CN112159862A - 与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记及其试剂盒与方法 - Google Patents

与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记及其试剂盒与方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112159862A
CN112159862A CN202010972060.5A CN202010972060A CN112159862A CN 112159862 A CN112159862 A CN 112159862A CN 202010972060 A CN202010972060 A CN 202010972060A CN 112159862 A CN112159862 A CN 112159862A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mosaic virus
cucumber
cucumber mosaic
cmv
snp marker
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010972060.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112159862B (zh
Inventor
薄凯亮
顾兴芳
张圣平
苗晗
董邵云
史利雪
余道亮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences filed Critical Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN202010972060.5A priority Critical patent/CN112159862B/zh
Publication of CN112159862A publication Critical patent/CN112159862A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112159862B publication Critical patent/CN112159862B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明“与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记及其试剂盒与方法”，涉及生物技术辅助育种领域。所述与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记的第190个碱基位点具有A/T单核苷酸多态性；所述SNP标记为SNP9153657 A/T；可扩增所述SNP标记的引物为核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的dCAPS‑NlaIII‑F和dCAPS‑NlaIII‑R。本发明提供的SNP标记具有高效、限制少的优点，提高了选育抗黄瓜花叶病毒的黄瓜材料的效率，缩短了育种周期。

Description

与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记及其试剂盒与 方法
技术领域
本发明涉及生物技术辅助育种领域，特别是与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记及其试剂盒与方法。
背景技术
黄瓜(Cucumis sativus L.)是世界十大蔬菜之一，种植地广阔。但是随着黄瓜种植面积日益扩大，病毒种类也日益增多，并且常常被多种病毒侵染。其中黄瓜花叶病毒(CMV)是为害黄瓜的主要病害。因此研究黄瓜抗黄瓜花叶病毒(CMV)的遗传规律及分子标记，对于选育符合市场需求的新品种具有重要意义。
目前，国内外关于黄瓜CMV抗性遗传规律的研究存在较大的争议，其中Shifriss等(1942)发现黄瓜CMV抗性符合数量性状遗传特性，由3对互补基因控制。Wasuwat等(1961)利用黄瓜抗病材料对CMV进行分析，结果表明抗性是由显性单基因控制的。Kooistra等(1969)报道黄瓜中CMV抗性是由3对显性基因控制。Kaan等(1973)根据Freeman‘s黄瓜材料发现CMV抗性是由3对隐性基因控制，而在Mitangchang黄瓜材料中由2对互补基因控制。Karchis(1997)研究结果得出F1材料的感病性表现型基因呈不完全显性。Wang等(1997)构建黄瓜F2群体(Surinam×Wisconsin 2757)进行CMV抗性鉴定，发现CMV的抗病性是由一对隐性单基因所控制。Munshi等(2008)对31份黄瓜C.sativusvar.hardwickii材料进行CMV抗病性鉴定，从中筛选出6份感病材料和6份抗病材料构建F2群体对其进行抗性遗传分析，发现在F2群体中感抗比符合3:1，从而表明CMV抗性是由一对隐性单基因控制的。黄焕焕(2007)以黄瓜感CMV自交系HZL04-1和抗CMV自交系F-3为亲本配制F1和F2后代群体，采用人工摩擦接种方法对CMV进行苗期接种鉴定，鉴定结果表明黄瓜CMV抗性是由一对隐性单基因控制。王军辉(2010)利用同样的亲本材料构建F1、F2和BC1后代群体，对其进行CMV苗期抗病性鉴定，鉴定结果表明CMV的抗性是由数量性状控制的，且受3个基因调控。史利雪(2018)利用RILs群体和DH群体将CMV定位在6号染色体，并拿到候选基因。到目前为止，市面上尚未出现可检测黄瓜中黄瓜花叶病毒(CMV)的有效的分子标记，而黄瓜中抗黄瓜花叶病毒(CMV)连锁的SNP标记也尚未见报道。
发明内容
本发明基于上述领域的空白，提供了一种与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记，并提供了其在选择黄瓜抗黄瓜花叶病毒种质资源上的应用。
本发明的技术方案如下：
