WO2020009113A1 - サトウキビ属植物の黒穂病抵抗性関連マーカーとその利用 - Google Patents

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昌昭 森
木村　達郎
宏征 榎
勇助 植田
岳雄 境垣内
祐助 樽本
穣 田中
克樹 安達
太一朗 服部
周 梅田
美智子 早野
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a smut resistance-related marker capable of selecting a sugarcane plant line exhibiting smut resistance, and a method of using the same.
  • Sugar cane is cultivated for food, such as sugar and liquor, and is also used in various industrial fields, including as a biofuel material. Under these circumstances, the desired properties (e.g., sugar content, enhancement of growth potential, sprout formation ability, disease and insect resistance, cold resistance, increase in leaf length, increase in leaf area, increase in stem length, etc. There is a need to develop new varieties of sugarcane plants having
  • Non-Patent Document 1 In sugarcane, there is a report on genotyping using SSR markers in USDA (Non-Patent Document 1), but the accuracy is low due to the small number of markers and the number of polymorphisms from each marker. ⁇ Because it is limited to Australian varieties, it cannot be used for lineage identification of major varieties and useful genetic resources such as in Japan and Taiwan and India.
  • Non-Patent Document 2 suggests the possibility of creating a genetic map in sugarcane by increasing the number of markers, comparing and verifying the characteristic relationship of each marker. However, Non-Patent Document 2 does not disclose a sufficient number of markers and does not find any marker linked to the target property.
  • Patent Document 1 As a marker associated with disease resistance, a marker associated with black root disease resistance in sugar beet is known as shown in Patent Document 1. Further, as disclosed in Patent Document 2, there is disclosed a technique for selecting varieties of maize using a marker linked to a target trait.
  • smut of sugarcane has a strong infectivity of the causative microorganism, and once the disease starts, the infection spreads to the whole field.
  • Sugarcane with smut can not only be used as a raw material for sugar production but also die. For this reason, the occurrence of smut will cause a significant decrease in revenue from the next fiscal year.
  • Smut damage has been reported in more than 28 countries, including Brazil, the United States, Australia, China, and Indonesia.
  • Methods for controlling smut include sterilization treatment at the time of planting, but the effect is limited at the time of initial growth. Therefore, there is a need for growing sugarcane varieties imparted with smut resistance.
  • Patent Document 3 discloses a marker linked to smut resistance, which was prepared by preparing a large number of markers in sugarcane and analyzing the linkage between the quantitative trait and the marker in the hybrid progeny line.
  • Patent Document 3 discloses a marker linked to smut resistance
  • an object of the present invention is to provide an even more excellent smut resistance marker having a higher relevance to smut resistance.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, prepared a large number of markers using specific sugarcane varieties, by linkage analysis of quantitative traits and markers in hybrid progeny lines, The present inventors have found a marker strongly linked to a quantitative trait such as disease resistance, and have completed the present invention.
  • the present invention includes the following. (1) a region between the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the chromosome of the sugarcane; a region between the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 135 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 143; A sugarcane smut resistance-related marker consisting of a continuous nucleic acid region selected from the region sandwiched by the nucleotide sequence of 144 or 145 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 151.
  • the nucleic acid region includes any one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 6, 135 to 143, and 144 to 151 or a part of the base sequence (1).
  • the described sugarcane smut resistance-related marker is the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 or a part of the nucleotide sequence in a sugarcane chromosome.
  • nucleic acid region is one nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 138 to 140 or a part of the nucleotide sequence in a sugarcane chromosome. Sex related markers.
  • nucleic acid region is a single nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 149 and 151 or a part of the nucleotide sequence in a sugarcane chromosome. Sex related markers.
  • the nucleic acid region is characterized by being one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 298, 303, 307, 311 and 316 on the sugarcane chromosome or a part of the base sequence (1).
  • the described sugarcane smut resistance-related marker (7) a step of extracting a chromosome of a progeny plant in which at least one parent is a sugarcane plant and / or a chromosome of the parent, and the sugarcane according to any one of (1) to (6) above in the chromosome obtained above Measuring a presence / absence of a smut resistance-related marker; a method for producing a sugarcane line having improved smut resistance.
  • a novel sugarcane smut resistance-related marker linked to smut resistance among sugarcane quantitative traits can be provided.
  • smut resistance in a sugarcane cross line can be assayed.
  • a sugarcane line having characteristics with improved smut resistance can be identified at a very low cost.
  • FIG. 4 is a characteristic diagram showing the results of QTL analysis on smut resistance in Example 1.
  • FIG. 14 is a characteristic diagram showing the number of reads of AMP0121265 in each system. It is a characteristic view which shows the number of reads of AMP0120752 in each system.
  • FIG. 14 is a characteristic diagram showing the number of reads of AMP0114852 in each system.
  • FIG. 14 is a characteristic diagram showing the number of reads of AMP0089904 in each system.
  • FIG. 9 is a characteristic diagram showing the number of reads of AMP0100370 in each system.
  • FIG. 10 is a characteristic diagram showing the results of QTL analysis on smut resistance in Example 2. It is a characteristic view which shows the number of reads of AMP0014532 in each system.
  • FIG. 14 is a characteristic diagram showing the number of reads of AMP0043152 in each system. It is a characteristic view which shows the number of reads of AMP0069135 in each system.
  • FIG. 14 is a characteristic diagram showing the number of reads of AMP0002312 in each system.
  • FIG. 9 is a characteristic diagram showing the number of reads of AMP0007121 in each system.
  • FIG. 14 is a characteristic diagram showing the number of reads of AMP0090108 in each system.
  • FIG. 9 is a characteristic diagram showing the results of calculating the smut disease incidence for progeny lines crossed with “KY09-6092” and “KY08-129”.
  • FIG. 10 is a characteristic diagram showing the results of QTL analysis on smut resistance in Example 3. It is a characteristic view which shows the number of reads of AMP0063683 in each system. It is a characteristic view which shows the number of reads of AMP0082090 in each system.
  • FIG. 3 is a characteristic diagram showing the number of reads of AMP0013802 in each system. It is a characteristic view which shows the number of reads of AMP0083204 in each system. It is a characteristic view which shows the number of reads of AMP0043774 in each system.
  • FIG. 14 is a characteristic diagram showing the number of reads of AMP0094596 in each system.
  • FIG. 14 is a characteristic diagram showing the number of reads of AMP0091501 in each system.
  • the sugarcane smut resistance-related marker according to the present invention is a specific region present on the chromosome of sugarcane, linked to a causative gene (group) of a trait such as sugarcane smut resistance, and linked to sugarcane smut resistance. It has the function of distinguishing the trait of sex. That is, in a progeny line obtained by using a known sugarcane line, it is determined that the line has a trait of improving smut resistance by confirming the presence or absence of a sugarcane smut resistance-related marker. Can be.
  • smut refers to a disease in which a lesion is formed due to infection by a microorganism of the genus Ustilago.
  • Ustilago scitaminea can be mentioned as an example of the microorganism of the genus Ustilago.
  • a sugarcane smut resistance-related marker means a marker linked to a gene (group) of a trait that improves smut resistance. For example, in a specific sugarcane variety, if the marker is present, it can be determined that the variety has improved smut resistance.
  • sugarcane means a plant belonging to the genus Sugarcane in the Poaceae family.
  • sugarcane is a so-called noble species (scientific name: Saccharum officinarum) and a wild species (scientific name: Saccharum spontaneum), a barbery species (Saccharum barberi), a ancestral species of Sincharse species (Saccharum sinense), and an ancestor species of Robustum species. (Saccharum robustum).
  • Known sugarcane varieties / lines are not particularly limited, and are meant to include all varieties / lines usable in Japan, varieties / lines used outside Japan, and the like.
  • sugarcane Japanese domestic varieties are not particularly limited, Ni1, NiN2, NiF3, NiF4, NiF5, Ni6, NiN7, NiF8, Ni9, NiTn10, Ni11, Ni12, Ni14, Ni15, Ni16, Ni17, NiTn19, NiTn20 , Ni22 and Ni23.
  • the main varieties of sugarcane in Japan are not particularly limited, but include NiF8, Ni9, NiTn10 and Ni15.
  • examples of the main varieties introduced in Japan in sugarcane include, but are not particularly limited to, F177, Nco310, and F172.
  • examples of sugarcane varieties and lines include wild varieties excellent in disease resistance, and particularly wild breeds excellent in smut resistance.
  • the wild species excellent in smut resistance is not particularly limited, and examples thereof include JW90, Iriomote 15 and Iriomote 8.
  • the progeny line may be a line by inbreeding in which both the mother and father are sugarcane varieties / strains, or one of them is a sugarcane cultivar / strain and the other is a closely related Erianthus arundinaceus. Such hybrid lines may be used. Further, the progeny line may be obtained by so-called backcrossing. In particular, it is preferable that both or one of the mother and father is a wild species excellent in smut resistance, such as JW90, Iriomote 15 or Iriomote 8.
  • Sugarcane smut resistance-related markers are based on 31191 markers (4503 of which are derived from JW90) uniquely obtained from sugarcane chromosomes, and a genetic linkage map consisting of 86 linkage groups derived from JW90. It was newly identified by QTL (Quantitative Trait Loci) analysis using sugarcane smut resistance data. It should be noted that sugarcane smut resistance is a quantitative trait that is thought to involve a number of genes and has a continuous distribution. That is, sugarcane smut resistance is evaluated based on the incidence of smut that has a continuous distribution.
  • a region included in the above genetic linkage map and having a rod score (LOD score) of not less than a predetermined threshold value (for example, 2.5), a region of about 8.4 cM (centimorgan) was specified.
  • LOD score rod score
  • Morgan (M) is a unit that relatively indicates the distance between genes on a chromosome, and is a value in which the cross-valency is a percentage.
  • 1 cM corresponds to about 2000 kbp.
  • a causative gene (group) of a trait that improves smut resistance is present at or near this peak position.
  • the 8.4 cM region is a region in which the six markers shown in Table 1 among the above markers are included in this order, and is a region linked to a trait that improves smut resistance.
  • the linkage group is a number assigned to each of the plurality of linkage groups specified in the QTL analysis.
  • the marker name described in the column of the nearby marker in Table 1 is the name given to the marker uniquely obtained in the present invention.
  • the peak contained in the 8.4 cM region exists close to the marker (AMP0121265) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a continuous nucleic acid region selected from the 8.4 cM region including the markers shown in Table 1 can be used as a sugarcane smut resistance-related marker.
  • the nucleic acid region refers to a nucleotide having an identity of 95% or less, preferably 90% or less, more preferably 80% or less, and most preferably 70% or less with other regions present on the sugarcane chromosome. It means a region consisting of an array. If the identity of the nucleic acid region serving as a sugarcane smut resistance-related marker to the other region is within the above range, the nucleic acid region can be specifically detected according to a standard method. Here, the value of the identity can be calculated using default parameters using BLAST, for example.
  • the nucleotide length of the nucleic acid region serving as a sugarcane smut resistance-related marker can be at least 8 nucleotides or more, preferably 15 nucleotides or more, more preferably 20 nucleotides or more, and most preferably 30 nucleotides or more. If the nucleotide length of the nucleic acid region serving as the sugarcane smut resistance-related marker is within the above range, the nucleic acid region can be specifically detected according to a standard method.
  • the sugarcane smut resistance-related marker may be any continuous nucleic acid region selected from the 8.4 cM region described above.
  • the base sequence of the 8.4 cM region can be identified by a contiguous sequence acquisition method such as inverse PCR using primers designed based on the base sequences of SEQ ID NOS: 1 to 6.
  • the sugarcane smut resistance-related marker is preferably selected from the above-mentioned 8.4 cM region from the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the region close to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. This is because the above peak exists close to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the sugarcane smut resistance-related marker can be the above-mentioned six types of markers themselves or a part thereof. That is, one or more of these six markers can be used as a sugarcane smut resistance-related marker. In addition, partial regions of these six types of markers can be used as sugarcane smut resistance-related markers.
  • Sugarcane smut resistance-related markers were based on 64,577 markers (1166 of which were derived from progeny having Iriomote 15 as ancestors) independently obtained from the chromosome of sugarcane, and were composed of 58 linkage groups of Iriomote 15 It is newly identified by QTL (Quantitative Trait Loci) analysis using a genetic linkage map derived from the progeny of the ancestor and sugarcane smut resistance data. It should be noted that sugarcane smut resistance is a quantitative trait that is thought to involve a number of genes and has a continuous distribution.
  • sugarcane smut resistance is evaluated based on the incidence of smut that has a continuous distribution.
  • genetic analysis software QTL Cartographer Wang S., CJ Basten, and Z.-B. Zeng (2010). Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC was used.
  • CIM Composite interval mapping
  • an area of about 26.6 cM (centimorgan) contained in the genetic linkage map where the rod score (LOD score) is equal to or more than a predetermined threshold (for example, 2.5) was specified.
  • Morgan (M) is a unit that relatively indicates the distance between genes on a chromosome, and is a value in which the cross-valency is a percentage.
  • 1 cM corresponds to about 2000 kbp.
  • a causative gene (group) of a trait that improves smut resistance is present at or near this peak position.
  • the 26.6 cM region is a region in which the nine markers shown in Table 2 are included in this order among the above markers, and is a region linked to a trait that improves smut resistance.
  • the linkage group is a number assigned to each of the plurality of linkage groups specified in the QTL analysis.
  • the marker name described in the column of the nearby marker in Table 2 is the name given to the marker uniquely obtained in the present invention.
  • the peak contained in the 26.6 cM region is located between the marker (AMP0032477) consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 138 and the marker (AMP002312) consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 140. It is present in the vicinity of a marker (AMP0018405) consisting of the nucleotide sequence shown.
  • a continuous nucleic acid region selected from the 26.6 cM region including the markers shown in Table 2 can be used as a sugarcane smut resistance-related marker.
