CN112752843A - 甘蔗属植物的黑穗病抗性相关标记及其利用 - Google Patents

甘蔗属植物的黑穗病抗性相关标记及其利用 Download PDF

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Abstract

本发明以更高的精度判定黑穗病抗性。一种甘蔗黑穗病抗性相关标记，包含从甘蔗染色体中夹在序列编号1所示碱基序列与序列编号6所示碱基序列之间的区域、夹在序列编号135所示碱基序列与序列编号143所示碱基序列之间的区域、或夹在序列编号144或145所示碱基序列与序列编号151所示碱基序列之间的区域选择的连续的核酸区域。

Description

甘蔗属植物的黑穗病抗性相关标记及其利用
技术领域
本发明涉及能够选拔显示针对黑穗病的抗性的甘蔗属植物株系的黑穗病抗性相关标记及其利用方法。
背景技术
甘蔗除了因为砂糖原料、酒类原料等食用目的而栽种以外，还在包括作为生物燃料原料利用的各种产业领域被利用。这样的情况下，有需要开发具有希望的特性(例如糖含量、生命力的增强、新芽形成能力、抗病性和虫害抗性、耐寒性、叶长的增加、叶面积的增大、茎长的增大等)的甘蔗植物新品种。
一般，作为植物品种/株系的识别，有下述三种方法：对特性数据进行比较的“特性比较”、在同一条件下栽培并进行比较的“比较栽培”、对DNA进行分析的“DNA分析”。利用特性比较和比较栽培进行的株系识别存在栽培条件差异导致的精度低下、长时间农场调查需要大量人力等多种问题。尤其是甘蔗与水稻、玉米等其他禾本科作物相比植株极大，难以通过农场调查实施株系识别。
此外，为了识别针对特定病害的抗性品种，在长时间栽培甘蔗后进行接种病原微生物的试验，之后对病斑等进行观察，从而收集抗性数据。但在进行该试验时，必须切实防止病原微生物向外部环境的传播，需要大规模的专用温室、专用农场、与外部隔离的设施等设备。进一步，为了制作甘蔗新品种，可以首先通过杂交制作数万种杂交种子，从其中进行实生选拔，进一步分阶段选拔优良的株系，最终可以获得具有希望的特性的2～3个株系的候选新品种。这样，在甘蔗新品种的制作中，就需要对非常多的株系进行栽培、评价，需要准备上述那样的温室、农场，耗费大量人力。
因此，需要开发使用基因组中存在的标记对显示病害抗性的甘蔗株系进行识别的方法。尤其是在制作甘蔗新品种时，如果能针对各种特性使用优异的标记，则能够避免上述那样的甘蔗特有的各种问题，可成为非常有效的工具。然而，甘蔗植物有高倍数性，染色体数量多(约100～130)，因此标记技术的开发很缓慢。甘蔗中，虽然在USDA有使用SSR来进行基因型确定的相关报告(非专利文献1)，但标记数和来自各标记的多态性低，导致精度低，适用范围仅限于美国/澳大利亚品种，因此无法用于日本和印度等国家以及中国台湾地区的主要品种和有用的遗传资源的株系识别。
此外，非专利文献2提示了下述可能性：增加标记数，对各个标记的特性关系进行比较、验证，从而制成甘蔗的基因图谱。但非专利文献2中没有公开足够数量的标记，也没有发现与目的特性相关联的标记。
另一方面，作为病害抗性相关标记，如专利文献1所示，已知甜菜中的黑根病抗性相关标记。此外，如专利文献2所示，公开了在玉米中，利用与目的性状相关联的标记来对品种进行选拔的技术。
另一方面，就甘蔗黑穗病而言，病原体的感染力强，一旦发病则整个农场感染扩大。患黑穗病的甘蔗不仅不能作为制糖原料使用，而且还会枯死。因此，黑穗病的发生导致次年以后的大幅减产。黑穗病的破坏在巴西、美国、澳大利亚、中国、印尼等28个以上国家均有报道。黑穗病的防治方法有种植时的杀菌处理，但效果仅限于生长初期。因此，需要培育赋予了黑穗病抗性的甘蔗品种。
而且，专利文献3中公开了与黑穗病抗性相关联的标记，其是通过准备甘蔗中的多个标记、对杂交后代株系中数量性状与标记的关联性进行分析而发现的。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Maydica 48(2003)，319-329“Molecular genotyping ofsugarcane clones with microsatellite DNA markers(利用微卫星DNA标记对甘蔗克隆的分子基因分型)”
非专利文献2：Nathalie Piperidis等,Molecular Breeding,2008,第21卷,233-247
专利文献
专利文献1：WO 2007/125958
专利文献2：日本特表2010-516236号公报
专利文献3：WO 2012/147635
发明概述
发明所要解决的课题
然而，专利文献3中虽然公开了与黑穗病抗性相关联的标记，但需要与黑穗病抗性的关联性更高的更优异的黑穗病抗性标记。因此，鉴于这样的实际情况，本发明的目的在于，提供与黑穗病抗性的关联性更高的更优异的黑穗病抗性标记。
用于解决课题的方法
为了解决上述课题，本发明人等反复进行深入研究，结果，使用特定甘蔗品种，准备多个标记，通过杂交后代株系中数量性状与标记的相关联分析，发现了与黑穗病抗性等数量性状强烈相关联的标记，从而完成了本发明。
本发明包括以下内容。
(1)一种甘蔗黑穗病抗性相关标记，包含选自以下区域的连续的核酸区域：甘蔗染色体中夹在序列编号1所示碱基序列与序列编号6所示碱基序列之间的区域；夹在序列编号135所示碱基序列与序列编号143所示碱基序列之间的区域；或者夹在序列编号144或145所示碱基序列与序列编号151所示碱基序列之间的区域。
(2)根据(1)所述的甘蔗黑穗病抗性相关标记，其特征在于，上述核酸区域包含选自由序列编号1～6、135～143和144～151组成的组的任一碱基序列或该碱基序列的一部分。
(3)根据(1)所述的甘蔗黑穗病抗性相关标记，其特征在于，上述核酸区域为甘蔗染色体中序列编号1或2所示碱基序列或该碱基序列的一部分。
(4)根据(1)所述的甘蔗黑穗病抗性相关标记，其特征在于，上述核酸区域为选自由甘蔗染色体中序列编号138～140组成的组的1条碱基序列或该碱基序列的一部分。
(5)根据(1)所述的甘蔗黑穗病抗性相关标记，其特征在于，上述核酸区域为选自由甘蔗染色体中序列编号149或151组成的组的1条碱基序列或该碱基序列的一部分。
(6)根据(1)所述的甘蔗黑穗病抗性相关标记，其特征在于，上述核酸区域为选自由甘蔗染色体中序列编号298、303、307、311和316组成的组的1条碱基序列或该碱基序列的一部分。
(7)一种黑穗病抗性提高的甘蔗株系的制造方法，包括：提取至少一个亲本为甘蔗植物的后代植物的染色体和/或该亲本的染色体的工序，以及测定上述得到的染色体中上述(1)～(6)中任一项所述的甘蔗黑穗病抗性相关标记的存在/不存在的工序。
(8)根据(7)所述的甘蔗株系的制造方法，其特征在于，在上述进行测定的工序中，使用具有针对上述甘蔗黑穗病抗性相关标记的探针的DNA芯片。
(9)根据(7)所述的甘蔗株系的制造方法，其特征在于，上述后代植物为种子或幼苗，从该种子或幼苗提取染色体。
本说明书包括作为本申请优先权基础的日本专利申请号2018-127142号、2018-197546号和2019-122913号的公开内容。
发明效果
根据本发明，能够提供在甘蔗的数量性状中与黑穗病抗性相关联的新的甘蔗黑穗病抗性相关标记。通过利用本发明涉及的甘蔗黑穗病抗性相关标记，能够鉴定甘蔗杂交株系的黑穗病抗性。由此，能够以非常低的成本识别具有黑穗病抗性提高特性的甘蔗株系。
附图说明
图1中，(A)为显示对于“KY08－6023”与“JW90”杂交而得到的后代计算黑穗病患病率得到的结果的特性图，(B)为显示对于“KY08－6039”与“JW90”杂交而得到的后代计算黑穗病患病率得到的结果的特性图，(C)为显示对于“KY08－6041”与“JW90”杂交而得到的后代计算黑穗病患病率得到的结果的特性图。
图2为显示实施例1中黑穗病抗性相关的QTL分析结果的特性图。
图3为显示各株系中AMP0121265的读取(read)数的特性图。
图4为显示各株系中AMP0120752的读取数的特性图。
图5为显示各株系中AMP0035185的读取数的特性图。
图6为显示各株系中AMP0114852的读取数的特性图。
图7为显示各株系中AMP0089904的读取数的特性图。
图8为显示各株系中AMP0100370的读取数的特性图。
图9为显示实施例2中黑穗病抗性相关的QTL分析结果的特性图。
图10为显示各株系中AMP0014532的读取数的特性图。
图11为显示各株系中AMP0043152的读取数的特性图。
图12为显示各株系中AMP0069135的读取数的特性图。
图13为显示各株系中AMP0032477的读取数的特性图。
图14为显示各株系中AMP0018405的读取数的特性图。
图15为显示各株系中AMP0002312的读取数的特性图。
图16为显示各株系中AMP0007121的读取数的特性图。
图17为显示各株系中AMP0090108的读取数的特性图。
图18为显示各株系中AMP0015886的读取数的特性图。
图19为显示对于“KY09－6092”与“KY08－129”杂交而得的后代株系计算黑穗病患病率而得到的结果的特性图。
图20为显示实施例3中黑穗病抗性相关的QTL分析结果的特性图。
图21为显示各株系中AMP0063683的读取数的特性图。
图22为显示各株系中AMP0082090的读取数的特性图。
图23为显示各株系中AMP0013802的读取数的特性图。
图24为显示各株系中AMP0083204的读取数的特性图。
图25为显示各株系中AMP0043774的读取数的特性图。
图26为显示各株系中AMP0094596的读取数的特性图。
图27为显示各株系中AMP0091501的读取数的特性图。
具体实施方式
以下，对本发明涉及的甘蔗黑穗病抗性相关标记及其利用方法、特别是使用甘蔗黑穗病抗性相关标记的甘蔗株系的制造方法进行说明。
＜甘蔗黑穗病抗性相关标记＞
本发明涉及的甘蔗黑穗病抗性相关标记是存在于甘蔗染色体上的特定区域，与甘蔗黑穗病抗性等性状的原因基因(群)相关联，具有能够判断甘蔗黑穗病抗性等性状的功能。即，通过对使用已知甘蔗株系得到的后代株系中甘蔗黑穗病抗性相关标记的存在/不存在进行确认，能够判断是否为具有黑穗病抗性提高性状的株系。需说明的是，本发明中，黑穗病的意思是，感染Ustilago属(黑粉菌属)的微生物导致的形成病斑的疾病。作为Ustilago属的微生物，可以列举甘蔗黑穗病菌(Ustilago scitaminea)作为一例。
此外，甘蔗黑穗病抗性相关标记的意思是，与黑穗病抗性提高的性状的原因基因(群)相关联的标记。例如，如果特定甘蔗品种中存在该标记，则能够判断为黑穗病抗性提高的品种。
这里，甘蔗的意思是属于禾本科甘蔗属的植物。此外，甘蔗的意思包括所谓高贵种(学名：Saccharum officinarum，甘蔗)和野生种(学名：Saccharum spontaneum，甜根子草)、印度种(Saccharum barberi，细秆甘蔗)、中国种(Saccharum sinense，竹蔗)、作为高贵种的祖先种的大茎野生种(Saccharum robustum)中的任一种。作为已知的甘蔗品种/株系没有特别限定，意思包括日本国内能够使用的所有品种/株系、日本国外使用的品种/株系等。例如，作为甘蔗的日本国内培育品种没有特别限定，可以列举Ni1、NiN2、NiF3、NiF4、NiF5、Ni6、NiN7、NiF8、Ni9、NiTn10、Ni11、Ni12、Ni14、Ni15、Ni16、Ni17、NiTn19、NiTn20、Ni22和Ni23等。此外，作为甘蔗的日本国内主要品种没有特别限定，可以列举NiF8、Ni9、NiTn10和Ni15等。进一步，作为甘蔗的日本国内导入主要品种没有特别限定，可以列举F177、Nco310和F172等。进一步，作为甘蔗品种/株系，可以列举病害抗性特别优异的野生种、其中的黑穗病抗性优异的野生种。作为黑穗病抗性优异的野生种没有特别限定，可以列举例如JW90、西表15和西表8等。
此外，后代株系可以是通过母本和父本双方为甘蔗品种/株系的同种杂交得到的株系，也可以是任一方为甘蔗品种/株系而另一方为近缘的斑茅(Erianthusarundinaceus)那样的杂交株系。此外，后代株系也可以通过所谓回交得到。尤其优选母本和父本双方或一方为黑穗病抗性优异的野生种、例如JW90、西表15或西表8。
＜甘蔗黑穗病抗性相关标记之例1＞
甘蔗黑穗病抗性相关标记是，使用基于从甘蔗染色体特有获得的31191个标记(其中4503个来源于JW90)制成的、以JW90为来源的86个相关联群构成的基因相关联图谱和甘蔗黑穗病抗性数据，通过QTL(Quantitative Trait Loci，数量性状位点)分析而新鉴定的标记。需说明的是，甘蔗黑穗病抗性被认为与多个基因相关，是呈连续分布的数量性状。即，甘蔗黑穗病抗性基于呈连续分布的黑穗病患病率进行评价。QTL分析中使用遗传分析软件QTL Cartographer(Wang S.,C.J.Basten和Z.-B.Zeng(2010)，Windows QTLCartographer2.5，统计系,北卡罗来纳州立大学,Raleigh,NC)，应用Composite intervalmapping(CIM，复合区间作图)法。
具体地，通过上述QTL分析，确定LOD值(LOD score)在规定的阈值(例如2.5)以上的上述基因相关联图谱包含的区域、约8.4cM(厘摩)的区域。这里，“摩(M)”为相对表示染色体上基因间的距离的单位，是将交换值设为百分比的值。甘蔗染色体中，1cM相当于约2000kbp。需说明的是，提示该峰值位置或其附近存在使黑穗病抗性提高的性状的原因基因(群)。
上述8.4cM的区域是依次包含上述标记中表1所示6种标记的区域，是与黑穗病抗性提高性状相关联的区域。
[表1]
Figure GDA0003003168360000081
需说明的是，表1中，相关联群是分别给与QTL分析中确定的多个相关联群的编号。表1中附近标记一栏记载的标记名称是给与本发明获得的特有标记的名称。
此外，8.4cM的区域包含的峰值邻接包含序列编号1所示碱基序列的标记(AMP0121265)而存在。
可以将从包含表1所示标记的8.4cM区域选择的连续的核酸区域用作甘蔗黑穗病抗性相关标记。这里，核酸区域的意思是，由与甘蔗染色体中存在的其他区域的同一性为95％以下、优选为90％以下、更优选为80％以下、最优选为70％以下的碱基序列构成的区域。作为甘蔗黑穗病抗性相关标记的核酸区域与其他区域的同一性在上述范围内，则可以通过常规方法对该核酸区域进行特异性检测。这里，同一性的值例如可以利用BLAST用默认参数算出。
作为甘蔗黑穗病抗性相关标记的核酸区域的碱基长度可以设为至少8个碱基长度以上、优选为15个碱基长度以上、更优选为20个碱基长度以上、最优选为30个碱基长度。作为甘蔗黑穗病抗性相关标记的核酸区域的碱基长度在上述范围内，则可以通过常规方法对该核酸区域进行特异性检测。
作为甘蔗黑穗病抗性相关标记，可以是从上述8.4cM的区域选择的任何连续的核酸区域。需说明的是，关于该8.4cM区域的碱基序列，可以通过使用基于序列编号1～6的碱基序列设计的引物的反向PCR等相邻序列获得方法来确定。
尤其是作为甘蔗黑穗病抗性相关标记，优选从与上述8.4cM的区域中序列编号1所示碱基序列或序列编号2所示碱基序列邻近的区域选择。因为上述峰值是与序列编号1所示碱基序列邻接存在的。
此外，甘蔗黑穗病抗性相关标记可以设为上述6种标记本身或其一部分。即，可以将这6种标记中的1种以上标记用作甘蔗黑穗病抗性相关标记。此外，可以将这6种标记的部分区域用作甘蔗黑穗病抗性相关标记。
＜甘蔗黑穗病抗性相关标记之例2＞
甘蔗黑穗病抗性相关标记是，通过基于从甘蔗染色体特有获得的64757个标记(其中1166个来自祖先中有西表15的后代)制成的、使用58个相关联群构成的以祖先中有西表15的后代为来源的基因相关联图谱和甘蔗黑穗病抗性数据的QTL(Quantitative TraitLoci)分析新鉴定的标记。需说明的是，甘蔗黑穗病抗性被认为与多个基因相关，是呈连续分布的数量性状。即，甘蔗黑穗病抗性基于呈连续分布的黑穗病患病率来评价。QTL分析中，使用遗传分析软件QTL Cartographer(Wang S.,C.J.Basten和Z.-B.Zeng(2010)，WindowsQTL Cartographer2.5.统计系,北卡罗来纳州立大学,Raleigh,NC)，应用Compositeinterval mapping(CIM)法。
具体地，通过上述QTL分析，确定LOD值(LOD score)为规定的阈值(例如2.5)以上的上述基因相关联图谱包含的区域、约26.6cM(厘摩)的区域。这里，“摩(M)”为相对表示染色体上基因间的距离的单位，是将交换值设为百分比的值。甘蔗染色体中，1cM相当于约2000kbp。需说明的是，提示该峰值位置或其附近存在提高黑穗病抗性的性状的原因基因(群)。
上述26.6cM的区域是依次包含上述标记中表2所示9种标记的区域，是与黑穗病抗性提高性状相关联的区域。
[表2]
Figure GDA0003003168360000101
需说明的是，表2中，相关联群是分别给与QTL分析中确定的多个相关联群的编号。表2中附近标记一栏记载的标记名称是给与本发明获得的特有标记的名称。
此外，26.6cM的区域包含的峰值位于序列编号138所示碱基序列构成的标记(AMP0032477)和序列编号140所示碱基序列构成的标记(AMP002312)之间，特别是邻接序列编号139所示碱基序列构成的标记(AMP0018405)而存在。
可以将从包含表2所示标记的26.6cM区域选择的连续的核酸区域用作甘蔗黑穗病抗性相关标记。这里，核酸区域的意思是，由与甘蔗染色体中存在的其他区域的同一性为95％以下、优选为90％以下、更优选为80％以下、最优选为70％以下的碱基序列构成的区域。作为甘蔗黑穗病抗性相关标记的核酸区域与其他区域的同一性在上述范围内，则可以根据常规方法对该核酸区域进行特异性检测。这里，同一性的值例如可以利用BLAST用默认参数算出。
作为甘蔗黑穗病抗性相关标记的核酸区域的碱基长度可以设为至少8个碱基长度以上、优选为15个碱基长度以上、更优选为20个碱基长度以上、最优选为30个碱基长度。作为甘蔗黑穗病抗性相关标记的核酸区域的碱基长度在上述范围内，则可以通过常规方法对该核酸区域进行特异性检测。
作为甘蔗黑穗病抗性相关标记，可以是从上述26.6cM的区域选择的任何连续的核酸区域。需说明的是，关于该26.6cM区域的碱基序列，可以通过使用基于序列编号135～143的碱基序列设计的引物的反向PCR等相邻序列获得方法来确定。
尤其是，作为甘蔗黑穗病抗性相关标记，优选从上述26.6cM的区域中夹在序列编号138所示碱基序列和序列编号140所示碱基序列之间的区域选择。进一步，作为甘蔗黑穗病抗性相关标记，优选从上述26.6cM的区域中与序列编号139所示碱基序列和该碱基序列邻近的碱基序列构成的区域选择。因为上述峰值是夹在序列编号138所示碱基序列和序列编号140所示碱基序列之间的区域，且是与序列编号139所示碱基序列邻接存在的。
此外，甘蔗黑穗病抗性相关标记可以设为上述9种标记本身或其一部分。即，可以将这9种标记中的1种以上标记用作甘蔗黑穗病抗性相关标记。此外，可以将这9种标记的部分区域用作甘蔗黑穗病抗性相关标记。
＜甘蔗黑穗病抗性相关标记之例3＞
甘蔗黑穗病抗性相关标记是，使用基于从甘蔗染色体特有获得的57444个标记(其中2936个来源于祖先中有西表8的后代“KY09-6092”)制成的、117个相关联群构成的以祖先中有西表8的后代“KY09-6092”为来源的基因相关联图谱和甘蔗黑穗病抗性数据，通过QTL(Quantitative Trait Loci)分析新鉴定的标记。
需说明的是，甘蔗黑穗病抗性被认为与多个基因相关，是呈连续分布的数量性状。即，甘蔗黑穗病抗性基于呈连续分布的黑穗病患病率进行评价。QTL分析中，使用遗传分析软件QTL Cartographer(Wang S.,C.J.Basten和Z.-B.Zeng(2010)，Windows QTLCartographer2.5，统计系,北卡罗来纳州立大学,Raleigh,NC)，应用Composite intervalmapping(CIM)法。
具体地，通过上述QTL分析，确定LOD值(LOD score)为规定的阈值(例如2.5)以上的上述基因相关联图谱包含的区域、约12.27cM区域(厘摩)的区域。这里，“摩(M)”为相对表示染色体上基因间的距离的单位，是将交换值设为百分比的值。甘蔗染色体中，1cM相当于约2000kbp。需说明的是，提示该峰值位置或其附近存在使黑穗病抗性提高的性状的原因基因(群)。
上述12.27cM的区域是依次包含上述标记中表3所示7种标记的区域，是与黑穗病抗性提高性状相关联的区域。
[表3]
Figure GDA0003003168360000121
需说明的是，表3中，相关联群是分别给与QTL分析中确定的多个相关联群的编号。表3中附近标记一栏记载的标记名称是给与本发明特有获得的标记的名称。表3所示标记中的AMP0063683是两端包含序列编号144所示碱基序列和序列编号145所示碱基序列的核酸区域。AMP0063683以外的标记是分别包含单一碱基序列的核酸区域。
此外，12.27cM的区域包含的峰值邻接包含序列编号151所示碱基序列的标记(AMP0091501)存在。
可以将从包含表3所示标记的12.27cM区域选择的连续的核酸区域用作甘蔗黑穗病抗性相关标记。这里，核酸区域的意思是由与甘蔗染色体中存在的其他区域的同一性为95％以下、优选为90％以下、更优选为80％以下、最优选为70％以下的碱基序列构成的区域。作为甘蔗黑穗病抗性相关标记的核酸区域与其他区域的同一性在上述范围内，则可以根据常规方法对该核酸区域进行特异性检测。这里，同一性的值例如可以利用BLAST用默认参数算出。
作为甘蔗黑穗病抗性相关标记的核酸区域的碱基长度可以设为至少8个碱基长度以上、优选为15个碱基长度以上、更优选为20个碱基长度以上、最优选为30个碱基长度。作为甘蔗黑穗病抗性相关标记的核酸区域的碱基长度在上述范围内，则可以通过常规方法对该核酸区域进行特异性检测。
作为甘蔗黑穗病抗性相关标记，可以是从上述12.27cM的区域选择的任何连续的核酸区域。需说明的是，关于该12.27cM区域的碱基序列，可以通过使用基于序列编号144～151的碱基序列设计的引物的反向PCR等邻接序列获得方法来确定。
尤其是作为甘蔗黑穗病抗性相关标记，优选从上述12.27cM的区域中夹在序列编号150所示碱基序列和序列编号151所示碱基序列之间的区域选择。因为上述峰值是与序列编号151所示碱基序列邻近存在的。
此外，甘蔗黑穗病抗性相关标记可以设为上述7种标记本身或其一部分。即，可以将这7种标记中的1种以上标记用作甘蔗黑穗病抗性相关标记。此外，可以将这7种标记的部分区域用作甘蔗黑穗病抗性相关标记。
另一方面，包含表3所示标记的12.27cM区域与包含表1所示标记的8.4cM区域具有一部分共通的部分区域。详细地，12.27cM区域包含的峰值附近与8.4cM区域包含的峰值附近在碱基序列中是共通的。具体地，表1所示JW90来源的甘蔗黑穗病抗性相关标记中包含位于0cM的AMP0121265的附近区域与表3所示西表8来源的甘蔗黑穗病抗性相关标记中包含位于83.76cM的AMP0091501的附近区域具有共通的碱基序列。因此，该碱基序列共通的区域存在提高甘蔗黑穗病抗性的因子(例如原因基因)的可能性很高。因此，更优选将该区域用作甘蔗黑穗病抗性相关标记。
＜甘蔗中标记的鉴定＞
本发明中，如上所述，由从甘蔗染色体特有获得的31191个标记(其中4503个为JW90来源)、从甘蔗染色体特有获得的64757个标记(其中1166个来源于祖先中有西表15的后代“KY08-6023、KY08-6039、KY08-6041”)和从甘蔗染色体特有获得的57444个标记(其中2936个来源于祖先中有西表8的后代“KY09-6092”)确定了甘蔗黑穗病抗性相关标记。这里，对该31191个标记(其中4503个来源于JW90)、64757个标记(其中1166个来源于祖先中有西表15的后代“KY08-6023、KY08-6039、KY08-6041”)和57444个标记(其中2936个来源于祖先中有西表8的后代“KY09-6092”)进行说明。对这些标记进行鉴定时，按照国际公开WO 2018/003220中记载的DNA文库制作方法来制作。
即，使核酸扩增反应在将具有任意碱基序列的引物(以下称为随机引物)调整为高浓度的反应液中进行，将扩增的核酸片段作为DNA文库。这里，高浓度的意思是，与通常的核酸扩增反应中的引物浓度相比为高浓度。即，本发明涉及的DNA文库制作方法具有使用与通常的核酸扩增反应中的引物浓度相比为高浓度的随机引物的特征。这里，作为反应液中含有的模板，可以使用从制作DNA文库的对象生物制备的基因组DNA。
作为随机引物，其序列没有任何限定，例如可以使用9～30个碱基长度的核苷酸。特别地，随机引物的意思是具有任意序列的9～30个碱基长度的核苷酸，核苷酸的种类(序列的种类)没有特别限定，为1种以上核苷酸、优选为1～10000种核苷酸、更优选为1～1000种核苷酸、更优选为1～100种核苷酸、最优选为1～96种核苷酸。通过使用上述范围的核苷酸(核苷酸组)作为随机引物，能够以更高的再现性获得扩增核酸片段。需说明的是，随机引物包含多个核苷酸的情况下，全部核苷酸没有必要为同一碱基长度(9～30个碱基长度)，可以含有不同碱基长度的多个核苷酸。
通常，为了使用核酸扩增反应获得特定的扩增子，是根据该扩增子来设计引物的碱基序列的。例如，以将基因组DNA等模板DNA中对应于扩增子的位置夹在中间的方式设计一对引物。这种情况下，引物是以与模板包含的特定区域杂交的方式设计的，因此可以称为“特异性引物”。
与此相对，随机引物与出于获得特定的扩增子的目的而设计的引物不同，并非以与模板DNA中特定的区域杂交的方式设计，而是为了获得随机的扩增子而设计的。随机引物的碱基序列可以为任何序列，可以通过与模板DNA包含的互补区域偶然地进行杂交来参与随机的扩增子扩增。
即，如上所述，随机引物可以说是具有参与随机的扩增子扩增的任意序列的核苷酸。这里，任意序列没有任何限定，例如，可以设计为从腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中随机选择的碱基序列，也可以设计为特定的碱基序列。作为特定的碱基序列，可以列举例如包含限制酶识别序列的碱基序列、具有第二代测序仪中使用的接头序列的碱基序列。
设计多种核苷酸作为随机引物的情况下，可以应用从腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中随机选择，设计多个规定长度的碱基序列的方法。此外，设计多种核苷酸作为随机引物的情况下，也可以应用设计多个包括特定碱基序列构成的共通部分和任意碱基序列构成的非共通部分的碱基序列的方法。这里，非共通部分可以设为从腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中随机选择的碱基序列，也可以设为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶构成的4种碱基的全部组合、或者从该全部组合选择的部分组合。共通部分没有特别限定，可以为任何碱基序列，例如，可以设为包含限制酶识别序列的碱基序列、具有第二代测序仪中使用的接头序列的碱基序列、特定基因家族中共有的碱基序列。
作为多个随机引物，从4种碱基随机选择设计多个规定长度的碱基序列的情况下，优选以下述方式进行设计：整体的30％以上、优选为50％以上、更优选为70％以上、进一步优选为90％以上为70％以下的同一性、优选为60％以下的同一性、更优选为50％以下的同一性、最优选为40％以下的同一性。作为多个随机引物，从4种碱基随机选择设计多个规定长度的碱基序列的情况下，通过以形成上述范围的同一性的方式对上述范围的核苷酸进行设计，能够对于对象物种的整个基因组DNA整体获得扩增片段。即，能够提高扩增片段的均匀性。
作为多个随机引物，设计多个包含特定的碱基序列构成的共通部分和任意碱基序列构成的非共通部分的碱基序列的情况下，例如，可以以将3’末端侧的数个碱基设为非共通部分、将剩下的5’末端侧设为共通部分的方式进行设计。如果将3’末端侧的n个碱基设为非共通部分，则可以设计4n种随机引物。这里，作为n个，可以设为1～5个，优选为2～4个，更优选为2～3个。
例如，作为包含共通部分和非共通部分的随机引物，可以设计将5’末端侧设为第二代测序仪中使用的接头序列(共通部分)、将3’末端侧设为2个碱基(非共通部分)的合计16种随机引物。需说明的是，如果将3’末端侧设为3个碱基(非共通部分)，则可以设计合计64种随机引物。随机引物的种类越多则能够对于对象物种的整个基因组DNA整体获得包罗性越高的扩增片段。因此，设计包含共通部分和非共通部分的随机引物时，优选3’末端侧的碱基设为3个碱基。
不过，也可以例如在设计包含共通部分和3个碱基的非共通部分的64种碱基序列后，使用从该64种碱基序列选择的63种以下的随机引物。换句话说，有时候，与使用全部64种随机引物时相比，使用63种以下随机引物的情况下，在核酸扩增反应、使用第二代测序仪的分析中显示更优异的结果。
随机引物的浓度优选根据随机引物的碱基长度适当设定。这里，使用不同碱基长度的多种核苷酸作为随机引物的情况下，随机引物的碱基长度可以设为其平均值(可以是单纯平均，也可以是考虑了核苷酸量的加权平均)。
具体地，使用9～30个碱基长度的随机引物，在将该随机引物浓度设为4～200μM的条件下、优选在设为4～100μM的条件下，进行核酸扩增反应。如果在该条件下，则可以通过核酸扩增反应，在实现高再现性的同时，获得多个扩增片段、特别是100～500个碱基长度的多个扩增片段。
更具体地，在随机引物为9～10个碱基长度的情况下，随机引物的浓度优选设为40～60μM。在随机引物为10～14个碱基长度的情况下，将随机引物的碱基长度设为y、将随机引物的浓度设为x时，优选随机引物的浓度满足y＞3E+08x－6.974且为100μM以下。在随机引物为14～18个碱基长度的情况下，随机引物的浓度优选设为4～100μM。在随机引物为18～28个碱基长度的情况下，优选随机引物的浓度为4μM以上且满足y＜8E+08x－5.533。在随机引物为28～29个碱基长度的情况下，随机引物的浓度优选设为6～10μM。通过根据随机引物的碱基长度如上所述对随机引物的浓度进行设定，能够在实现高再现性的同时，更切实地获得多个扩增片段。
需说明的是，上述不等式y＞3E+08x－6.974和y＜8E+08x－5.533是如在国际公开WO2018/003220中说明的那样对随机引物的长度与浓度的关系进行详细调查的结果，是作为能够以良好的再现性对100～500个碱基长度的多个DNA片段进行扩增的范围算出的。
此外，核酸扩增反应中作为模板的基因组DNA没有特别限定，将反应液的量设为50μl时，优选设为0.1～1000ng，更优选设为1～500ng，进一步优选设为5～200ng，最优选设为10～100ng。通过将作为模板的基因组DNA的量设在该范围内，能够不阻碍来自随机引物的扩增反应，在实现高再现性的同时，获得多个扩增片段。
按照以上方法，能够从黑穗病抗性优异的甘蔗制作DNA文库，此外能够从显示黑穗病敏感性的甘蔗制作DNA文库。通过用第二代测序仪对这些DNA文库的碱基序列进行分析、对构成文库的片段的读取数进行比较，能够选择从黑穗病抗性优异的甘蔗制作的DNA文库中特有的片段。
更具体地，本发明人等对于使甘蔗野生种“JW90”与使甘蔗野生种“西表15”与已知甘蔗品种“NiF8”杂交而得到的后代株系(3个株系)进行杂交而得到的各后代株系(33个株系、35个株系和35个株系)制作了上述DNA文库。然后，由对该DNA文库应用第二代测序仪而得到的读取数数据获得基因型数据，基于该基因型数据，使用遗传图谱制作软件AntMap(Iwata H,Ninomiya S(2006)AntMap:constructing genetic linkage maps using anant colony optimization algorithm(AntMap：使用蚁群优化算法构建遗传相关联图谱)，Breed Sci 56:371-377)，利用遗传距离计算式Kosambi算出染色体中标记的位置信息。进一步，基于获得的标记的位置信息，利用Mapmaker/EXP ver.3.0(A Whitehead Institutefor Biomedical Research Technical Report,Third Edition,January,1993(怀特海生物医学研究所技术报告第三版，1993年1月))制成遗传图谱数据表。结果，鉴定出包括上述序列编号1～6所示6种甘蔗黑穗病抗性相关标记的31191个标记。此外，通过将对DNA文库应用第二代测序仪获得读取数数据的工序重复2次，获得更多的读取数数据，由得到的读取数数据获得基因型数据。然后，同样操作，鉴定出包括上述序列编号135～143所示9种甘蔗黑穗病抗性相关标记的64757个标记。
进一步，本发明人等对于由使甘蔗野生种“西表8”与已知甘蔗品种“NiF8”杂交而得到的后代株系和使甘蔗品种“NiTn18”与“NiTn24”杂交而得到的后代株系制作的154个株系的后代株系，制作了上述DNA文库。而且，由对该DNA文库应用第二代测序仪而得到的读取数数据获得基因型数据，基于该基因型数据，使用遗传图谱制作软件AntMap(Iwata H,Ninomiya S(2006)AntMap:constructing genetic linkage maps using an ant colonyoptimization algorithm.Breed Sci 56:371-377)，利用遗传距离计算式Kosambi算出染色体中标记的位置信息。进一步，基于获得的标记的位置信息，用Mapmaker/EXP ver.3.0(AWhitehead Institute for Biomedical Research Technical Report,Third Edition,January,1993)制成遗传图谱数据表。结果，鉴定出包括上述序列编号144(和145)～151所示7种甘蔗黑穗病抗性相关标记的57444个标记。
此外，包含具有序列编号151所示碱基序列的甘蔗黑穗病抗性相关标记的附近区域与包含具有序列编号1所示碱基序列的甘蔗黑穗病抗性相关标记的附近区域虽然被分别独立地鉴定，但也可包括具有相同碱基序列的多个标记。
＜甘蔗黑穗病抗性相关标记的利用＞
通过利用甘蔗黑穗病抗性相关标记，能够对于后代株系等黑穗病抗性表型未知的甘蔗株系，判断是否为显示黑穗病抗性提高的表型的株系。作为甘蔗黑穗病抗性相关标记，可以利用上述8.4cM区域包含的1个核酸区域，也可以利用上述8.4cM区域包含的多个核酸区域。此外，作为甘蔗黑穗病抗性相关标记，可以利用上述26.6cM区域包含的1个核酸区域，也可以利用上述26.6cM区域包含的多个核酸区域。进一步，作为甘蔗黑穗病抗性相关标记，可以利用上述12.27cM区域包含的1个核酸区域，也可以利用上述12.27cM区域包含的多个核酸区域。进一步，作为甘蔗黑穗病抗性相关标记，还可以利用从上述8.4cM区域包含的1个或多个核酸区域、上述26.6cM区域包含的1个或多个核酸区域和上述12.27cM区域包含的1个或多个核酸区域选择的核酸区域。这里，利用甘蔗黑穗病抗性相关标记的意思包括利用使用特异性扩增该标记的引物对的核酸扩增反应的形态、利用具有针对该标记的探针的DNA微阵列的形态。
特异性扩增甘蔗黑穗病抗性相关标记的引物对可以基于上述8.4cM区域的碱基序列、上述26.6cM区域的碱基序列和上述12.27cM区域的碱基序列适当设计。例如，引物对可以以扩增上述8.4cM区域、上述26.6cM区域的碱基序列和上述12.27cM区域的碱基序列包含的例如1kbp以下的长度、或800bp以下的长度、或500bp以下的长度、或350bp以下的长度的区域的方式进行设计。或者，作为引物对，可以以扩增序列编号1～6、135～143和144(145)～151中的任一个所示碱基序列构成的核酸区域的全部或一部分的方式进行设计。作为该核酸区域的一部分，可以设为序列编号1～6、135～143和144(145)～151中的任一个所示碱基序列包含的连续的10个碱基，可以设为连续的20个碱基，可以设为连续的40个碱基，可以设为连续的80个碱基，可以设为连续的100个碱基，可以设为连续的140个碱基。
针对甘蔗黑穗病抗性相关标记的探针的意思是，能够与如上所述定义的甘蔗黑穗病抗性相关标记在严格条件下特异性杂交的寡核苷酸。这样的寡核苷酸例如可以设计为如上所述定义的甘蔗黑穗病抗性相关标记的碱基序列或其互补链中至少连续的10个碱基、15个碱基、20个碱基、25个碱基、30个碱基、35个碱基、40个碱基、45个碱基、50个碱基或50个以上的碱基长度的部分区域或整个区域。需说明的是，该探针也可以固定在载体上使用。即，可以是以玻璃、硅酮等的平面基板为载体的微阵列、以微珠为载体的微珠阵列、或者将探针固定于中空纤维内壁的三维微阵列等任意类型的微阵列。
通过使用如上所述制作的DNA微阵列，可以对于后代株系等代表的黑穗病抗性表型未知的甘蔗株系，判断是否为显示黑穗病抗性提高的表型的株系。需说明的是，除了使用上述DNA微阵列的方法以外，也可以使用以往公知的方法对上述甘蔗黑穗病抗性相关标记进行检测，对于黑穗病抗性表型未知的甘蔗株系，判断是否为具有黑穗病抗性提高性状的株系。
详细地，首先，从待测甘蔗提取基因组DNA。该待测甘蔗是制作后代株系等黑穗病抗性表型未知的甘蔗株系和/或后代株系时使用的亲本甘蔗株系，是作为判断是否具有黑穗病抗性提高性状的对象的甘蔗株系。需说明的是，也可以以甘蔗以外的植物、例如高粱、蔗茅等禾本科植物为待测植物，评价这些待测植物的黑穗病抗性。
然后，通过以提取的基因组DNA为模板、使用上述引物对的核酸扩增反应，对甘蔗黑穗病抗性相关标记进行扩增。此时，通过对引物中的一者添加荧光色素等标记，可以在扩增的基因组DNA片段上添加标记。作为标记，可以使用以往公知的任何物质。例如可以使用荧光分子、色素分子、放射性分子等作为标记。
然后，使具有标记的基因组DNA片段在规定条件下与DNA微阵列接触，使固定于DNA微阵列的探针与具有标记的基因组DNA片段杂交。此时，杂交时优选设为高严格性条件。通过设为这样的高严格性条件，能够以更高的精度判定待测甘蔗中是否存在甘蔗黑穗病抗性相关标记。需说明的是，严格性条件可以通过反应温度和盐浓度来调节。即，通过设为更高温度，形成严格性更高的条件，此外通过更低的盐浓度形成严格性更高的条件。例如，使用50～75个碱基长度的探针的情况下，作为杂交条件，通过设为40～44℃、0.21SDS、6×SSC的条件，可以设为严格性更高的条件。
此外，探针与具有标记的基因组DNA片段的杂交可以基于标记进行检测。即，上述具有标记的基因组DNA片段与探针的杂交反应之后，对未反应的基因组DNA片段等进行洗涤，之后，对与探针特异性杂交的基因组DNA片段的标记进行观察。例如，标记为荧光物质时，检测其荧光波长；如果标记为色素分子则检测该色素波长。更具体地，可以使用通常的DNA微阵列分析中使用的荧光检测装置、图像分析仪等装置。
需说明的是，除了如上所述使用DNA微阵列的方法以外，还可以对从待测甘蔗提取的基因组DNA中的甘蔗黑穗病抗性相关标记进行检测。例如，可以以从待测甘蔗提取的基因组DNA为模板，使用第二代测序仪测定甘蔗黑穗病抗性相关标记的读取数，从而高精度判断甘蔗黑穗病抗性相关标记是否存在。
如上所述，通过使用上述DNA微阵列、第二代测序仪，能够判断待测甘蔗是否具有上述甘蔗黑穗病抗性相关标记。这里，甘蔗黑穗病抗性相关标记是与黑穗病抗性提高的性状相关联的标记。因此，如果待测甘蔗中存在甘蔗黑穗病抗性相关标记，则可以判断为黑穗病抗性提高的品种。
特别是，上述方法中，无需使待测甘蔗生长至能够实施实际的黑穗病抗性试验的程度，例如可以使用后代株系的种子、使该种子发芽得到的幼苗。因此，通过利用甘蔗黑穗病抗性相关标记，可以大幅削减用于使待测甘蔗生长的农场、以及用于生长的成本。此外，通过利用甘蔗黑穗病抗性相关标记，无需实际感染黑穗病的病原体(Ustilagoscitaminea，黑穗病菌)，能够削减大规模专用温室、专用农场、与外部隔离的设施等设备等所花费的成本。
尤其在制作甘蔗新品种时，优选首先通过杂交制作数万种杂交种以后，在实生选拔之前或代替实生选拔，利用甘蔗黑穗病抗性相关标记进行判断。由此，能够大幅减少在实际的农场中栽培优良株系的数量，能够大幅降低制作甘蔗新品种花费的人手、成本。
或者，也可以在制作甘蔗新品种时，首先判断杂交中使用的亲本中是否存在甘蔗黑穗病抗性相关标记，选拔黑穗病抗性优异的亲本。通过优先使用黑穗病抗性优异的亲本制作后代株系，可以期待黑穗病抗性优异的后代株系的高频出现。由此，能够大幅减少栽培优良株系的数量，能够大幅降低制作甘蔗新品种花费的人手、成本。
实施例
以下，通过实施例更详细地对本发明进行说明，但本发明的技术范围不受以下实施例的限制。
〔实施例1〕
(1)材料
对于使“西表15”与甘蔗品种“NiF8”、甘蔗野生种“西表15”、“NiF8”杂交而得的3个后代株系“KY08－6023”、“KY08－6039”、“KY08－6041”、分别使甘蔗野生种“JW90”与该3个后代株系杂交而得的后代各33、35、35个株系，用DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN公司)提取、纯化基因组DNA。
(2)DNA文库的制作
本实施例中DNA文库是基于国际公开WO 2018/003220中记载的DNA文库制作方法制作的。即，在15.0ng上述(1)中获得的基因组DNA中分别加入终浓度0.2mM的dNTPmixture、0.625unit的Prime STAR DNA Polymerase(宝生物公司)和60μM随机引物，以25μl终反应量进行PCR。反应是，98℃2分钟后，以98℃10秒、50℃15秒和72℃20秒为1个循环，进行30个循环，最终4℃保存。
其中，将本例中使用的随机引物汇总于表4。
[表4]
Figure GDA0003003168360000231
(3)第二代测序仪用DNA文库的制作
在1.5μl上述(2)的反应后的溶液中分别加入终浓度0.2mM的dNTP mixture、1.25unit的PrimeSTAR HS DNA Polymerase(宝生物公司)和引物组，以50μl终反应量进行PCR。反应条件是，95℃2分钟后，以98℃15秒、55℃15秒和72℃20秒为1个循环，进行25个循环，最终4℃保存。需说明的是，本例中，关于针对用于使“JW90”与“KY08-6023”、“KY08-6039”、“KY08-6041”杂交而得的103个株系(各33、35、35株系)和用于这些亲本和祖父母株系(“NiF8”、“西表15”、“KY08-6023”、“KY08-6039”、“KY08-6041”、“JW90”6个株系用(各2个重复)的合计115个组合，使用的是表5所示正向引物(序列编号19～133)与反向引物(5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCGCGCAGATCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(序列编号134))的组合。
[表5]
Figure GDA0003003168360000241
Figure GDA0003003168360000251
Figure GDA0003003168360000261
(4)纯化和电泳
将上述(3)的反应后的溶液在一根管中等量混合，利用MinElute PCRPurification Kit(QIAGEN公司)对其中的50μl进行纯化后，用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent Technology公司)电泳，得到荧光单位(Fluorescence Unit：FU)。
(5)第二代测序仪分析
基于读取长度100碱基的双端条件，用Hiseq4000测序株系(Illumina株式会社)对上述(3)中得到的DNA文库进行分析。
(6)读取数据的分析
由上述(5)中得到的读取数据，使用分析软件GRAS-Di(丰田自动车株式会社)进行分析，得到31191个标记的基因型数据。
(7)遗传图谱的制作
基于上述(6)中得到的JW90来源的基因型数据，使用遗传图谱制作软件AntMap(Iwata H,Ninomiya S(2006)AntMap:constructing genetic linkage maps using anant colony optimization algorithm.Breed Sci 56:371-377)，利用遗传距离计算式Kosambi获得86个相关联群构成的遗传图谱数据。86个相关联群中包括属于JW90型的4503个标记的基因型数据。
(8)黑穗病鉴定试验数据的获得
使甘蔗野生种“西表15”与甘蔗品种“NiF8”杂交而得的3个后代株系“KY08－6023”、“KY08－6039”、“KY08－6041”、使甘蔗野生种“JW90”分别与该3个后代株系杂交，对由此获得的后代各33、35、35个株系的茎进行回收，在室温、高湿度条件下进行2～3天催芽处理后，进行黑穗病孢子的创伤接种。创伤接种是，在苗芽两侧造成创伤(计6处，深度约4.0mm)，用毛笔涂布孢子悬浮液(107～108个孢子/ml)。将创伤接种的苗在室温、高湿度条件下培养2～3天，种植于育苗箱(40芽/箱，2箱/株系)。种植苗后，在高湿度条件下温室栽培。黑穗病患病程度的调查是，测定作为患病症状的鞭状物从顶部露出的株数，作为患病株数。调查患病株数后，将患病株的植株从靠近地面部割下除去。算出患病株数相对于发芽株数(黑穗病以外的枯死株除外)的比例(黑穗病患病率)作为黑穗病患病率。将针对使“KY08－6023”和“JW90”杂交而得到的后代计算黑穗病患病率的结果示于图1(A)，将针对使“KY08－6039”和“JW90”杂交而得到的后代计算黑穗病患病率的结果示于图1(B)，将针对使“KY08－6041”和“JW90”杂交而得到的后代计算黑穗病患病率的结果示于图1(C)。
(9)数量性状(Quantitative Trait Loci)的分析
基于上述(7)中得到的JW90来源的遗传图谱数据和(8)中得到的黑穗病鉴定试验数据，使用遗传分析软件QTL Cartographer(http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/cartographer.html)，通过Composite interval mapping(CIM)法进行QTL分析。LOD的阈值使用2.5。结果，在甘蔗野生种“JW90”的第42相关联群的包含标记AMP0121265至AMP0100370的约8.4cM区域确认到甘蔗黑穗病相关QTL的存在(表6和图2)。需说明的是，效果的数字为负的情况下，意思是该QTL与黑穗病抗性提高性状相关联。
[表6]
Figure GDA0003003168360000281
如表6和图2所示，可以确认本实施例中发现的第42相关联群的标记AMP0121265至AMP0100370的范围与国际公开WO2012/147635中记载的QTL相比LOD值显著高，此外效果也显著提高。
(10)黑穗病抗性选拔标记的选定
选择上述(9)确认的甘蔗黑穗病抗性QTL区域包含的标记(AMP0121265、AMP0120752、AMP0035185、AMP0114852、AMP0089904、AMP0100370)作为选拔标记(表7)。
[表7]
Figure GDA0003003168360000291
各标记的基因型、即待测株系是否具有上述选拔标记是，将各自的读取数的阈值设为10，读取数为10以上的情况下判断为“有”，读取数低于10的情况下判断为“无”(图3～8、表8)。
[表8]
Figure GDA0003003168360000301
如表8和图3～8所示，可见黑穗病患病率低的待测株系与黑穗病患病率高的待测株系相比该标记数显著高。根据这些结果可见，可以将从包含AMP0121265、AMP0120752、AMP0035185、AMP0114852、AMP0089904和AMP0100370的约8.4cM区域选择的连续的核酸区域用作甘蔗黑穗病抗性相关标记。
〔实施例2〕
实施例1中，基于31191个标记的基因型数据中属于JW90型的4503个基因型数据对甘蔗黑穗病抗性相关标记进行鉴定。本实施例中，收集属于西表15型的基因型数据，同样操作，对甘蔗黑穗病抗性相关标记进行鉴定。
本实施例中，为了增加属于西表15型的基因型数据数，对于实施例1中制作的DNA文库，将(5)第二代测序仪分析重复2次。由这样得到的读取数据，使用分析软件GRAS-Di(丰田自动车株式会社)进行分析，得到64757个标记的基因型数据。
然后，基于祖先有西表15型的后代“KY08-6023、KY08-6039、KY08-6041”来源的基因型数据，与实施例1同样操作，使用遗传图谱制作软件AntMap(Iwata H,Ninomiya S(2006)AntMap:constructing genetic linkage maps using an ant colonyoptimization algorithm.Breed Sci 56:371-377)，利用遗传距离计算式Kosambi，得到58个相关联群构成的遗传图谱数据。58个相关联群中包括属于祖先中有西表15的后代“KY08-6023、KY08-6039、KY08-6041”型的4503个标记的基因型数据。
基于以这种方式得到的遗传图谱数据和实施例1中得到的黑穗病鉴定试验数据，使用遗传分析软件QTL Cartographer(http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/cartographer.html)，通过Composite interval mapping(CIM)法进行QTL分析。LOD的阈值使用2.5。结果，在甘蔗野生种“西表15”的第15相关联群的标记AMP0014532至AMP0015886的区间内确认到甘蔗黑穗病相关QTL的存在(表9、图9)。需说明的是，效果的数字为负的情况下，意思是该QTL与黑穗病抗性提高的性状相关联。
[表9]
Figure GDA0003003168360000311
如表9和图9所示，可以确认本实施例2中发现的第15相关联群的标记AMP0014532至AMP0015886的区间的范围与国际公开WO2012/147635中记载的QTL相比LOD值显著高，此外效果也显著提高。本实施例中，选择这样操作确认的甘蔗黑穗病抗性QTL区域包含的标记(AMP0014532、AMP0043152、AMP0069135、AMP0032477、AMP0018405、AMP0002312、AMP0007121、AMP0090108、AMP0015886)作为选拔标记(表10)。
[表10]
Figure GDA0003003168360000321
Figure GDA0003003168360000331
各标记的基因型、即待测株系是否具有上述选拔标记是，将各自的读取数的阈值设为10，将在10以上判断为“有”，将低于10判断为“无”(图10～18、表11)。
[表11]
Figure GDA0003003168360000332
如表11和图10～18所示，可见黑穗病患病率低的待测株系与黑穗病患病率高的待测株系相比这些标记数显著高。根据这些结果可见，可以将从包含AMP0014532、AMP0043152、AMP0069135、AMP0032477、AMP0018405、AMP0002312、AMP0007121、AMP0090108、AMP0015886的约26.6cM区域选择的连续的核酸区域用作甘蔗黑穗病抗性相关标记。
〔实施例3〕
本实施例中，使用使甘蔗品种“NiF8”和甘蔗野生种“西表8”杂交而得的后代“KY09－6092”、使甘蔗品种“NiTn18”和甘蔗品种“NiN24”杂交而得的后代“KY08－129”、使“KY09－6092”和“KY08－129”杂交而得的后代154株系，除此以外，与实施例1同样操作，对甘蔗野生种“西表8”来源的甘蔗黑穗病抗性相关标记进行鉴定。
本实施例中，制作第二代测序仪用的DNA文库时，代替表5所示正向引物，使用表12所示正向引物，除此以外，由通过与实施例1同样的方法得到的读取数据，使用分析软件GRAS-Di(丰田自动车株式会社)进行分析，得到57444个标记的基因型数据。
[表12]
Figure GDA0003003168360000351
Figure GDA0003003168360000361
Figure GDA0003003168360000371
其中，得到属于KY09－6092的2936个基因型和属于KY08－129的1877个基因型。而且，获得了“KY09-6092”来源的117个相关联群构成的遗传图谱数据和“KY08-129”来源的123个相关联群构成的遗传图谱数据。此外，对于使“KY09－6092”和“KY08－129”杂交而得的154个后代株系，在与实施例1同样的条件下获得黑穗病鉴定试验数据，计算黑穗病患病率，将结果示于图19。然后，基于该遗传图谱数据和黑穗病鉴定试验数据，使用遗传分析软件QTL Cartographer(http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/cartographer.html)，通过Composite interval mapping(CIM)法进行QTL分析。LOD的阈值使用2.5。
结果，确认到“KY09-6092”的包含第8相关联群的标记AMP0063683至AMP0091501的约12.27cM区域中甘蔗黑穗病相关QTL的存在(表13和图20)。需说明的是，效果的数字为负的情况下，意思是该QTL与黑穗病抗性提高性状相关联。
[表13]
Figure GDA0003003168360000372
如表13和图20所示，可以确认，本实施例中发现的第8相关联群的标记AMP0063683至AMP0091501的范围与国际公开WO2012/147635中记载的QTL相比LOD值显著高，此外效果也显著提高。选择本实施例确认的甘蔗黑穗病抗性QTL区域包含的标记(AMP0063683、AMP0082090、AMP0013802、AMP0083204、AMP0043774、AMP0094596和AMP0091501)作为选拔标记(表14)。
[表14]
Figure GDA0003003168360000391
需说明的是，表14所示标记中AMP0063683 PCR产物的大小为200bp以上的大小，因此定义为两端包含利用第二代测序仪确定了碱基序列的读取1(序列编号144)和读取2(序列编号145)的核酸区域。
各标记的基因型、即待测株系是否具有上述选拔标记是，将各自的读取数的阈值设为10，读取数为10以上的情况下判断为“有”，读取数低于10的情况下判断为“无”(图21～27、表15)。
[表15]
Figure GDA0003003168360000401
如表15和图21～27所示，可见，黑穗病患病率低的待测株系与黑穗病患病率高的待测株系相比该标记数显著高。根据这些结果可见，可以将从包含AMP0063683、AMP0082090、AMP0013802、AMP0083204、AMP0043774、AMP0094596和AMP0091501的约12.27cM区域选择的连续的核酸区域用作甘蔗黑穗病抗性相关标记。
〔实施例4〕
本实施例中，对实施例1中鉴定的包含JW90来源的甘蔗黑穗病抗性相关标记的约8.4cM区域与实施例3中鉴定的包含西表8来源的甘蔗黑穗病抗性相关标记的约12.27cM区域进行碱基序列比较。结果发现，实施例1中鉴定的JW90来源的甘蔗黑穗病抗性相关标记中包含位于0cM的AMP0121265的附近区域与实施例3中鉴定的西表8来源的甘蔗黑穗病抗性相关标记中包含位于83.76cM的AMP0091501的附近区域包含多个具有相同碱基序列的标记。
将实施例1中鉴定的JW90来源的甘蔗黑穗病抗性相关标记中包含位于0cM的AMP0121265的附近区域中包含的标记汇总于表16。将实施例3中鉴定的西表8来源的甘蔗黑穗病抗性相关标记中位于包含83.76cM的AMP0091501的附近区域中包含的标记汇总于表17。需说明的是，表16和17中，各标记相关的碱基序列信息一栏中，由利用第二代测序仪分析读取的一对读取数据导出重叠群序列的情况下，记载的是该重叠群序列的碱基序列；在未导出重叠群序列时，记载的是一对读取序列(读取序列1和读取序列2)。即，表16和17所示各标记可以用重叠群序列的碱基序列定义，或者也可以用读取序列1的碱基序列和读取序列2的碱基序列定义。
对于表16中列举的标记中具有与表17中列举的包含AMP0179276的附近区域中包含的标记相同的碱基序列的标记，在“西表8来源的DNA标记的有无()：西表8标记ID”一栏中记载○并记载具有相同碱基序列的西表8来源标记的ID。同样地，对于表17中列举的标记中具有与表16中列举的包含AMP0121265的附近区域中包含的标记相同的碱基序列的标记，在“JW90来源的DNA标记的有无()：JW90标记ID”一栏中记载○并记载具有相同碱基序列的JW90来源标记的ID。
[表16]
Figure GDA0003003168360000421
Figure GDA0003003168360000431
Figure GDA0003003168360000441
Figure GDA0003003168360000451
Figure GDA0003003168360000461
Figure GDA0003003168360000471
Figure GDA0003003168360000481
[表17]
Figure GDA0003003168360000491
Figure GDA0003003168360000501
Figure GDA0003003168360000511
如表16所示，JW90来源的甘蔗黑穗病抗性相关标记中包含位于0cM的AMP0121265的附近区域中包含36个标记，如表17所示，西表8来源的甘蔗黑穗病抗性相关标记中包含位于83.76cM的AMP0091501的附近区域中包含18个标记。判明其中5个标记具有相同的碱基序列。根据该结果，包含表16所示36个标记的区域和包含表17所示18个标记的区域可以理解为与对甘蔗黑穗病的抗性密切相关的QTL。特别地，本实施例中确定的甘蔗黑穗病抗性的QTL存在于JW90和西表8两者中，因此被认为没有特别限制地广泛存在于各种甘蔗品种中。
特别地，根据本实施例，表明表16所示36个标记和表17所示18个标记可以用作特别优异的甘蔗黑穗病抗性相关标记。
进一步表明，表16所示36个标记和表17所示18个标记中已知具有相同的碱基序列的5个标记(AMP0016471(序列编号298)＝AMP0020554(序列编号248)、AMP0036426(序列编号303)＝AMP0045000(序列编号270)、AMP0046626(序列编号307)＝AMP0057239(序列编号271)、AMP0052709(序列编号311)＝AMP0062853(序列编号273)、AMP0091501(序列编号316)＝AMP0111891(序列编号292))可以用作最优异的甘蔗黑穗病抗性相关标记。
本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请直接通过引用并入本说明书。
序列表
<110> 丰田自动车株式会社
<120> 甘蔗属植物的黑穗病抗性相关标记及其利用
<130> PH-7519-PCT
<150> JP 2018-127142
<151> 2018-07-03
<150> JP 2018-197546
<151> 2018-10-19
<150> JP 2019-122913
<151> 2019-07-01
<160> 318
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 148
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 1
tagcccacta aaagaaagcc ttgcataacc cttgatgtca ctttattttg gtttaagaca 60
gataagtcta gctgagtacc ttctcgtact tagggcgttg ttcccattgt tgttgtagat 120
gattagatgt actacggcta ttgcgtca 148
<210> 2
<211> 169
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 2
tagagcggag ggcgttggag cgtctaggaa tagatcgcgt tctctccagt ggcgagccga 60
tctgagtggg aggacgtgga tggggctcac gcggcgagga ggatgtggat gcggcgccgt 120
cctggttcct gctcaaccac agcgacgctg gcggctactg cacggtgga 169
<210> 3
<211> 237
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 3
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ccccacccag ctgacacgcc aagcggaaat cggcgagcca aagttcgggt ttggtctcgc 120
tgttgtactt ggtgagagtc gtggggggcg aaaccgcgcc gggagtatca tttcacgaat 180
agccttactg aagacccgag ggcccggagg ctcgggtgaa gggctacgat cctccga 237
<210> 4
<211> 142
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 4
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agtctagctg agtaccttct cgtactcagg gctttgttcc cacttgttgc agatggacag 120
atgtagtatg gttattgtat ca 142
<210> 5
<211> 197
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 5
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<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
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<220>
<223> 合成DNA
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<220>
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<400> 107
caagcagaag acggcatacg agatacacag tagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 108
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 108
caagcagaag acggcatacg agatcagatg tagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 109
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 109
caagcagaag acggcatacg agatctctac aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 110
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 110
caagcagaag acggcatacg agatgtcact aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 111
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 111
caagcagaag acggcatacg agattgtact aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 112
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 112
caagcagaag acggcatacg agatacgcta tggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 113
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 113
caagcagaag acggcatacg agatatgtat aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 114
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 114
caagcagaag acggcatacg agattgtgac aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 115
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 115
caagcagaag acggcatacg agatgacgtc aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 116
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
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caagcagaag acggcatacg agatagatcg aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 117
caagcagaag acggcatacg agatatagta gagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 118
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 118
caagcagaag acggcatacg agattatgac tagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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<211> 66
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 119
caagcagaag acggcatacg agattagaga tggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 120
caagcagaag acggcatacg agatagctga gagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 121
caagcagaag acggcatacg agatacatct gagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 122
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 122
caagcagaag acggcatacg agatgcgtgc tagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 123
caagcagaag acggcatacg agatacatgt aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 124
caagcagaag acggcatacg agatatagag aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 125
caagcagaag acggcatacg agatgtatct aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 126
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 126
caagcagaag acggcatacg agatatactg tagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 127
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成DNA
<400> 127
caagcagaag acggcatacg agatgcacat aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 128
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 128
caagcagaag acggcatacg agatatgatg aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 129
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 129
caagcagaag acggcatacg agatagtagt aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
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caagcagaag acggcatacg agattatgtc aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 131
caagcagaag acggcatacg agatgtgtgt gagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 132
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 132
caagcagaag acggcatacg agattacgac aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 133
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 133
caagcagaag acggcatacg agatatgtga tggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 134
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 134
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc gcgcagatcg tcggcagcgt cagatgtgta 60
taagagacag 70
<210> 135
<211> 162
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 135
cagaacgtgg tcgccgtcgc catgctcctt cgtaacatgc ctgagccatc gaatcctgac 60
actcgtcaag cccgagatga aatccgagga ctcatcgaga ccgctgctat gcagcaaacc 120
gagagttctg ccttgaggtg acgcgggcct acctcggagc ag 162
<210> 136
<211> 128
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 136
ctctggcgaa cgcggtgagg agcacaccca tggtctgccc cggcgagatg accagcgtgg 60
tggccgctgt agacccccac acgccgccct gcactctgcc tccttccgag gagttcgacc 120
tcttcggc 128
<210> 137
<211> 216
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 137
gagcacttga tgtcacctaa tatactggtt ctgagccatt acccgtttgg ggtccaatta 60
atttatgaaa tgacttgttg tcaattaccc tgagtttttg tccactctga agctgaactg 120
aacattgtgt gctccggtag ctgaaaatcc tacccttagc actcagactg agtccattgt 180
tcttatcata gccttatggt tgttcatttt gtatgc 216
<210> 138
<211> 238
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 138
ctcgagcggt gtccgacagg aacaggggga gttgtcgtat gatgacccgg tcgtcagtgg 60
ccccacccaa ctgacaagcc aagtggaagt cagcgagcca aagtttgggt ttggtttcgc 120
cgttatactt ggtaagagtc gtgggggggc ggaaccgagc cgggagtaac atttcatgaa 180
tggccttgct aaagacccga ggtcccggtg gctcgggtga agggctttga tcctccga 238
<210> 139
<211> 212
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 139
cagtaagctc catcgaggga caagcatcta gtgagtcaat accaaagtgg cgtggggcat 60
aaccatacag agcctgaaat ggggaacgat ccagagtgga atgccaactt gaattgtacc 120
aaaactcggc aagatggatc caattatgcc acttgtgggg taccgcattg acaaaacagc 180
gtaagaaggt ctccatgcac tggttgacgc gc 212
<210> 140
<211> 239
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 140
acagtgaaca gtggtactat atacagtacc cgctacagca acacacgtcg tggtctcctt 60
aggcagcaga aatggtataa aaaaacgtac ataaaggtac atggcagata ggagtatatt 120
ctataaggag cacgtaacgc gtgacgggtc acgcgttcca gcgtcgtcta cctcgtgaca 180
ggcctcctcc cttgccccct tctccctccc cgtgcccctc ctcctctgcc ccctccctc 239
<210> 141
<211> 124
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 141
caaaacaggg acaatatata tcctttgtct gcttaatcaa agcatgcctt ttagctgctt 60
gaataaaacc attcacatct tgtatgtaga aagcttcata tcttcgtttc gtgtacatcc 120
atga 124
<210> 142
<211> 197
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 142
gccaccggcc tcgtggtcgt gagaccgagg agaccggtac ctggggatgg gctggtagtc 60
ctcatcagtg ctgtctgaag tgacatcctc aggtatatca gcagtctgag tctcaaggtc 120
cgcgagctct gcctcggcaa gctcgtcaac tctggcgtcc tgctcagctg ctgtctcagg 180
aacatctggg cgctcac 197
<210> 143
<211> 140
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 143
cagaggccct tgaaagcaca gctggttttc atcgtcaccc agtgaagaat gacatttcga 60
ggaaggcttt aggctacttg aatcccacga acatttctac agtaatattg gtaatatgcg 120
cagagggtcc ttggctactc 140
<210> 144
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 144
gatcccggag gaagttcagg accggccaga gcagccagag gtaccaaccg gcgacgaagc 60
tcctgccgaa gatctacccg agtgtcctga ccaccggccc 100
<210> 145
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 145
tacaatgcag caagtgtttt catataactc ctagaactta atgcaataaa caattaaaag 60
tactcaagat agatttataa aaatgatggg ttcagcatgc 100
<210> 146
<211> 175
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 146
gcggaaaata gaccaatgta ttaggctatc cattgccgat atgcaaaaga atgaatccat 60
aatgatagcc gccgctcact tctggtcaga caccacaaat acctttatgt ttggtcatgg 120
tccatccgcc cctactcttg ccgatgtata catgctcacc gacttagata tctca 175
<210> 147
<211> 81
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 147
caggaacttg caaacaagct cgggtgcaca gatccaaatc atttggtcgg ttgatgtgga 60
ctccgatgtg gactcaaatg c 81
<210> 148
<211> 136
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 148
gcgtggcaga ggatgggggc acgacaggga tggcaccgtg gcgaggggag gagcacggtg 60
tggcagggaa aggagcgcgg cgagcttgac gccgggggcg caaccaggat gaggattgag 120
tcacggatgg ttggac 136
<210> 149
<211> 135
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 149
gaaaacaagc tctaccactg gcacaacacg ggctcacagg tcacagctct gcttgctcag 60
tggtactacg agtgctagca cgggagcgct gttggacgga tcgccagcat gaaatgccca 120
ccgcgcacgt actgc 135
<210> 150
<211> 143
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 150
taccccacca aaaagcctat catgatcctt ggtgtcattt tatttttggt tctgtcaggt 60
aagtctagct gagtaccttc tcatactcag ggctttgttc ccacttgtta cagatggaca 120
gatgtactat ggttattgta tca 143
<210> 151
<211> 146
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 151
taacccacca aagatagcct tgcatgctcc ttagtgtcgc ttattttggt ttaagacggg 60
taagtctagc tgagtacctt ctcgtactca gggcgttgtt ctcattgttg ttgcagatgg 120
ttagatgtac tatggatatt gcgtca 146
<210> 152
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 152
caagcagaag acggcatacg agattcgtca gagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 153
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 153
caagcagaag acggcatacg agatcgctag cggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 154
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 154
caagcagaag acggcatacg agattctcag tagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 155
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 155
caagcagaag acggcatacg agatcgtaga tagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 156
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 156
caagcagaag acggcatacg agatatacgt gagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 157
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 157
caagcagaag acggcatacg agatgtctag aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 158
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 158
caagcagaag acggcatacg agatagtcga cagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 159
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 159
caagcagaag acggcatacg agatagcgac gcgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 160
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 160
caagcagaag acggcatacg agattgatag aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 161
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 161
caagcagaag acggcatacg agatgacgac tggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 162
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 162
caagcagaag acggcatacg agattgtgct cagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 163
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 163
caagcagaag acggcatacg agatatgagc tggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 164
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 164
caagcagaag acggcatacg agattctctc acgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 165
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 165
caagcagaag acggcatacg agatgcagat cagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 166
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 166
caagcagaag acggcatacg agattctgca gagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 167
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 167
caagcagaag acggcatacg agatacgtga gcgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 168
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 168
caagcagaag acggcatacg agatcgcgtg aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 169
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 169
caagcagaag acggcatacg agatcatact acgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 170
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 170
caagcagaag acggcatacg agattctaca cagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 171
<211> 66
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 171
caagcagaag acggcatacg agatgataga tcgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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<211> 66
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 172
caagcagaag acggcatacg agatgagcgt acgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 173
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 173
caagcagaag acggcatacg agatcagaga cagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 174
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 174
caagcagaag acggcatacg agatcataga tggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 175
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 175
caagcagaag acggcatacg agatagatgc tagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 176
<211> 66
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 176
caagcagaag acggcatacg agatctcatc tcgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 177
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成DNA
<400> 177
caagcagaag acggcatacg agattatcta tggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 178
caagcagaag acggcatacg agatagagta tcgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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<220>
<223> 合成DNA
<400> 179
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agacag 66
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<213> 人工序列
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caagcagaag acggcatacg agatctatgc tcgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 181
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<220>
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caagcagaag acggcatacg agatctgact acgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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caagcagaag acggcatacg agattatcag tagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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agacag 66
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agacag 66
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agacag 66
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agacag 66
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agacag 66
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caagcagaag acggcatacg agatgactgt aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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caagcagaag acggcatacg agattcagta cagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
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agacag 66
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agacag 66
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agacag 66
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agacag 66
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agacag 66
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agacag 66
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agacag 66
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agacag 66
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agacag 66
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成DNA
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caagcagaag acggcatacg agattcatga tagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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<212> DNA
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<223> 合成DNA
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caagcagaag acggcatacg agatgtcatc tcgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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<211> 66
<212> DNA
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<220>
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caagcagaag acggcatacg agattatctc tagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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<211> 66
<212> DNA
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<220>
<223> 合成DNA
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caagcagaag acggcatacg agatctgata tagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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<211> 66
<212> DNA
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caagcagaag acggcatacg agattacgca tggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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<212> DNA
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caagcagaag acggcatacg agatcgtgag tggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 218
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agacag 66
<210> 219
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 219
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<220>
<223> 合成DNA
<400> 220
caagcagaag acggcatacg agatgcgtct aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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<223> 合成DNA
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agacag 66
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agacag 66
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caagcagaag acggcatacg agattagtga cggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 224
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成DNA
<400> 224
caagcagaag acggcatacg agatcacgat aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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<212> DNA
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<400> 225
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agacag 66
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<400> 226
caagcagaag acggcatacg agatagcatc acgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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<400> 227
caagcagaag acggcatacg agattagtcg tagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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agacag 66
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caagcagaag acggcatacg agatatcatg tcgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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caagcagaag acggcatacg agatgtactc tagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 231
<211> 66
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caagcagaag acggcatacg agatagtgca tagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 232
<211> 66
<212> DNA
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caagcagaag acggcatacg agatcgcatc aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
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<212> DNA
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<223> 合成DNA
<400> 233
caagcagaag acggcatacg agatcgctat aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 234
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成DNA
<400> 234
caagcagaag acggcatacg agatgtcgat aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 235
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 235
caagcagaag acggcatacg agatacacag tagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 236
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 236
caagcagaag acggcatacg agatcagatg tagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 237
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 237
caagcagaag acggcatacg agatctctac aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 238
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 238
caagcagaag acggcatacg agatgtcact aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 239
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 239
caagcagaag acggcatacg agattgtact aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 240
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 240
caagcagaag acggcatacg agatacgcta tggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 241
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 241
caagcagaag acggcatacg agatatgtat aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 242
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 242
caagcagaag acggcatacg agattgtgac aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 243
<211> 126
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 243
acagggaagt gaaagagaag tggccattga aaaacctaat attgttacgg aagtgcctcg 60
cgtccgcgtc gaagctcgtc caaagcctca tgagctggtc tggtatgact ggcgcattca 120
gctcga 126
<210> 244
<211> 89
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 244
caagcgcagg aaaaggaaac gctgcccgca gttcctcacc cggctccccc gttgtcgccc 60
tcagccgctt ccgccatcct cgctgtcac 89
<210> 245
<211> 112
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 245
caataaaatg ggaacatgat ggaaggacag gttacccgat gcattatgag catacagaac 60
ggcctacaaa acaccgattg gaatgtcacc atatcaactt atctatggaa ga 112
<210> 246
<211> 156
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 246
cagacagata gccacgagac gaggactcac agagctttcg gtgagcctcc atagtccaga 60
gatagtctct gttggttctt tttctttcct ttttcgacga gatctttttt tcttggtccc 120
acacgaactg gcgttgtgct tctattatgc tgtcac 156
<210> 247
<211> 121
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 247
catcatggtg cgaatcttcg agttcagacc cctcataaaa caagcttgct tctttcgatc 60
tgagttgatt tggtcagctg catactatga taaatgattg aacctaccca catattgcat 120
c 121
<210> 248
<211> 126
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 248
catgaaagct cacaaacccg ctcgagctct gggtcgatgg ctcatcccat ttgcctcgag 60
aatgcccctc ctccgctgcg caggtgccgc ctctccttac atcacgcgtc accatgccat 120
gcccgc 126
<210> 249
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 249
ctaatgcttg gtagctcata catgaacctt atagtcgtcc tgcatttaac aactgtcaag 60
gacaggttcg agtgcacatg tataatgcta tcaacgtttt 100
<210> 250
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 250
tagccacata actttcccac aatgtaaagg tattttcaat aaagaatcta ggagtactaa 60
ttctatgttt tcaatctata caatcattgg catattgatg 100
<210> 251
<211> 153
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 251
ctcgaaaatc tctaacaaac tcattccaag taataggagg agcattgtta ggacgtgcag 60
cttgatacga ctcccaccaa gtctgtgttg tcccctgtaa ctgaccagtt gcatataaca 120
ccttttccat atcattgcat tgagcgatgt tca 153
<210> 252
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 252
ctcgagcgat gtccgatagg aacaggggaa gttgtcgaat gatgacccgg tcgtcggtgg 60
ccccacccaa ctgactagcc aagcggaagt cagcgagcca 100
<210> 253
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 253
tcggaggatc gaagcccttc acccgagcca ccaggccctc gggtctttag caaagccatc 60
cgcaaaacgt tactcccagc tcggttcctc ccccatgact 100
<210> 254
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 254
ctcgagcggt gtcagagagg aacaggggga gctgccggat gatgttccgg tcgtcggtgg 60
ccccgcccag ctgacacgcc aagcggaaat cggcgagcca 100
<210> 255
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 255
tcggaggatc gtagcccttc acccgagcct ccgggccctc gggtcttcag taaggctatt 60
cgtgaaatga tactcccggc gcggtttcgc ccccccccca 100
<210> 256
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 256
ctcgagcggt gtcgaagagg aacagaggga gctgtcggat gatgacctgg tcgtcggtgg 60
ccccacccag ctgacatgcc aagcggaaat cggcgagcca 100
<210> 257
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 257
tcggaggatc gcagcccatc acccgagcct ccaggccctc gggtcttcag taaggctatc 60
cgcgaaacta tactcccggc gcagtttcgc cctcccacga 100
<210> 258
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 258
ctcgagcggt gtcggagagg aacaggggga gctgtcggat gatgacccgg tcgtcggtgg 60
ccccacccag ctgacacgcc aagcggaaat cggcgagcca 100
<210> 259
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 259
tcggaggatc gtagcccttc acccgagcct ccgggccctc gggtcttcag taaggctatc 60
cgcgaaataa tactcccggc gcggtttcgc cctcccacga 100
<210> 260
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 260
ctcgagcggt gtcggagagg aacaggggga gctgtcggat gatgacccgg tcgtcggtgg 60
ccccgcccag ctgacatgcc aagcggaaat cggcgagcca 100
<210> 261
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 261
tcggaggatc gaagcccttc acccgagcct ccgggccctc gggtcttcag caaggctatc 60
cgcgaaacga tactcctggc gcggtttcgc cctcccacga 100
<210> 262
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 262
ctcgagcggt gttagagagg aacaggggga gctgtcggat gatgacccgg tcgtcggtgg 60
ccccacccag ctgacatgcc aagcggaaat cggcaagcca 100
<210> 263
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 263
tcggaggatc gtagcccttc acccgagcct ccgggccctc gggtcttcag taaggctatc 60
cgcgaaacga tactcccggc gcggtttcgc cctcccacga 100
<210> 264
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 264
ctcgggcggt atcggagagg aataggggga gttgtcggat gatgacccgg tcgtcggtgg 60
ccccgcctag ctaacacgcc aagcagaaat cggcgagcca 100
<210> 265
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 265
tcagaagatc gtagcccttc acccgagcct ccgggctctc gggtctttag taaggctatc 60
cgcgagacgg tgctcccggc tcggtttcgc cctcccacga 100
<210> 266
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 266
ctcgggcggt gtcggagagg aacaggggga gttatcgaat gatgacccgg tcgtcggtgg 60
ccccgcccag ctgacacgcc aagcggaaat cggtgagcca 100
<210> 267
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 267
tcggaagatc gtagtccttc acccgagcct ccgggccctc tggtcttctg taaagctatc 60
cgtgaaatgg tgctcccggc tcagtttcgc cctcccacga 100
<210> 268
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 268
ctcgggcggt gtcggagagg aacaggggga gttgtcgaat gataacccgg tcgtcggtgg 60
ccccacccag ctgacatgcc aagcggaaat cagcaagcca 100
<210> 269
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 269
tcgaaagatc gtagtccttc acccgagcct ccgggccctc gggtcttcag taaggctatc 60
cgtgaaacgg tgctcccatc tcggtttcgc cctcccacga 100
<210> 270
<211> 170
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 270
ctgagtctag taataagact ttgatcaagc ttatcaagaa gaaaattgag gaaaattcaa 60
ggaggtggca tgaagttttg tctgaagctc tatgggcaca tcgtatttca aaacatggtg 120
ctaccaaagt tattcctttt aagctagtat atgaccaaga ggccgtgtta 170
<210> 271
<211> 84
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 271
gaagctactg ttggttggga gctaatcgga atgactattt atcatttttt gaaaataaaa 60
agggatgact gatacttatg caca 84
<210> 272
<211> 85
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 272
gacaatgcat cacgccgatg tagccgagat catcccttcg ctgcccctgg agatcaggtg 60
gccaccgttc cgtctccgcc attac 85
<210> 273
<211> 160
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 273
gaccacgcgg gcgacatcga caccagcaag agcacgagcg ggattctctt cttcctcggc 60
aggtgcctcg ttagctggca gtcggtcaag cagcaggtgg tggccctgtc cagctgcgag 120
gccgagtaca tagcggcttc caccgcttcg acttaggcgc 160
<210> 274
<211> 104
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 274
gacctggcag gcgacgtgaa tgactgaaag agcaccagcg ggctgatctt cttcctggca 60
ggaggcccga ttgcttggca gtcggcaaaa cagagggtgg ttgc 104
<210> 275
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 275
gagatgagag gagcgaggaa aggagaggaa gggaggtgag gtgttgtagt gtggatacag 60
ctaacagctt acatggaggt ggagtatggg gcctggttta 100
<210> 276
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 276
gcgcaggaaa gaggtcgtgg acaaatccag ggcgtgttta gttgggctga ttttggacgt 60
ccaaaatctg cacagtgtaa gattccatac tgtagcattt 100
<210> 277
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 277
gagcgagacg agagacaaac aaaaaggtgg tgacgataag aggcgccacg cactaaaccc 60
gcaccatggt catggagtag cgtgtaagga acaagtagca 100
<210> 278
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 278
gcgagaggtg gtggtacacg cctacctagg tggtgggctc gtcgtcgtca gacaccaggc 60
gtcacaggcc gtcgtccgtt tctgccgccc catgctcgct 100
<210> 279
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 279
gcacgacatg gtatggcagg ggacaaagac ggagatgggg tgcgccgtgg gggatggctt 60
cagcgacatg ccagagtggg ccacggcgcg acagagtggg 100
<210> 280
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 280
gctgctccct tctccggcgc gaggctcctc gtcgtggcct tctctagcgc ggtggcaccg 60
catccgctcc catcccgcgc tgctccacac tccgcgcgcg 100
<210> 281
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 281
gccaccggcc tcgtggtcgt gagaccgagg agaccggtac ctgggatggg ctggtagtcc 60
tcatctgtgc tgtcagaagt cacatcctca ggtatatcag 100
<210> 282
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 282
gtgagcgccc agacgttcct gagacagcag ctgagcagga tgccagagtt gacgagcttg 60
ctgaggcaga gcttgcggac cttgaggctc agactgctga 100
<210> 283
<211> 130
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 283
gcggttgtgt gttgtggccg ggccattggc ggatgagcga gcgagtgcaa ccagaggcga 60
acgtacccaa cccagcgaca gcaagtcagc aacatatatt ctctcactcg atcacgtccc 120
cacgggccta 130
<210> 284
<211> 151
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 284
gctaagaaca ttcggtgtct gcaatgtgag aagtgaacac tctagtaact taagaaatgc 60
tatcaacaaa atgagccatc ttgttcatct agacattgcg gctctagggg agagcgaagt 120
gttgcagcta gagggacttc atttgcctcc a 151
<210> 285
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 285
ggcagaggga gccaagcaac taatcaaact caaagcgcct cctaccaacc gaaaaggcga 60
gaaaaagcta agccaaggtg gggatcggaa gaattatcca 100
<210> 286
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 286
tagcaagtgc ggctgctatc ttgagaggtt ggcgctgtgg tgctaggctt tttgccgtgc 60
tgggtgcctg ggtggtggag atggatggat gtatatatag 100
<210> 287
<211> 169
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 287
gtatgtcacc tttgagggtt ttgactttta atgaatttgc aactatggca cccaattttt 60
gcagctgtag tgttgcttcc atcatcagtc aggtctacac ctaccaaata attctagtgt 120
tccatggctc caatgaaatg tggattgaaa gttaatctta attgcatta 169
<210> 288
<211> 160
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 288
gtgagcgccc agatgttcct gagacagcag ctgagcagga cgctacagtt gacgagcttg 60
ctgaggcaga gctcgcagac cttgagactc agactgctga catacctgag gatgtcactt 120
cagatagcac agatgaggac taccagccca ttcccaggta 160
<210> 289
<211> 160
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 289
gtgagcgccc agatgttcct gagacagcag ctgagcagga cgctacagtt gacgagcttg 60
ctgaggcaga gctcgcggat cttgaggctc agactgctga catacctgag gatgccactt 120
ctgatagcac agatgaggac taccagccca ttcccaggta 160
<210> 290
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 290
gtggggcgtg tgtctcaccc aacgaagtag tggccaagta aggtagccag cggtgggcga 60
gctccttatt tgatgacgtg gtccagaaaa tggttctctt 100
<210> 291
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 291
tcatgtccaa gtactcgcaa gctgatgctt gggggctaca accactgggg tctcctgagc 60
gcaaattgtc aggatcgcgc gctgattcta ccacgcggcc 100
<210> 292
<211> 146
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 292
taacccacca aagatagcct tgcatgctcc ttagtgtcgc ttattttggt ttaagacggg 60
taagtctagc tgagtacctt ctcgtactca gggcgttgtt ctcattgttg ttgcagatgg 120
ttagatgtac tatggatatt gcgtca 146
<210> 293
<211> 148
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 293
tagcccacta aaagaaagcc ttgcataacc cttgatgtca ctttattttg gtttaagaca 60
gataagtcta gctgagtacc ttctcgtact tagggcgttg ttcccattgt tgttgtagat 120
gattagatgt actacggcta ttgcgtca 148
<210> 294
<211> 56
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 294
tcaaatgaag gccaagcgtc aagcagtgag cattctttca atttcttggc aaccca 56
<210> 295
<211> 80
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 295
caaagtctag taggtactct cgagaccctc atacgctctg atggcggcga acatagcact 60
cattgcctgg ttgtcgctag 80
<210> 296
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 296
caagcactgg gttgattctg gcaactacgg catcaaattt gttcctctgg gaccgggctt 60
cttgctccag cacatcgaac tgtgccttga ccctctgatg 100
<210> 297
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 297
gcgagcgaac aaactgaccg aggagcttaa cggtaagtat ccactggtcg ggttttctgc 60
tgtagcgatt gtcttgcctg atggaacttc aaaatgcatg 100
<210> 298
<211> 126
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 298
catgaaagct cacaaacccg ctcgagctct gggtcgatgg ctcatcccat ttgcctcgag 60
aatgcccctc ctccgctgcg caggtgccgc ctctccttac atcacgcgtc accatgccat 120
gcccgc 126
<210> 299
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 299
ctaaaggaag aaaccaacac gacaaaaaac agaaaaggta cgtaccagcg tggaagttct 60
caagggtgga gaattcctcg gcctgccgag ccacctgctc 100
<210> 300
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 300
gcggagcacc ttggtgtcgg agcagaacgc cttggagttg gcttggaatg ccctggagtc 60
aaagcgaaat gcctggtcag aggcggacca ggaggtgctc 100
<210> 301
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 301
ctcgggcggt gtcggagagg aacaggggga gttgtcgaat gataacccgg tcgtcggtgg 60
ccccacccag ctgacatgcc aagcggaaat cggcaagcca 100
<210> 302
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 302
tcgaaagatc gtagtccttc acccgagcct ccgggccctc gggtcttcag taaggctatc 60
cgtgaaacgg tgctcccggc tcggtttcgc cctcccacga 100
<210> 303
<211> 170
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 303
ctgagtctag taataagact ttgatcaagc ttatcaagaa gaaaattgag gaaaattcaa 60
ggaggtggca tgaagttttg tctgaagctc tatgggcaca tcgtatttca aaacatggtg 120
ctaccaaagt tattcctttt aagctagtat atgaccaaga ggccgtgtta 170
<210> 304
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 304
ctggaagggt gatttagtct ctgatcggaa ggcctagcta aggaggaaca acgctcgctt 60
gcgactctga cctgcctctc cgaccggaag gcctggccaa 100
<210> 305
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 305
tcggagtcag aatcgagcgt cgttcctcct tggctaggcc ttttggttgg agaggcgggt 60
cagagttaga agcgagcatc gttcctcctt ggccaggcct 100
<210> 306
<211> 85
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 306
ctggcacctc ctccaaactc tttccttctc tcctctctct atttctaaag actagatcct 60
aataaggact aatcttctct cgata 85
<210> 307
<211> 84
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 307
gaagctactg ttggttggga gctaatcgga atgactattt atcatttttt gaaaataaaa 60
agggatgact gatacttatg caca 84
<210> 308
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 308
gaagggtggt aggtgggcat cgaacggacc tggtacatgg gcttgggaaa gccatagaag 60
tcgtagatgg tgtcgttgct gccgcggata acgttgaccg 100
<210> 309
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 309
gcgggcagac ccaaaccaga gacgcggcac gcgacgcggg agggcgagga gcagcggcgg 60
cgcggcgaca tcgcgaggcc agggccagac gcaacggccg 100
<210> 310
<211> 146
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 310
gacacacgac acgagagttt ggccatggca acggtctcct cgctcgctcg ctcctcactg 60
gcggccgtca cacctggaga gtgaccgact ggcagtagct gtagcagccc tcagcctcac 120
gcgacgcagc gcaggcctct ggatgc 146
<210> 311
<211> 160
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 311
gaccacgcgg gcgacatcga caccagcaag agcacgagcg ggattctctt cttcctcggc 60
aggtgcctcg ttagctggca gtcggtcaag cagcaggtgg tggccctgtc cagctgcgag 120
gccgagtaca tagcggcttc caccgcttcg acttaggcgc 160
<210> 312
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 312
gacgcggcga tcaggccgga aggagtcgtg gcgccgccgt ccgtgagctt acctgattga 60
tttgattgat tgttgcattg gttaattatt attagttact 100
<210> 313
<211> 100
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 313
gagaatgccg gtgagcagga tcgccgtggg cgctccgggc gagctgtccc accccgacac 60
cgccaaggcc gccgtcgccg agttcatctc catgctcatc 100
<210> 314
<211> 111
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 314
gagcggcggc gacggcggaa atggagaggg cggtgggggg aaagcggcct agggttcgag 60
gggagaggga atggatacga ttgaggggtg aggggcgcgg ggatggggcg a 111
<210> 315
<211> 155
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 315
gaggacagcg accagagctg gaggaggatc gatcggcgga gggtggtctg ttatgttccg 60
tgaccaggcg tgactccgtg tcgcatatga ttagggaaag gatatgaacc gtgagctccg 120
tggcgctgaa gttgcgccgg ttagctggtc actga 155
<210> 316
<211> 146
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 316
taacccacca aagatagcct tgcatgctcc ttagtgtcgc ttattttggt ttaagacggg 60
taagtctagc tgagtacctt ctcgtactca gggcgttgtt ctcattgttg ttgcagatgg 120
ttagatgtac tatggatatt gcgtca 146
<210> 317
<211> 148
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 317
tagcccacta aaataaaacc ttgcatactc cttggtgtca ctttatttct gtttaaggcg 60
ggtaagtcta gctgagtacc ctctcgtact cagggctttg ttcctattgt tgttgcagat 120
ggccagatgt actatggtta ttgcatca 148
<210> 318
<211> 112
<212> DNA
<213> 甜根子草（Saccharum spontaneum）
<400> 318
tcggaacgtc aaggccaagt acatgagctc tggagcactc agaagccaga catcgatcaa 60
ctcatgttga gccatcagcg agccgtgtcg atccatcaaa caagccgtcc ga 112

Claims (9)

1.一种甘蔗黑穗病抗性相关标记，包含选自下述区域的连续的核酸区域：甘蔗染色体中
夹在序列编号1所示碱基序列与序列编号6所示碱基序列之间的区域；
夹在序列编号135所示碱基序列与序列编号143所示碱基序列之间的区域；或者
夹在序列编号144或145所示碱基序列与序列编号151所示碱基序列之间的区域。
2.根据权利要求1所述的甘蔗黑穗病抗性相关标记，其特征在于，所述核酸区域包含选自由序列编号1～6、135～143和144～151组成的组的任一碱基序列或该碱基序列的一部分。
3.根据权利要求1所述的甘蔗黑穗病抗性相关标记，其特征在于，所述核酸区域为甘蔗染色体中序列编号1或2所示碱基序列或该碱基序列的一部分。
4.根据权利要求1所述的甘蔗黑穗病抗性相关标记，其特征在于，所述核酸区域为选自由甘蔗染色体中序列编号138～140组成的组的1条碱基序列或该碱基序列的一部分。
5.根据权利要求1所述的甘蔗黑穗病抗性相关标记，其特征在于，所述核酸区域为选自由甘蔗染色体中序列编号149或151组成的组的1条碱基序列或该碱基序列的一部分。
6.根据权利要求1所述的甘蔗黑穗病抗性相关标记，其特征在于，所述核酸区域为选自由甘蔗染色体中序列编号298、303、307、311和316组成的组的1条碱基序列或该碱基序列的一部分。
7.一种黑穗病抗性提高的甘蔗株系的制造方法，包括：提取至少一个亲本为甘蔗植物的后代植物的染色体和/或该亲本的染色体的工序，以及测定如上得到的染色体中所述权利要求1～6中任一项所述的甘蔗黑穗病抗性相关标记的存在/不存在的工序。
8.根据权利要求7所述的甘蔗株系的制造方法，其特征在于，在所述进行测定的工序中，使用具有针对所述甘蔗黑穗病抗性相关标记的探针的DNA芯片。
9.根据权利要求7所述的甘蔗株系的制造方法，其特征在于，所述后代植物为种子或幼苗，从该种子或幼苗提取染色体。
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