与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记的第190个碱基位点具有A/T单核苷酸多态性；所述SNP标记为SNP9153657A/T。
可扩增所述SNP标记的引物为核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的dCAPS-NlaIII-F和dCAPS-NlaIII-R。
所述SNP标记的上下游引物扩增的与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的特征条带核苷酸序列如Seq ID No.1所示；
所述SNP标记的上下游引物扩增的与黄瓜感黄瓜花叶病毒基因Cmv连锁的特征条带核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
用于鉴定黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv的试剂盒，其特征在于，包括可扩增所述的与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记的引物。
所述与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记的引物为核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的的dCAPS-NlaIII-F和dCAPS-NlaIII-R；
优选地，所述SNP标记的上下游引物扩增的与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的特征条带核苷酸序列如Seq ID No.1所示；
所述SNP标记的上下游引物扩增的与黄瓜感黄瓜花叶病毒基因Cmv连锁的特征条带核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
所述的用于鉴定黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv的试剂盒还包括：PCR试剂、和/或，电泳试剂；
优选地，所述PCR试剂包括：Taq酶、PCR缓冲液、dNTP；所述PCR试剂优选3G TaqMaster Mix for PAGE(Red Dye)；
优选地，所述电泳试剂包括：电泳缓冲液、聚丙烯酰胺凝胶；
优选地，所述试剂盒还包括NlaIII限制性内切酶、酶切缓冲液、双蒸水。
一种鉴定黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv的方法，其特征在于，包括：采用可扩增所述的与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记的引物，和/或，所述的试剂盒中的引物对待测黄瓜材料的DNA进行PCR扩增。
所述的一种鉴定黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv的方法还包括，对所述PCR扩增产物进行测序或酶切电泳；
测序结果如Seq ID No.1所示，或，酶切电泳结果为210bp的黄瓜材料的基因型和表型均为抗黄瓜花叶病毒；
测序结果如Seq ID No.2所示，或，酶切电泳结果为192bp的黄瓜材料的基因型和表型均为感黄瓜花叶病毒。
所述PCR扩增体系包括：0.75ng/μlDNA模板，上下游引物各5ng/μl，0.5μL/μl2*3GTaq Master Mix for PAGE(Red Dye)；
优选地，所述PCR反应体系为：7.5ng DNA模板，正向和反向引物各50ng，5μL 2*3GTaq Master Mix for PAGE(Red Dye)，加双蒸水至10μl。
所述PCR扩增程序为：95℃预变性3分钟；以95℃变性15秒，57℃退火15秒，72℃延伸30秒为1个循环，共35个循环；72℃保温5分钟。
优选地，所述酶切指NlaIII限制性内切酶对PCR扩增产物酶切；
优选地，所述酶切体系包括：PCR扩增产物0.3μl/μl，内切酶0.02μl/μl，NEBuffer0.1μl/μl；
优选地，所述酶切体系为：PCR扩增产物3μl，内切酶0.2μl，NEBuffer1μl，双蒸水5.8μl；
优选地，所述酶切温度为37℃，酶切时间为2h。
本发明所述SNP标记扩增的与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的特征条带核苷酸序列如Seq ID No.1所示，序列的190位碱基为T；所述SNP标记扩增的与黄瓜感黄瓜花叶病毒基因Cmv连锁的特征条带核苷酸序列如Seq ID No.2所示，序列的190位碱基为A，经NlaIII酶切后得到192bp片段，如Seq ID No.3所示。
上述SNP标记在筛选具有抗黄瓜花叶病毒基因cmv的黄瓜种质资源中的应用，其步骤如下：
(1)提取待测样品基因组DNA；
(2)以所述待测样品基因组DNA为模板，以权利要求1所述的引物进行PCR扩增；
(3)对PCR扩增片段进行测序或NlaIII酶切；
如果测序结果如Seq ID No.1所示，植株为抗黄瓜花叶病毒病材料，如果测序结果如Seq ID No.2所示，植株为感黄瓜花叶病毒病材料；
如果酶切后片段为210bp，则植株为抗黄瓜花叶病毒病材料；如果酶切后片段为192bp，植株为感黄瓜花叶病毒病材料。
所述PCR反应体系为:7.5ng DNA模板，正向和反向引物各50ng，5μL 2*3G TaqMaster Mix for PAGE(Red Dye)，加双蒸水至10ul。
所述PCR扩增程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，57℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，10℃保存。
NlaIII酶切的体系为：PCR产物3μl，内切酶0.2μl，NEBuffer1μl，双蒸水5.8μl，酶切温度为37℃，酶切时间为2h。
所述凝胶电泳检测：指采用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于150V恒功率电泳分离1h10min，最后银染显色，进行条带统计。