  • the nucleic acid region refers to a nucleotide having an identity of 95% or less, preferably 90% or less, more preferably 80% or less, and most preferably 70% or less with other regions present on the sugarcane chromosome. It means a region consisting of an array. If the identity of the nucleic acid region serving as a sugarcane smut resistance-related marker to the other region is within the above range, the nucleic acid region can be specifically detected according to a standard method. Here, the value of the identity can be calculated using default parameters using BLAST, for example.
  • the nucleotide length of the nucleic acid region serving as a sugarcane smut resistance-related marker can be at least 8 nucleotides or more, preferably 15 nucleotides or more, more preferably 20 nucleotides or more, and most preferably 30 nucleotides or more. If the nucleotide length of the nucleic acid region serving as the sugarcane smut resistance-related marker is within the above range, the nucleic acid region can be specifically detected according to a standard method.
  • the sugarcane smut resistance-related marker may be any continuous nucleic acid region selected from the 26.6 cM region described above.
  • the nucleotide sequence of the 26.6 cM region can be identified by a method for obtaining adjacent sequences such as inverse PCR using primers designed based on the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 135 to 143.
  • the sugarcane smut resistance-related marker is preferably selected from the 26.6 cM region described above and the region sandwiched between the base sequence shown in SEQ ID NO: 138 and the base sequence shown in SEQ ID NO: 140. Furthermore, the sugarcane smut resistance-related marker is preferably selected from the 26.6 cM region described above from the region consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 139 and the nucleotide sequence adjacent to the nucleotide sequence. This is because the above-mentioned peak is a region interposed between the base sequence shown in SEQ ID NO: 138 and the base sequence shown in SEQ ID NO: 140, and is present in close proximity to the base sequence shown in SEQ ID NO: 139.
  • the sugarcane smut resistance-related marker can be the nine types of markers themselves or a part thereof. That is, one or more of these nine markers can be used as a sugarcane smut resistance-related marker. In addition, partial regions of these nine types of markers can be used as sugarcane smut resistance-related markers.
  • sugarcane smut resistance-related markers were 117 linkage groups created based on 57,444 markers (2936 of which were derived from the progeny "KY09-6092", of which 2936 were Iriomote 8 ancestors), independently obtained from the sugarcane chromosome. Newly identified by QTL (Quantitative Trait Loci) analysis using a genetic linkage map derived from the progeny “KY09-6092” having the ancestor of Iriomote 8 consisting of “Iriomote 8” and sugarcane smut resistance data.
  • QTL Quantitative Trait Loci
  • Sugarcane smut resistance is a quantitative trait that is thought to involve a number of genes and has a continuous distribution. That is, sugarcane smut resistance is evaluated based on the incidence of smut that has a continuous distribution.
  • QTL analysis includes genetic analysis software QTLQCartographer (Wang S., C. J. Basten, and Z.-B. Zeng (2010). Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC) And the Composite interval mapping (CIM) method is applied.
  • LOD score rod score
  • centimorgan centimorgan
  • M is a unit that relatively indicates the distance between genes on a chromosome, and is a value in which the cross-valency is a percentage.
  • 1 cM corresponds to about 2000 kbp.
  • a causative gene (group) of a trait that improves smut resistance is present at or near this peak position.
  • the 12.27 cM region is a region in which the seven types of markers shown in Table 3 are included in this order among the above markers, and is a region linked to a trait that improves smut resistance.
  • the linkage group is a number assigned to each of the plurality of linkage groups specified in the QTL analysis.
  • the marker name described in the column of the nearby marker in Table 3 is the name given to the marker uniquely obtained in the present invention.
  • AMP0063683 is a nucleic acid region containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 144 and the base sequence shown in SEQ ID NO: 145 at both ends. Markers other than AMP0063683 are nucleic acid regions each containing a single base sequence.
  • the peak contained in the region of 12.27 cM is present near the marker (AMP0091501) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 151.
  • a continuous nucleic acid region selected from the 12.27 cM region containing the markers shown in Table 3 can be used as a sugarcane smut resistance-related marker.
  • the nucleic acid region refers to a nucleotide having an identity of 95% or less, preferably 90% or less, more preferably 80% or less, and most preferably 70% or less with other regions present on the sugarcane chromosome. It means a region consisting of an array. If the identity of the nucleic acid region serving as a sugarcane smut resistance-related marker to the other region is within the above range, the nucleic acid region can be specifically detected according to a standard method. Here, the value of the identity can be calculated using default parameters using BLAST, for example.
  • the nucleotide length of the nucleic acid region serving as a sugarcane smut resistance-related marker can be at least 8 nucleotides or more, preferably 15 nucleotides or more, more preferably 20 nucleotides or more, and most preferably 30 nucleotides or more. If the nucleotide length of the nucleic acid region serving as the sugarcane smut resistance-related marker is within the above range, the nucleic acid region can be specifically detected according to a standard method.
  • the sugarcane smut resistance-related marker may be any continuous nucleic acid region selected from the above-mentioned 12.27 cM region.
  • the nucleotide sequence of this 12.27 cM region can be identified by a method for obtaining adjacent sequences such as inverse PCR using primers designed based on the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 144 to 151.
  • the sugarcane smut resistance-related marker is preferably selected from the above-mentioned 12.27 cM region and the region flanked by the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 150 and the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 151. This is because the above peak exists close to the base sequence shown in SEQ ID NO: 151.
  • the sugarcane smut resistance-related marker can be the above seven types of markers themselves or a part thereof. That is, one or more of these seven markers can be used as sugarcane smut resistance-related markers. Further, partial regions of these seven types of markers can be used as sugarcane smut resistance-related markers.
  • the 12.27 cM region including the marker shown in Table 3 has a partial region partially common to the 8.4 cM region including the marker shown in Table 1. Specifically, the vicinity of the peak included in the 12.27 cM region is common in base sequence with the vicinity of the peak included in the 8.4 cM region. Specifically, among the JW90-derived sugarcane smut resistance-related markers shown in Table 1, a neighboring region containing AMP0121265 located at 0 cM and the sugarcane smut resistance-related markers derived from Iriomote 8 shown in Table 3 Neighboring regions including AMP0091501 located at 83.76 cM have a common base sequence.
  • a region for example, a causative gene that enhances sugarcane smut resistance is present in the region having the common nucleotide sequence. Therefore, it is more preferable to use the region as a marker associated with sugarcane smut resistance.
  • markers 4503 of which are derived from JW90
  • 64,557 markers of which 1,166 are derived from progeny "KY08-6023, KY08-6039, KY08-6041” having Iriomote 15 ancestor
  • 57444 The following describes the markers (derived from the progeny “KY09-6092”, of which 2936 have Iriomote 8 as their ancestors). When identifying these markers, they were prepared according to the method for preparing a DNA library described in International Publication WO 2018/003220.
  • a nucleic acid amplification reaction is performed in a reaction solution prepared by adjusting a primer having an arbitrary base sequence (hereinafter, random primer) to a high concentration, and the amplified nucleic acid fragment is used as a DNA library.
  • the high concentration means that the concentration is higher than the primer concentration in a normal nucleic acid amplification reaction.
  • the method for preparing a DNA library according to the present invention is characterized in that a random primer is used at a higher concentration than the primer concentration in a normal nucleic acid amplification reaction.
  • genomic DNA prepared from an organism for which a DNA library is to be prepared can be used as a template contained in the reaction solution.
  • the sequence of the random primer is not limited at all, and for example, a nucleotide having a length of 9 to 30 bases can be used.
  • a random primer is a nucleotide having an arbitrary sequence and a length of 9 to 30 bases, and the type of nucleotide (the type of sequence) is not particularly limited, and one or more nucleotides, preferably 1 to 10,000 nucleotides , More preferably 1 to 1000 nucleotides, more preferably 1 to 100 nucleotides, and most preferably 1 to 96 nucleotides.
  • nucleotide nucleotide group
  • an amplified nucleic acid fragment can be obtained with higher reproducibility.
  • a random primer contains a plurality of nucleotides, not all nucleotides need to have the same base length (9 to 30 bases), and may include a plurality of nucleotides having different base lengths.
  • the base sequence of a primer is designed according to the amplicon.
  • a pair of primers is designed to sandwich a position corresponding to an amplicon in a template DNA such as genomic DNA.
  • the primer is designed to hybridize to a specific region included in the template, and thus can be referred to as a “specific primer”.
  • random primers unlike primers designed to obtain a specific amplicon, are not designed to hybridize to a specific region in a template DNA, but rather obtain a random amplicon. Designed for.
  • the random primer may have any base sequence, and can participate in random amplicon amplification by accidentally hybridizing to a complementary region contained in the template DNA.
  • a random primer can be a nucleotide having an arbitrary sequence involved in random amplicon amplification.
  • the arbitrary sequence is not limited at all.
  • it may be designed as a base sequence randomly selected from the group of adenine, guanine, cytosine and thymine, or may be designed as a specific base sequence.
  • Specific base sequences include, for example, a base sequence including a restriction enzyme recognition sequence and a base sequence having an adapter sequence used in a next-generation sequencer.
  • a method of randomly selecting from the group of adenine, guanine, cytosine and thymine and designing a plurality of base sequences of a predetermined length can be applied.
  • a method of designing a plurality of types of nucleotides as random primers a method of designing a plurality of base sequences each consisting of a common portion consisting of a specific base sequence and a non-common portion consisting of an arbitrary base sequence can also be applied.
  • the non-common portion may be a base sequence randomly selected from the group of adenine, guanine, cytosine and thymine, or a combination of all four types of bases consisting of adenine, guanine, cytosine and thymine, or Some combinations selected from all these combinations can be used.
  • the common portion is not particularly limited, and may be any base sequence.For example, a base sequence including a restriction enzyme recognition sequence, a base sequence having an adapter sequence used for a next-generation sequencer, a base sequence common to a specific gene family, can do.
  • n can be 1 to 5, preferably 2 to 4, and more preferably 2 to 3.
  • a random primer consisting of a common part and a non-common part an adapter sequence (common part) used for the next-generation sequencer was used at the 5 ′ end, and two bases (non-common part) were used at the 3 ′ end.
  • a total of 16 random primers can be designed. If the 3'-terminal side is 3 bases (non-common portion), a total of 64 types of random primers can be designed. The more types of random primers, the more comprehensively amplified fragments can be obtained over the entire genomic DNA of the target species. Therefore, when designing a random primer consisting of a common part and a non-common part, it is preferable that the 3'-terminal base is three bases.
  • 63 or less random primers selected from these 64 types of base sequences may be used.
  • 63 or less random primers shows superior results in the nucleic acid amplification reaction or analysis using the next-generation sequencer as compared to the case where all 64 random primers are used.
  • the concentration of the random primer is appropriately set according to the base length of the random primer.
  • the base length of the random primer is an average value thereof (a simple average or a weighted average considering nucleotide amounts). be able to.
  • a random primer having a length of 9 to 30 bases is used, and the nucleic acid amplification reaction is performed under the conditions of the concentration of the random primer being 4 to 200 ⁇ M, preferably 4 to 100 ⁇ M. Under these conditions, a large number of amplified fragments, particularly a large number of amplified fragments having a length of 100 to 500 bases, can be obtained by the nucleic acid amplification reaction while achieving high reproducibility.
  • the concentration of the random primer is preferably 40 to 60 ⁇ M when the random primer has a length of 9 to 10 bases.
  • the base length of the random primer is y, and when the concentration of the random primer is x, y> 3E + 08x ⁇ 6.974 and 100 ⁇ M or less Is preferred.
  • the concentration of the random primer is preferably 4 to 100 ⁇ M.
  • the concentration of the random primer is preferably 4 ⁇ M or more, and y ⁇ 8E + 08x ⁇ 5.533 is preferably satisfied.
  • the concentration of the random primer is preferably 6 to 10 ⁇ M.
  • the genomic DNA used as a template in the nucleic acid amplification reaction is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 1000 ng, more preferably 1 to 500 ng when the volume of the reaction solution is 50 ⁇ l. It is more preferably 5 to 200 ng, most preferably 10 to 100 ng.
  • the amount of the genomic DNA serving as the template within this range, a large number of amplified fragments can be obtained while achieving high reproducibility without inhibiting the amplification reaction from random primers.
  • a DNA library can be prepared from sugarcane having excellent smut resistance, and a DNA library can be prepared from sugarcane having smut resistance.
  • a fragment specific to a DNA library made from sugarcane with excellent smut resistance is selected. can do.
  • the present inventors crossed a wild-type sugarcane variety “JW90” to a progeny line (3 lines) obtained by crossing a known sugarcane variety “NiF8” with a wild-type sugarcane “Iriomote 15”.
  • the above-mentioned DNA library is prepared for each progeny line (33 lines, 35 lines, and 35 lines) obtained as described above.
  • genotype data is obtained from the read number data obtained by subjecting the DNA library to a next-generation sequencer, and based on the genotype data, a genetic mapping software AntMap (Iwata H, Ninomiya S (2006) AntMap: constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm.
  • the present inventors obtained a progeny line obtained by crossing a sugarcane wild species ⁇ Iriomote 8 '' with a known sugarcane variety ⁇ NiF8 '' and a sugarcane variety ⁇ NiTn18 '' with ⁇ NiTn24 ''
  • the above-described DNA library is prepared.
  • genotype data is obtained from the read number data obtained by subjecting the DNA library to a next-generation sequencer, and based on the genotype data, a genetic mapping software AntMap (Iwata H, Ninomiya S (2006) AntMap: constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm.
  • ⁇ Use of markers associated with sugarcane smut resistance> By using the sugarcane smut resistance-related marker, it is possible to determine whether the smut resistance phenotype of a progeny line or the like is a line showing an phenotype of improving smut resistance in an unknown sugarcane line. .
  • the sugarcane smut resistance-related marker one nucleic acid region included in the 8.4 cM region described above may be used, or a plurality of nucleic acid regions included in the 8.4 cM region described above may be used.
  • one nucleic acid region included in the above 26.6 cM region may be used, or a plurality of nucleic acid regions included in the above 26.6 cM region may be used.
  • one nucleic acid region contained in the above-mentioned 12.27 cM region may be used, or a plurality of nucleic acid regions contained in the above-mentioned 12.27 cM region may be used.
  • sugarcane smut resistance-related marker one or more nucleic acid regions contained in the 8.4 cM region described above, one or more nucleic acid regions contained in the 26.6 cM region described above and the 12.27 cM region described above.
  • a nucleic acid region selected from one or more included nucleic acid regions may be used.
  • the use of the sugarcane smut resistance-related marker refers to a form using a nucleic acid amplification reaction using a primer pair that specifically amplifies the marker, a form using a DNA microarray having a probe corresponding to the marker, It is a meaning including.
  • a primer pair for specifically amplifying the sugarcane smut resistance-related marker is appropriately designed based on the base sequence of the 8.4 cM region described above, the base sequence of the 26.6 cM region described above, and the base sequence of the 12.27 cM region described above. be able to.
  • the primer pair is contained in the above-mentioned 8.4 cM region, the above-mentioned nucleotide sequence of the 26.6 cM region and the above-mentioned nucleotide sequence of the 12.27 cM region, for example, a length of 1 kbp or less, or a length of 800 bp or less, or 500 bp or less.
  • the primer pair can be designed so as to amplify all or a part of the nucleic acid region consisting of the nucleotide sequence shown in any of SEQ ID NOS: 1 to 6, 135 to 143 and 144 (145) to 151. .
  • 10 consecutive bases contained in any of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 6, 135 to 143 and 144 (145) to 151 can be used, and 20 consecutive bases can be used.
  • a probe corresponding to a sugarcane smut resistance-related marker refers to an oligonucleotide that can specifically hybridize under stringent conditions to the sugarcane smut resistance-related marker defined above.
  • Such oligonucleotides include, for example, at least 10 bases, 15 bases, 20 bases, 25 bases, 30 bases, and 35 bases of the nucleotide sequence of the sugarcane smut resistance-related marker defined as described above or a complementary strand thereof. It can be designed as a partial region or a whole region having a base length of 40, 45, 50 or more bases.
  • this probe can be used by being fixed to a carrier.
  • any type of microarray such as a microarray using a flat substrate such as glass or silicone as a carrier, a bead array using microbeads as a carrier, or a three-dimensional microarray fixing a probe on the inner wall of a hollow fiber may be used.
  • the DNA microarray prepared as described above is a line that shows a phenotype of improving smut resistance to sugarcane lines whose smut resistance phenotype, such as progeny lines, is unknown. Can be determined.
  • the sugarcane smut resistance related marker described above is detected using a conventionally known method, and the smut resistance phenotype is unknown for the sugarcane line. It may be determined whether the strain has a trait of improving smut resistance.
  • genomic DNA is extracted from the test sugarcane.
  • the test sugarcane is a parental sugarcane line used when producing a smut resistant phenotype of a progeny line such as a sugarcane line and / or a progeny line, and has improved smut resistance.
  • This is a sugarcane line to be determined whether or not it has the trait of Plants other than sugarcane, for example, grasses such as sorghum and Erianthus may be used as test plants, and the smut resistance in these test plants may be evaluated.
  • a marker associated with sugarcane smut resistance is amplified by a nucleic acid amplification reaction using the extracted genomic DNA as a template and the above-mentioned primer pair.
  • the label can be added to the amplified genomic DNA fragment by adding a label such as a fluorescent dye to one of the primers. Any conventionally known substance may be used as the label.
  • a fluorescent molecule, a dye molecule, a radioactive molecule and the like can be used as the label.
  • the labeled genomic DNA fragment is brought into contact with the DNA microarray under predetermined conditions, and the probe fixed on the DNA microarray is hybridized with the labeled genomic DNA fragment.
  • high stringency conditions when performing hybridization. Under such high stringency conditions, it is possible to determine with higher accuracy whether or not a sugarcane smut resistance-related marker is present in the test sugarcane.
  • stringency conditions can be adjusted by reaction temperature and salt concentration. That is, higher temperatures result in higher stringency conditions, and lower salt concentrations result in higher stringency conditions. For example, when a probe having a length of 50 to 75 bases is used, higher stringency conditions can be obtained by setting the hybridization conditions to 40 to 44 ° C., 0.21 SDS, and 6 ⁇ SSC.
  • hybridization between the probe and the labeled genomic DNA fragment can be detected based on the label. That is, after the hybridization reaction of the probe with the genomic DNA fragment having the above-described label, the unreacted genomic DNA fragment and the like are washed, and thereafter, the label of the genomic DNA fragment specifically hybridized to the probe is observed. .
  • the label is a fluorescent substance
  • the fluorescence wavelength is detected
  • the label is a dye molecule
  • the dye wavelength is detected.
  • a device such as a fluorescence detection device or an image analyzer used for ordinary DNA microarray analysis can be used.
  • a marker associated with sugarcane smut resistance in genomic DNA extracted from a test sugarcane can be detected. For example, by using the genomic DNA extracted from the test sugarcane as a template and measuring the number of sugarcane smut resistance-related markers read using a next-generation sequencer, it is determined whether or not the sugarcane smut resistance-related marker is present. It can be determined with high accuracy.
  • the test sugarcane has the above-mentioned sugarcane smut resistance-related marker by using the above-described DNA microarray or next-generation sequencer.
  • the sugarcane smut resistance-related marker is a marker linked to a trait that improves smut resistance. Therefore, if a sugarcane smut resistance-related marker is present in the test sugarcane, it can be determined that the variety has improved smut resistance.
  • sugarcane smut resistance-related marker it is possible to significantly reduce the cost for the growth of the test sugarcane in the field and in other fields.
  • sugarcane smut resistance-related markers eliminates the need to actually infect the smut disease-causing microorganism (Ustilago scitaminea), making it possible to use such facilities as large-scale dedicated greenhouses, dedicated fields, and isolation facilities from outside. Such costs can be reduced.
  • a new sugarcane variety when a new sugarcane variety is produced, first, the presence or absence of a sugarcane smut resistance-related marker in a parent variety used for crossing can be determined, and a parent variety excellent in smut resistance can be selected.
  • a parent variety excellent in smut resistance By preferentially using the parent varieties excellent in smut resistance to produce progeny lines, it can be expected that progeny lines excellent in smut resistance will appear frequently. Thereby, the number of cultivating excellent lines can be greatly reduced, and the labor and cost involved in producing new varieties of sugarcane can be significantly reduced.
  • Example 1 Materials Sugarcane varieties “NiF8”, wild sugarcane “Iriomote 15”, and “NiF8” crossed with “Iriomote 15", three progeny lines “KY08-6023”, “KY08-6039”, “KY08-6041”, Genomic DNA was extracted and purified using a DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) for each of 33, 35, and 35 progeny lines in which the sugarcane wild type “JW90” was crossed to these three progeny lines, respectively.
  • QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit
  • a DNA library was prepared according to the method for preparing a DNA library described in International Publication WO 2018/003220. That is, 15.0 ng of the genomic DNA obtained in (1) above was added with a final concentration of 0.2 mM dNTP mixture, and 0.625 units of Prime STAR DNA Polymerase (Takara Bio Inc.) with 60 ⁇ M random primer, respectively, and PCR was performed in a final reaction volume of 25 ⁇ l. The reaction was performed at 98 ° C for 2 minutes, 30 cycles of 98 ° C for 10 seconds, 50 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 20 seconds, and finally stored at 4 ° C.
  • Table 4 summarizes the random primers used in this example.
  • Table 6 shows a total of 115 combinations for the 6 systems of NiF8, Iriomote 15, KY08-6023, KY08-6039, KY08-6041, and JW90 (two repetitions).
  • the inoculated seedlings were cultured for 2-3 days under room temperature and high humidity conditions and planted in nursery boxes (40 buds / box, 2 boxes / line). After planting the seedlings, they were cultivated in a greenhouse under high humidity conditions. In the investigation of the degree of smut disease, the number of strains where the flagellate, which is a sign of sickness, was exposed from the top was measured, and the number was determined as the number of affected strains. After investigating the number of diseased strains, the plants of the diseased strains were cut off and removed from the ground. The smut disease incidence was calculated as the ratio of the number of diseased strains to the number of germinated strains (excluding dead strains other than smut) (smut disease incidence). Fig.
  • FIG. 1 (A) shows the results of calculating the smut disease incidence for progeny obtained by crossing "KY08-6023" with “JW90", and crossing "KY08-6039” with “JW90".
  • the results of calculating the smut disease incidence for the obtained progeny are shown in FIG. 1 (B), and the results of calculating the smut disease incidence for the progeny obtained by crossing "KY08-6041" and "JW90" are shown. This is shown in FIG.
  • the genotype of each marker that is, whether or not the test line has the above-mentioned selection marker is determined by setting the threshold value of the number of reads to 10 and “present” when the number of reads is 10 or more. When it was less than the above, it was determined as “absent” (FIGS. 3 to 8, Table 8).
  • Example 2 sugarcane smut resistance-related markers were identified based on the genotype data of 4503 genotypes belonging to the JW90 type among the genotype data of 31191 markers. In this example, genotype data belonging to type 15 of Iriomote was collected, and a marker associated with sugarcane smut resistance was identified in the same manner.
  • next-generation sequencer analysis was repeated twice on the DNA library prepared in Example 1 in order to increase the number of genotype data belonging to type 15 of Iriomote. From the read data thus obtained, analysis was performed using analysis software GRAS-Di (Toyota Motor Corporation) to obtain genotype data of 64,557 markers.
  • GRAS-Di Toyota Motor Corporation
  • the genetic map creation software AntMap ⁇ (Iwata H, Using Ninomiya S (2006) AntMap: constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm. Breed Sci 56: 371-377), we obtained genetic map data consisting of 58 linkage groups using the genetic distance calculation formula Kosambi.
  • the 58 linkage groups include genotype data of 4503 markers belonging to the progeny “KY08-6023, KY08-6039, KY08-6041” having Iriomote 15 as an ancestor.
  • the range of the section of markers 15 of the 15th linkage group found in Example 2 from AMP0014532 to AMP0015886 has a lower LOD value than the QTL described in International Publication No. WO2012 / 147635. It was remarkably high and the effect was remarkably improved.
  • the markers AMP0014532, AMP0043152, AMP0069135, AMP0032477, AMP0018405, AMP0002312, AMP0007121, AMP0090108, AMP0015886 contained in the sugarcane smut resistant QTL region thus confirmed were selected as the selection markers (Table 10). ).
  • the genotype of each marker that is, whether or not the test line has the above-mentioned selection marker, was determined by setting the threshold value of the number of reads to 10; 10-18, Table 11).
  • a DNA library for a next-generation sequencer was prepared in the same manner as in Example 1 except that the forward primer shown in Table 12 was used instead of the forward primer shown in Table 5.
  • the read data was analyzed using the analysis software GRAS-Di (Toyota Motor Corporation) to obtain genotype data of 57444 markers.
  • FIG. 19 shows the results of obtaining smut disease test data for 154 progeny lines crossed with “KY09-6092” and “KY08-129” under the same conditions as in Example 1 and calculating the smut disease incidence. Indicated.
  • the range of markers AMP0063683 to AMP0091501 of the eighth linkage group found in this example has a significantly higher LOD value than the QTL described in International Publication WO2012 / 147635. It was also confirmed that the effect was significantly improved. Markers (AMP0063683, AMP0082090, AMP0013802, AMP0083204, AMP0043774, AMP0094596 and AMP0091501) contained in the sugarcane smut resistance QTL region confirmed in this example were selected as selection markers (Table 14).
  • AMP0063683 has a PCR product size of 200 bp or more. Therefore, Read 1 (SEQ ID NO: 144) and Read 2 (SEQ ID NO: 145) whose base sequences were determined by the next-generation sequencer were used. ) At both ends.
  • the genotype of each marker that is, whether or not the test line has the above-mentioned selection marker is determined by setting the threshold value of the number of reads to 10 and “present” when the number of reads is 10 or more. If it is less than the above, it was determined as “absent” (FIGS. 21 to 27, Table 15).
  • Example 4 the region containing the JW90-derived sugarcane smut resistance-related marker identified in Example 1 and the sugarcane smut resistance-related marker derived from Iriomote 8 identified in Example 3
  • the nucleotide sequences of about 12.27 cM regions were compared.
  • the vicinity region including AMP0121265 located at 0 cM and the sugarcane smut resistance-related from Iriomote 8 identified in Example 3 It became clear that a plurality of markers having the same base sequence were contained in the vicinity region including AMP0091501 located at 83.76 cM among the markers.
  • Table 16 summarizes the markers contained in the vicinity region including AMP0121265 located at 0 cM among the sugarcane smut disease-related markers derived from JW90 identified in Example 1.
  • markers associated with sugarcane smut disease resistance derived from Iriomote 8 identified in Example 3 markers included in the neighboring region containing AMP0091501 located at 83.76 cM are summarized in Table 17.
  • Tables 16 and 17 in the column of nucleotide sequence information for each marker, if a contig sequence can be derived from a pair of read data read by the next-generation sequencer analysis, the nucleotide sequence of the contig sequence is described.
  • each marker shown in Tables 16 and 17 can be defined by the nucleotide sequence of the contig sequence, or can be defined by the nucleotide sequence of the lead sequence 1 and the nucleotide sequence of the lead sequence 2.
  • markers listed in Table 16 those having the same base sequence as the markers contained in the neighboring region including AMP0179276 listed in Table 17 are referred to as “presence or absence of DNA marker derived from Iriomote 8 (): Iriomote 8 marker ID”
  • the ID of a marker derived from Iriomote 8 having the same base sequence as ⁇ is described.
  • those having the same nucleotide sequence as the marker contained in the neighboring region including AMP0121265 listed in Table 16 are referred to as “presence / absence of JW90-derived DNA marker (): JW90 marker ID”.
  • the ID of a JW90-derived marker having the same nucleotide sequence are examples having the same nucleotide sequence.
  • the sugarcane smut resistance-related markers As shown in Table 16, of the JW90-derived sugarcane smut resistance-related markers, 36 markers were included in the vicinity region including AMP0121265 located at 0 cM, and as shown in Table 17, from Iri Table 8 Among the sugarcane smut resistance-related markers, 18 markers were contained in the vicinity region including AMP0091501 located at 83.76 cM. Of these, five markers were found to have the same base sequence. From these results, the region containing the 36 markers shown in Table 16 and the region containing the 18 markers shown in Table 17 can be understood as QTLs strongly associated with the resistance to sugarcane smut. In particular, since the sugarcane smut resistance QTL specified in this example is present in both JW90 and Iriomote 8, it is considered that the sugarcane varieties exist in a wide variety of sugarcane varieties without particular limitation.
  • this example showed that the 36 markers shown in Table 16 and the 18 markers shown in Table 17 can be used as particularly excellent sugarcane smut resistance-related markers.

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Abstract

黒穂病抵抗性をより高精度に判定する。　サトウキビの染色体における配列番号１に示す塩基配列及び配列番号６に示す塩基配列により挟まれる領域；配列番号１３５に示す塩基配列及び配列番号１４３に示す塩基配列により挟まれる領域；又は配列番号１４４若しくは１４５に示す塩基配列及び配列番号１５１に示す塩基配列により挟まれる領域から選ばれる連続する核酸領域からなる、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。

Description

サトウキビ属植物の黒穂病抵抗性関連マーカーとその利用
　本発明は、黒穂病に対する抵抗性を示すサトウキビ属植物系統を選抜することができる黒穂病抵抗性関連マーカー及びその利用方法に関する。
　サトウキビは、砂糖の原料、酒類原料など、食用に栽培されている他、バイオ燃料原料としての利用を含む様々な産業分野で利用されている。このような状況下、所望の特性(例えば、糖含有量、生長力の増強、新芽形成能、耐病性及び虫害抵抗性、耐寒性、葉長の増大、葉面積の増大、茎長の増大など)を有するサトウキビ植物の新品種を開発するニーズがある。
　一般に、植物品種・系統の識別として、特性データを比較する「特性比較」、同一条件で栽培し比較する「比較栽培」、DNAを解析する「DNA分析」の3つの方法がある。特性比較および比較栽培による系統識別は、栽培条件の違いによる精度低下や多大な工数が必要とされる長期間の圃場調査など多くの問題を抱える。特に、サトウキビは、イネやトウモロコシなど、他のイネ科作物と比べ植物体が極めて大きく、圃場調査による系統識別の実施が困難である。
　また、特定の病害に対する抵抗性品種を識別するには、サトウキビを長期間栽培した後、病害原因微生物を接種する試験を行い、その後、病班等を観察することで抵抗性データを収集する。しかし、当該試験を行うには、外部環境に対する病害原因微生物の伝搬を確実に防止しなければならず、大規模専用温室や専用圃場、外部との隔離施設など設備が必要となる。さらに、サトウキビの新品種作出には、先ず、交配により数万種類の交配種子を作製し、そこから実生選抜、さらに優良な系統を段階的に選抜し、最終的に所望な特性を有する２～３系統の新品種候補を得ることができる。このように、サトウキビの新品種作出には、非常に多くの系統を栽培・評価する必要があり、上述したような温室や圃場を準備して多大な手間をかける必要がある。
　したがって、病害抵抗性を示すサトウキビ系統を、ゲノムに存在するマーカーを用いて識別する方法の開発が求められている。特に、サトウキビにおける新品種作出に際して、種々の特性について優れたマーカーが使用できれば、上述したようなサトウキビに特有の諸問題を回避でき、非常に有効なツールとなりうる。しかしながら、サトウキビ植物は、高次倍数性で染色体数が多いため（約100～130）、マーカー技術開発が遅れている。サトウキビでは、USDAにおいてSSRマーカーを用いた遺伝子型決定に関する報告があるものの(非特許文献１)、マーカー数及び各マーカーからの多型数が少ないことに起因して精度が低く、適用範囲がアメリカ・オーストラリア品種に限られるため、日本国内および台湾・インドなどの主要品種および有用な遺伝資源の系統識別に利用できない。
　また、非特許文献２は、マーカー数を増やし、各々のマーカーの特性関係を比較し、検証することでサトウキビにおける遺伝子地図を作成する可能性を示唆している。しかしながら、非特許文献２には、十分な数のマーカーが開示されておらず、目的とする特性に連鎖したマーカーも見つかっていない。
　一方、病害抵抗性に関連するマーカーとしては、特許文献１に示すように、テンサイにおける黒根病抵抗性関連マーカーが知られている。また、特許文献２に示すように、トウモロコシにおいて、目的とする形質に連鎖したマーカーを利用して品種を選抜する技術が開示されている。
　一方、サトウキビの黒穂病は、原因微生物の感染力が強く、一旦発病すると圃場全体に感染が拡大する。黒穂病に罹病したサトウキビは、製糖用原料として利用できないだけではなく枯死する。このため、黒穂病の発生は、次年度以降における大幅な減収を引き起こす。黒穂病の被害は、ブラジル、アメリカ、オーストラリア、中国、インドネシアなど28ヶ国以上で報告がある。黒穂病の防除方法には、植付時の殺菌処理があるが、初期生育時に効果が限定される。しがって、黒穂病の抵抗性を付与したサトウキビ品種の育成が求められている。
　そして、特許文献３には、サトウキビにおける多数のマーカーを準備し、交雑後代系統における量的形質とマーカーとの連鎖解析によって見いだされた、黒穂病抵抗性に連鎖するマーカーが開示されている。
Maydica 48(2003),319-329 "Molecular genotyping of sugarcane clones with microsatellite DNA markers" Nathalie Piperidis et al., Molecular Breeding, 2008, Vol 21, 233-247
WO 2007/125958 特表2010-516236号公報 WO 2012/147635
　しかしながら、特許文献３に黒穂病抵抗性に連鎖するマーカーが開示されるものの、黒穂病抵抗性に対する関連性がより高い更に優れた黒穂病抵抗性マーカーが求められていた。そこで、本発明は、このような実情に鑑み、黒穂病抵抗性に対する関連性がより高い更に優れた黒穂病抵抗性マーカーを提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、特定のサトウキビ品種を用いて多数のマーカーを準備し、交雑後代系統における量的形質とマーカーとの連鎖解析によって、黒穂病抵抗性といった量的形質に強く連鎖するマーカーを見いだし、本発明を完成するに至った。
　本発明は以下を包含する。
　（１）サトウキビの染色体における配列番号１に示す塩基配列及び配列番号６に示す塩基配列により挟まれる領域；配列番号１３５に示す塩基配列及び配列番号１４３に示す塩基配列により挟まれる領域；又は配列番号１４４若しくは１４５に示す塩基配列及び配列番号１５１に示す塩基配列により挟まれる領域から選ばれる連続する核酸領域からなる、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。
　（２）上記核酸領域は、配列番号１～６、１３５～１４３及び１４４～１５１からなる群から選ばれるいずれか１の塩基配列又は当該塩基配列の一部を含むことを特徴とする（１）記載のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。
　（３）上記核酸領域は、サトウキビの染色体における配列番号１若しくは２に示す塩基配列又は当該塩基配列の一部であることを特徴とする（１）記載のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。
　（４）上記核酸領域は、サトウキビの染色体における配列番号１３８～１４０からなる群から選ばれる１つの塩基配列又は当該塩基配列の一部であることを特徴とする（１）記載のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。
　（５）上記核酸領域は、サトウキビの染色体における配列番号１４９若しくは１５１からなる群から選ばれる１つの塩基配列又は当該塩基配列の一部であることを特徴とする（１）記載のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。
　（６）上記核酸領域は、サトウキビの染色体における配列番号２９８、３０３、３０７、３１１及び３１６からなる群から選ばれる１つの塩基配列又は当該塩基配列の一部であることを特徴とする（１）記載のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。
　（７）少なくとも一方の親がサトウキビ植物である後代植物の染色体及び/又は当該親の染色体を抽出する工程と、上記で得られた染色体における上記（１）～（６）いずれかに記載のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を測定する工程とを含む、黒穂病抵抗性が向上したサトウキビ系統の製造方法。
　（８）上記測定する工程では、上記サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーに対応するプローブを備えるDNAチップを使用することを特徴とする（７）記載のサトウキビ系統の製造方法。
　（９）上記後代植物は種子又は幼苗であり、当該種子又は幼苗から染色体を抽出することを特徴とする（７）記載のサトウキビ系統の製造方法。 
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-127142号、2018-197546号及び2019-122913号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、サトウキビにおける量的形質の中でも黒穂病抵抗性に連鎖する新規なサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを提供することができる。本発明に係るサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを利用することによって、サトウキビの交配系統における黒穂病抵抗性を検定することができる。これにより、黒穂病抵抗性が向上した特性を有するサトウキビ系統を非常に低コストに識別することができる。
（Ａ）：「KY08－6023」と「JW90」とを交配して得られた後代について黒穂病罹病率を計算した結果、（Ｂ）：「KY08－6039」と「JW90」とを交配して得られた後代について黒穂病罹病率を計算した結果、（Ｃ）：「KY08－6041」と「JW90」とを交配して得られた後代について黒穂病罹病率を計算した結果を示す特性図である。 実施例１における黒穂病抵抗性に関するQTL解析の結果を示す特性図である。 各系統におけるAMP0121265のリード数を示す特性図である。 各系統におけるAMP0120752のリード数を示す特性図である。 各系統におけるAMP0035185のリード数を示す特性図である。 各系統におけるAMP0114852のリード数を示す特性図である。 各系統におけるAMP0089904のリード数を示す特性図である。 各系統におけるAMP0100370のリード数を示す特性図である。 実施例２における黒穂病抵抗性に関するQTL解析の結果を示す特性図である。 各系統におけるAMP0014532のリード数を示す特性図である。 各系統におけるAMP0043152のリード数を示す特性図である。 各系統におけるAMP0069135のリード数を示す特性図である。 各系統におけるAMP0032477のリード数を示す特性図である。 各系統におけるAMP0018405のリード数を示す特性図である。 各系統におけるAMP0002312のリード数を示す特性図である。 各系統におけるAMP0007121のリード数を示す特性図である。 各系統におけるAMP0090108のリード数を示す特性図である。 各系統におけるAMP0015886のリード数を示す特性図である。 「KY09－6092」及び「KY08－129」を交配した後代系統について黒穂病罹病率を計算した結果を示す特性図である。 実施例３における黒穂病抵抗性に関するQTL解析の結果を示す特性図である。 各系統におけるAMP0063683のリード数を示す特性図である。 各系統におけるAMP0082090のリード数を示す特性図である。 各系統におけるAMP0013802のリード数を示す特性図である。 各系統におけるAMP0083204のリード数を示す特性図である。 各系統におけるAMP0043774のリード数を示す特性図である。 各系統におけるAMP0094596のリード数を示す特性図である。 各系統におけるAMP0091501のリード数を示す特性図である。
　以下、本発明に係るサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー及びその利用方法、特にサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを用いたサトウキビ系統の製造方法について説明する。
＜サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー＞
　本発明に係るサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとは、サトウキビの染色体上に存在する特定の領域であり、サトウキビの黒穂病抵抗性といった形質の原因遺伝子（群）に連鎖して、サトウキビ黒穂病抵抗性という形質を判別できる機能を有する。すなわち、既知のサトウキビ系統を用いて得られた後代系統において、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を確認することで黒穂病抵抗性の向上という形質を有する系統であると判断することができる。なお、本発明において、黒穂病とは、Ustilago属の微生物が感染することに起因して病班が形成される病気を意味している。Ustilago属の微生物としては、一例としてUstilago scitamineaを挙げることができる。
　また、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとは、黒穂病抵抗性が向上する形質の原因遺伝子（群）に連鎖するマーカーの意味である。例えば、特定のサトウキビ品種において、当該マーカーが存在していれば黒穂病抵抗性が向上した品種と判断できる。
　ここで、サトウキビとは、イネ科サトウキビ属に属する植物を意味する。また、サトウキビとは、所謂、高貴種（学名：Saccharum officinarum）と野生種（学名：Saccharum spontaneum）、バルベリ種（Saccharum barberi）、シネンセ種（Saccharum sinense）、オフィシナルム種の祖先種であるロバスタム種（Saccharum robustum）のいずれも含むことを意味する。既知のサトウキビ品種・系統としては、特に限定されず、日本国内にて使用可能なあらゆる品種・系統、日本国外において使用されている品種・系統等を含む意味である。例えば、サトウキビ日本国内育成品種としては、特に限定されないが、Ni1、NiN2、NiF3、NiF4、NiF5、Ni6、NiN7、NiF8、Ni9、NiTn10、Ni11、Ni12、Ni14、Ni15、Ni16、Ni17、NiTn19、NiTn20、Ni22及びNi23等を挙げることができる。また、サトウキビ日本国内主要品種としては、特に限定されないが、NiF8、Ni9、NiTn10及びNi15等を挙げることができる。さらに、サトウキビ日本国内導入主要品種としては、特に限定されないが、F177、Nco310及びF172等を挙げることができる。さらに、サトウキビ品種・系統としては、特に病害抵抗性に優れた野生種、中でも黒穂病抵抗性に優れた野生種を挙げることができる。黒穂病抵抗性に優れた野生種としては、特に限定されないが、例えば、JW90、西表１５及び西表８等を挙げることができる。
　また、後代系統は、母本及び父本の両方がサトウキビ品種・系統である同種交配による系統であっても良いし、いずれか一方がサトウキビ品種・系統であり他方が近縁のErianthus arundinaceusであるような交雑系統であっても良い。また、後代系統は、いわゆる戻し交配によって得られたものでも良い。特に、母本及び父本の両方又は一方が黒穂病抵抗性に優れた野生種、例えばJW90、西表１５又は西表８であることが好ましい。
＜サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーの例１＞
　サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーは、サトウキビの染色体から独自に取得した31191個のマーカー（そのうち4503個がJW90由来）を基に作成した、JW90を由来とする86の連鎖群からなる遺伝子連鎖地図とサトウキビ黒穂病抵抗性データとを用いたQTL（Quantitative Trait Loci）解析によって新たに同定されたものである。なお、サトウキビ黒穂病抵抗性は、多数の遺伝子が関与していると考えられ、連続分布をとる量的形質である。すなわち、サトウキビ黒穂病抵抗性は、連続分布をとる黒穂病への罹患率に基づいて評価される。QTL解析には、遺伝解析ソフトQTL Cartographer（Wang S., C. J. Basten, and Z.-B. Zeng (2010). Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC）を使用し、Composite interval mapping（CIM）法を適用している。
　具体的に、上述したQTL解析により、ロッドスコア（LOD score）が所定の閾値（例えば2.5）以上となる上記遺伝子連鎖地図に含まれる領域、約8.4cM（センチモルガン）の領域を特定した。ここで、「モルガン（Ｍ）」は、染色体上の遺伝子間の距離を相対的に示した単位であり、交叉価をパーセントにした値である。サトウキビの染色体において、1cMは、約2000kbpに相当する。なお、このピーク位置又はその近傍には、黒穂病抵抗性を向上させる形質の原因遺伝子（群）が存在することが示唆される。
　上記8.4cMの領域は、上記マーカーのうち表１に示す６種類のマーカーがこの順で含まれる領域であり、黒穂病抵抗性が向上する形質に連鎖する領域である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　なお、表１において、連鎖群とは、QTL解析において特定された複数の連鎖群についてそれぞれ付された番号である。表１において近傍マーカーの欄に記載したマーカー名は、本発明で独自に取得したマーカーに付された名称である。
　また、8.4cMの領域に含まれるピークは、配列番号１に示す塩基配列からなるマーカー（AMP0121265）に近接して存在している。
　表１に示したマーカーが含まれる8.4cM領域から選ばれる連続した核酸領域を、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして使用することができる。ここで、核酸領域とは、サトウキビの染色体に存在する他の領域との同一性が９５％以下、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、最も好ましくは７０％以下となるような塩基配列からなる領域を意味する。サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとなる核酸領域と他の領域との同一性が上記範囲であれば、定法に従って、当該核酸領域を特異的に検出することができる。ここで、同一性の値は、例えばＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出することができる。
　サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとなる核酸領域の塩基長は、少なくとも８塩基長以上、好ましくは１５塩基長以上、より好ましくは２０塩基長以上、最も好ましくは３０塩基長とすることができる。サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとなる核酸領域の塩基長が上記範囲であれば、定法に従って、当該核酸領域を特異的に検出することができる。
　サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとしては、上述した8.4cMの領域から選ばれる如何なる連続した核酸領域でもよい。なお、この8.4cMの領域の塩基配列については、配列番号１～６の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いたインバースPCR等の隣接配列取得法によって特定することができる。
　特に、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとしては、上述した8.4cMの領域のうち、配列番号１に示す塩基配列又は配列番号２に示す塩基配列と近接した領域から選ばれることが好ましい。上記ピークが配列番号１に示す塩基配列と近接して存在するためである。
　また、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーは、上記６種類のマーカーそのもの又はその一部とすることができる。すなわち、これら６種類のマーカーのうち１種類以上のマーカーをサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして使用することができる。また、これら６種類のマーカーの部分領域をサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして使用することができる。
＜サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーの例２＞
　サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーは、サトウキビの染色体から独自に取得した64757個のマーカー（そのうち1166個が西表１５を祖先に有する後代由来）を基に作成した、58の連鎖群からなる西表１５を祖先に有する後代を由来とする遺伝子連鎖地図とサトウキビ黒穂病抵抗性データとを用いたQTL（Quantitative Trait Loci）解析によって新たに同定されたものである。なお、サトウキビ黒穂病抵抗性は、多数の遺伝子が関与していると考えられ、連続分布をとる量的形質である。すなわち、サトウキビ黒穂病抵抗性は、連続分布をとる黒穂病への罹患率に基づいて評価される。QTL解析には、遺伝解析ソフトQTL Cartographer（Wang S., C. J. Basten, and Z.-B. Zeng (2010). Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC）を使用し、Composite interval mapping（CIM）法を適用している。
　具体的に、上述したQTL解析により、ロッドスコア（LOD score）が所定の閾値（例えば2.5）以上となる上記遺伝子連鎖地図に含まれる領域、約26.6cM（センチモルガン）の領域を特定した。ここで、「モルガン（Ｍ）」は、染色体上の遺伝子間の距離を相対的に示した単位であり、交叉価をパーセントにした値である。サトウキビの染色体において、1cMは、約2000kbpに相当する。なお、このピーク位置又はその近傍には、黒穂病抵抗性を向上させる形質の原因遺伝子（群）が存在することが示唆される。
　上記26.6cMの領域は、上記マーカーのうち表２に示す９種類のマーカーがこの順で含まれる領域であり、黒穂病抵抗性が向上する形質に連鎖する領域である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　なお、表２において、連鎖群とは、QTL解析において特定された複数の連鎖群についてそれぞれ付された番号である。表２において近傍マーカーの欄に記載したマーカー名は、本発明で独自に取得したマーカーに付された名称である。
　また、26.6cMの領域に含まれるピークは、配列番号１３８に示す塩基配列からなるマーカー（AMP0032477）及び配列番号１４０に示す塩基配列からなるマーカー（AMP002312）の間に位置し、特に配列番号１３９に示す塩基配列からなるマーカー（AMP0018405）に近接して存在している。
　表２に示したマーカーが含まれる26.6cM領域から選ばれる連続した核酸領域を、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして使用することができる。ここで、核酸領域とは、サトウキビの染色体に存在する他の領域との同一性が９５％以下、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、最も好ましくは７０％以下となるような塩基配列からなる領域を意味する。サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとなる核酸領域と他の領域との同一性が上記範囲であれば、定法に従って、当該核酸領域を特異的に検出することができる。ここで、同一性の値は、例えばＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出することができる。
　サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとなる核酸領域の塩基長は、少なくとも８塩基長以上、好ましくは１５塩基長以上、より好ましくは２０塩基長以上、最も好ましくは３０塩基長とすることができる。サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとなる核酸領域の塩基長が上記範囲であれば、定法に従って、当該核酸領域を特異的に検出することができる。
　サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとしては、上述した26.6cMの領域から選ばれる如何なる連続した核酸領域でもよい。なお、この26.6cMの領域の塩基配列については、配列番号１３５～１４３の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いたインバースPCR等の隣接配列取得法によって特定することができる。
　特に、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとしては、上述した26.6cMの領域のうち、配列番号１３８に示す塩基配列及び配列番号１４０に示す塩基配列に挟み込まれる領域から選ばれることが好ましい。さらに、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとしては、上述した26.6cMの領域のうち、配列番号１３９に示す塩基配列及び当該塩基配列に近接する塩基配列からなる領域から選ばれることが好ましい。上記ピークが配列番号１３８に示す塩基配列及び配列番号１４０に示す塩基配列に挟み込まれる領域であって、配列番号１３９に示す塩基配列と近接して存在するためである。
　また、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーは、上記９種類のマーカーそのもの又はその一部とすることができる。すなわち、これら９種類のマーカーのうち１種類以上のマーカーをサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして使用することができる。また、これら９種類のマーカーの部分領域をサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして使用することができる。
＜サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーの例３＞
　サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーは、サトウキビの染色体から独自に取得した57444個のマーカー（そのうち2936個が西表８を祖先に有する後代「KY09-6092」由来）を基に作成した、117の連鎖群からなる西表８を祖先に有する後代「KY09-6092」を由来とする遺伝子連鎖地図とサトウキビ黒穂病抵抗性データとを用いたQTL（Quantitative Trait Loci）解析によって新たに同定されたものである。
　なお、サトウキビ黒穂病抵抗性は、多数の遺伝子が関与していると考えられ、連続分布をとる量的形質である。すなわち、サトウキビ黒穂病抵抗性は、連続分布をとる黒穂病への罹患率に基づいて評価される。QTL解析には、遺伝解析ソフトQTL Cartographer（Wang S., C. J. Basten, and Z.-B. Zeng (2010). Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC）を使用し、Composite interval mapping（CIM）法を適用している。
　具体的に、上述したQTL解析により、ロッドスコア（LOD score）が所定の閾値（例えば2.5）以上となる上記遺伝子連鎖地図に含まれる領域、約12.27cM領域（センチモルガン）の領域を特定した。ここで、「モルガン（Ｍ）」は、染色体上の遺伝子間の距離を相対的に示した単位であり、交叉価をパーセントにした値である。サトウキビの染色体において、1cMは、約2000kbpに相当する。なお、このピーク位置又はその近傍には、黒穂病抵抗性を向上させる形質の原因遺伝子（群）が存在することが示唆される。
　上記12.27cMの領域は、上記マーカーのうち表３に示す７種類のマーカーがこの順で含まれる領域であり、黒穂病抵抗性が向上する形質に連鎖する領域である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　なお、表３において、連鎖群とは、QTL解析において特定された複数の連鎖群についてそれぞれ付された番号である。表３において近傍マーカーの欄に記載したマーカー名は、本発明で独自に取得したマーカーに付された名称である。表３に示したマーカーのうち AMP0063683は、配列番号１４４に示す塩基配列と配列番号１４５に示す塩基配列とを両端に含む核酸領域である。AMP0063683以外のマーカーは、それぞれ単一の塩基配列を含む核酸領域である。
　また、12.27cMの領域に含まれるピークは、配列番号１５１に示す塩基配列からなるマーカー（AMP0091501）に近接して存在している。
　表３に示したマーカーが含まれる12.27cM領域から選ばれる連続した核酸領域を、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして使用することができる。ここで、核酸領域とは、サトウキビの染色体に存在する他の領域との同一性が９５％以下、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、最も好ましくは７０％以下となるような塩基配列からなる領域を意味する。サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとなる核酸領域と他の領域との同一性が上記範囲であれば、定法に従って、当該核酸領域を特異的に検出することができる。ここで、同一性の値は、例えばＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出することができる。
　サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとなる核酸領域の塩基長は、少なくとも８塩基長以上、好ましくは１５塩基長以上、より好ましくは２０塩基長以上、最も好ましくは３０塩基長とすることができる。サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとなる核酸領域の塩基長が上記範囲であれば、定法に従って、当該核酸領域を特異的に検出することができる。
　サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとしては、上述した12.27cMの領域から選ばれる如何なる連続した核酸領域でもよい。なお、この12.27cMの領域の塩基配列については、配列番号１４４～１５１の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いたインバースPCR等の隣接配列取得法によって特定することができる。
　特に、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとしては、上述した12.27cMの領域のうち、配列番号１５０に示す塩基配列及び配列番号１５１に示す塩基配列に挟み込まれる領域から選ばれることが好ましい。上記ピークが配列番号１５１に示す塩基配列と近接して存在するためである。
　また、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーは、上記７種類のマーカーそのもの又はその一部とすることができる。すなわち、これら７種類のマーカーのうち１種類以上のマーカーをサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして使用することができる。また、これら７種類のマーカーの部分領域をサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして使用することができる。
　ところで、表３に示したマーカーが含まれる12.27cM領域は、表１に示したマーカーが含まれる8.4cM領域と一部共通した部分領域を有している。詳細には、12.27cM領域に含まれるピーク近傍が、8.4cM領域に含まれるピーク近傍と塩基配列において共通している。具体的に、表１に示したJW90由来のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーのうち0cMに位置するAMP0121265を含む近傍領域と、表３に示した西表８由来のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーのうち83.76cMに位置するAMP0091501を含む近傍領域が共通した塩基配列を有している。したがって、この塩基配列が共通した領域は、サトウキビ黒穂病抵抗性を高める因子（例えば原因遺伝子）が存在する可能性が高い。よって、当該領域をサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして使用することがより好ましい。
＜サトウキビにおけるマーカーの同定＞
　本発明では、上述したように、サトウキビの染色体から独自に取得した31191個のマーカー（そのうち4503個がJW90由来）、サトウキビの染色体から独自に取得した64757個のマーカー（そのうち1166個が西表１５を祖先に有する後代「KY08-6023, KY08-6039, KY08-6041」由来）及びサトウキビの染色体から独自に取得した57444個のマーカー（そのうち2936個が西表８を祖先に有する後代「KY09-6092」由来）からサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを特定した。ここでは、これら31191個のマーカー（そのうち4503個がJW90由来）、64757個のマーカー（そのうち1166個が西表１５を祖先に有する後代「KY08-6023, KY08-6039, KY08-6041」由来）及び57444個のマーカー（そのうち2936個が西表８を祖先に有する後代「KY09-6092」由来）について説明する。こられマーカーを同定する際には、国際公開WO 2018/003220に記載されたDNAライブラリーの作製方法に準じて作製した。
　すなわち、任意の塩基配列を有するプライマー（以下、ランダムプライマー）を高濃度となるように調整した反応液で核酸増幅反応を行い、増幅した核酸断片をDNAライブラリーとするものである。ここで、高濃度とは、通常の核酸増幅反応におけるプライマー濃度と比較して高濃度であることを意味する。すなわち、本発明に係るDNAライブラリー作製方法は、通常の核酸増幅反応におけるプライマー濃度と比較して高濃度のランダムプライマーを使用することに特徴を有している。ここで、反応液に含まれる鋳型としては、DNAライブラリーを作製する対象の生物から調製したゲノムDNAを使用することができる。
　ランダムプライマーとしては、その配列には何ら限定されず、例えば９～３０塩基長のヌクレオチドを使用することができる。特に、ランダムプライマーとは、任意の配列を有する、９～３０塩基長のヌクレオチドであって、ヌクレオチドの種類（配列の種類）は特に限定されず、１種類以上のヌクレオチド、好ましくは１～１００００種類のヌクレオチド、より好ましくは１～１０００種類のヌクレオチド、より好ましくは１～１００種類のヌクレオチド、最も好ましくは１～９６種類のヌクレオチドを意味する。ランダムプライマーとして上述の範囲のヌクレオチド（ヌクレオチド群）を使用することによって、より高い再現性で増幅核酸断片を得ることができる。なお、ランダムプライマーとして、複数のヌクレオチドを含む場合、全てのヌクレオチドが同じ塩基長（９～３０塩基長）である必要はなく、異なる塩基長の複数のヌクレオチドを含んでいても良い。
　通常、核酸増幅反応を用いて特定のアンプリコンを得るためには、当該アンプリコンに応じてプライマーの塩基配列を設計する。例えば、ゲノムDNA等の鋳型DNAにおけるアンプリコンに対応する位置を挟み込むように一対のプライマーを設計する。この場合、プライマーは、鋳型に含まれる特定の領域にハイブリダイズするように設計されるため「特異的プライマー」と呼称することができる。
　これに対して、ランダムプライマーは、特定のアンプリコンを得る目的で設計されるプライマーとは異なり、鋳型DNAにおける特定の領域にハイブリダイズするように設計されるのではなく、ランダムなアンプリコンを得るために設計される。ランダムプライマーは、その塩基配列が如何なる配列であってもよく、鋳型DNAに含まれる相補的な領域に偶発的にハイブリダイズすることでランダムなアンプリコン増幅に関与できる。
　すなわち、ランダムプライマーとは、上述のように、ランダムなアンプリコン増幅に関与する任意配列を有するヌクレオチドということができる。ここで任意配列とは、何ら限定されないが、例えば、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンの群から無作為に選択された塩基配列として設計しても良いし、特定の塩基配列として設計しても良い。特定の塩基配列としては、例えば、制限酵素認識配列を含む塩基配列や、次世代シーケンサーに使用するアダプタ配列を有する塩基配列を挙げることができる。
　ランダムプライマーとして複数種類のヌクレオチドを設計する場合、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンの群から無作為に選択して所定の長さの塩基配列を複数設計する方法が適用できる。また、ランダムプライマーとして複数種類のヌクレオチドを設計する場合、特定の塩基配列からなる共通部分と、任意の塩基配列からなる非共通部分とからなる塩基配列を複数設計する方法も適用できる。ここで、非共通部分は、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンの群から無作為に選択された塩基配列としても良いし、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンからなる４種類の塩基の全ての組み合わせ、又はこれら全ての組み合わせから選ばれる一部の組み合わせとすることができる。共通部分は、特に限定されず如何なる塩基配列でもよいが、例えば、制限酵素認識配列を含む塩基配列や、次世代シーケンサーに使用するアダプタ配列を有する塩基配列、特定の遺伝子ファミリーに共通する塩基配列とすることができる。
　複数のランダムプライマーとして、４種類の塩基から無作為に選択して所定の長さの塩基配列を複数設計する場合、全体の３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは９０％以上が、７０％以下の同一性、好ましくは６０％以下の同一性、より好ましくは５０％以下の同一性、最も好ましくは４０％以下の同一性となるように設計することが好ましい。複数のランダムプライマーとして、４種類の塩基から無作為に選択して所定の長さの塩基配列を複数設計する場合であって、上述の範囲のヌクレオチドについて上記範囲の同一性となるように設計することで、対象生物種のゲノムDNA全体に亘って増幅断片を得ることができる。すなわち、増幅断片の均一性を高めることができる。
　複数のランダムプライマーとして、特定の塩基配列からなる共通部分と、任意の塩基配列からなる非共通部分とからなる塩基配列を複数設計する場合、例えば、３’末端側の数塩基を非共通部分とし、残りの５’末端側を共通部分とするように設計することができる。３’末端側のｎ個の塩基を非共通部分とすれば、４ｎ種類のランダムプライマーを設計することができる。ここで、ｎ個としては、１～５個とすることができ、好ましくは２～４個、より好ましくは２～３個である。
　例えば、共通部分と非共通部分とからなるランダムプライマーとしては、５’末端側を次世代シーケンサーに使用するアダプタ配列（共通部分）とし、３’末端側を２塩基（非共通部分）とした、合計１６種類のランダムプライマーを設計することができる。なお、３’末端側を３塩基（非共通部分）とすれば、合計６４種類のランダムプライマーを設計することができる。ランダムプライマーの種類が多くなるほど、対象生物種のゲノムDNA全体に亘って増幅断片をより網羅的に得ることができる。したがって、共通部分と非共通部分とからなるランダムプライマーを設計する場合、３’末端側の塩基は３塩基とすることが好ましい。
　ただし、例えば、共通部分と３塩基の非共通部分とからなる６４種類の塩基配列を設計した後、これら６４種類の塩基配列から選ばれる６３種類以下のランダムプライマーを使用してもよい。言い換えると、６４種類のランダムプライマーの全てを使用した場合と比較して、６３種類以下のランダムプライマーを使用した場合のほうが核酸増幅反応や、次世代シーケンサーを用いた解析において優れた結果を示す場合がある。
　ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーの塩基長に応じて適宜設定することが好ましい。ここで、ランダムプライマーの塩基長は、異なる塩基長の複数種類のヌクレオチドをランダムプライマーとして使用する場合には、その平均値（単純平均でもよいし、ヌクレオチド量を加味した加重平均でもよい）とすることができる。
　具体的には、９～３０塩基長のランダムプライマーを用い、当該ランダムプライマー濃度を４～２００μＭとする条件、好ましくは４～１００μＭとする条件で核酸増幅反応を行う。この条件であれば、核酸増幅反応により、高い再現性を達成しながら多数の増幅断片、特に１００～５００塩基長の多数の増幅断片を得ることができる。
　より具体的には、ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが９～１０塩基長である場合、４０～６０μＭとすることが好ましい。ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが１０～１４塩基長である場合、ランダムプライマーの塩基長をｙとし、ランダムプライマーの濃度をｘとしたときに、ｙ＞３Ｅ＋０８ｘ－６．９７４且つ１００μＭ以下を満たすことが好ましい。ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが１４～１８塩基長の場合、４～１００μＭとすることが好ましい。ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが１８～２８塩基長の場合、４μＭ以上であり、且つｙ＜８Ｅ＋０８ｘ－５．５３３を満たすことが好ましい。ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが２８～２９塩基長の場合、６～１０μＭとすることが好ましい。ランダムプライマーの濃度を、ランダムプライマーの塩基長に応じて上記のように設定することで、高い再現性を達成しながら多数の増幅断片をより確実に得ることができる。
　なお、上述したｙ＞３Ｅ＋０８ｘ－６．９７４及びｙ＜８Ｅ＋０８ｘ－５．５３３の不等式は、国際公開WO 2018/003220で説明するように、ランダムプライマーの長さと濃度との関係を詳細に調べた結果、１００～５００塩基長の多数のDNA断片を再現性良く増幅できる範囲として算出されたものである。
　また、核酸増幅反応において鋳型となるゲノムDNAは、特に限定されないが、反応液の量を５０μｌとしたときに、０．１～１０００ｎｇとすることが好ましく、１～５００ｎｇとすることがより好ましく、５～２００ｎｇとすることが更に好ましく、１０～１００ｎｇとすることが最も好ましい。鋳型となるゲノムDNAの量をこの範囲とすることで、ランダムプライマーからの増幅反応が阻害されることなく、高い再現性を達成しながら多数の増幅断片を得ることができる。
　以上の方法に従って、黒穂病抵抗性に優れたサトウキビからDNAライブラリーを作製し、また黒穂病感受性を示すサトウキビからDNAライブラリーを作製することができる。これらDNAライブラリーの塩基配列を次世代シーケンサーにより解析し、ライブラリーを構成する断片のリード数を比較することで、黒穂病抵抗性に優れたサトウキビから作製したDNAライブラリーに特有の断片を選択することができる。
　より具体的に、本発明者らは、既知のサトウキビ品種「NiF8」にサトウキビ野生種「西表１５」を交配して得られた後代系統（3系統）に、サトウキビ野生種「JW90」を交配して得られた各後代系統（33系統、35系統及び35系統）について、上述したDNAライブラリーを作製する。そして、当該DNAライブラリーを次世代シーケンサーに供して得られたリード数データから遺伝子型データを取得し、この遺伝子型データを元にして、遺伝地図作成ソフトウェアAntMap（Iwata H, Ninomiya S (2006) AntMap: constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm. Breed Sci 56: 371-377）を使用し、遺伝距離計算式Kosambiにより染色体におけるマーカーの位置情報を算出した。さらに、取得したマーカーの位置情報をもとに、Mapmaker/EXP ver.3.0（A Whitehead Institute for Biomedical Research Technical Report, Third Edition, January, 1993）により遺伝地図データシートを作成した。その結果、上述した配列番号１～６に示した６種類のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを含む31191個のマーカーを同定している。また、DNAライブラリーを次世代シーケンサーに供してリード数データを取得する工程を２回繰り返すことで、より多くのリード数データを取得し、得られたリード数データから遺伝子型データを取得した。そして、同様にして、上述した配列番号１３５～１４３に示した９種類のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを含む64757個のマーカーを同定している。
　さらに、本発明者らは、既知のサトウキビ品種「NiF8」にサトウキビ野生種「西表８」を交配して得られた後代系統と、サトウキビ品種「NiTn18」と「NiTn24」を交配して得られた後代系統とから作製した154系統の後代系統について、上述したDNAライブラリーを作製している。そして、当該DNAライブラリーを次世代シーケンサーに供して得られたリード数データから遺伝子型データを取得し、この遺伝子型データを元にして、遺伝地図作成ソフトウェアAntMap（Iwata H, Ninomiya S (2006) AntMap: constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm. Breed Sci 56: 371-377）を使用し、遺伝距離計算式Kosambiにより染色体におけるマーカーの位置情報を算出した。さらに、取得したマーカーの位置情報をもとに、Mapmaker/EXP ver.3.0（A Whitehead Institute for Biomedical Research Technical Report, Third Edition, January, 1993）により遺伝地図データシートを作成した。その結果、上述した配列番号１４４（及び１４５）～１５１に示した７種類のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを含む57444個のマーカーを同定している。
　また、配列番号１５１に示した塩基配列を有するサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを含む近傍領域と、配列番号１に示した塩基配列を有するサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを含む近傍領域とは、それぞれ独立して同定されたにも拘わらず、同一の塩基配列を有する複数のマーカーを含んでいる。
＜サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーの利用＞
　サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを利用することで、後代系統等の黒穂病抵抗性の表現型が未知のサトウキビ系統について黒穂病抵抗性の向上という表現型を示す系統であるか判断することができる。サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして、上述した8.4cM領域に含まれる１つの核酸領域を利用しても良いし、上述した8.4cM領域に含まれる複数の核酸領域を利用しても良い。また、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして、上述した26.6cM領域に含まれる１つの核酸領域を利用しても良いし、上述した26.6cM領域に含まれる複数の核酸領域を利用しても良い。さらに、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして、上述した12.27cM領域に含まれる１つの核酸領域を利用しても良いし、上述した12.27cM領域に含まれる複数の核酸領域を利用しても良い。さらにまた、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして、上述した8.4cM領域に含まれる１つ又は複数の核酸領域、上述した26.6cM領域に含まれる１つ又は複数の核酸領域及び上述した12.27cM領域に含まれる１つ又は複数の核酸領域から選ばれる核酸領域を利用しても良い。ここで、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを利用するとは、当該マーカーを特異的に増幅するプライマー対を用いた核酸増幅反応を利用する形態、当該マーカーに対応するプローブを有するDNAマイクロアレイを利用する形態を含む意味である。
　サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを特異的に増幅するプライマー対は、上述した8.4cM領域の塩基配列、上述した26.6cM領域の塩基配列及び上述した12.27cM領域の塩基配列に基づいて適宜、設計することができる。例えば、プライマー対は、上述した8.4cM領域、上述した26.6cM領域の塩基配列及び上述した12.27cM領域の塩基配列に含まれる、例えば1kbp以下の長さ、又は800bp以下の長さ、又は500bp以下の長さ、又は350bp以下の長さの領域を増幅するように設計することができる。或いは、プライマー対としては、配列番号１～６、１３５～１４３及び１４４（１４５）～１５１のいずれかに示した塩基配列からなる核酸領域の全部又は一部を増幅するように設計することができる。当該核酸領域の一部としては、配列番号１～６、１３５～１４３及び１４４（１４５）～１５１のいずれかに示した塩基配列に含まれる連続する１０塩基とすることができ、連続する２０塩基とすることができ、連続する４０塩基とすることができ、連続する８０塩基とすることができ、連続する１００塩基とすることができ、連続する１４０塩基とすることができる。
　サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーに対応するプローブとは、上述のように定義されたサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーに対して、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを意味する。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、上述のように定義されたサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーの塩基配列又はその相補鎖の少なくとも連続する１０塩基、１５塩基、２０塩基、２５塩基、３０塩基、３５塩基、４０塩基、４５塩基、５０塩基又はそれ以上の塩基長の部分領域若しくは全領域として設計することができる。なお、このプローブは、担体に固定して使用することもできる。すなわち、ガラスやシリコーン等の平面基板を担体とするマイクロアレイや、マイクロビーズを担体とするビーズアレイ、或いは中空繊維の内壁にプローブを固定する３次元マイクロアレイ等の如何なるタイプのマイクロアレイであってもよい。
　以上のように作製されたDNAマイクロアレイを使用することで、後代系統等に代表される黒穂病抵抗性の表現型が未知のサトウキビ系統について、黒穂病抵抗性の向上という表現型を示す系統であるか判断することができる。なお、上述したDNAマイクロアレイを使用する方法以外であっても、従来公知の手法を用いて上述したサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを検出して、黒穂病抵抗性の表現型が未知のサトウキビ系統について黒穂病抵抗性の向上という形質を有する系統であるか判断してもよい。
　詳細には、先ず、供試サトウキビからゲノムDNAを抽出する。この供試サトウキビとは、後代系統等の黒穂病抵抗性の表現型が未知のサトウキビ系統及び/又は後代系統を作製する際に使用した親のサトウキビ系統のことであり、黒穂病抵抗性が向上する形質を有するか判定する対象となるサトウキビ系統である。なお、サトウキビ以外の植物、例えば、ソルガムやエリアンサスといったイネ科植物を供試植物とし、これら供試植物における黒穂病抵抗性を評価しても良い。
　次に、抽出したゲノムDNAを鋳型として上述したプライマー対を用いた核酸増幅反応によりサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを増幅する。このとき、プライマーの一方に蛍光色素等の標識を付加することで、増幅したゲノムDNA断片に標識を付加することができる。標識としては、従来公知の如何なる物質を使用しても良い。標識としては、例えば蛍光分子、色素分子、放射性分子等を使用することができる。
　次に、標識を有するゲノムDNA断片を所定の条件下でDNAマイクロアレイに接触させ、DNAマイクロアレイに固定されたプローブと標識を有するゲノムDNA断片とをハイブリダイズさせる。このとき、ハイブリダイズさせる際には高いストリンジェンシー条件とすることが好ましい。このような高いストリンジェンシー条件とすることによって、供試サトウキビにサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーが存在しているか否かを、より高精度に判定することができる。なお、ストリンジェンシー条件は、反応温度及び塩濃度で調節することができる。すなわち、より高温とすることでより高いストリンジェンシー条件となり、またより低い塩濃度でより高いストリンジェンシー条件となる。例えば、50～75塩基長のプローブを使用する場合、ハイブリダイゼーション条件としては、40～44℃、0.21SDS、6×SSCの条件とすることでより高いストリンジェンシー条件とすることができる。
　また、プローブと標識を有するゲノムDNA断片とのハイブリダイズは、標識に基づいて検出することができる。すなわち、上述した標識を有するゲノムDNA断片とプローブのハイブリダイズ反応の後、未反応のゲノムDNA断片等を洗浄し、その後、プローブに対して特異的にハイブリダイズしたゲノムDNA断片の標識を観察する。例えば、標識が蛍光物質である場合にはその蛍光波長を検出し、標識が色素分子であればその色素波長を検出する。より具体的には、通常のDNAマイクロアレイ解析に使用している、蛍光検出装置やイメージアナライザー等の装置を使用することができる。
　なお、上述のようにDNAマイクロアレイを使用する方法以外にも、供試サトウキビから抽出したゲノムDNAにおけるサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを検出することができる。例えば、供試サトウキビから抽出したゲノムDNAを鋳型として、次世代シーケンサーを用いてサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーのリード数を測定することでサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーが存在しているか否かを高精度に判定することができる。
　以上のように、上述したDNAマイクロアレイや次世代シーケンサーを使用することにより、供試サトウキビが上述したサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを有するか否か判断することができる。ここで、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーは、黒穂病抵抗性が向上する形質に連鎖するマーカーである。したがって、供試サトウキビにおいて、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーが存在していれば、黒穂病抵抗性が向上した品種と判断できる。
　特に、上述した方法では、供試サトウキビを実際の黒穂病抵抗性試験を実施可能な程度まで成長させる必要はなく、例えば後代系統の種子や当該種子を発芽させた幼苗を使用することができる。したがって、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを利用することによって、供試サトウキビを生育させるための圃場やその他、生育のためのコストを大幅に削減することができる。また、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを利用することによって、実際に黒穂病の原因微生物（Ustilago scitaminea）を感染させる必要がなく、大規模専用温室や専用圃場、外部との隔離施設など設備等にかかるコストを削減できる。
　特に、サトウキビの新品種作出に際して、先ず、交配により数万種類の交配種を作製した後、実生選抜に先立って若しくは実生選抜に代えて、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを利用した判断を行うことが好ましい。これにより、実際の圃場において、優良な系統を栽培する数を大幅に削減することができ、サトウキビの新品種作出に係る手間やコストを大幅に抑制することができる。
　或いは、サトウキビの新品種作出に際して、先ず、交配に使用する親品種におけるサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーの存在の有無を判定し、黒穂病抵抗性に優れた親品種を選抜することもできる。黒穂病抵抗性に優れた親品種を優先的に使用して後代系統を作出することで、黒穂病抵抗性に優れた後代系統が高頻度に出現すると期待できる。これにより、優良な系統を栽培する数を大幅に削減することができ、サトウキビの新品種作出に係る手間やコストを大幅に抑制することができる。
　以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
(1)材料
　サトウキビ品種「NiF8」、サトウキビ野生種「西表１５」、「NiF8」に「西表１５」を交配した後代3系統「KY08－6023」、「KY08－6039」、「KY08－6041」、これら後代3系統にサトウキビ野生種「JW90」をそれぞれ交配した後代各33、35、35系統についてDNeasy　Plant　Mini　Kit（QIAGEN社）によりゲノムDNAを抽出、精製した。
(2)DNAライブラリーの作製
　本実施例においてDNAライブラリーは、国際公開WO 2018/003220に記載されたDNAライブラリーの作製方法に準じて作製した。すなわち、上記(1)で取得したゲノムDNA15.0ngに最終濃度0.2mM dNTP mixture、0.625 unit Prime STAR DNA Polymerase（タカラバイオ社）に60μMランダムプライマーをそれぞれ加え、最終反応量25μlでPCRを行った。反応は98℃で2分後、98℃で10秒、50℃で15秒及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行い、最終的に4℃で保存した。
　なお、本例で使用したランダムプライマーを表４にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
(3)次世代シーケンサー用のDNAライブラリーの作製
　上記(2)の反応後の溶液1.5μlに最終濃度0.2 mM dNTP mixture、1.25 unit PrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ社）にプライマーセットをそれぞれ加え、最終反応量50μlでPCRを行った。反応条件は95℃で2分後、98℃で配列番号15秒、55℃で15秒及び72℃で20秒を1サイクルとして25サイクル行い、最終的に4℃で保存した。なお、本例では、「KY08-6023」、「KY08-6039」、「KY08-6041」に「JW90」を交配させた103系統用（各33、35、35系統）と、これら親及び祖父母系統（「NiF8」、「西表１５」、「KY08-6023」、「KY08-6039」、「KY08-6041」、「JW90」の6系統用（各2反復）について、合計115の組合せに関して表５に示したフォワードプライマー（配列番号１９～１３３）と、リバースプライマー（5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCGCGCAGATCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’（配列番号１３４））のセットを利用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
(4)精製及び電気泳動
　上記(3)の反応後の溶液を1本のチューブに等量混合し、その内、50μlをMinElute PCR Purification Kit（QIAGEN社）により精製後、Agilent 2100 バイオアナライザー（Agilent Technology社）で電気泳動し、蛍光ユニット（Fluorescence Unit：FU）を得た。
(5)次世代シーケンサー解析
　上記(3)で得られたDNAライブラリーをHiseq4000シーケンスシステム（イルミナ株式会社）により、リード長100塩基のペアエンド条件のもとで解析した。
(6)リードデータの解析
　上記(5)で得られたリードデータから、解析ソフトウェアGRAS-Di（トヨタ自動車株式会社）を用いて解析し、31191個のマーカーの遺伝子型データを得た。
(7)遺伝地図の作製
　上記(6)で得られたJW90由来の遺伝子型データをもとに、遺伝地図作成ソフトAntMap (Iwata H, Ninomiya S (2006) AntMap: constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm. Breed Sci 56: 371-377)を用い、遺伝距離計算式Kosambiにより86の連鎖群からなる遺伝地図データを取得した。86の連鎖群にはJW90型に属する4503個のマーカーの遺伝子型データが含まれる。
(8)黒穂病検定試験データの取得
　サトウキビ品種「NiF8」にサトウキビ野生種「西表１５」を交配した後代3系統「KY08－6023」、「KY08－6039」、「KY08－6041」、これら後代3系統にサトウキビ野生種「JW90」をそれぞれ交配した後代各33、35、35系統の茎を収穫し、2～3日間、室温・高湿度条件下で催芽処理した後、黒穂病胞子の有傷接種を行った。有傷接種は、苗芽子両側に傷を付け（計6か所、深さ約4.0mm）、毛筆により胞子浮遊液（107～108個・胞子/ml）を塗布した。有傷接種した苗は、2～3日間、室温・高湿度条件下で培養し、育苗箱へ植付けた（40芽/箱、2箱/系統）。苗の植付け後、高湿度条件下、温室で栽培した。黒穂病罹病程度の調査は、罹病の兆候である鞭状物が頂部より露出した株数を計測し罹病株数とした。罹病株数の調査後、罹病株の植物体は、地際部より刈取り除去した。黒穂病の罹病率は、発芽株数（黒穂病以外の枯死株を除く）に対する罹病株数の割合（黒穂病罹病率）として算出した。「KY08－6023」と「JW90」とを交配して得られた後代について黒穂病罹病率を計算した結果を図１（Ａ）に示し、「KY08－6039」と「JW90」とを交配して得られた後代について黒穂病罹病率を計算した結果を図１（Ｂ）に示し、「KY08－6041」と「JW90」とを交配して得られた後代について黒穂病罹病率を計算した結果を図１（Ｃ）に示した。
(9)量的形質（Quantitative Trait Loci）の解析
　上記(7)で得られたJW90由来の遺伝地図データ及び(8)で得られた黒穂病検定試験データをもとに、遺伝解析ソフトQTL Cartographer (http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/cartographer.html)を使い、Composite interval mapping (CIM)法により、QTL解析を行った。LODの閾値は2.5を用いた。その結果、サトウキビ野生種「JW90」の第42連鎖群のマーカーAMP0121265からAMP0100370を含む約8.4cM領域にサトウキビ黒穂病に関連するQTLの存在を確認した（表６及び図２）。なお、効果の数字が負である場合、当該QTLは黒穂病抵抗性が向上する形質に連鎖することを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表６及び図２に示すように、本実施例で見いだした第42連鎖群のマーカーAMP0121265からAMP0100370の範囲は、国際公開 WO2012/147635に記載されたQTLに比して、LOD値が著しく高く、また効果が著しく向上することを確認できた。
(10)黒穂病抵抗性選抜マーカーの選定
　上記(9)で確認したサトウキビ黒穂病抵抗性QTL領域に含まれるマーカー（AMP0121265、AMP0120752、 AMP0035185、AMP0114852、AMP0089904、AMP0100370）を選抜マーカーとして選定した(表７)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　各マーカーの遺伝子型、すなわち供試系統が上述した選抜マーカーを有するか否かは、それぞれのリード数の閾値を10とし、リード数が10以上である場合に“有”とし、リード数が10未満である場合に“無”として判別した(図３～８、表８)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表８及び図３～８に示したように、黒穂病罹病率の低い供試系統は、黒穂病罹病率の高い供試系統と比較してこれらマーカー数が有意に高いことがわかる。これらの結果より、AMP0121265、AMP0120752、AMP0035185、AMP0114852、AMP0089904及びAMP0100370を含む約8.4cM領域から選ばれる連続する核酸領域を、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして利用できることが明らかとなった。
〔実施例２〕
　実施例１では、31191個のマーカーの遺伝子型データの内、JW90型に属する4503個の遺伝子型データに基づいてサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを同定した。本実施例では、西表１５型に属する遺伝子型データを収集し、同様にしてサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを同定した。
　本実施例では、西表１５型に属する遺伝子型データ数を増やすため、実施例１で作製したDNAライブラリーに対して、(5)次世代シーケンサー解析を２回繰り返した。このようにして得られたリードデータから、解析ソフトウェアGRAS-Di（トヨタ自動車株式会社）を用いて解析し、64757個のマーカーの遺伝子型データを得た。
　そして、西表１５型を祖先に有する後代「KY08-6023, KY08-6039, KY08-6041」由来の遺伝子型データをもとに、実施例１と同様にして、遺伝地図作成ソフトAntMap (Iwata H, Ninomiya S (2006) AntMap: constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm. Breed Sci 56: 371-377)を用い、遺伝距離計算式Kosambiにより58の連鎖群からなる遺伝地図データを取得した。58の連鎖群には西表１５を祖先に有する後代「KY08-6023, KY08-6039, KY08-6041」型に属する4503個のマーカーの遺伝子型データが含まれる。
　このようにして得られた遺伝地図データ及び実施例１で得られた黒穂病検定試験データをもとに、遺伝解析ソフトQTL Cartographer (http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/cartographer.html)を使い、Composite interval mapping (CIM)法により、QTL解析を行った。LODの閾値は2.5を用いた。その結果、サトウキビ野生種「西表１５」の第15連鎖群のマーカーAMP0014532からAMP0015886の区間内にサトウキビ黒穂病に関連するQTLの存在を確認した（表９、図９）。なお、効果の数字が負である場合、当該QTLは黒穂病抵抗性が向上する形質に連鎖することを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表９及び図９に示すように、本実施例２で見いだした第15連鎖群のマーカーAMP0014532からAMP0015886の区間の範囲は、国際公開 WO2012/147635に記載されたQTLに比して、LOD値が著しく高く、また効果が著しく向上することを確認できた。本実施例では、このようにして確認したサトウキビ黒穂病抵抗性QTL領域に含まれるマーカー（AMP0014532、AMP0043152、AMP0069135、AMP0032477、AMP0018405、AMP0002312、AMP0007121、AMP0090108、AMP0015886）を選抜マーカーとして選定した(表１０)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
　各マーカーの遺伝子型、すなわち供試系統が上述した選抜マーカーを有するか否かは、それぞれのリード数の閾値を10とし、それ以上を“有”、それ未満を“無”として判別した(図１０～１８、表１１)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　表１１及び図１０～１８に示したように、黒穂病罹病率の低い供試系統は、黒穂病罹病率の高い供試系統と比較してこれらマーカー数が有意に高いことがわかる。これらの結果より、AMP0014532、AMP0043152、AMP0069135、AMP0032477、AMP0018405、AMP0002312、AMP0007121、AMP0090108、AMP0015886を含む約26.6cM領域から選ばれる連続する核酸領域を、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして利用できることが明らかとなった。
〔実施例３〕
　本実施例では、サトウキビ品種「NiF8」とサトウキビ野生種「西表８」を交配した後代「KY09－6092」、サトウキビ品種「NiTn18」とサトウキビ品種「NiN24」を交配した後代「KY08－129」、「KY09－6092」及び「KY08－129」を交配した後代154系統を使用した以外は実施例１と同様にして、サトウキビ野生種「西表８」由来のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを同定した。
　本実施例では、次世代シーケンサー用のDNAライブラリーを作製するに際して表５に示したフォワードプライマーに代えて、表１２に示したフォワードプライマーを用いた以外は実施例１と同様な方法で得られたリードデータから、解析ソフトウェアGRAS-Di（トヨタ自動車株式会社）を用いて解析し、57444個のマーカーの遺伝子型データを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
　その内、KY09－6092に属する2936個の遺伝子型とKY08－129に属する1877個の遺伝子型とを得た。そして、「KY09-6092」由来の117の連鎖群からなる遺伝地図データと、「KY08-129」由来の123の連鎖群からなる遺伝地図データを取得した。また、「KY09－6092」及び「KY08－129」を交配した後代154系統について、実施例１と同様な条件で黒穂病検定試験データを取得し、黒穂病罹病率を計算した結果を図１９に示した。そして、これら遺伝地図データと黒穂病検定試験データをもとに、遺伝解析ソフトQTL Cartographer (http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/cartographer.html)を使い、Composite interval mapping (CIM)法により、QTL解析を行った。LODの閾値は2.5を用いた。
　その結果、「KY09-6092」の第8連鎖群のマーカーAMP0063683からAMP0091501を含む約12.27cM領域にサトウキビ黒穂病に関連するQTLの存在を確認した（表１３及び図２０）。なお、効果の数字が負である場合、当該QTLは黒穂病抵抗性が向上する形質に連鎖することを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　表１３及び図２０に示すように、本実施例で見いだした第8連鎖群のマーカーAMP0063683からAMP0091501の範囲は、国際公開 WO2012/147635に記載されたQTLに比して、LOD値が著しく高く、また効果が著しく向上することを確認できた。本実施例で確認したサトウキビ黒穂病抵抗性QTL領域に含まれるマーカー（AMP0063683、AMP0082090、AMP0013802、AMP0083204、AMP0043774、AMP0094596及びAMP0091501）を選抜マーカーとして選定した(表１４)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　なお、表１４に示したマーカーのうちAMP0063683は、PCR産物の大きさが200bp以上のサイズのため、次世代シーケンサーで塩基配列が決定されたリード１（配列番号１４４）とリード２（配列番号１４５）を両端に含む核酸領域として定義される。
　各マーカーの遺伝子型、すなわち供試系統が上述した選抜マーカーを有するか否かは、それぞれのリード数の閾値を10とし、リード数が10以上である場合に“有”とし、リード数が10未満である場合に“無”として判別した(図２１～２７、表１５)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　表１５及び図２１～２７に示したように、黒穂病罹病率の低い供試系統は、黒穂病罹病率の高い供試系統と比較してこれらマーカー数が有意に高いことがわかる。これらの結果より、AMP0063683、AMP0082090、AMP0013802、AMP0083204、AMP0043774、AMP0094596及びAMP0091501を含む約12.27cM領域から選ばれる連続する核酸領域を、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして利用できることが明らかとなった。
〔実施例４〕
　本実施例では、実施例１で同定されたJW90由来のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを含む約8.4cM領域と、実施例３で同定された西表８由来のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーを含む約12.27cM領域について塩基配列を比較した。その結果、実施例１で同定されたJW90由来のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーのうち0cMに位置するAMP0121265を含む近傍領域と、実施例３で同定された西表８由来のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーのうち83.76cMに位置するAMP0091501を含む近傍領域に同一の塩基配列を有するマーカーが複数含まれることが明らかとなった。
　実施例１で同定されたJW90由来のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーのうち0cMに位置するAMP0121265を含む近傍領域に含まれるマーカーを表１６にまとめた。実施例３で同定された西表８由来のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーのうち83.76cMに位置するAMP0091501を含む近傍領域に含まれるマーカーを表１７にまとめた。なお、表１６及び１７において、各マーカーに関する塩基配列情報の欄には、次世代シーケンサー解析により読み取れた一対のリードデータからコンティグ配列を導き出せる場合には、そのコンティグ配列の塩基配列を記載し、コンティグ配列を導き出せない場合には一対のリード配列（リード配列１及びリード配列２）を記載している。すなわち、表１６及び１７に示す各マーカーは、コンティグ配列の塩基配列で定義できるか、又はリード配列１の塩基配列及びリード配列２の塩基配列で定義できる。
　表１６に列挙したマーカーのうち、表１７に列挙したAMP0179276を含む近傍領域に含まれるマーカーと同一の塩基配列を有するものについて、「西表８由来のDNAマーカーの有無（）：西表8マーカーID」の欄に○及び同一の塩基配列を有する西表８由来マーカーのIDを記載した。同様に、表１７に列挙したマーカーのうち、表１６に列挙したAMP0121265を含む近傍領域に含まれるマーカーと同一の塩基配列を有するものについて、「JW90由来のDNAマーカーの有無（）：JW90マーカーID」の欄に○及び同一の塩基配列を有するJW90由来マーカーのIDを記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000030
　表１６に示したように、JW90由来のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーのうち0cMに位置するAMP0121265を含む近傍領域に３６個のマーカーが含まれ、表１７に示したように、西表８由来のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーのうち83.76cMに位置するAMP0091501を含む近傍領域に１８個のマーカーが含まれていた。これらのうち、５個のマーカーが同一の塩基配列を有していることが判明した。この結果から、表１６に示した３６個のマーカーを含む領域と、表１７に示した１８個のマーカーを含む領域は、サトウキビ黒穂病に対する抵抗性に強く関連するQTLとして理解することができる。特に、本実施例で特定したサトウキビ黒穂病抵抗性のQTLは、JW90及び西表８の両者が有するため、特に限定されることなく広く様々なサトウキビ品種に存在するものと考えられる。
　特に、本実施例から、表１６に示した３６個のマーカー及び表１７に示した１８個のマーカーは、特に優れたサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして利用できることが示された。
　さらに、表１６に示した３６個のマーカー及び表１７に示した１８個のマーカーのうち、同一の塩基配列を有することが明らかとなった５個のマーカー（AMP0016471（配列番号２９８）＝AMP0020554（配列番号２４８）、AMP0036426（配列番号３０３）＝AMP0045000（配列番号２７０）、 AMP0046626（配列番号３０７）＝AMP0057239（配列番号２７１）、AMP0052709（配列番号３１１）＝AMP0062853（配列番号２７３）、AMP0091501（配列番号３１６）＝AMP0111891（配列番号２９２））は、最も優れたサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーとして利用できることが示された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (9)

  1. 　サトウキビの染色体における配列番号１に示す塩基配列及び配列番号６に示す塩基配列により挟まれる領域；配列番号１３５に示す塩基配列及び配列番号１４３に示す塩基配列により挟まれる領域；又は配列番号１４４若しくは１４５に示す塩基配列及び配列番号１５１に示す塩基配列により挟まれる領域から選ばれる連続する核酸領域からなる、サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。
  2. 　上記核酸領域は、配列番号１～６、１３５～１４３及び１４４～１５１からなる群から選ばれるいずれか１の塩基配列又は当該塩基配列の一部を含むことを特徴とする請求項１記載のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。
  3. 　上記核酸領域は、サトウキビの染色体における配列番号１若しくは２に示す塩基配列又は当該塩基配列の一部であることを特徴とする請求項１記載のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。
  4. 　上記核酸領域は、サトウキビの染色体における配列番号１３８～１４０からなる群から選ばれる１つの塩基配列又は当該塩基配列の一部であることを特徴とする請求項１記載のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。
  5. 　上記核酸領域は、サトウキビの染色体における配列番号１４９若しくは１５１からなる群から選ばれる１つの塩基配列又は当該塩基配列の一部であることを特徴とする請求項１記載のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。
  6. 　上記核酸領域は、サトウキビの染色体における配列番号２９８、３０３、３０７、３１１及び３１６からなる群から選ばれる１つの塩基配列又は当該塩基配列の一部であることを特徴とする請求項１記載のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカー。
  7. 　少なくとも一方の親がサトウキビ植物である後代植物の染色体及び/又は当該親の染色体を抽出する工程と、上記で得られた染色体における上記請求項１～６いずれか１項に記載のサトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を測定する工程とを含む、黒穂病抵抗性が向上したサトウキビ系統の製造方法。
  8. 　上記測定する工程では、上記サトウキビ黒穂病抵抗性関連マーカーに対応するプローブを備えるDNAチップを使用することを特徴とする請求項７記載のサトウキビ系統の製造方法。
  9. 　上記後代植物は種子又は幼苗であり、当該種子又は幼苗から染色体を抽出することを特徴とする請求項７記載のサトウキビ系統の製造方法。 
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007125958A1 (ja) 2006-04-28 2007-11-08 National Agriculture And Food Research Organization テンサイ黒根病抵抗性品種選抜マーカーとその選抜方法
JP2010516236A (ja) 2007-01-18 2010-05-20 シンジェンタ・パティシペーションズ・アクチェンゲゼルシャフト 新規なトウモロコシ植物
WO2012147635A1 (ja) 2011-04-28 2012-11-01 トヨタ自動車株式会社 サトウキビ属植物の黒穂病抵抗性関連マーカーとその利用
WO2018003220A1 (ja) 2016-06-29 2018-01-04 トヨタ自動車株式会社 Ｄｎａライブラリーの作製方法及びｄｎａライブラリーを用いたゲノムｄｎａ解析方法
JP2018127142A (ja) 2017-02-09 2018-08-16 Ｋｙｂ株式会社 電動パワーステアリング装置、及び車両
JP2018197546A (ja) 2017-05-22 2018-12-13 シュスン リ， 乗り物用風力原動機
JP2019122913A (ja) 2018-01-16 2019-07-25 株式会社トーテン 焼酎粕の処理方法、および焼酎粕の処理装置

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007125958A1 (ja) 2006-04-28 2007-11-08 National Agriculture And Food Research Organization テンサイ黒根病抵抗性品種選抜マーカーとその選抜方法
JP2010516236A (ja) 2007-01-18 2010-05-20 シンジェンタ・パティシペーションズ・アクチェンゲゼルシャフト 新規なトウモロコシ植物
WO2012147635A1 (ja) 2011-04-28 2012-11-01 トヨタ自動車株式会社 サトウキビ属植物の黒穂病抵抗性関連マーカーとその利用
WO2018003220A1 (ja) 2016-06-29 2018-01-04 トヨタ自動車株式会社 Ｄｎａライブラリーの作製方法及びｄｎａライブラリーを用いたゲノムｄｎａ解析方法
JP2018127142A (ja) 2017-02-09 2018-08-16 Ｋｙｂ株式会社 電動パワーステアリング装置、及び車両
JP2018197546A (ja) 2017-05-22 2018-12-13 シュスン リ， 乗り物用風力原動機
JP2019122913A (ja) 2018-01-16 2019-07-25 株式会社トーテン 焼酎粕の処理方法、および焼酎粕の処理装置

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"A Whitehead Institute for Biomedical Research Technical Report", January 1993
"Molecular genotyping of sugarcane clones with microsatellite DNA markers", MAYDICA, vol. 48, 2003, pages 319 - 329
HATTORI, TAIICHIRO ET AL: "QTL analysis for smut resistance in sugarcane varieties NiF8 and Ni9 with consideration of other characteristics", ABSTRACTS OF THE 233RD MEETING OF THE CROP SCIENCE, vol. 233, 2012, pages 344 - 345, XP055775717 *
HUANG, N. ET AL.: "Identification of smut-responsive genes in sugarcane using cDNA-SRAP", GENETICS AND MOLECULAR RESEARCH, vol. 14, no. 2, 2015, pages 6808 - 6818, XP055673366 *
IWATA HNINOMIYA, S.: "AntMap: Constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm", BREED SCI., vol. 56, 2006, pages 371 - 377
KHAN, MEHWISH ET AL.: "Development of an RAPD-based SCAR marker for smut disease resistance in commercial sugarcane cultivars of Pakistan", CROP PROTECTION, vol. 94, 2017, pages 166 - 172, XP029898389, DOI: 10.1016/j.cropro.2016.12.024 *
NATHALIE PIPERIDIS ET AL., MOLECULAR BREEDING, vol. 21, 2008, pages 233 - 247
RABOIN, LM ET AL.: "Undertaking Genetic Mapping of Sugarcane Smut Resistance", PROC S AFR SUG TECHNOL AS S, vol. 75, 2001, pages 94 - 98, XP055775719 *

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