JP6253132B2 - イチゴ属植物の炭疽病抵抗性関連マーカーとその利用 - Google Patents
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Description
本発明は以下を包含する。
上記で得られた染色体における上記(1)乃至(3)いずれか1に記載のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を測定する工程とを含む、炭疽病抵抗性が向上したイチゴ属植物系統の製造方法。
本発明に係るイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとは、イチゴ属植物の染色体上に存在する特定の領域であり、イチゴ属植物炭疽病抵抗性という形質を判別できる機能を有する。すなわち、既知のイチゴ属植物を用いて得られた後代系統において、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を確認することで炭疽病抵抗性の向上という形質を有する系統であると判断することができる。なお、本発明において、イチゴ炭疽病とは、Microbiol. Cult. Coll., 25(1): 27-32, 2009に記載されるように、Glomerella cingulate及び/又はColletotrichum acutatumが感染することに起因して病班が形成される病気を意味している。特に、本発明において、イチゴ炭疽病とは、Glomerella cingulataの感染を原因とする病気としても良い。
本発明では、上述したように、さちのかから取得した1,502個のマーカー及びいちご中間母本農2号から取得した2,162個のマーカーからイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを特定した。ここでは、これら1,502個と2,162個のマーカーについて説明する。このマーカーを同定する際には、特開2011-120558号公報や国際公開公報2011/074510に開示された方法を適用したDNAマイクロアレイを使用することができる。
イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを利用することで、炭疽病抵抗性が未知であるイチゴ属植物(例えば、後代系統)について炭疽病抵抗性を示す系統であるか判断することができる。ここで、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを利用するとは、当該マーカーを含む核酸断片を特異的に増幅する方法を利用する形態、当該マーカーに対応するプローブを有するDNAマイクロアレイを利用する形態を含む意味である。
(1)材料
栽培いちご品種:さちのか及びいちご中間母本農2号を用いた。
これら栽培いちご品種からそれぞれゲノムDNAをCTAB法(Cetyl trimethyl ammonium bromide法)により抽出した。抽出したゲノムDNA(180ng)を制限酵素PstI(NEB社、6unit)で37℃、1時間処理した。その後、PstI処理後のゲノムDNA(150ng)を制限酵素BstNI(NEB社、5unit)を添加、60℃で1時間処理した。
(2)で処理したゲノムDNA断片(120ng)にPstI配列アダプター(5’-CACGATGGATCCAGTGCA-3’(配列番号11)、5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’ (配列番号12))とT4 DNA Ligase(NEB社、800 unit)を加え、16℃で4時間以上の条件でライゲーション反応を行った。これにより、(2)で処理したゲノムDNA断片のうち、両末端にPstI認識配列を有するゲノムDNA断片に対して選択的にアダプターを付加した。
(3)で得られたアダプターを有するゲノムDNA断片(15ng)にPstI配列アダプター認識プライマー(5’-GATGGATCCAGTGCAG-3’(配列番号13))とTaq polymerase(タカラバイオ社PrimeSTAR、1.25unit)を加え、PCR(98℃を10秒間、55℃を15秒間、72℃を1分間を1サイクルとして30サイクル実施後、72℃で3分間処理後、4℃で保存)でゲノムDNA断片を増幅した。
(4)においてPCR増幅したゲノムDNA断片についてGAII(Illumina社)を用いて塩基配列を決定した。
(5)のゲノムシークエンス情報をもとに50〜75bpのプローブを設計した。設計したプローブの塩基配列情報をもとに、これらプローブを有するDNAマイクロアレイを作製した。
(1)材料
栽培いちご品種:さちのか、いちご中間母本農2号及びこれらの交雑後代133系統を用いた。
これら栽培いちご品種及び交雑後代からそれぞれゲノムDNAをCTAB法により抽出した。抽出したゲノムDNA(180ng)を制限酵素PstI(NEB社、6unit)で37℃、1時間処理した。その後、PstI処理後のゲノムDNA(150ng)を制限酵素BstNI(NEB社、5unit)を添加、60℃で1時間処理した。
(2)で処理したゲノムDNA断片(120ng)にPstI配列アダプター(5’-CACGATGGATCCAGTGCA-3’(配列番号11)、5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’ (配列番号12))とT4 DNA Ligase(NEB社、800 unit)を加え、16℃で4時間以上の条件でライゲーション反応を行った。これにより、(2)で処理したゲノムDNA断片のうち、両末端にPstI認識配列を有するゲノムDNA断片に対して選択的にアダプターを付加した。
(3)で得られたアダプターを有するゲノムDNA断片(15ng)にPstI配列アダプター認識プライマー(5’-GATGGATCCAGTGCAG-3’(配列番号13))とTaq polymerase(タカラバイオ社PrimeSTAR、1.25unit)を加え、PCR(98℃を10秒間、55℃を15秒間、72℃を1分間を1サイクルとして30サイクル実施後、72℃で3分間処理後、4℃で保存)でゲノムDNA断片を増幅した。
上述した(4)で得られたPCR増幅断片をカラム(Qiagen社)で精製後、NimbleGen Arrays User’s Guideに従ってNimbleGen One-Color DNA Labelingを用いてラベル化サンプルを調整した。
(5)のラベル化サンプルを用い、NimbleGen Array User's Guideに従い、上記1.で作製したDNAマイクロアレイを用いてハイブリダイズを行い、ラベルに基づくシグナルを検出した。
(1)遺伝地図データ作成
さちのか、いちご中間母本農2号、交雑後代133系統のシグナルデータから、さちのか型の1,502個のマーカー及びいちご中間母本農2号型の2,162個のマーカーとなりうる遺伝子型データを取得した。遺伝子型データをもとに、遺伝地図作成ソフトウェアAntMap(Iwata H, Ninomiya S (2006) AntMap: constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm. Breed Sci 56: 371-378)を使用し、遺伝距離計算式Kosambiにより染色体におけるマーカーの位置情報を算出してマーカーの遺伝地図データを取得した。
さちのか、いちご中間母本農2号、交雑後代103系統のランナー増殖したクローン株を検定株とした。各検定株について1区5株×3反復で栽培した。接種2日前までに展開葉が3〜4枚になるように下葉を除去して葉数をそろえた。
上記(1)で得られた遺伝地図データ及び上記(2)で得られたイチゴ炭疽病検定試験データ(萎凋・枯死株率)をもとに、遺伝解析ソフトQTL Cartographer(Wang S., C. J. Basten, and Z.-B. Zeng (2010). Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC)を使用し、Composite interval mapping(CIM)法によりQTL解析を行った。LODの閾値は2.5を用いた。その結果、図4に示すように、いちご中間母本農2号の第23連鎖群のマーカーIA204069からIA201502の区間内にLOD値18.3のイチゴの炭疽病抵抗性に関する遺伝子の存在を示唆するピークを確認することができた。得られたピークは表2に示すように特定することができ、当該ピークの位置に炭疽病抵抗性を向上させる機能を有する原因遺伝子(群)が存在することが示唆された。
また、本実施例で作成したプローブの塩基配列及びシグナル値の閾値を表3に示した。
また、本実施例では、いちご中間母本農2号の第23連鎖群のマーカーIA204069からIA201502の領域のなかからマーカーIA202631及びIA200826をPCRによって増幅するプライマーを設計した。
シーケンスアセンブリソフトウェアATGC ver.6を使い、マーカーIA202631及びIA200826の配列情報から、それぞれの配列を識別するプライマーを作製した。すなわち、IA202631についてはCGGTTAACCCCTCCTAGAAAATC(IA202631F_2A:配列番号24)とTGCAGCTGTGAGGTTGTCTTTAT(IA202631R_111A:配列番号25)を設計し、IA200826についてはCTGCAGAAAAGGGAGAAGAAGTTC(IA200826F_1A:配列番号26)とGCCAGATGAAATAGAAGATTAGCACC(IA200826R_259A:配列番号27)を設計した。
イチゴ品種さちのか、いちご中間母本農2号および交雑後代12系統のゲノムDNA(15ng)に、上記プライマーペアとTaq polymerase(タカラバイオ社、PrimeSTAR、0.5 unit)を加え、PCR(98℃を10秒間、55℃を5秒間、72℃を1分間、30サイクル後、72℃で3分間処理後、4℃で保存)で増幅した。PCR増幅したDNA断片は、電気泳動(2.0 %アガロースゲル、TAE、100 v 30分)により確認した。マーカーIA200826をPCR増幅した結果を図15に示し、マーカーIA202631をPCR増幅した結果を図16に示した。図15及び図16に示すように、表4に示したシグナルデータと一致して、いずれのプライマーペアも目的のバンドパターンを増幅できることが示された。
(1)遺伝子型データと炭疽病萎凋・枯死株率
イチゴ品種さちのか、いちご中間母本農2号および交雑後代133系統の選抜マーカーIA200826の遺伝子型データと炭疽病萎凋・枯死株率を比較した(図17)。イチゴ炭疽病への抵抗性に優れる系統の多くは、選抜マーカーIA200826を持っていた(平均10.6%)。一方、イチゴ炭疽病への罹病性を示す系統の多くは、選抜マーカーIA200826を持っていなかった(平均49.8%)。T検定の結果、有意水準1%で両平均値に有意な差が認められた。
I.ゲノムDNAの抽出
新たに、イチゴ品種さちのか、いちご中間母本農2号の交雑後代2系統(A及びB)について、CTAB法によりゲノムDNAを抽出した。
イチゴ品種さちのか、いちご中間母本農2号および交雑後代2系統(A及びB)のゲノムDNA(15ng)に、上記4.で設計したIA202631プライマーペア(IA202631F_2A及びIA202631R_111A)或いはIA200826プライマーペア(IA200826F_1A及びIA200826R_259A)とTaq polymerase(タカラバイオ社、PrimeSTAR、0.5 unit)を加え、PCR(98℃を10秒間、55℃を5秒間、72℃を1分間、30サイクル後、72℃で3分間処理後、4℃で保存)で増幅した。PCR増幅したDNA断片は、電気泳動(2.0 %アガロースゲル、TAE、100 v 30分)により確認した。その結果を図18に示した。図18に示すように、交雑後代A系統は、IA202631及びIA200826のいずれのマーカーも保有していなかった。一方、交雑後代B系統は、IA202631及びIA200826の両方のマーカーを保有していた。
炭疽病検定試験の結果、交雑後代A系統及び交雑後代B系統の炭疽病萎凋・枯死株率は、それぞれ80.0%と13.3%であった。T検定の結果、有意水準1%で系統Aおよび系統Bの炭疽病萎凋・枯死株率に有意な差が認められた。IA202631及びIA200826マーカーを保有していた交雑後代B系統は、炭疽病萎凋・枯死株率が低く、イチゴ炭疽病の抵抗性に優れていた。一方、IA202631及びIA200826のマーカーをいずれも保有していなかった交雑後代A系統は、炭疽病萎凋・枯死株率が高く、イチゴ炭疽病の抵抗性が劣っていた。以上の結果から、これらのマーカーを利用することで、炭疽病抵抗性に優れる系統、炭疽病抵抗性に劣る系統を判別できることが明らかとなった。
イチゴ品種さちのか、いちご中間母本農2号のゲノムDNA(15ng)に、プライマーペア(IA200826F_1AおよびIA202631R_111A)とTaq polymerase(タカラバイオ社、PrimeSTAR、0.5 unit)を加え、PCR(98℃を10秒間、55℃を5秒間、72℃を2分間、25サイクル後、72℃で3分間処理後、4℃で保存)で増幅した。PCR増幅したDNA断片は、電気泳動(2.0 %アガロースゲル、TAE、100 v 30分)により確認した。その結果を図19に示した。図19に示すように、いちご中間母本農2号では、1.4kbpのPCR増幅したDNA断片が確認された。すなわち、いちご中間母本農2号の第23連鎖群のマーカーIA204069からIA201502の領域のなかからマーカーIA202631及びIA200826を含む領域をPCRによって増幅することができた。
Claims (12)
- イチゴ属植物の染色体における配列番号1に示す塩基配列及び配列番号10に示す塩基配列により挟まれる領域に含まれる、連続する核酸領域からなる、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを検出するためのプローブ。
- 上記核酸領域は、配列番号1〜10からなる群から選ばれるいずれか1の塩基配列又は当該塩基配列の一部を含むことを特徴とする請求項1記載のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを検出するためのプローブ。
- 上記核酸領域は、イチゴ属植物の染色体における配列番号4に示す塩基配列と配列番号8に示す塩基配列とにより挟み込まれる領域に位置することを特徴とする請求項1記載のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを検出するためのプローブ。
- 少なくとも一方の親がイチゴ属植物である後代植物の染色体及び/又は当該親のイチゴ属植物の染色体を抽出する工程と、
上記で得られた染色体における、配列番号1に示す塩基配列及び配列番号10に示す塩基配列により挟まれる領域に含まれる、連続する核酸領域からなるイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を測定する工程とを含む、炭疽病抵抗性が向上したイチゴ属植物系統の製造方法。 - 上記測定する工程では、上記イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを特異的に増幅するプライマーを用いた核酸増幅反応により当該イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を測定することを特徴とする請求項4記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
- 上記測定する工程では、上記請求項1乃至3いずれか一項記載のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを検出するためのプローブを備えるDNAチップを使用することを特徴とする請求項4記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
- 上記後代植物は種子又は幼苗であり、当該種子又は幼苗から染色体を抽出することを特徴とする請求項4記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
- 上記核酸領域は、配列番号1〜10からなる群から選ばれるいずれか1の塩基配列又は当該塩基配列の一部を含むことを特徴とする請求項4記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
- 上記核酸領域は、イチゴ属植物の染色体における配列番号4に示す塩基配列と配列番号8に示す塩基配列とにより挟み込まれる領域に位置することを特徴とする請求項4記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
- イチゴ属植物の染色体における配列番号1に示す塩基配列及び配列番号10に示す塩基配列により挟まれる領域に含まれる、連続する核酸領域からなる、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを増幅するためのプライマー。
- 上記核酸領域は、配列番号1〜10からなる群から選ばれるいずれか1の塩基配列又は当該塩基配列の一部を含むことを特徴とする請求項10記載のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを増幅するためのプライマー。
- 上記核酸領域は、イチゴ属植物の染色体における配列番号4に示す塩基配列と配列番号8に示す塩基配列とにより挟み込まれる領域に位置することを特徴とする請求項10記載のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを増幅するためのプライマー。
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