar. Indicações de certo genótipo também incluem, porém não são limitadas a, qualquer entrada em qualquer tipo de banco de dados eletrônico ou gravado pelo que o genótipo da planta é fornecido.

[00016] Um "local" é uma posição em uma sequência genômica que é normalmente encontrada por um ponto de referência; por exemplo uma sequência de DNA curta que é um gene, ou parte de um gene ou região intergênica. Um local pode se referir a uma posição de nucleotídeo em um ponto de referência em um cromossomo, como uma posição a partir da extremidade do cromossomo.

[00017] Como utilizado aqui, "grupo de ligação L" corresponde ao grupo de ligação de soja L descrito em Choi, e outros., Genetics. Maio de 2007; 176(1): 685-696. O grupo de ligação L, como utilizado aqui, também corresponde ao cromossomo de soja 19 (como descrito na World Wide Web em soybase.org/LG2Xsome.php) como utilizado aqui, "polimorfismo" significa a presença de uma ou mais variações de uma sequência de ácido nucleico em um ou mais locais em uma população de pelo menos dois membros. A variação pode compreender, porém não é limitada a, uma ou mais substituições de base de nucleotídeo, a inserção de um ou mais nucleotídeos, uma inversão de sequência de nucleotídeo, e/ou a deleção de um ou mais nucleotídeos.

[00018] Como utilizado aqui, o termo "polimorfismo de nucleotídeo único", também mencionado pela abreviatura "SNP", significa um polimorfismo em um sítio único em que o polimorfismo constitui qualquer ou todos de uma alteração de par base única, uma inserção de um ou mais pares de base, e/ou uma deleção de um ou mais pares de base.

[00019] Como utilizado aqui, "marcador" significa uma característica detectável que pode ser utilizada para discriminar entre organismos. Os exemplos de tais características incluem, porém não são limitados a, marcadores genéticos, marcadores bioquímicos, rendimento de fermentação, eficiência de fermentação, rendimento de energia, compostos secundários, metabolites, características morfológicas, e características agronômicas.

[00020] Como utilizado aqui, "ensaio marcador" significa um método para detectar um polimorfismo em um local específico utilizando um método específico. Ensaios de marcador incluem desse modo, porém não são limitados a, medição de pelo menos um fenótipo (como cor de semente, cor da flor, ou outro tração visualmente detectável bem como qualquer traço bioquímico), polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), extensão de base única, eletroforese, alinhamento de sequência, hibridização de oligonucleotídeo específico alélico (ASO), DNA polimórfico amplificado aleatório (RAPD), tecnologias de detecção de polimorfismo baseadas em microconjunto, e similares.

[00021] Como utilizado aqui, "genótipo" significa o componente genético do fenótipo e pode ser indiretamente caracterizado utilizando marcadores ou diretamente caracterizado por sequenciamento de ácido nucleico.

[00022] Como utilizado aqui, o termo "introgredido", quando utilizado em referência a um local genético, se refere a um local genético que foi introduzido em um novo background genético. Introgressão de um local genético pode ser desse modo obtido através tanto de métodos de produção de planta como por métodos genéticos moleculares. Tais métodos genéticos moleculares incluem, porém não são limitados a, várias técnicas de transformação de planta e/ou métodos que fornecem recombinação homóloga, recombinação não homóloga, recombinação específica de sítio, e/ou modificações genômicas que fornecem substituição de local ou conversão de local. Em certas modalidades, introgressão poderia ser desse modo obtida por substituição de um local de flash amarelo por um local sem flash correspondente ou por conversão de um local de genótipo de flash amarelo em um genótipo sem flash.

[00023] Como utilizado aqui, "fenótipo" significa as características detectáveis de uma célula ou organismo que pode ser influenciada por expressão de gene.

[00024] Como utilizado aqui, "ligação" se refere à frequência relativa na qual tipos de gametas são produzidas em um cruzamento. Por exemplo, se o local A tiver genes "A" ou "a" e o local B tiver genes "B" ou "b" e um cruzamento entre pai I com AABB e pai B com aabb produzirá quatro gametas possíveis onde os genes são segregados em AB, Ab, aB e ab. A expectativa nula é que haverá segregação igual independente em cada dos quatro genótipos possíveis, isto é, sem ligação % dos gametas de cada genótipo. A segregação de gametas em um genótipo diferindo de % é atribuída à ligação.

[00025] Como utilizado aqui, o termo "ligado", quando utilizado no contexto de marcadores e/ou regiões genômicas, significa que os marcadores e/ou regiões genômicas são localizadas no mesmo grupo de ligação ou cromossomo.

[00026] Como utilizado aqui, uma "molécula de ácido nucleico, seja uma molécula de ocorrência natural ou de outro modo pode ser "substancialmente purificada", se desejado, com referência a uma molécula separada substancialmente de todas as outras moléculas normalmente associadas em seu estado nativo. Mais preferivelmente, uma molécula substancialmente purificada é a espécie predominante presente em uma preparação. Uma molécula substancialmente purificada pode ser pelo menos aproximadamente 60% livre, preferivelmente pelo menos aproximadamente 75% livre, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 90% livre, e mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 95% isenta de outras moléculas (excluindo solvente) presente na mistura natural. O termo "substancialmente purificado" não pretende abranger moléculas presentes em seu estado nativo.

[00027] Como utilizado aqui, "local de traço quantitativo (QTL)" significa um local que controla até certo grau traços numericamente representáveis que são normalmente distribuídos continuamente. Como utilizado aqui, o termo "transgene" significa moléculas de ácido nucleico na forma de DNA, como cDNA ou DNA genômico, e RNA, como mRNA ou microRNA, que pode ser de fita única ou dupla.

[00028] Como utilizado aqui, o termo "evento", quando utilizado no contexto de descrever uma planta transgênica, se refere a uma linhagem de planta transformada específica. Em um programa de produção transgênica típico, uma construção de transformação responsável por um traço é introduzida no genoma através de um método de transformação. Inúmeros transformantes independentes (eventos) são normalmente gerados para cada construção. Esses eventos são avaliados para selecionar aqueles com desempenho superior.

[00029] Como utilizado aqui, o termo "soja" significa Glycine maxe inclui todas as variedades de planta que podem ser produzidas com soja, incluindo espécie de soja selvagem. Em certas modalidades, plantas de soja da espécie Glycine maxe as subespécies Glycine max L. ssp. maxou Glycine max. ssp. formosana podem ser genotipificadas utilizando as composições e métodos da presente invenção. Em um aspecto adicional, a planta de soja é da espécie Glycine soja, de outro modo conhecida como soja selvagem, pode ser genotipificada utilizando essas composições e métodos. Alternativamente, germoplasma de soja derivada de qualquer de Glycine max, Glycine max L. ssp. max, Glycine max Ssp. formosana, e/ou Glycine soja pode ser genotipificado utilizando composições e métodos fornecidos aqui.

[00030] Como utilizado aqui, o termo "volume" se refere a um método de controlar uma população de segregação durante procriação consaguínea que envolve crescer a população em um lote maior, colher a semente autopolinizada de plantas em volume, e utilizar uma amostra do volume para plantar a próxima geração.

[00031] Como utilizado aqui a frase "Seleção de planta única" (ou o acrônimo "SPS") se refere a um método que é frequentemente utilizado em vez de método de volume (vide imediatamente acima) para avançar germoplasma de segregação em gerações anteriores. SPS é sempre utilizado para avançar germoplasma para análises de "Fileira de progénie"(Prow) e "Experimento de rendimento de fileira de progénie"(PRYT).

[00032] Como utilizado aqui, a frase "Fileira de progénie"(Prow) se refere a um método de análise e produção de planta onde uma fileira de plantas de progénie de SPS é cultivada para observação, seleção adicional e/ou volume.