本试验以抗黄瓜花叶病毒病自交系02245和感黄瓜花叶病毒病自交系65G为材料开发SNP标记，通过利用140份重组自交系群体进行验证，结果标记CMV-SNP2用于分子标记辅助选择的正确率为100％。
本试验不仅为黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育抗黄瓜花叶病毒的黄瓜新品种提供了高效的途径。本发明基于开发的SNP标记提供用于辅助筛选具有抗黄瓜花叶病毒基因的黄瓜新品种的方法。该方法中，采用所述SNP9153657特异性引物扩增待测材料的DNA，然后对扩增产物进行测序及酶切。通过本发明提供的方法，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行抗黄瓜花叶病毒的筛选，具有高效、限制少、准确的优点。
附图说明
图1是本发明的一个实施例提供的SNP标记CMV-SNP2对黄瓜亲本材料02245(P2)，65G(P1)，F1世代单株的检测结果；P1：65G(感黄瓜花叶病毒病)；P2：02245(抗黄瓜花叶病毒病)。
图2是本发明的另一个实施例提供的SNP标记CMV-SNP2对黄瓜重组自交系群体的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获得。
生物材料的来源
本发明实验例所用的试验材料为65G(P1)，02245(P2)，本课题保存的140份重组自交系群体材料。该重组自交系群体是申请人实验室自行配制的一个专用于研究病毒抗性基因的黄瓜重组自交系群体，该群体是以感黄瓜花叶病毒材料65G为母本，以抗黄瓜花叶病毒材料02245为父本二者杂交获得的F1代选择的一株优良单株经多代自交产生的。该群体材料可自本发明申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
65G是欧洲温室型黄瓜，感黄瓜花叶病毒。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
02245为华北密刺型黄瓜，抗黄瓜花叶病毒。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
dCAPS-NlaIII标记引物是本实验室基于重测序的基因组信息、利用dCAPSFinder软件和Primer 3.0软件设计，并在北京生工公司合成。
试剂耗材
PCR实验使用Vazyme公司的2*3G Taq Master Mix for PAGE(Red Dye)；酶切使用NEBuffer的限制性内切酶NlaIII；凝胶电泳使用北京酷来搏科技有限公司的40％非变性聚丙烯酰胺，将其稀释至6％后使用。测序在北京生工公司进行。
实验例1.本发明的黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因连锁的SNP标记的获得
结合黄瓜基因组序列的数据和两亲本重测序数据，利用生物信息学结合遗传群体的表型鉴定，分析定位该区域内的SNP，找到SNP9153657A/T，发现该SNP在材料黄瓜亲本材料02245(P2)基因组中，该位点碱基为T；在材料65G(P1)基因组中，该碱基为A。
基于获得的与黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因连锁的SNP标记，开发与黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因连锁的dCAPS标记(命名为dCAPS-NlaIII)。其中正向和反向引物分别为：
dCAPS—NlaIII—F：AACTTTCGCAGCAACAACCA(SEQ ID NO.6)
dCAPS—NlaIII—R：ACTAGCAGAGAGTGAAGGGC(SEQ ID NO.7)
由于上述所得SNP的关系(SNP＝T/A)，当碱基A存在时，形成内切酶NlaIII的识别序列(CATG↓，↓为酶切位点)，扩增片段可以被内切酶切开；当碱基T存在时，不能形成内切酶识别序列，扩增片段无法被内切酶NlaIII切开。
通过上述引物(dCAPS—NlaIII—F/dCAPS—NlaIII—R)对双亲材料进行PCR扩增，并结合内切酶NlaIII对扩增片段进行酶切，获得特异性条带，其中在材料02245(抗黄瓜花叶病毒病)中，获得一个210bp的条带，在材料65G(感黄瓜花叶病毒)中，获得一个192bp的条带。
具体操作方法：
步骤1.DNA提取和PCR扩增
取黄瓜植株的嫩叶，用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取亲本65G(P1)、02245(P2)、F1和重组自交系群体各单株的基因组DNA。
dCAPS标记PCR反应体系为：反应体系10μL,3μL DNA(5.0ng·μL-1)，正向和反向引物(50ng·μL-1)各1μL，5μL 2*3G Taq Master Mix for PAGE(Red Dye)(Vazyme公司产品)。
PCR扩增程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，57℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，10℃保存forever。
步骤2.NlaIII完全酶切PCR产物
酶切体系为：PCR产物3μl，内切酶0.2μl，NEBuffer1μl，双蒸水5.8μl。酶切温度为37℃，酶切时间为2h。
步骤3.结果判定
方法一：跳过步骤2，不经过酶切，将PCR产物直接测序。02245(抗黄瓜花叶病毒病)所得序列在第190位碱基为T；65G(感黄瓜花叶病毒)所得序列在190位碱基为A；F1所得序列该位置有两种碱基，T和A同时存在。
方法二：经过内切酶完全酶切，酶切产物用用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，150V恒功率电泳分离1h10min，电泳后银染显色，统计带型。
02245(抗黄瓜花叶病毒病)得到一个为210bp的片段，条带带型记为a；65G(感黄瓜花叶病毒)得到一个192bp的片段条带带型记为b；F1中两个条带同时检测到，条带带型记为h，这种杂合带型表明对应的黄瓜材料的基因型和表型均为感黄瓜花叶病毒。该基因是隐性遗传，带型为a是抗病，带型为b或者h为感病。
实验例2.本发明的黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因连锁的SNP标记的验证
利用本课题保存的140份重组自交系群体，对实施例1获得的与cmv基因连锁的标记CMV-SNP2进行验证，以确定该标记用于分子标记辅助选择的准确性：经和所选材料的田间表现型相比，标记在140份重组自交系群体带型反映的表型数据与田间调查结果一致，经计算正确率为100％。扩增条带见图2。
Figure BDA0002684443030000071
Figure BDA0002684443030000081
Figure BDA0002684443030000091
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记及其试剂盒与方法
<130> P200702/SCH
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 210
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记片段
<400> 1
aactttcgca gcaacaacca ggatctactg gccttcaaaa tatgcaaatc cctccatttg 60
gtcattctcc atccaatatg tctacccacc cgttgcttcc atcagattct cattctctct 120
ctgaggttct acagaccgac tctctcggtc gattacaggg tctcgacatc agtagtaaag 180
gatcgtcgct tgtgaaatcc gagggccctt 210
<210> 2
<211> 210
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 与黄瓜感黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记片段
<400> 2
aactttcgca gcaacaacca ggatctactg gccttcaaaa tatgcaaatc cctccatttg 60
gtcattctcc atccaatatg tctacccacc cgttgcttcc atcagattct cattctctct 120
ctgaggttct acagaccgac tctctcggtc gattacaggg tctcgacatc agtagtaaag 180
gatcgtcgca tgtgaaatcc gagggccctt 210
<210> 3
<211> 192
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 与黄瓜感黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记片段酶切结果序列
<400> 3
aactttcgca gcaacaacca ggatctactg gccttcaaaa tatgcaaatc cctccatttg 60
gtcattctcc atccaatatg tctacccacc cgttgcttcc atcagattct cattctctct 120
ctgaggttct acagaccgac tctctcggtc gattacaggg tctcgacatc agtagtaaag 180
gatcgtcgca tg 192
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dCAPS-NlaIII-F
<400> 4
aactttcgca gcaacaacca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dCAPS-NlaIII-R
<400> 5
actagcagag agtgaagggc 20

Claims (10)

1.与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记的第190个碱基位点具有A/T单核苷酸多态性；所述SNP标记为SNP9153657A/T。
2.根据权利要求1所述的与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记，其特征在于，可扩增所述SNP标记的引物为核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的dCAPS-NlaIII-F和dCAPS-NlaIII-R。
3.根据权利要求1或2所述的与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记的上下游引物扩增的与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的特征条带核苷酸序列如Seq ID No.1所示；
所述SNP标记的上下游引物扩增的与黄瓜感黄瓜花叶病毒基因Cmv连锁的特征条带核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
4.用于鉴定黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv的试剂盒，其特征在于，包括可扩增权利要求1-3任一所述的与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记的引物。
5.根据权利要求3所述的用于鉴定黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv的试剂盒，其特征在于，所述与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记的引物为核苷酸序列分别如SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5所示的的dCAPS-NlaIII-F和dCAPS-NlaIII-R；