[00033] Como utilizado aqui, a frase "Experimento de rendimento de fileira de progénie"(PRYT) se refere a um método de análise e produção de planta onde uma fileira de planas de um SPS é cultivada em um experimento de rendimento pequeno com outro material SPS. Na maioria dos casos, o PRYT é normalmente da mesma população e normalmente consiste em um rep em um local.

[00034] Como utilizado aqui, o termo "compreendendo" significa "incluindo porém não limitado a".

II. Descrição da invenção: visão geral

[00035] De acordo com a presente invenção, os requerentes descobriram regiões genômicas, marcadores associados e métodos associados para identificar e associar genótipos que efetuam um traço de tolerância a glifosato mediado por transgene. Por exemplo, em uma modalidade, um método da invenção compreende classificar uma pluralidade de entradas de germoplasma transgênica exibindo uma variação herdável para pelo menos um traço de tolerância a glifosato mediada por transgene em que a variação herdável é ligada a pelo menos um genótipo; e associar pelo menos um genótipo das entradas de germoplasma transgênica a pelo menos um traço de tolerância a glifosato mediada por transgene. Em outra modalidade, um método da invenção compreende cruzar pelo menos duas entradas de germoplasma com uma entrada de germoplasma de teste para a avaliação do desempenho de pelo menos um traço de tolerância a glifosato mediada por transgene para determinar esquemas de cruzamento preferidos. Os métodos da presente invenção podem ser utilizados com técnicas de produção tradicionais como descrito abaixo para classificar mais eficientemente e identificar genótipos que afetam um traço de tolerância a glifosato mediata por transgene.

[00036] O uso de marcadores para inferir um fenótipo de interesse resulta na economia de um programa de produção por substituir ensaios de fenotipagem intensos em tempo caros com ensaio de genotipagem. Além disso, programas de produção podem ser projetados para acionar explicitamente a frequência de fenótipos favoráveis específicos por alvejar genótipos específicos (patente US 6.399.855). A fidelidade dessas associações pode ser monitorada continuamente para assegurar capacidade preditiva mantida e desse modo, decisões de produção informadas (pedido de patente US 2005/0015827). Nesse caso, ensaios de fenotipagem intensos em tempo, caros exigidos para determinar se uma planta, ou plantas, contém uma região genômica associada a um fenótipo "sem flash" ou "flash amarelo" podem ser suplantados por ensaios genotípicos que fornecem identificação de uma planta ou plantas que contêm a região genômica desejada.

III. Região genômica associada a um fenótipo sem flash

[00037] É fornecida aqui uma região genômica de soja que é mostrada aqui como sendo associada a um fenótipo sem flash desejável quando presente em certas formas alélicas e quando combinada com certos locais transgênicos que conferem tolerância a glifosato.

[00038] Uma região genômica de soja fornecida que pode ser associada a um fenótipo sem flash desejável quando presente em certas formas alélicas é localizada na extremidade próxima telômero do braço curto de grupo de ligação de soja L (cromossomo 19). Uma série de marcadores úteis na prática dos métodos da presente invenção é fornecida aqui na Tabela 1. Marcadores adicionais úteis na prática da invenção são fornecidos aqui na tabela 2 do Relatório descritivo que é incorporado aqui a título de referência na íntegra. A tabela 2 provê os marcadores da Tabela 1, marcadores de ácido nucleico adicionais ou locais que foram revelados em vários bancos de dados, as posições relativas dos marcadores em um mapa físico de grupo de ligação L (cromossomo de soja 19), e fontes para os marcadores. Tabela 1. Marcadores gue cobrem uma região genômica associada a um fenótipo sem flash desejável

1as posições relativas da posição media dos marcadores listados ou locais com base nas posições de nucleotídeo em um mapa físico de grupo de ligação de soja L (cromossomo 19) da Tabela 2 são fornecidos onde a posição de nucleotídeo 0 (zero) é telômero próxima e a posição de nucleotídeo 2009800 é centrômero próxima. Bases de nucleotídeo polimórfico são designados na listagem de sequência fornecida aqui de acordo com o padrão WIPO ST.25 (1998), Tabela 1, como a seguir: r=g ou a (purina); y=t/u ou c (pirimidina); m=a ou c; (amino); k=g ou t/u (ceto); s=g ou c (ligações 3-H de interações fortes); w=a ou t/u ligações 2H de interações fracas); b=g ou c ou t/u (não a); d=a ou g ou t/u (não c); h=a ou c ou t/u (não g); v=a ou g ou c (não t, não u); e n=a ou g ou c ou t/u (desconhecido, ou outro; qualquer). 2 os alelos tanto maternal como paternal dos polimorfismos de nucleotídeo único que podem ser associados a um fenótipo não flash são mostrados. 3o alelo polimórfico identificado de marcador M0129138 é localizado no nucleotídeo 218 da SEQ ID NO: 4. 4o alelo polimórfico identificado de marcador M0101742 é localizado no nucleotídeo 1206 da SEQ ID NO: 5. 5 o alelo polimórfico identificado de marcador M0093116 é localizado no nucleotídeo 183 da SEQ ID NO: 6. 6o alelo polimórfico identificado de marcador M0129925 é localizado no nucleotídeo 328 da SEQ ID NO: 7. 7 o alelo polimórfico identificado de marcador M0129138 "GG" pode ser associado a um fenótipo sem flash quando os alelos polimórficos identificados dos outros marcadores são: "TT" para M0101742, "AA" para marcador M0093116, e "GG" ou "CC" para o marcador M0129925. 8 o alelo polimórfico identificado de marcador M0129138 "AA" pode ser associado a um fenótipo sem flash quando os alelos polimórficos identificados dos outros marcadores são: "CC" para M0101742, "TT" para marcador M0093116, e "GG" para o marcador M 0129925.

[00039] São também fornecidas aqui sub-regiões da região do grupo de ligação L que é flanqueada por locais BG406195 (SEQ ID NO: 13) e BU082700 (SEQ ID: 14) que são associados a um fenótipo sem flash. Uma primeira sub-região da região do grupo de ligação L associada a um fenótipo sem flash é flanqueada por locais BG406195 (SEQ ID NO: 13) e BU551345 (SEQ ID NO: 16). Esses locais flanqueiam uma primeira sub-região que cobre nucleotídeo próximo telômero 107039 até nucleotídeo próximo centrômero 115956 no mapa físico de grupo de ligação L fornecido na tabela 2 do relatório descritivo. Polimorfismos localizados nessa primeira sub-região que são associados a um fenótipo sem flash podem ser detectados com marcadores que incluem, porém não são limitados a, M0129138 (SEQ ID NO: 4) e M0101742 (SEQ ID NO: 5). Uma segunda sub-região da região de grupo de ligação L associada a um fenótipo sem flash é flanqueada por locais TA14086_34305 (SEQ ID NO: 15) e BU082700 (SEQ ID NO: 14). Esses locais flanqueiam a segunda sub-região que cobre nucleotídeo próximo telômero 800932 até o nucleotídeo próximo centrômero 864449 no mapa físico do grupo de ligação L fornecido na tabela 2 do relatório descritivo. Polimorfismos localizados nessa segunda sub-região que são associados a um fenótipo sem flash podem ser detectados com marcadores que incluem, porém não são limitados a, M0093116 (SEQ ID NO: 6), e M0129925 (SEQ ID NO: 7). Em certas modalidades da invenção, um polimorfismo associado a um fenótipo sem flash é detectado somente em uma dessas sub-regiões. Em outras modalidades da invenção, pelo menos um polimorfismo associado a um fenótipo nem flash é detectado nessas duas sub-regiões. Desse modo, um ou mais marcadores selecionados do grupo que consiste em M0129138 (SEQ ID NO: 4), M0101742 (SEQ ID NO: 5), e marcadores localizados entre locais BG406195 (SEQ ID NO: 13) e BU551345 (SEQ ID NO: 16) podem ser utilizados independentemente ou em combinação com um ou mais marcadores selecionados do grupo que consiste em M0093116 (SEQ ID NO: 6), e M0129925 (SEQ ID NO: 7), e marcadores localizados entre locais TA14086_34305 (SEQ ID NO: 15) e BU082700 (SEQ ID NO: 14) para detectar polimorfismos associados a um fenótipo sem flash. Inversamente, um ou mais marcadores selecionados do grupo que consiste em M0093116 (SEQ ID NO:6), e M0129925 (SEQ ID NO:7), e marcadores localizados entre locais TA14086_34305 (SEQ ID NO: 15) e BU082700 (SEQ ID NO: 14) podem ser também utilizados independentemente de ou em combinação com quaisquer marcadores localizados na primeira sub-região para detectar polimorfismos associados a um fenótipo sem flash. Em certas modalidades, um polimorfismo na primeira sub-região é detectado com o marcador M0101742 (SEQ ID NO: 5) e um polimorfismo na segunda sub-região é detectado com o marcador M0129925 (SEQ ID NO: 7).

[00040] Marcadores genéticos adicionais podem ser utilizados em combinação com os marcadores fornecidos na tabela 1 e/ou tabela 2 ou independentemente dos marcadores fornecidos na tabela 1 e/ou tabela 2 para pôr em prática os métodos da presente invenção. Bancos de dados de marcador disponíveis ao público dos quais marcadores úteis podem ser obtidos incluem, porém não são limitados a, soybase.org web site na Internet (World Wide Web) que é administrado pela United States Agricultural Research Service, the United States Department of Agriculture, e Iowa State University. Marcadores de soja adicionais que podem ser utilizados e que foram descritos na literatura incluem, porém não são limitados a, Hyten e outros., BMC Genomics. 11:38, 2010; Choi e outros., Genetics. 176(1):685-96, 2007; Yoon e outros., Theor Appl Genet. 2007 Mar;114(5):885-99; e Hyten e outros. Crop Sei. 2010 50: 960-968. Dada a provisão aqui de uma região genômica no grupo de ligação L (cromossomo 19) delimitado ou flanqueado pelo local próximo telômero BG406195 (SEQ ID NO: 13) da Tabela 2 e o local próximo centrômero BU082700 (SEQ ID NO: 14) da Tabela 2 bem como uma variedade de germoplasmas de soja apresentando um fenótipo de "flash amarelo" ou "sem flash", marcadores adicionais localizados em ou perto dessa região genômica que são associados a esses fenótipos podem ser obtidos por tipificar meramente os novos marcadores nos vários germoplasmas fornecidos aqui. A região genômica no grupo de ligação L (cromossomo 19) delimitado ou flanqueado pelo local próximo telômero BG406195 (SEQ ID NO: 13) da Tabela 2 e o local próximo centrômero BU082700 (SEQ ID NO: 14) da Tabela 2 também pode ser mapeado em relação a marcadores fornecidos em qualquer mapa genético ou físico de soja disponível ao público ou outro para colocar esse local genético naquele mapa.

IV. Identificação de plantas que apresentam o fenótipo "flash"ou "sem flash"

[00041] Para observar a presença ou ausência dos fenótipos "Flash amarelo" ou "sem flash", plantas de soja transgênica compreendendo um transgene que confere tolerância a glifosato são tipicamente expostas em estágios de crescimento vegetative inicial ou médio a uma ou mais doses elevadas de glifosato. Doses típicas de glifosato que podem eliciar um fenótipo de flash amarelo podem variar de aproximadamente taxa de aplicação de rótulo de 2 vezes de uma formulação de glifosato comercialmente disponível a aproximadamente uma taxa de aplicação de rótulo de 3 vezes de uma formulação de glifosato comercialmente disponível. Em termos de equivalentes de ácido de ácido glifosato aplicado, doses típicas de glifosato que podem eliciar um fenótipo de flash amarelo podem variar de uma taxa de aplicação de aproximadamente 1,5 libras de ácido equivalente por acre (aproximadamente 1,68 quilogramas por hectare) de ácido glifosato a aproximadamente 2,25 libras de ácido equivalente por acre (isto é, aproximadamente 2,52 quilogramas por hectare) de ácido glifosato quando as quantidades indicadas de ácido glifosato são fornecidas em uma formulação de glifosato comercialmente disponível ou quando as quantidades indicadas de ácido glifosato são fornecidas em uma formulação similar apropriada para aplicação a culturas tolerantes a glifosato. Formulações de glifosato comercialmente disponíveis que podem ser utilizadas incluem, porém não são limitadas a, Roundup Original MAX®, Roundup PowerMAX®, Roundup UltraMax®, ou RoundUp WeatherMAX® (Monsanto Co., St. Louis, MO., USA); Touchdown IQ® ou Touchdown Total® (Syngenta, Wilmington, Delaware, USA); Glyphomax®, Glyphomax Plus®, ou Glyphomax XRT® (Dow Agrosciences LLC, Indianapolis, IN, USA). Em certas modalidades, a formulação de glifosato comercialmente disponível utilizada é RoundUp WeatherMAX®. Em certas modalidades, as doses de glifosato que podem eliciar um fenótipo de flash amarelo podem variar de uma taxa de aplicação de 2 vezes de aproximadamente 42,6 onças por acre de Roundllp WeatherMax® (1,68 quilogramas por hectare) até aproximadamente 63,9 onças por acre de Roundllp WeatherMax® (isto é, aproximadamente 2.52 quilogramas por hectare).

[00042] O fenótipo de flash amarelo pode ser observado aproximadamente uma semana após aplicação de herbicida em certas variedades de soja compreendendo o transgene que confere tolerância a glifosato. Glifosato é tipicamente aplicado durante estágios de crescimento vegetative. Em certas modalidades desses métodos, glifosato pode ser aplicado em intervalos semanais (isto é, uma vez por semana) para quaisquer de 2, 3, 4 ou mais semanas sucessivas para marcar a presença do fenótipo de flash amarelo. Em certas modalidades, plantas de soja aproximadamente no estágio de desenvolvimento vegetative V3 - V4 são expostas a uma pulverização inicial de glifosato seguida por três pulverizações subsequentes em intervalos semanais. A primeira pulverização pode ser baseada no estágio de crescimento e as pulverizações restantes foram programadas em intervalos de 7 dias após a pulverização inicial. Como discutido aqui, os estágios vegetativos de soja são como a seguir: VE (emergência), VC (estágio de cotilédone), V1 (primeira folha trifoliada), V2 (segunda folha trifoliada), V3 (terceira folha trifoliada), V(n) (na folha trifoliada) e V6 (florescimento logo começará). Uma descrição dos estágios vegetativos de soja pode ser encontrada no world wide web (internet) em ag.ndsu.edu/pubs/plantsci/rowcrops/a1174/a1174w.htm (North Dakota State University publicação A-1174, Junho de 1999, examinado e reimpresso em agosto de 2004). A expressão do traço de flash amarelo também pode ser influenciada por temperatura, onde o traço em variedades que exibem o fenótipo de flash amarelo é mais acentuado após tratamento em temperaturas de aproximadamente 32 graus Celsius ou mais.

[00043] Uma escala de classificação que avalia o grau de flash amarelo também pode ser empregada para identificar plantas com "flash" e "sem flash". Uma escala exemplar e não limitadora para avaliar o fenótipo de flash amarelo é como a seguir, onde os números baixos correspondem a fenótipo "sem flash" e os números elevados correlacionam a um fenótipo de "flash": 1: verde - sem amarelecimento 2: na maior parte verde, muito pouco amarelo < 5% (1-2 plantas com um pouco de amarelo) 3: 5-10% de plantas com amarelecimento 4: 11-20% plantas com amarelecimento 5: 21-35% plantas com amarelecimento 6: 36-50% plantas com amarelecimento 7: 51-65% plantas com amarelecimento 8: 66-80% plantas com amarelecimento, um pouco de necrose 9: 81-100% plantas com amarelecimento e/ou necrose

V. Introqressão ode uma região genômica associada a um fenótipo sem flash

[00044] São também fornecidos aqui germoplasma de soja exclusivos compreendendo uma região genômica introgredida que é associada a um fenótipo sem flash e métodos de obter o mesmo. Introgressão auxiliada por marcador envolve a transferência de uma região cromossômica, definida por um ou mais marcadores, de um germoplasma opera um segundo germoplasma. O produto de um cruzamento que contém a região genômica introgredida pode ser identificado pela combinação de marcadores característicos da região genômica introgredida desejada de um primeiro germoplasma (isto é, como um germoplasma sem flash) e marcadores tanto ligados como não ligados característicos de background genético desejado de um segundo germoplasma (isto é, um germoplasma de flash amarelo). Além dos marcadores fornecidos aqui que identificam alelos de região genômica que é associada a um fenótipo sem flash, marcadores de flanquear que estão compreendidos na extremidade próxima telômero da região genômica no grupo de ligação L (cromossomo 19) e na extremidade próxima centromere da região genômica de grupo de ligação L (cromossomo 19) são também fornecidos nas tabelas 1 e 2. Tais marcadores de flanquear são úteis em uma variedade de esforços de produção que incluem, porém não são limitados a, introgressão da região genômica associada a um fenótipo sem flash em um background genético compreendendo marcadores associados à germoplasma que contém comumente as formas alélicas da região genômica que é associada a um fenótipo de "flash amarelo". Marcadores de flanquear próximo telômero que podem ser utilizados nesses métodos incluem, porém não são limitados a, M0205928 (SEQ ID NO: 3) e/ou polimorfismos em quaisquer dos locais listados na tabela 2 do relatório descritivo localizada entre a base de partida 16426 (a base próxima telômero) de local asmbl_11856 e base de partida 107039 do local BG406195. Tais polimorfismos podem ser identificados por sequenciar locais de germoplasmas de flash e sem flash. Marcadores de flanquear próximos centrômero que podem ser utilizados nesses métodos incluem, porém não são limitados a, M0202715 (SEQ ID NO: 9), M0206286 (SEQ ID NO: 10), M0206054 (SEQ ID NO: 11), e M0205375 (SEQ ID NO: 12). Marcadores adicionais localizados no grupo de ligação L (cromossomo 19) e outros cromossomos são revelados na publicação de pedido de patente US 20090208964. Bancos de dados de marcador disponíveis ao público dos quais marcadores úteis adicionais localizados no grupo de ligação L (cromossomo 19) e outros cromossomos podem ser obtidos incluem, porém não são limitados a, soybase.org web site na internet que é administrado pelo United States Agricultural Research Service, the United States Department of Agriculture, e Iowa State University. Plantas de soja ou germoplasma compreendendo uma região genômica introgredida que é associada a um fenótipo sem flash em que pelo menos 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, ou 99% das sequências genômicas restantes carregam marcadores características de plantas de soja ou germoplasma que são de outro modo ou comumente compreendem uma região genômica associada ao fenótipo de flash amarelo são desse modo fornecidos.

VI. Plantas de soja que compreendem região genômica associada aos fenótipos de flash e sem flash e transgenes gue conferem tolerância a glifosato

[00045] Uma lista exemplar e não limitadora de plantas de soja que compreendem regiões genômicas associadas a um fenótipo de flash ou sem flash é fornecida aqui na Tabela 3. Tabela 3. Variedades de soja compreendendo uma região genômica associada a um fenótipo sem flash ou com flash

1Nomes de marca da Asgrow® (designada "AG") e variedades de soja DEKALB® da Monsanto Co. 800 N. Lindbergh Blvd., St. Louis, MO, USA. 2números de depósito de semente disponíveis através da American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, Va., USA, 20110-2209.

[00046] São também fornecidas aqui plantas de soja adicionais que compreendem uma região genômica associada a um fenótipo com flash ou sem flash que são identificadas pelo uso dos marcadores fornecidos na tabela 1 e/ou tabela 2 e/ou métodos fornecidos aqui. Quaisquer das plantas de soja identificadas na tabela 3 ou outras plantas de soja que são de outro modo identificadas utilizando os marcadores ou métodos fornecidos aqui podem ser utilizadas em métodos que incluem, porém não são limitados a, métodos de obter plantas de soja com um local sem flash introgredido, obter uma planta de soja que apresenta um fenótipo sem flash, ou obter uma planta de soja compreendendo em seu genoma uma região genética associada a um fenótipo sem flash.

[00047] Em certas modalidades, as plantas de soja fornecidas aqui ou utilizadas nos métodos fornecidos aqui podem compreender um transgene que confere tolerância a glifosato. Transgenes que podem conferir tolerância a glifosato incluem, porém não são limitados a, transgenes que codificam enzimas EPSPS (sintases de 5- enolipiruvilshiquimato-3-fosfato) classe I tolerantes a glifosato ou enzimas EPSPS (sintases de 5-enolipiruvilshiquimato-3-fosfato) classe II tolerantes a glifosato. Enzimas EPSPS tolerantes a glifosato úteis fornecidas aqui são reveladas em US 6.803.501, RE39.247, US 6.225.114, US 5.188.642 e US 4.971.908. Em certas modalidades, as plantas de soja tolerantes a glifosato podem compreender um transgene que codifica um oxidorreductase de glifosato ou outra enzima que degrada glifosato. Enzimas de oxidorreductase de glifosato tinham sido descritas na patente US 5.776.760e patente de reexpedição US RE 38.825. em certas modalidades a planta de soja pode compreender um transgene que codifica um gene de N-acetil transferase de glifosato que confere tolerância a glifosato. Em certas modalidades, a planta de soja pode compreender um transgene de codificação de n-acetil transferase glifosato como aqueles descritos na patente US 7.666.644. Ainda em outras modalidades, plantas de soja compreendendo combinações de transgenes que conferem tolerância a glifosato são fornecidas. Plantas de soja compreendendo tanto EPSPS resistente a glifosato como um N- acetitransferease de glifosato são também fornecidas aqui. Em certas modalidades, considera-se que as plantas de soja utilizadas aqui podem compreender uma ou mais inserção(ões) genômica(s) específicas de um transgene tolerante a glifosato incluindo, porém não limitado a, como aquelas encontradas em: i) soja MON89788 (depositado sob o número de acessão ATCC PTA-6708 e descrito na publicação do pedido de patente US número 20100099859), ii) soja GTS 40-3-2 (Padgette e outros., Crop Sei. 35: 1451-1461, 1995), iii) evento soja 3560.4.3.5 (semente depositada de acordo com o número de acessão ATCC PTA- 8287 e descrita na publicação de patente US 20090036308), ou qualquer combinação de i (soja de MON89788), ii (soja de GTS 40-3-2), e iii (evento soja 3560.4.3.5).

[00048] Em certas modalidades, considera-se que ensaios genotípicos que fornecem identificação não destrutiva da planta ou plantas podem ser realizados em semente, o estágio de emergência, o estágio "VC" (isto é, cotilédones não dobrados), o estágio VI (aparição do primeiro nó e folhas unifoliadas), o estágio V2 (aparição da primeira folha trifoliada), e posteriormente. Em certas modalidades, ensaios genotípicos não destrutivos são realizados em semente utilizando aparelhos e métodos associados como descrito nas patentes US 6.959.617; 7.134.351; 7.454.989; 7.502.113; 7.591.101; 7.611.842; e 7.685.768, que são aqui incorporadas a título de referência nas íntegras. Em certas modalidades, ensaios genotípicos não destrutivos são realizados em sementes utilizando aparelhos e métodos associados como descrito nas publicações do pedido de patente 20100086963, 20090215060, e 20090025288, que são incorporadas aqui a título de referência na íntegra. Os pedidos de patente US publicados US 2006/0042527, US 2006/0046244, US 2006/0046264, US 2006/0048247, US 2006/0048248, US 2007/0204366, e US 2007/0207485, que são aqui incorporados a título de referência na íntegra, também revelam aparelho e sistemas para a amostragem automatizada de sementes bem como métodos de amostragem, teste e volume de sementes. Desse modo, em certas modalidades, quaisquer dos métodos fornecidos aqui podem compreender classificar marcadores em sementes individuais de uma população onde somente semente com pelo menos um genótipo de interesse é avançado.

VII. Técnicas de produção auxiliadas moleculares

[00049] Marcadores genéticos que podem ser utilizados na prática da presente invenção incluem, porém não são limitados a, Polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), polimorfismos de comprimento de fragmento amplificado (AFLP), repetições de sequência simples (SSR), polimorfismos de nucleotídeo único (SNP), polimorfismos de inserção/deleção (Indels), repetições tangem de número variável (VNTR), e DNA polimórfico amplificado aleatório (RAPF) e outros conhecidos por aqueles versados na técnica. A descoberta e desenvolvimento de marcador em culturas provêem a estrutura inicial para aplicações para atividades de produção auxiliadas por marcador (pedidos de patente US 2005/0204780, 2005/0216545, 2005/0218305, e 2006/00504538). O "mapa genético" resultante é a apresentação da posição relativa de locais caracterizados (marcadores de DNA ou qualquer outro local para o qual alelos podem ser identificados) ao longo dos cromossomos. A medição de distância nesse mapa é relativa à frequência de eventos de cruzamento entre cromátides irmãs em meiose.

[00050] Como conjunto, marcadores polimórficos servem como uma ferramenta útil para fazer a impressão de plantas para informar o grau de identidade de linhagens ou variedades (patente US 6.207.367). esses marcadores formam a base para determinar associações com fenótipo e podem ser utilizados para acionar ganho genético. A implementação de seleção auxiliada por marcador depende da capacidade de detectar diferenças genéticas subjacentes entre indivíduos.

[00051] Certos marcadores genéticos para uso na presente invenção incluem marcadores "dominantes" ou "codominantes". "Marcadores codominantes" revelam a presença de dois ou mais alelos (dois por indivíduo diplóide). "Marcadores dominantes" revelam a presença de somente um único alelo. A presença do fenótipo de marcador dominante (por exemplo, uma faixa de DNA) é uma indicação de que um alelo está presente na condição homozigota ou heterozigota. A ausência do fenótipo de marcador dominante (por exemplo, ausência de uma faixa de DNA) é meramente evidência de que "algum outro" alelo indefinido está presente. No caso de população onde indivíduos são predominantemente homozigotos e locais são predominantemente dimórficos, marcadores dominantes e codominantes podem ser igualmente valiosos. À medida que as populações se tornam mais heterozigotas e multialélicas, marcadores codominantes frequentemente se tornam mais informativos do genótipo do que marcadores dominantes.

[00052] Em outra modalidade, marcadores que incluem, porém não são limitados a marcadores de repetição de sequência única (SSR), marcadores RFLP, marcadores RAPD, marcadores fenotípicos, marcadores de isozima, polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), inserções ou deleções (INdels), polimorfismos de característica única (SFPs, por exemplo, como descrito em Borevitz e outros 2003 Gen Res. 13:513-523), perfis de transcrição de microconjunto, sequências derivadas de DNA, e sequências derivadas de RNA que são geneticamente ligadas a locais sem flash, e/ou regiões que são não ligadas a locais sem flash podem ser utilizadas em certas modalidades da presente invenção.

[00053] Em uma modalidade, análises baseadas em ácido nucleico para determinar a presença ou ausência do polimorfismo genético (isto é, para genotipagem) podem ser utilizadas para a seleção de sementes em uma população de produção. Uma ampla variedade de marcadores genéticos para a análise de polimorfismos genéticos é disponível e conhecida por aqueles versados na técnica. A análise pode ser utilizada para seleção para genes, porções de genes, QTL, alelos, ou regiões genômicas (Genótipos) que compreendem ou são ligados a um marcador genético que é ligado a ou correlacionado com locais sem flash, regiões flanqueando locais sem flash, regiões ligadas a locais sem flash, e/ou regiões que são não ligadas a locais sem flash podem ser utilizadas em certas modalidades da presente invenção.

[00054] Aqui, métodos de análise de ácido nucleico incluem, porém não são limitados a, métodos de detecção baseados em PCR (por exemplo, ensaios TaqMan), métodos de microconjunto, métodos baseados em espectrometria de massa e/ou métodos de sequenciamento de ácido nucleico. Em uma modalidade, a detecção de sítios polimórficos em uma amostra de DNA, RNA ou cDNA pode ser facilitada através do uso de métodos de amplificação de ácido nucleico. Tais métodos aumentam especificamente a concentração de polinucleotídeos que cobrem o sítio polimórfico, ou incluem aquele sítio e sequências localizadas distais ou próximas ao mesmo. Tais moléculas amplificadas podem ser prontamente detectadas por eletroforese de gel, métodos de detecção de fluorescência ou outros meios.

[00055] Um método de obter tal amplificação emprega a reação de cadeia de polimerase (PCR) (Mullis e outros. 1986 Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273; patente européia 50,424; patente européia 84.796; patente européia 258.017; patente européia 237.362; patente europeia 201.184; patente US 4.683.202; patente US 4.582.788; e patente US 4.683.194), utilizando pares de iniciador que são capazes de hibridizar com as sequências próximas que definem um polimorfismo em sua forma de fita dupla.

[00056] Os métodos para tipificar DNA com base em espectrometria de massa também podem ser utilizados. Tais métodos são revelados nas patentes US 6.613.509 e 6.503.710, e referências encontradas nas mesmas.

[00057] Polimorfismos em sequências de DNA podem ser detectados ou tipificados por uma variedade de métodos eficazes bem conhecidos na técnica incluindo, porém não limitado aqueles revelados nas patentes US 5.468.613; 5.217.863; 5.210.015; 5.876.930; 6.030.787; 6.004.744; 6.013.431; 5.595.890; 5.762.876; 5.945.283; 5.468.613; 6.090.558; 5.800.944; 5.616.464; 7.312.039; 7.238.476; 7.297.485; 7.282.355; 7.270.981 e 7.250.252 todos os quais são incorporados aqui a título de referência na íntegra. Entretanto, as composições e métodos da presente invenção podem ser utilizadas em combinação com qualquer método de tipificação de polimorfismo para tipificar polimorfismos em amostras de DNA genômicas. Essas amostras de DNA genômicas utilizadas incluem, porém não são limitados a DNA genômico isolado diretamente de uma planta, DNA genômico clonado ou DNA genômico amplificado.

[00058] Por exemplo, polimorfismos em sequências de DNA podem ser detectados por hibridização com sondas de oligonucleotídeo específicos de alelo (ASO) como revelado nas patentes US 5.468.613 e 5.217.863. A patente US 5.468.613 revela hibridizações de oligonucleotídeo específico de alelo onde variações de nucleotídeo único ou múltiplo em sequência de ácido nucleico podem ser detectadas em ácidos nucleicos por um processo no qual a sequência contendo a variação de nucleotídeo é amplificada, marcada em uma membrana e tratada com uma sonda de oligonucleotídeo específico de sequência rotulada.

[00059] Sequência de ácido nucleico alvo pode ser também detectada por métodos de ligação de sonda como revelado na patente US 5.800.944 onde a sequência de interesse é amplificada e hibridizada com sondas seguido por ligação para detectar uma parte rotulada da sonda.

[00060] Microconjuntos também podem ser utilizados para detecção de polimorfismo, em que conjuntos de sonda de oligonucleotídeo são montados em um modo de sobreposição para preparar uma sequência única de tal modo que uma diferença na sequência alvo em um ponto resultaria em hibridização de sonda parcial (Borevitz e outros., Genome Res. 13:513-523 (2003); Cui e outros., Bioinformatics 21:3852-3858 (2005). Em qualquer microconjunto espera-se que haja uma pluralidade de sequências alvo que podem representar genes e/ou regiões de não codificação em que cada sequência alvo é representada por uma série de oligonucleotídeos de sobreposição, em vez de por uma única sonda. Essa plataforma provê produtividade elevada que classifica uma pluralidade de polimorfismos. Um polimorfismo de característica única (SFP) é um polimorfismo detectado por uma sonda única em um conjunto de oligonucleotídeo, em que uma característica é uma sonda no conjunto a tipificação de sequências alvo por métodos baseados em microconjunto é revelada nas patentes US 6.799.122; 6.913.879; e 6.996.476.

[00061] Sequência de ácido nucleico alvo também pode ser detectada por métodos de ligação de sonda como revelado nas patentes US 5.616.464, empregando pelo menos um par de sondas tendo sequências homólogas a porções adjacentes da sequência de ácido nucleico alvo e tendo cadeias laterais que se ligam não covalentemente para formar uma haste após emparelhamento de base das sondas com a sequência de ácido nucleico alvo. Pelo menos uma das cadeias laterais tem um grupo fotoativável que pode formar uma reticulação covalente com o outro membro de cadeia lateral da haste.

[00062] Outros métodos de detectar SNPs e Indels incluem métodos de extensão de base única (SBE). Os exemplos de métodos SBE incluem, porém não são limitados aqueles revelados nas patentes US 6.004.744; 6.013.431; 5.595.890; 5.762.876; e 5.945.283. Métodos de SBE são baseados em extensão de um iniciador de nucleotídeo que é adjacente a um polimorfismo para incorporar um resíduo de nucleotídeo detectável após extensão do iniciador. Em certas modalidades, o método SBE utiliza três oligonucleotídeos sintéticos. Dois dos oligonucleotídeos servem como iniciadores PCR e são complementares à sequência do local de DNA genômico que flanqueia uma região contendo o polimorfismo a ser ensaiado. Após amplificação da região do genoma contendo o polimorfismo, o produto PCR é misturado com o terceiro oligonucleotídeo (chamado um iniciador de extensão) que é projetado para hibridizar com o DNA amplificado adjacente ao polimorfismo na presença de polimerase de DNA e dois dideoxinucleosideotrifosfatos rotulados diferencialmente. Se o polimorfismo estiver presente no gabarito, um dos dideoxinucleosideotrifosfatos rotulados pode ser adicionado ao iniciador em uma extensão de cadeia de base única. O alelo presente é então inferior por determinar qual dos dois rótulos diferenciais foi adicionado ao iniciador de extensão. Amostras homozigotas resultarão em somente uma das duas bases rotuladas sendo incorporada e desse modo somente um dos dois rótulos será detectado. Amostras heterozigotas têm ambos os alelos presentes, e desse modo orientarão incorporação dos dois alelos (em moléculas diferentes do iniciador de extensão) e desse modo os dois rótulos serão detectados.

[00063] Em outro método para detectar polimorfismos, SNPs e Indels podem ser detectados por métodos revelados nas patentes US 5.210.015; 5.876.930; e 6.030.787 nas quais uma sonda de oligonucleotídeo tendo um corante repórter fluorescente 5’ e um corante resfriador 3’ covalentemente ligado às extremidades 5’ e 3’ da sonda. Quando a sonda está intacta, a proximidade do corante repórter ao corante resfriador resulta na supressão da fluorescência de corante reporte, por exemplo, por transferência de energia do tipo Forster. Durante PCR iniciadores avançado e inverso hibridizam com uma sequência específica do DNA alvo que flanqueia um polimorfismo enquanto a sonda de hibridização hibridiza com a sequência contendo polimorfismo no produto PCR amplificado. No ciclo de PCR subsequente polimerase DNA com 5’ 3’ atividade de exonuclease cliva a sonda e separa o corante reporte do corante resfriador resultando em fluorescência aumentada do repórter.

[00064] Em outra modalidade, o local ou locais de interesse podem ser diretamente sequenciados utilizando tecnologias de sequenciamento de ácido nucleico. Os métodos para sequenciamento de ácido nucleico são conhecidos na técnica e incluem tecnologias fornecidas por 454 Life Sciences (Branford, CT), Agencourt Bioscience (Beverly, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA), LI-COR Biosciences (Lincoln, NE), NimbleGen Systems (Madison, Wl), Illumina (San Diego, CA), e VisiGen Biotechnologies (Houston, TX). Tais tecnologias de sequenciamento de ácido nucleico compreendem formatos como conjuntos de conta paralela, sequenciamento por ligação, eletroforese capilar, microchips eletrônicos, "biochips", microconjuntos, microchips paralelos, e conjuntos de molécula única, como examinado por R.F. Service Science 2006 311:1544-1546.

[00065] Os marcadores a serem utilizados nos métodos da presente invenção dêem ser preferivelmente diagnósticos de origem para inferências a serem feitas sobre populações subsequentes. A experiência até a presente data sugere que marcadores SNP podem ser ideais para mapeamento devido à probabilidade de que um alelo SNP específico é derivado de origens independentes nas populações existentes de uma espécie específica ser muito baixa. Como tal, marcadores SNP parecem ser úteis para rastrear e auxiliar introgressão de QTLs, particularmente no caso de Genótipos.

Exemplos

[00066] Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar modalidades preferidas da invenção. Deve ser reconhecido por aqueles versados na técnica que as técnicas reveladas nos exemplos que seguem representam técnicas descobertas pelo inventor para funcionar bem na prática da invenção, e desse modo podem ser consideradas como constituindo modos preferidos para sua prática. Entretanto, aqueles versados na arte devem, à luz da presente revelação, apreciar que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas que são reveladas e ainda obter um resultado semelhante ou similar sem se afastar do espírito e escopo da invenção.

Exemplo 1. Identificação de um local associado a flash amarelo

[00067] Em experimentos de rendimento sendo conduzidos em Thomasboro, IL em agosto de 2003, foi observado que algumas linhagens de soja F3:5 do pedigree A3525/DKB31-51 (que continha um transgene que confere tolerância a glifosato e apresentou flash amarelo quando pulverizado com glifosato (isto é, Roundllp WeatherMax® enquanto outras linhagens do mesmo pedigree mostraram tolerância a glifosato e nenhum sintoma de flash amarelo. Experimentos de repetição conduzidos em 2004 produziram resultados similares em 130 linhagens F3:6 em experimentos de rendimento conduzidos em Hopedale, IL. A3525 é uma variedade de soja Asgrow® comercialmente disponível e também é conhecida sob o nome de variedade SN70025. DKB31-51 é descrito na patente US 6.346.658 e amostras dessa semente foram depositadas anteriormente sob o número de acessão ATCC PTA-3871.

[00068] Cinquenta e três linhagens foram categorizadas como "Flash" ou "sem flash" com o restante do material estando compreendido entre os extremos.

[00069] As cinquenta e três linhagens categorizadas em 2004 foram plantadas em Covell, IL em 2005 e foram pulverizadas com RoundUp WeatherMax® em uma taxa de aproximadamente 42 onças/acre em uma base semanal começando aproximadamente no estágio V3 a V4 por até quatro semanas, desse modo em certos casos obtendo uma taxa total de exposição à glifosato de uma duração de 4 semanas de aproximadamente 168 onças/acre. Amostras de tecido foram coletadas de uma planta individual de cada de quinze linhagens que demonstraram o flash amarelo mais severo e quinze que não mostraram sintomas. A tabela 4 mostra o histórico de produção e teste dos materiais utilizados nesse estudo.

SPS: seleção de planta única. Prow: fileira de progénie. PRYT: experimento de rendimento de fileira de progénie.

Exemplo 2: identificação de marcadores moleculares que são associados a um fenótipo de "flash amarelo".

[00070] Para identificar o marcador associado a sintoma de flash amarelo, utilizamos uma abordagem de "Varredura de genoma". Quinze amostras de linhagens que não mostram flash e 15 amostras de linhagens com flash severo foram coletadas de uma população de segregação (F3:6). DNA foi extraído dessas 30 amostras e utilizado com gabarito para classificar um conjunto de 2746marcadores SNP que fornecem uma cobertura de densidade elevada de todo o genoma de soja com dois marcadores aproximados por Unidade CentiMorgan (cM). Marcações alélicas em cada marcador foram coletadas e comparadas através de 30 linhagens. Dos 2746 marcadores testados, 776 estavam segregando e 226 eram heterozigotos. Dois marcadores, MO102027 e MO101742, mostraram claramente um alelo sem flash e outro alelo em amostras de flash (tabela 5), indicando uma ligação entre esses dois marcadores e os fenótipos. Ter 15 plantas mostrando o mesmo alelo e o mesmo fenótipo por acaso é muito baixo (1/215). Portanto, isso não podia ser explicado por um evento aleatório. Um terceiro marcador, M0129138, mostra um alelo nas linhagens de flash e outro alelo em 14 de 15 linhagens sem flash, indicando uma ligação desse marcador com os fenótipos flash. M0101742 e M0129138 acabaram sendo mapeados no mesmo local cromossômico sem recombinação na população de mapeamento. Outros dados que apoiam a ligação são que todas as sete variedades comerciais com fenótipos de flash conhecidos casaram perfeitamente com os dados alélicos nos dois marcadores. Tabela 5. Genótipos para fenótipos de flash amarelo

Exemplo 3. Análise do qenótipo de variedades de soja e fenótipo de flash amarelo

[00071] Aproximadamente 1.700 variedades de soja (linhagens) foram ensaiadas ou tipificadas em relação à presença ou ausência de variantes alélicos dos marcadores M0101742 (SEQ ID NO: 5), M0129138 (SEQ ID NO: 4), M0093116 (SEQ ID NO: 6), e M0129925 (SEQ ID NO: 7). Dessas linhagens, marcações completas para todos os quatro marcadores foram obtidas em 844 linhagens. Um sumário dos genótipos observados nessas 844 linhagens é fornecido na tabela 6.

1 O genótipo de uma linhagem é mostrado como N1N2N3N4N5N6N7N8, onde pode ser A, T, G, ou C dependendo da posição e linhagem e onde N1 é nucleotídeo, N2 é nucleotídeo 2, N3 é nucleotídeo 3, N4 é nucleotídeo 4, N5 é nucleotídeo 5, N6 é nucleotídeo 6, N7 é nucleotídeo 7, e N8 é nucleotídeo 8.0 genótipo representa as formas alélicas tanto paternal como maternal dos marcadores M0101742 (SEQ ID NO: 5; posição 1206; nucleotídeos 1 e 2 no genótipo mostrado), M0129138 (SEQ ID NO: 4; posição 218; nucleotídeos 3 e 4 no genótipo mostrado), M0093116 (SEQ ID NO: 6; posição 183; nucleotídeos 5 e 6 no genótipo mostrado), e M0129925 (SEQ ID NO: 7; posição 328; nucleotídeos 3 e 4 no genótipo mostrado). Desse modo, o genótipo "TTGGAACC" significa que a linhagem é "TT" para contribuições paternal e maternal para o polimorfismo M0101742, "GG" para contribuições paternal e maternal para o polimorfismo M0129138, "AA" para contribuições paternal e maternal para o polimorfismo M0129116, e "CC" contribuições paternal e maternal para o polimorfismo M0129925.

[00072] Sessenta 63 variedades de soja foram subsequentemente selecionadas de vários grupos de genótipo e testadas em relação a flash amarelo essencialmente como descrito no exemplo 1 (isto é, foram pulverizados com Roundup WeatherMax® em taxas de aproximadamente 42 onças/acre em uma base semanal começando aproximadamente no estágio V3 a V4 por até quatro semanas, desse modo em certos casos obtendo uma taxa total de exposição a glifosato de uma duração de 4 semanas de aproximadamente 168 onças/Acre). Os resultados dessas análises são fornecidos na tabela 7.

[00073] O genótipo representa as formas alélicas tanto paterna como maternal dos marcadores M0101742 (SEQ ID NO:5 posição 1206), M0129138 (SEQ ID NO:4, posição 218), M0093116 (SEQ ID NO:6; posição 183), e M0129925 (SEQ ID NO:7, posição 328). Escala de classificação de flash: 1: verde - sem amarelecimento 2: na maior parte verde, amarelecimento muito leve <5% (1- 2 plantas com um pouco de amarelecimento) 3: 5-10% plantas com amarelecimento 4: 11-20% plantas com amarelecimento 5: 21-35% plantas com amarelecimento 6: 36-50% plantas com amarelecimento 7: 51-65% plantas com amarelecimento 8: 66-80% plantas com amarelecimento, um pouco de necrose 9: 81-100% plantas com amarelecimento e/ou necrose

[00074] Para predição ótima de fenótipo de flash amarelo, todos os quatro marcadores (M0101742, M0129138, M0093116, e M0129925) podem ser utilizados. Entretanto, pode-se obter capacidade de previsão elevada somente com dois marcadores, M0101742 e M0129925. Com base em informações de pegada, esses dois marcadores identificariam dois genótipos: CCAAAACC e CCAATTCC. CCAAAACC é o genótipo previsto para plantas que apresentam flash amarelo (193/844 variedades classificadas com base em análise de pegada). CCAATTCC é um genótipo adicional que somente representou 9/844 variedades com base em dados de pegada. Todas as 9 variedades compreendendo o genótipo CCAATTCC foram Introduções de Planta (Pls). Como utilizado aqui em referência à soja, Introduções de Planta (Pis) se refere a maioria de germoplasmas típicos que não foram submetidos a aperfeiçoamentos de produção. Por exemplo, Pis são linhagens incluídas que não foram obtidas por intercruzamento seguido por seleção. Pis podem incluir também linhagens obtidas de sementes ou propágulos vegetativos de plantas que foram introduzidas de outro país. Portanto, os dois marcadores M0101742 e M0129925 poderiam distinguir entre os três genótipos mais comuns observados: CCAAAACC (associado a um fenótipo de flash amarelo), TTGGAACC (associado a um fenótipo não flash) e CCAATTGG (associado a um fenótipo não flash). Mais especificamente onde M0101742 é CC e M0129925 é CC, seria previsto que a maioria das linhagens de soja desse modo identificadas, e que foram obtidas de, ou relacionadas a, variedades analisadas nesse exemplo, teriam um fenótipo de flash amarelo.

Exemplo 4. Genótipos e fenótipos de várias variedades comerciais

[00075] Em testes de campo realizados em 2006, diversas variedades comerciais foram genotipificadas com os marcadores M0101742 (SEQ ID NO: 5), M0129138 (SEQ ID NO: 4), M0093116 (SEQ ID NO: 6), e M0129925 (SEQ ID NO: 7) e expostos a glifosato para testar em relação à presença ou ausência do fenótipo de flash amarelo essencialmente como descrito no exemplo 1 (isto é, foram pulverizados com Roundup WeatherMax® em uma taxa de aproximadamente 42 onças/acre em uma base seminal começando aproximadamente no estágio V3 a V4 por até quatro semanas, desse modo em certas casos obtendo uma taxa total de exposição a glifosato de uma duração de 4 semanas de aproximadamente 168 onças/acre). Os resultados dessa análise são fornecidos na tabela 8.

Exemplo 5: Ensaios de marcador exemplares para detectar polimorfismos

[00076] Em uma modalidade, a detecção de sítios polimórficos em uma amostra de DNA, RNA ou cDNA pode ser facilitada através do uso de métodos de amplificação de ácido nucleico. Tais métodos aumentam especificamente a concentração de polinucleotídeos que cobrem o sítio polimórfico, ou incluem aquele sítio e sequências localizadas distais ou próximas do mesmo. Tais moléculas amplificadas podem ser prontamente detectadas por eletroforese de gel, métodos de detecção de fluorescência ou outros meios. Iniciadores exemplares e sondas para amplificar e detectar regiões genômicas associadas a um fenótipo sem flash são dadas na tabela 9.

Exemplo 6: Sondas de oligonucleotídeo úteis para detectar polimorfismos por métodos de extensão de base única

[00077] Oligonucleotídeos podem ser também utilizados para detectar ou tipificar os polimorfismos revelados aqui por métodos de detecção SNP baseados em extensão de base única (SBE). Oligonucleotídeos exemplares para uso em detecção de SNP baseado em SBE são fornecidos na tabela 10. Métodos SBE são baseados em extensão de um iniciador de nucleotídeo que é hibridizado com sequências adjacentes a um polimorfismo para incorporar um resíduo de nucleotídeo detectável após extensão do iniciador. Também é previsto que o método SBE pode utilizar três oligonucleotídeos sintéticos. Dois dos oligonucleotídeos servem como iniciadores PCR e são complementares à sequência do local que flanqueia uma região contendo o polimorfismo a ser ensaiado. Iniciadores de PCR exemplares que podem ser utilizados para tipificar polimorfismos revelados nessa invenção são fornecidos na tabela 4 nas colunas rotuladas "Iniciador avançado SEQ ID"e "Iniciador inverso SEQ ID". Após amplificação da região contendo o polimorfismo, o produto PCR é hibridizado com um iniciador de extensão que anela ao DNA amplificado adjacente ao polimorfismo. Polimerase de DNA e dois trifosfatos de dideoxinucleosídeo diferencialmente rotulados são então fornecidos. Se o polimorfismo estiver presente no gabarito, um dos trifosfatos de dideoxinucleosídeo rotulados pode ser adicionado ao iniciador em uma extensão de cadeia de base única. O alelo presente é então inferido por determinar qual dos dois rótulos diferenciais foi adicionado ao iniciador de extensão. Amostras homozigotas resultarão em somente uma das duas bases rotuladas sendo incorporada e desse modo somente um dos dois rótulos será detectado. Amostras heterozigotas têm os dois alelos presentes, e desse modo orientarão a incorporação dos dois rótulos (em moléculas diferentes do iniciador de extensão) e desse modo os dois rótulos serão detectados. Sondas SBE avançada e inversa exemplares são fornecidas na tabela 10.

[00078] Bases de nucleotídeo polimórficas são designadas na tabela 11 e na listagem d sequência fornecida de acordo com o Padrão WIPO ST.25 (1998), Tabela 1, como a seguir: r=g ou a (purina); y=t/u ou c (pirimidina); m=a ou c; (amino); k=g ou t/u (ceto); s=g ou c (ligações 3H de interações fortes); w=a ou t/u (ligações 2H de interações fracas); b=g ou c ou t/u (não a); d=a ou g ou t/u (não c); h=a ou c ou t/u (não g); v=a ou g ou c (não t, não u); e n=a ou g ou c ou t/u (desconhecido, ou outro, qualquer.)

[00079] Tendo ilustrado e descrito os princípios da presente invenção, deve ser evidente para pessoas versadas na técnica que a invenção pode ser modificada em arranjo e detalhe sem se afastar de tais princípios.

[00080] Embora os materiais e métodos da presente invenção tenham sido descritos em termos de várias modalidades e exemplos ilustrativos, será evidente para aqueles versados na técnica que variações podem ser aplicadas aos materiais e métodos descritos aqui sem se afastar do conceito, espírito e escopo da invenção. Todos os substitutos similares e modificações evidentes para aqueles versados na técnica são considerados como estando compreendidos no espírito, escopo e conceito da invenção como definido pelas reivindicações apensas.

[00081] Sequências para os genes fornecidos acima podem ser obtidas da World Wide Web (ou Internet) utilizando os identificados fornecidos na coluna 1 (Nome de display/local) ou Coluna 5 (INFORMAÇÕES ADICIONAIS DO LOCAL) a partir dos seguintes locais na Internet: a) "soybase.org"(descrito em Grant e outros., Nucleic Acids Research, 2010, Vol. 38, Database issue D843-D846) ou soybase.org/gbrowse/cgi-bin/gbrowse/gmax1.01/ (vide Hyten DL, Choi l-Y, Song Q, Specht JE, Carter TE e outros. (2010) A high density integrated genetic linkage map of soybean and the development of a 1,536 Universal Soy Linkage Panel for QTL mapping. Crop Science 50:960-968. (Crop Science); e Hyten DL, Cannon SB, Song Q, Weeks N, Fickus EW e outros. (2010) High-throughput SNP discovery through deep resequencing of a reduced representation library to anchor e orient scaffolds in the soybean whole genome sequence. BMC Genomics 11(1): 38); b) "phytozome.net" ou "phytozome.net/cgi- bin/gbrowse/soja/?name=Gm09"; c) "www.plantgdb.org" ou "plantgdb.org/GmGDB/ (Assembly version Glyrna1.170 (Abril 2009)"; e, d) "ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez" e subsites "ncbi.nlm.nih.gov/nucest", "ncbi. nlm.nih.gov/dbEST", "ncbi.nlm.nih.gov/genbank/", ".ncbi.nlm.nih.gov/sites/ genome", "ncbi.nlm.nih.gov/unigene", e "ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/UGOrg.cgi? TAXID=3847".

Claims (5)

1. Método de identificar uma planta de soja que compreende um genótipo associado a um fenótipo sem flash, caracterizado pelo fato de que compreende: detectar na referida planta de soja um polimorfismo de DNA em pelo menos um local de marcador de flash amarelo associado ao fenótipo sem flash com uma técnica de análise de ácido nucleico, em que o local marcador de flash amarelo está em uma região genômica de grupo de ligação L flanqueada por locais BG406195 (SEQ ID NO: 13) e BU082700 (SEQ ID NO: 14) e em que o referido genótipo associado a um fenótipo sem flash é detectado pela identificação de pelo menos um alelo polimórfico de pelo menos um marcador na referida região do grupo de ligação L selecionado do grupo que consiste em M0129138 (SEQ ID NO: 4), M0101742 (SEQ ID NO : 5), M0093116 (SEQ ID NO: 6) e M0129925 (SEQ ID NO: 7) que está associado a um fenótipo sem flash com a técnica de análise de ácido nucleico, e selecionar a referida planta de uma população de plantas em que a planta selecionada compreende um genótipo associado a um fenótipo sem flash e a planta selecionada ou a progénie da mesma exibe um fenótipo sem flash.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta indicada ou a progénie da mesma compreende um transgene que confere tolerância a glifosato.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a planta de soja ou progénie da mesma é exposta a uma dosagem de glifosato suficiente para causar flash amarelo em uma variedade suscetível.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o genótipo associado a um fenótipo sem flash é detectado por meio da identificação de pelo menos um dos alelos: GG ou AA no nucleotídeo 218 de SEQ ID NO: 4, alelos TT ou CC no nucleotídeo 1206 de SEQ ID NO: 5, alelos AA ou TT no nucleotídeo 183 de SEQ ID NO: 6 e/ou alelos CC ou GG no nucleotídeo 328 de SEQ ID NO: 7.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o fenótipo associado a um fenótipo sem flash é detectado por meio da identificação: (i) alelos GG no nucleotídeo 218 de SEQ ID NO: 4, alelos TT no nucleotídeo 1206 de SEQ ID NO: 5, alelos AA no nucleotídeo 183 de SEQ ID NO: 6 e alelos CC no nucleotídeo 328 de SEQ ID NO: 7 com a técnica de análise de ácido nucleico; ou, (ii) alelos AA no nucleotídeo 218 de SEQ ID NO: 4, alelos CC no nucleotídeo 1206 de SEQ ID NO: 5, alelos TT no nucleotídeo 183 de SEQ ID NO: 6 e alelos GG no nucleotídeo 328 de SEQ ID NO: 7.