优选地，所述SNP标记的上下游引物扩增的与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的特征条带核苷酸序列如Seq ID No.1所示；
所述SNP标记的上下游引物扩增的与黄瓜感黄瓜花叶病毒基因Cmv连锁的特征条带核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
6.根据权利要求4或5所述的用于鉴定黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv的试剂盒，其特征在于，还包括：PCR试剂、和/或，电泳试剂；
优选地，所述PCR试剂包括：Taq酶、PCR缓冲液、dNTP；所述PCR试剂优选3G Taq MasterMix for PAGE(Red Dye)；
优选地，所述电泳试剂包括：电泳缓冲液、聚丙烯酰胺凝胶；
优选地，所述试剂盒还包括NlaIII限制性内切酶、酶切缓冲液、双蒸水。
7.一种鉴定黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv的方法，其特征在于，包括：采用可扩增权利要求1-3任一所述的与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记的引物，和/或，权利要求4-6任一所述的试剂盒中的引物对待测黄瓜材料的DNA进行PCR扩增。
8.根据权利要求7所述的一种鉴定黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv的方法，其特征在于，还包括，对所述PCR扩增产物进行测序或酶切电泳；
测序结果如Seq ID No.1所示，或，酶切电泳结果为210bp的黄瓜材料的基因型和表型均为抗黄瓜花叶病毒cmv；
测序结果如Seq ID No.2所示，或，酶切电泳结果为192bp的黄瓜材料的基因型和表型均为感黄瓜花叶病毒cmv。
9.根据权利要求7或8所述的一种鉴定黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv的方法，其特征在于，所述PCR扩增体系包括：0.75ng/μl DNA模板，上下游引物各5ng/μl，0.5μL/μl2*3G TaqMaster Mix for PAGE(Red Dye)；
优选地，所述PCR反应体系为：7.5ng DNA模板，正向和反向引物各50ng，5μL 2*3G TaqMaster Mix for PAGE(Red Dye)，加双蒸水至10μl。
10.根据权利要求7或8所述的一种鉴定黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv的方法，其特征在于，所述PCR扩增程序为：95℃预变性3分钟；以95℃变性15秒，57℃退火15秒，72℃延伸30秒为1个循环，共35个循环；72℃保温5分钟。
优选地，所述酶切指NlaIII限制性内切酶对PCR扩增产物酶切；
优选地，所述酶切体系包括：PCR扩增产物0.3μl/μl，内切酶0.02μl/μl，NEBuffer0.1μl/μl；
优选地，所述酶切体系为：PCR扩增产物3μl，内切酶0.2μl，NEBuffer1μl，双蒸水5.8μl；
优选地，所述酶切温度为37℃，酶切时间为2h。
CN202010972060.5A 2020-09-16 2020-09-16 与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记及其试剂盒与方法 Active CN112159862B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010972060.5A CN112159862B (zh) 2020-09-16 2020-09-16 与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记及其试剂盒与方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010972060.5A CN112159862B (zh) 2020-09-16 2020-09-16 与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记及其试剂盒与方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112159862A true CN112159862A (zh) 2021-01-01
CN112159862B CN112159862B (zh) 2022-08-02

Family

ID=73858060

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010972060.5A Active CN112159862B (zh) 2020-09-16 2020-09-16 与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记及其试剂盒与方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112159862B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115747363A (zh) * 2022-07-27 2023-03-07 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 用于检测黄瓜对灰霉病抗性性状的snp分子标记及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100199390A1 (en) * 2003-10-27 2010-08-05 Fnp Corp., Ltd. Molecular Marker Associated With CMV Resistance And Use Thereof
CN107674922A (zh) * 2017-09-01 2018-02-09 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv的InDel标记及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100199390A1 (en) * 2003-10-27 2010-08-05 Fnp Corp., Ltd. Molecular Marker Associated With CMV Resistance And Use Thereof
CN107674922A (zh) * 2017-09-01 2018-02-09 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv的InDel标记及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
S. WANG等: "A Rare SNP Identified a TCP Transcription Factor Essential for Tendril Development in Cucumber", 《MOLECULAR PLANT》 *
陈学好等: "黄瓜基因及其连锁研究进展", 《园艺学报》 *
黄焕焕: "黄瓜CMV抗性相关基因的分子标记研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115747363A (zh) * 2022-07-27 2023-03-07 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 用于检测黄瓜对灰霉病抗性性状的snp分子标记及其应用
CN115747363B (zh) * 2022-07-27 2023-11-17 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 用于检测黄瓜对灰霉病抗性性状的snp分子标记及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112159862B (zh) 2022-08-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Acheré et al. A full saturated linkage map of Picea abies including AFLP, SSR, ESTP, 5S rDNA and morphological markers
CN109913577B (zh) 与小麦抗条锈病基因Yr1152紧密连锁的分子标记及其应用
CN108486276A (zh) 辣椒熟性snp分子标记及其应用
CN109628627A (zh) 水稻广谱抗稻瘟病基因Pigm的SNP标记开发和应用
KR100753676B1 (ko) 배추과 작물의 품종 구분 및 유용표지인자 개발수단으로서의 왜성전이인자, 이를 이용한 ｄｎａ 표지인자제작용 프라이머, 및 이들을 이용한 배추과 작물의 품종구분방법
CN109609687B (zh) 用于检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合及其应用
CN102747070A (zh) 甜瓜抗白粉病基因Pm-AN紧密连锁的两个CAPs标记与使用方法
CN112159862B (zh) 与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv连锁的SNP标记及其试剂盒与方法
CN106701997B (zh) 鉴定转基因植物或者转基因玉米双抗12-5外源基因插入染色体位置的方法及其应用
CN109762928B (zh) 一种与甜瓜蔓长相关的分子标记及其在鉴定甜瓜蔓长性状中的应用
CN105543366B (zh) 水稻抗稻瘟病基因Pi25基因内特异SNP共显性分子标记开发及应用
CN111961753A (zh) 一种辣椒番茄斑点萎蔫病毒病抗性基因相关的snp标记及其特异性引物和应用
CN109554494B (zh) 水稻抗褐飞虱bph9复等位基因的通用共显性分子标记及其检测方法和应用
CN111926098A (zh) 与茄子果色的上位性基因Y紧密连锁的InDel分子标记与应用
Kyaligonza et al. Identification of F1 cassava (Manihot esculenta Crantz) progeny using microsatellite markers and capillary electrophoresis
CN112159861B (zh) 与黄瓜抗西瓜花叶病毒基因wmv连锁的SNP标记及其试剂盒与方法
CN114480718B (zh) 一种基于kasp技术用于水稻耐高温基因分型的引物组、检测试剂盒及其应用
CN111793706B (zh) 一种豇豆InDel分子标记检测引物组及试剂盒
CN113046464B (zh) 筛选大豆材料的分子标记、筛选方法、育种方法和应用
US20180310501A1 (en) Soy gene cluster regions and methods of use
CN105176994B (zh) 稻瘟病抗性基因Pi9功能特异性分子标记Pi9FNP及方法与应用
CN110592260B (zh) 硬粒小麦成株抗叶锈病位点的竞争性等位基因特异聚合酶链式反应标记及其应用
CN111549172B (zh) 西瓜叶片后绿基因连锁位点及caps标记
CN114369674B (zh) 一种与印度南瓜短蔓基因CmDw-1连锁的SNP标记及其引物、试剂盒与应用
CN113736906B (zh) 用于检测番茄黄萎病抗性的snp位点组合及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant