BR112020026955A2 - Marcador associado à resistência à smut na planta pertencente ao gênero saccharum e uso da mesma - Google Patents

Abstract

“marcador associado à resistência à smut na planta pertencente ao gênero saccharum e uso da mesma”. esta invenção tem como objetivo avaliar a resistência a smut com maior precisão usando um marcador associado à resistência de smut da cana-de-açúcar, que consiste em uma região contínua de ácido nucleico existente em uma região entre a sequência de nucleotídeos como mostrado na seq id no: 1 e a sequência de nucleotídeos como mostrado em seq id no: 6, uma região entre a sequência de nucleotídeos como mostrado na seq id no: 135 e a sequência de nucleotídeos como mostrado em seq id no: 143, ou uma região entre a sequência de nucleotídeos como mostrado em seq id no: 144 ou 145 e a sequência de nucleotídeos como mostrado na seq id no: 151 de um cromossomo de cana-de-açúcar.

Description

“MARCADOR ASSOCIADO À RESISTÊNCIA À SMUT NA PLANTA PERTENCENTE AO GÊNERO SACCHARUM E USO DA MESMA” Campo técnico

[001]A presente invenção se refere a um marcador associado à resistência a smut que permite a seleção de uma linhagem de cana-de-açúcar resistente a smut e um método para usar o mesmo. Fundamentos da técnica

[002]A cana-de-açúcar tem sido cultivada para uso comestível, como matéria-prima para açúcar, licor e semelhantes. Além disso, a cana-de-açúcar tem sido utilizada em diversos campos industriais, inclusive como matéria-prima para biocombustíveis. Sob tais circunstâncias, há uma necessidade de desenvolver novas variedades de cana-de-açúcar com características desejáveis (por exemplo, teor de açúcar, aumento da capacidade vegetativa, capacidade de brotação, resistência à doenças, resistência aos insetos, resistência ao frio, aumento no comprimento da lâmina foliar, aumento na área foliar, e um aumento no comprimento do caule).

[003]Em geral, existem três métodos para identificação de uma variedade/linhagem de planta: ou seja, “comparação de características” para comparação de dados de características; “comparação durante o cultivo” para comparação de plantas cultivadas nas mesmas condições; e “ensaio de DNA” para análise de DNA. Existem muitos problemas na identificação de linhagem por meio de comparação de características ou comparação durante o cultivo, como precisão reduzida devido às diferenças nas condições de cultivo e pesquisa de campo de longo prazo que requer uma série de etapas. Em particular, as plantas de cana-de-açúcar são muito maiores do que outras culturas gramíneas, como arroz e milho, e, portanto, é difícil conduzir a identificação da linhagem por meio de pesquisa de campo.

[004]Para identificar uma variedade resistente a uma determinada doença, além disso, é necessário realizar um teste de inoculação com um micro-organismo causador de uma doença após o cultivo de cana-de-açúcar a longo prazo e, em seguida, coletar dados de resistência à doenças por meio da observação de lesões e semelhantes. Quando o teste é realizado, no entanto, é necessário evitar que o micro-organismo causador se propague para um ambiente externo de forma mais definitiva e fornecer instalações, como uma estufa de grande escala para fins especiais, um campo para fins especiais ou uma instalação isolada de um ambiente externo. Para preparar uma nova variedade de cana-de-açúcar, além disso, dezenas de milhares de híbridos são primeiramente preparados por cruzamento, seguido pela seleção de mudas e seleção gradual de linhagens de elite. Eventualmente, podem ser obtidos 2 ou 3 tipos de novas variedades candidatas com características desejáveis. Para a preparação de uma nova variedade de cana-de-açúcar, conforme descrito acima, é necessário cultivar e avaliar um número enorme de linhas, e também é necessário preparar a estufa ou campo em grande escala como descrito acima e fazer esforços demorados.

[005]Portanto, tem sido necessário o desenvolvimento de um método para identificação de uma linhagem de cana-de-açúcar resistente às doenças com o uso de marcadores presentes no genoma da cana-de-açúcar. Se marcadores excelentes em uma variedade de características pudessem ser usados para a produção de uma nova variedade de cana-de-açúcar, em particular, vários problemas peculiares à cana-de-açúcar, conforme descrito acima, seriam resolvidos, e os marcadores seriam capazes de servir como ferramentas muito eficazes. No entanto, as plantas de cana-de-açúcar apresentam um grande número de cromossomos (aproximadamente 100 a 130) devido à maior poliploidia, e o desenvolvimento da tecnologia de marcadores tem sido lento. No caso da cana-de-açúcar, o USDA relatou a genotipagem com o uso de marcadores SSR (Literatura não patente 1), embora a precisão da genotipagem seja baixa devido ao pequeno número de marcadores e polimorfismos em cada marcador. Além disso, a genotipagem acima está disponível apenas para variedades americanas/australianas e não pode ser usada para a identificação das principais variedades cultivadas no Japão, Taiwan, Índia e outros países e linhagens servindo como recursos genéticos úteis.

[006]Além disso, a Literatura Não Patente 2 sugere a possibilidade de um mapa genético da cana-de-açúcar ser preparado aumentando o número de marcadores, comparando marcadores individuais em termos de uma relação característica e verificando os resultados. No entanto, a Literatura Não Patente 2 não divulga um número suficiente de marcadores e não foram encontrados marcadores vinculados a características de interesse.

[007]Conforme divulgado na Literatura de Patente 1, um marcador associado à resistência à podridão da raiz negra na beterraba sacarina é conhecido como um marcador associado à resistência às doenças. A literatura de patentes 2 também divulga uma técnica de seleção de uma variedade de Zea mays usando um fabricante vinculado a uma característica de interesse.

[008]Enquanto isso, os micro-organismos causadores do smut da cana-de-açúcar apresentam alto nível de infectividade e, portanto, o aparecimento do smut resulta na infecção imediata de todo o campo. As lavouras de cana-de-açúcar afetadas com smut não podem ser usadas como matéria-prima para a produção de açúcar e, além disso, essas safras afetadas murchariam e morreriam. Portanto, o desenvolvimento de smut causará um declínio significativo na produção no ano seguinte e posteriormente. Danos devido à poluição foram relatados em 28 ou mais países, incluindo Brasil, EUA, Austrália, China e Indonésia. A poluição pode ser evitada com tratamento de esterilização na época do plantio; no entanto, os efeitos preventivos são limitados ao período de crescimento inicial. Portanto, o cultivo de uma variedade de cana-de-açúcar dotada de resistência à smut foi aguardado.

[009]A literatura de patentes 3 divulga marcadores ligados à resistência a smut que foram descobertos pela preparação de muitos marcadores de planta de cana-de-açúcar e pela realização de análises de ligação de características quantitativas junto com tais marcadores para linhagens de progênie híbrida.

Lista de citações Literatura de não Patente Literatura de não Patente 1: Maydica 48, 2003, 319-329, “Molecular genotyping of sugarcane clones with microsatellite DNA markers” Literatura de não Patente 2: Nathalie Piperidis et al., Molecular Breeding, 2008, Vol. 21, 233-247 Literatura de Patente Literatura de Patente 1: WO 2007/125958 Literatura de Patente 2: JP 2010-516236 A Literatura de Patente 3: WO 2012/147635 Sumário da invenção Problema técnico

[010]Embora a literatura de patentes 3 divulgue marcadores ligados à resistência a smut, o desenvolvimento de marcadores de resistência à smut exibindo uma associação mais elevada com a resistência à smut era aguardado. Sob as circunstâncias acima, a presente invenção se destina a fornecer um marcador melhorado de resistência a smut exibindo maior associação com a resistência a smut. Solução para o Problema

[011]Os presentes inventores conduziram estudos intensivos para atingir o objetivo. Os presentes inventores prepararam muitos marcadores de variedades particulares de cana-de-açúcar e conduziram análises de ligação de características quantitativas junto com tais marcadores para linhagens de progênie híbrida. Consequentemente, os presentes inventores encontraram marcadores ligados a características quantitativas, como resistência a smut. Isto conduziu à conclusão da presente invenção.

[012]A presente invenção abrange o seguinte. (1) Um marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar, que consiste em uma região de ácido nucleico contínua existente em uma região entre a sequência de nucleotídeos, conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 e a sequência de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NO: 6, uma região entre a sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 135 e a sequência de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NO: 143, ou uma região entre a sequência de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NO: 144 ou 145 e a sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 151 de um cromossomo de cana-de-açúcar. (2) O marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar, de acordo com (1), em que a região de ácido nucleico compreende qualquer sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NOs: 1 a 6, 135 a 143 e 144 a 151 ou uma parte da sequência de nucleotídeos. (3) O marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar, de acordo com (1), em que a região de ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 1 ou 2 de um cromossomo de cana-de-açúcar ou uma parte da sequência de nucleotídeos. (4) O marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar, de acordo com (1), em que a região de ácido nucleico compreende qualquer sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NOs: 138 a 140 de um cromossomo de cana-de-açúcar ou uma parte da sequência de nucleotídeos. (5) O marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar, de acordo com (1), em que a região de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 149 ou 151 de um cromossomo de cana-de-açúcar ou uma parte da sequência de nucleotídeos. (6) O marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar, de acordo com (1), em que a região de ácido nucleico compreende qualquer sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NOs: 298, 303, 307, 311 e 316 de um cromossomo de cana-de-açúcar ou uma parte da sequência de nucleotídeos. (7) Um método para produzir uma linhagem de cana-de-açúcar com resistência aprimorada ao smut, caracterizado pelo fato de que compreende: uma etapa de extração de um cromossomo de uma progênie de planta obtida de plantas parentais, pelo menos uma das quais é uma planta de cana-de-açúcar e/ou um cromossomo de uma planta de cana-de-açúcar parental; e uma etapa de determinação da presença ou ausência do marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar de acordo com qualquer um de (1) a (6) no cromossomo obtido. (8) O método para produzir uma linhagem de cana-de-açúcar, de acordo com (7), em que a etapa de determinação envolve o uso de um chip de DNA que compreende uma sonda correspondente ao marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar. (9) O método para produzir uma linhagem de cana-de-açúcar, de acordo com (7), em que a planta de progênie é uma semente ou muda jovem e o cromossomo é extraído da semente ou muda jovem.

[013]Esta descrição inclui parte ou todo o conteúdo conforme divulgado nas descrições e/ou desenhos dos Pedidos de Patente Japonesa Nos. 2018-127142, 2018-197546 e 2019-122913, que são documentos prioritários do presente pedido. Efeitos vantajosos da invenção

[014]A presente invenção pode fornecer um novo marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar que está ligado particularmente à resistência a smut entre várias características quantitativas da cana-de-açúcar. Com o uso do marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar da presente invenção, a resistência a smut de linhagens de progênie de cana-de-açúcar híbrida pode ser testada. Assim, uma variedade de cana-de-açúcar com resistência melhorada a smut pode ser identificada de maneira muito econômica.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[015]A Fig. 1 mostra os diagramas característicos que mostram: (A) os resultados do cálculo da morbidade de smut de uma linhagem de progênie resultante do cruzamento entre “KY08-6023” e “JW90”; (B) os resultados do cálculo da morbidade de smut de uma linhagem de progênie resultante do cruzamento entre “KY08-6039” e “JW90”; e (C) os resultados do cálculo da morbidade de smut de uma linhagem de progênie resultante do cruzamento entre “KY08-6041” e “JW90”.

[016]A Fig. 2 mostra um diagrama característico que mostra os resultados da análise de QTL com relação à resistência a smut conduzida no Exemplo 1.

[017]A Fig. 3 mostra um diagrama característico mostrando o número de leituras de AMP0121265 em cada linhagem.

[018]A Fig. 4 mostra um diagrama característico mostrando o número de leituras de AMP0120752 em cada linhagem.

[019]A Fig. 5 mostra um diagrama característico mostrando o número de leituras de AMP0035185 em cada linhagem.

[020]A Fig. 6 mostra um diagrama característico mostrando o número de leituras de AMP0114852 em cada linhagem.

[021]A Fig. 7 mostra um diagrama característico mostrando o número de leituras de AMP0089904 em cada linhagem.

[022]A Fig. 8 mostra um diagrama característico mostrando o número de leituras de AMP0100370 em cada linhagem.

[023]A Fig. 9 mostra um diagrama característico que mostra os resultados da análise de QTL com relação à resistência a smut conduzida no Exemplo 2.

[024]A Fig. 10 mostra um diagrama característico mostrando o número de leituras de AMP0014532 em cada linhagem.

[025]A Fig. 11 mostra um diagrama característico mostrando o número de leituras de AMP0043152 em cada linhagem.

[026]A Fig. 12 mostra um diagrama característico mostrando o número de leituras de AMP0069135 em cada linhagem.

[027]A Fig. 13 mostra um diagrama característico mostrando o número de leituras de AMP0032477 em cada linhagem.

[028]A Fig. 14 mostra um diagrama característico mostrando o número de leituras de AMP0018405 em cada linhagem.

[029]A Fig. 15 mostra um diagrama característico mostrando o número de leituras de AMP0002312 em cada linhagem.

[030]A Fig. 16 mostra um diagrama característico mostrando o número de leituras de AMP0007121 em cada linhagem.

[031]A Fig. 17 mostra um diagrama característico mostrando o número de leituras de AMP0090108 em cada linhagem.

[032]A Fig. 18 mostra um diagrama característico mostrando o número de leituras de AMP0015886 em cada linhagem.

[033]A Fig. 19 mostra um diagrama característico que mostra os resultados do cálculo da morbidade de smut para as linhagens de progênie resultantes do cruzamento entre “KY09-6092” e “KY08-129”.

[034]A Fig. 20 mostra um diagrama característico que mostra os resultados da análise de QTL da resistência de smut realizada no Exemplo 3.

[035]A Fig. 21 mostra um diagrama característico mostrando o número de leituras de AMP0063683 em cada linhagem.

[036]A Fig. 22 mostra um diagrama característico mostrando o número de leituras de AMP0082090 em cada linhagem.

[037]A Fig. 23 mostra um diagrama característico mostrando o número de leituras de AMP0013802 em cada linhagem.

[038]A Fig. 24 mostra um diagrama característico mostrando o número de leituras de AMP0083204 em cada linhagem.

[039]A Fig. 25 mostra um diagrama característico mostrando o número de leituras de AMP0043774 em cada linhagem.

[040]A Fig. 26 mostra um diagrama característico mostrando o número de leituras de AMP0094596 em cada linhagem.

[041]A Fig. 27 mostra um diagrama característico mostrando o número de leituras de AMP0091501 em cada linhagem. Descrição das modalidades

[042]O marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar de acordo com a presente invenção e o método para usar o mesmo são descritos abaixo. Em particular, é descrito um método para produzir uma linhagem de cana-de-açúcar usando um marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar. Marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar

[043]O marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar da presente invenção é uma região particular presente em um cromossomo da cana-de-açúcar, ele está ligado a um gene causador (ou um grupo de genes causadores) para uma característica de resistência a smut da cana-de-açúcar, e pode ser usado assim para identificação de uma característica de resistência a smut da cana-de-açúcar. Portanto, se uma linhagem de progênie obtida ou não com o uso de uma linhagem de cana-de-açúcar conhecida tem uma característica de melhorar a resistência a smut pode ser determinado pela confirmação da presença ou ausência do marcador associado à resistência de smut de cana-de-açúcar nessa linhagem. Na presente invenção, o termo “smut” se refere a uma doença caracterizada pela formação de lesões devido à infecção com um micro-organismo do gênero Ustilago. Um exemplo de micro-organismo do gênero Ustilago é o Ustilago scitaminea.

[044]Além disso, o termo “marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar” se refere a um marcador ligado a um gene causal (ou a um grupo de genes causais) de uma característica para melhorar a resistência a smut. Na presença do marcador de interesse em uma certa variedade de cana-de-açúcar, por exemplo, pode-se determinar que essa variedade de cana-de-açúcar tem resistência aprimorada a smut.

[045]O termo “cana-de-açúcar” aqui utilizado se refere a uma planta pertencente ao gênero Saccharum da família Poaceae. Além disso, o termo “cana-de-açúcar” inclui a chamada cana nobre (nome científico: Saccharum officinarum) e cana selvagem (nome científico: Saccharum spontaneum), Saccharum barberi, Saccharum sinense e as espécies anteriores de Saccharum officinarum (Saccharum robustum). O termo “variedade/linhagem de cana-de-açúcar conhecida” não é particularmente limitado. Inclui qualquer variedade/linhagem usada no Japão e qualquer variedade/linhagem usada fora do Japão. Exemplos de variedades de cana-de-açúcar cultivadas no Japão incluem, mas não estão particularmente limitados a Ni1, NiN2, NiF3, NiF4, NiF5, Ni6, NiN7, NiF8, Ni9, NiTn10, Ni11, Ni12, Ni14, Ni15, Ni16, Ni17, NiTn19, NiTn20, Ni22 e Ni23. Os exemplos das principais variedades de cana-de-açúcar usadas no Japão incluem, mas não estão particularmente limitados a NiF8, Ni9, NiTn10 e Ni15. Além disso, os exemplos das principais variedades de cana-de-açúcar que foram introduzidas no Japão incluem, mas não estão limitados a F177, Nco310 e F172. Além disso, as variedades e linhagens de cana-de-açúcar são variedades do tipo selvagem com excelente resistência às doenças, e variedades do tipo selvagem com excelente resistência a smut são usadas. Exemplos de variedades de tipo selvagem com excelente resistência a smut incluem, mas não estão particularmente limitados a JW90, Iriomote 15 e Iriomote 8.

[046]Além disso, uma linhagem de progênie pode ser uma linhagem obtida pelo cruzamento de uma planta materna e uma planta paterna da mesma espécie, cada uma das quais é uma variedade/linhagem de cana-de-açúcar, ou pode ser uma linhagem híbrida obtida de plantas parentais quando uma delas é uma variedade/linhagem de cana-de-açúcar e a outra é uma variedade/linhagem intimamente relacionada (Erianthus arundinaceus). Além disso, uma linhagem de progênie pode ser obtida pelo chamado retrocruzamento. Em particular, ambas ou a linhagem materna quanto a linhagem paterna são de preferência uma variedade do tipo selvagem com excelente resistência a smut, como JW90, Iriomote 15 ou Iriomote

8. Exemplo de marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar 1

[047]O marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar foi recentemente identificado por análise de loci de característica quantitativa (QTL) usando um mapa de ligação genética compreendendo 86 grupos de ligação, incluindo 31.191 marcadores (4.503 deles são derivados de JW90) originalmente obtidos de cromossomos de cana-de-açúcar e os dados de resistência a smut da cana-de-açúcar. Além disso, muitos genes estão presumivelmente associados à resistência a smut da cana-de-açúcar, que é uma característica quantitativa caracterizada por uma distribuição contínua. Ou seja, a resistência a smut da cana-de-açúcar é avaliada com base na morbidade de smut caracterizada por essa distribuição contínua. Para a análise de QTL, o software de análise de gene QTL Cartographer (Wang S., C.J. Basten, e Z.-B. Zeng, 2010; Windows QTL Cartographer

2.5, Departamento de Estatística, Universidade do Estado da Carolina do Norte, Raleigh, NC) é usado, e a análise é realizada pelo método de mapeamento de intervalo composto (CIM).

[048]Especificamente, uma região incluída no mapa de ligação genética acima com pontuações LOD equivalentes a ou excedendo um determinado limite (por exemplo, 2,5); isto é, uma região de aproximadamente 8,4 cM (centimorgan), foi identificada pela análise de QTL descrita acima. O termo “morgan (M)” aqui utilizado se refere a uma unidade que representa a distância relativa entre os genes em um cromossomo e expressa a taxa de cruzamento em números percentuais. No caso do cromossomo da cana-de-açúcar, 1 cM corresponde a aproximadamente 2.000 kb. Além disso, sugere-se que um gene causador (ou um grupo de genes causadores) para uma característica que melhora a resistência a smut pode estar presente na posição de pico ou nas proximidades dela.

[049]A região de 8,4 cM compreende 6 tipos de marcadores listados na

Tabela 1 na ordem mostrada nela e está ligada a uma característica de melhorar a resistência a smut. Tabela 1

[050]Na Tabela 1, “Grupo de ligação” representa o número dado a cada grupo entre uma pluralidade de grupos de ligação especificados por análise de QTL. Na Tabela 1, o nome do marcador fornecido na coluna indicando marcadores adjacentes representa o nome dado a cada marcador originalmente obtido na presente invenção.

[051]Além disso, o pico incluído na região de 8,4 cM está presente adjacente ao marcador que compreende a sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 1 (AMP0121265).

[052]Uma região contínua de ácido nucleico existente na região de 8,4 cM contendo os marcadores mostrados na Tabela 1 pode ser usada como um marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar. O termo “região de ácido nucleico” aqui utilizado se refere a uma região que compreende uma sequência de nucleotídeos com 95% ou menos, preferencialmente 90% ou menos, mais preferencialmente 80% ou menos, e mais preferencialmente 70% ou menos de identidade com uma região diferente presente em um cromossomo de cana-de-açúcar. Se a identidade de uma região de ácido nucleico que serve como um marcador associado à resistência de smut da cana-de-açúcar a uma região diferente cair dentro da faixa acima, a região de ácido nucleico pode ser detectada especificamente de acordo com uma técnica convencional. O valor de identidade aqui descrito pode ser calculado usando, por exemplo, BLAST com configurações de parâmetros padrão.

[053]A região de ácido nucleico que serve como um marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar pode compreender 8 ou mais, de preferência 15 ou mais, mais preferencialmente 20 ou mais, e mais preferencialmente 30 nucleotídeos. Se o comprimento da região de ácido nucleico que serve como um marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar cair dentro da faixa acima, a região de ácido nucleico pode ser detectada especificamente de acordo com uma técnica convencional.

[054]O marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar pode ser qualquer região de ácido nucleico contínua selecionada a partir da região de 8,4 cM. A sequência de nucleotídeos da região de 8,4 cM pode ser identificada por análise de sequência de flanqueamento, como análise de PCR reversa usando iniciadores projetados com base nas sequências de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NOs: 1 a 6.

[055]Em particular, o marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar é preferencialmente selecionado de uma região adjacente à sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 1 ou 2 na região de 8,4 cM descrita acima por causa da presença do pico adjacente à sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 1.

[056]Os 6 tipos de marcadores ou alguns deles podem ser usados como marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar. Especificamente, um ou mais marcadores selecionados entre os 6 tipos de marcadores podem ser usados como marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar. Alternativamente, uma região parcial dos 6 tipos de marcadores pode ser usada como marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar. Exemplo de marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar 2

[057]O marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar foi recentemente identificado por análise de loci de características quantitativas (QTL) usando um mapa de ligação genética de plantas descendentes de Iriomote 15 compreendendo 58 grupos de ligação incluindo 64.757 marcadores (1.166 deles são derivados de plantas descendentes de Iriomote 15) originalmente obtido dos cromossomos da cana-de-açúcar e dos dados de resistência a smut da cana-de-açúcar. Além disso, muitos genes estão presumivelmente associados à resistência a smut da cana-de-açúcar, que é uma característica quantitativa caracterizada por uma distribuição contínua. Ou seja, a resistência a smut da cana-de-açúcar é avaliada com base na morbidade de smut caracterizada por essa distribuição contínua. Para a análise de QTL, o software de análise de gene QTL Cartographer (Wang S., C.J. Basten, e Z.-B. Zeng, 2010; Windows QTL Cartographer

2.5, Departamento de Estatística, Universidade do Estado da Carolina do Norte, Raleigh, NC) é usado, e a análise é realizada pelo método de mapeamento de intervalo composto (CIM).

[058]Especificamente, uma região incluída no mapa de ligação genética acima com pontuações LOD equivalentes a ou excedendo um determinado limite (por exemplo, 2,5); isto é, uma região de aproximadamente 26,6 cM (centimorgan), foi identificada pela análise de QTL descrita acima. O termo “morgan (M)” aqui utilizado se refere a uma unidade que representa a distância relativa entre os genes em um cromossomo e expressa a taxa de cruzamento em números percentuais. No caso do cromossomo da cana-de-açúcar, 1 cM corresponde a aproximadamente 2.000 kb. Além disso, sugere-se que um gene causador (ou um grupo de genes causadores) para uma característica que melhora a resistência a smut pode estar presente na posição de pico ou nas proximidades dela.

[059]A região de 26,6 cM compreende 9 tipos de marcadores listados na Tabela 2 na ordem mostrada nela e está ligada a uma característica de melhorar a resistência a smut.

Tabela 2

[060]Na Tabela 2, “Grupo de ligação” representa o número dado a cada grupo entre uma pluralidade de grupos de ligação especificados por análise de QTL. Na Tabela 2, o nome do marcador fornecido na coluna indicando marcadores adjacentes representa o nome dado a cada marcador originalmente obtido na presente invenção.

[061]Além disso, o pico incluído na região de 26,6 cM está presente em uma posição entre o marcador que compreende a sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 138 (AMP0032477) e o marcador compreendendo a sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 140 (AMP002312). Em particular, o pico está presente adjacente ao marcador que compreende a sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 139 (AMP0018405).

[062]Uma região contínua de ácido nucleico existente na região de 26,6 cM contendo os marcadores mostrados na Tabela 2 pode ser usada como um marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar. O termo “região de ácido nucleico” aqui utilizado se refere a uma região que compreende uma sequência de nucleotídeos com 95% ou menos, preferencialmente 90% ou menos, mais preferencialmente 80% ou menos, e mais preferencialmente 70% ou menos de identidade com uma região diferente presente em um cromossomo de cana-de-açúcar. Se a identidade de uma região de ácido nucleico que serve como um marcador associado à resistência de smut da cana-de-açúcar a uma região diferente cair dentro da faixa acima, a região de ácido nucleico pode ser detectada especificamente de acordo com uma técnica convencional. O valor de identidade aqui descrito pode ser calculado usando, por exemplo, BLAST com configurações de parâmetros padrão.

[063]A região de ácido nucleico que serve como um marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar pode compreender 8 ou mais, de preferência 15 ou mais, mais preferencialmente 20 ou mais, e mais preferencialmente 30 nucleotídeos. Se o comprimento da região de ácido nucleico que serve como um marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar cair dentro da faixa acima, a região de ácido nucleico pode ser detectada especificamente de acordo com uma técnica convencional.

[064]O marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar pode ser qualquer região de ácido nucleico contínua selecionada a partir da região de 26,6 cM. A sequência de nucleotídeos da região de 26,6 cM pode ser identificada por análise de sequência de flanqueamento, como análise de PCR reversa usando iniciadores projetados com base nas sequências de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NOs: 135 a 143.

[065]Em particular, o marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar é preferencialmente selecionado a partir da região entre a sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 138 e a sequência de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NO: 140 na região de 26,6 cM descrita acima. Além disso, o marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar é preferencialmente selecionado a partir da região que compreende a sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 139 e uma sequência de nucleotídeos adjacente à sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 139 na região de 26,6 cM descrita acima. O marcador é preferencialmente selecionado de tal maneira devido à presença do pico na região entre a sequência de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NO: 138 e a sequência de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NO: 140, que é adjacente à sequência de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NO: 139.

[066]Os 9 tipos de marcadores ou alguns deles podem ser usados como marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar. Especificamente, um ou mais marcadores selecionados entre os 9 tipos de marcadores podem ser usados como marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar. Alternativamente, uma região parcial dos 9 tipos de marcadores pode ser usada como marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar. Exemplo de marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar 3

[067]O marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar foi recentemente identificado por análise de loci de características quantitativas (QTL) usando um mapa de ligação genética derivado da linhagem de progênie “KY09-6092” de Iriomote 8 compreendendo 117 grupos de ligação incluindo 57.444 marcadores (2.936 dos mesmos são derivados da linhagem de progênie “KY09-6092” de Iriomote 8) originalmente obtida de cromossomos de cana-de-açúcar e dados de resistência a smut da cana-de-açúcar.

[068]Além disso, muitos genes estão presumivelmente associados à resistência a smut da cana-de-açúcar, que é uma característica quantitativa caracterizada por uma distribuição contínua. Ou seja, a resistência a smut da cana-de-açúcar é avaliada com base na morbidade de smut caracterizada por essa distribuição contínua. Para a análise de QTL, o software de análise de gene QTL Cartographer (Wang S., C.J. Basten, e Z.-B. Zeng, 2010; Windows QTL Cartographer

2.5, Departamento de Estatística, Universidade do Estado da Carolina do Norte, Raleigh, NC) é usado, e a análise é realizada pelo método de mapeamento de intervalo composto (CIM).

[069]Especificamente, uma região incluída no mapa de ligação genética acima com pontuações LOD equivalentes a ou excedendo um determinado limite (por exemplo, 2,5); isto é, uma região de aproximadamente 12,27 cM (centimorgan), foi identificada pela análise de QTL descrita acima. O termo “morgan (M)” aqui utilizado se refere a uma unidade que representa a distância relativa entre os genes em um cromossomo e expressa a taxa de cruzamento em números percentuais. No caso do cromossomo da cana-de-açúcar, 1 cM corresponde a aproximadamente 2.000 kb. Além disso, sugere-se que um gene causador (ou um grupo de genes causadores) para uma característica que melhora a resistência a smut pode estar presente na posição de pico ou nas proximidades dela.

[070]A região de 12,27 cM compreende 7 tipos de marcadores listados na Tabela 3 na ordem mostrada nela e está ligada a uma característica de melhorar a resistência a smut. Tabela 3

[071]Na Tabela 3, “Grupo de ligação” representa o número dado a cada grupo entre uma pluralidade de grupos de ligação especificados por análise de QTL. Na Tabela 3, o nome do marcador fornecido na coluna indicando marcadores adjacentes representa o nome dado a cada marcador originalmente obtido na presente invenção. Entre os marcadores mostrados na Tabela 3, AMP0063683 é uma região de ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 144 e a sequência de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NO: 145 em ambas as extremidades. Os marcadores diferentes de AMP0063683 são, cada um, uma região de ácido nucleico que compreende uma única sequência de nucleotídeos.

[072]Além disso, o pico incluído na região de 12,27 cM está presente adjacente ao marcador que compreende a sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 151 (AMP0091501).

[073]Uma região contínua de ácido nucleico existente na região de 12,27 cM contendo os marcadores mostrados na Tabela 3 pode ser usada como um marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar. O termo “região de ácido nucleico” aqui utilizado se refere a uma região que compreende uma sequência de nucleotídeos com 95% ou menos, preferencialmente 90% ou menos, mais preferencialmente 80% ou menos, e mais preferencialmente 70% ou menos de identidade com uma região diferente presente em um cromossomo de cana-de-açúcar. Se a identidade de uma região de ácido nucleico que serve como um marcador associado à resistência de smut da cana-de-açúcar a uma região diferente cair dentro da faixa acima, a região de ácido nucleico pode ser detectada especificamente de acordo com uma técnica convencional. O valor de identidade aqui descrito pode ser calculado usando, por exemplo, BLAST com configurações de parâmetros padrão.

[074]A região de ácido nucleico que serve como um marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar pode compreender 8 ou mais, de preferência 15 ou mais, mais preferencialmente 20 ou mais, e mais preferencialmente 30 nucleotídeos. Se o comprimento da região de ácido nucleico que serve como um marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar cair dentro da faixa acima, a região de ácido nucleico pode ser detectada especificamente de acordo com uma técnica convencional.

[075]O marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar pode ser qualquer região de ácido nucleico contínua selecionada a partir da região de 12,27 cM. A sequência de nucleotídeos da região de 12,27 cM pode ser identificada por análise de sequência de flanqueamento, como análise de PCR reversa usando iniciadores projetados com base nas sequências de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NOs: 144 a 151.

[076]Em particular, o marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar é preferencialmente selecionado a partir de uma região entre a sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 150 e a sequência de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NO: 151 na região de 12,27 cM descrita acima por causa da presença do pico adjacente à sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 151.

[077]Os 7 tipos de marcadores ou alguns deles podem ser usados como marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar. Especificamente, um ou mais marcadores selecionados entre os 7 tipos de marcadores podem ser usados como marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar. Alternativamente, uma região parcial dos 7 tipos de marcadores pode ser usada como marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar.

[078]Uma parte da região de 12,27 cM que compreende os marcadores mostrados na Tabela 3 compreende uma região parcial em comum com uma parte da região de 8,4 cM que compreende os marcadores mostrados na Tabela 1. Especificamente, a sequência de nucleotídeos de uma região na vizinhança do pico incluída na região de 12,27 cM está em comum com a sequência de nucleotídeos de uma região na vizinhança do pico incluída na região de 8,4 cM. Mais especificamente, a sequência de nucleotídeos de uma região adjacente compreendendo AMP0121265 localizada a 0 cM entre os marcadores associados à resistência a smut de cana-de-açúcar derivada de JW90 mostrada na Tabela 1 é em comum com a sequência de nucleotídeos de uma região adjacente compreendendo AMP0091501 localizada a 83,76 cM entre os marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar derivados do Iriomote 8 mostrados na Tabela 3. Consequentemente, é altamente provável que as regiões que compreendem a sequência de nucleotídeos comum compreendam um fator (por exemplo, um gene causador) que melhora a resistência de smut da cana-de-açúcar. É mais preferencial que essas regiões sejam usadas como marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar. Identificação de marcador de cana

[079]Conforme descrito acima, os marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar foram identificados entre 31.191 marcadores originalmente obtidos dos cromossomos da cana-de-açúcar (4.503 marcadores dos mesmos são derivados do JW90), 64.757 marcadores originalmente obtidos dos cromossomos da cana-de-açúcar (1.166 marcadores dos mesmos são derivados das linhagens de progênie “KY08 -6023”, “KY08-6039” e “KY08-6041” de Iriomote 15), e 57.444 marcadores originalmente obtidos de cromossomos de cana-de-açúcar (2.936 marcadores dos mesmos são derivados da linhagem de progênie “KY09-6092”de Iriomote 8) na presente invenção. Os 31.191 marcadores (4.503 marcadores dos mesmos são derivados de JW90), os 64.757 marcadores (1.166 marcadores dos mesmos são derivados das linhagens de progênie “KY08-6023”, “KY08-6039” e “KY08-6041” de Iriomote 15), e os 57.444 marcadores (2.936 marcadores dos mesmos são derivados da linhagem de progênie “KY09-6092” de Iriomote 8) são descritos neste documento. Ao identificar estes marcadores, uma biblioteca de DNA foi preparada de acordo com o método para preparar uma biblioteca de DNA divulgado em WO 2018/003220.

[080]Especificamente, uma reação de amplificação de ácido nucleico é realizada em uma solução de reação em que um iniciador compreendendo uma sequência de nucleotídeos arbitrária (doravante, referido como um “iniciador aleatório”) é ajustado em alta concentração, e os fragmentos de ácido nucleico amplificados são servidos como uma biblioteca de DNA. Aqui, o termo “alta concentração” se refere a uma concentração mais alta do que a concentração do iniciador em uma reação de amplificação de ácido nucleico convencional. Especificamente, o método para preparar uma biblioteca de DNA de acordo com a presente invenção envolve o uso de um iniciador aleatório em concentração mais alta do que a concentração do iniciador em uma reação de amplificação de ácido nucleico convencional. Como um molde incluído na solução de reação, pode ser utilizado DNA genômico preparado a partir de um organismo, cuja biblioteca de DNA deve ser preparada.

[081]A sequência do iniciador aleatório não é particularmente limitado. Por exemplo, um nucleotídeo compreendendo 9 a 30 bases pode ser usado. Em particular, um iniciador aleatório é um nucleotídeo que compreende uma sequência arbitrária de 9 a 30 bases. Um tipo de nucleotídeo (um tipo de sequência) não é particularmente limitado e 1 ou mais tipos de nucleotídeos, de preferência 1 a 10.000 tipos de nucleotídeos, mais preferencialmente 1 a 1.000 tipos de nucleotídeos, ainda mais preferencialmente 1 a 100 tipos de nucleotídeos, e mais preferencialmente 1 a 96 tipos de nucleotídeos podem ser usados. Com o uso de nucleotídeos (um grupo de nucleotídeos) dentro da faixa descrita acima como um iniciador aleatório, fragmentos de ácido nucleico amplificados podem ser obtidos com maior reprodutibilidade. Quando um iniciador aleatório compreende uma pluralidade de nucleotídeos, não é necessário que todos os nucleotídeos compreendam o mesmo número de bases (9 a 30 bases), e um iniciador aleatório pode compreender uma pluralidade de nucleotídeos com um número diferente de bases.

[082]A fim de obter um amplicon particular por meio de uma reação de amplificação de ácido nucleico, em geral, as sequências de nucleotídeos dos iniciadores são projetadas de acordo com o amplicon de interesse. Por exemplo, um par de iniciadores é projetado para flanquear a posição correspondente ao amplicon no DNA molde, como o DNA genômico. Em tal caso, os iniciadores são concebidos para hibridizar com uma região específica no molde e, portanto, podem ser referidos como “iniciadores específicos”.

[083]Ao contrário de um iniciador projetado para obter um amplicon específico, em contraste, um iniciador aleatório não é projetado para hibridizar com uma região específica no DNA molde, mas é projetado para obter um amplicon aleatório. Um iniciador aleatório pode compreender qualquer sequência de nucleotídeos. Ele acidentalmente hibridiza com uma região complementar no DNA molde e, portanto, pode estar envolvido na amplificação do amplicon aleatório.

[084]Especificamente, um iniciador aleatório pode ser um nucleotídeo compreendendo uma sequência arbitrária envolvida na amplificação do amplicon aleatório, como descrito acima. Uma sequência arbitrária não é particularmente limitada. Por exemplo, pode ser projetada como uma sequência de nucleotídeos de nucleotídeos selecionados aleatoriamente do grupo que consiste em adenina, guanina, citosina e timina, ou pode ser projetado como uma sequência de nucleotídeos particular. Exemplos de sequências de nucleotídeos particulares incluem uma sequência de nucleotídeos compreendendo uma sequência de reconhecimento de enzima de restrição ou uma sequência de nucleotídeos compreendendo uma sequência adaptadora aplicada a um sequenciador de próxima geração.

[085]Quando uma pluralidade de tipos de nucleotídeos é projetada como iniciadores aleatórios, uma pluralidade de sequências de nucleotídeos de determinado comprimento pode ser projetada selecionando nucleotídeos aleatoriamente do grupo que consiste em adenina, guanina, citosina e timina. Quando uma pluralidade de tipos de nucleotídeos é projetada como iniciadores aleatórios, alternativamente, uma pluralidade de sequências de nucleotídeos, cada uma compreendendo uma região comum composta por uma sequência de nucleotídeos particular e uma região incomum composta por uma sequência de nucleotídeos arbitrária pode ser projetada. Uma região incomum pode ser composta por uma sequência de nucleotídeos selecionados aleatoriamente a partir do grupo que consiste em adenina, guanina, citosina e timina. Alternativamente, uma região incomum pode compreender todos os 4 tipos de nucleotídeos; isto é, adenina, guanina, citosina e timina, ou alguns dos mesmos. Uma região comum não é particularmente limitada e pode ser composta por qualquer sequência de nucleotídeos. Por exemplo, uma região comum pode ser uma sequência de nucleotídeos compreendendo uma sequência de reconhecimento de enzima de restrição, uma sequência de nucleotídeos compreendendo uma sequência adaptadora aplicada a um sequenciador de próxima geração ou uma sequência de nucleotídeos que é comum entre uma família de genes particular.

[086]Quando uma pluralidade de sequências de nucleotídeos de determinado comprimento são projetadas selecionando nucleotídeos aleatoriamente entre 4 tipos de nucleotídeos como uma pluralidade de iniciadores aleatórios, uma pluralidade de sequências de nucleotídeos é preferencialmente projetada para ter 70% ou menos, preferencialmente 60% ou menos, mais preferencialmente 50% ou menos, e mais preferencialmente 40% ou menos identidade em regiões que constituem 30% ou mais, preferencialmente 50% ou mais, mais preferencialmente 70% ou mais, e ainda preferencialmente 90% ou mais de todas as sequências. Quando uma pluralidade de sequências de nucleotídeos de determinado comprimento é projetada pela seleção aleatória de nucleotídeos dentre 4 tipos de nucleotídeos como uma pluralidade de iniciadores aleatórios, as sequências de nucleotídeos são projetadas para compreender os nucleotídeos com a identidade dentro da faixa descrita acima. Assim, os fragmentos amplificados podem ser obtidos sobre todo o DNA genômico da espécie de organismo alvo. Ou seja, a homogeneidade de fragmentos amplificados pode ser aumentada.

[087]Quando uma pluralidade de sequências de nucleotídeos, cada uma compreendendo uma região comum composta por uma sequência de nucleotídeos particular e uma região incomum composta por uma sequência de nucleotídeos arbitrária, são projetadas como uma pluralidade de iniciadores aleatórios, por exemplo, vários nucleotídeos do terminal 3' podem ser projetados como um região incomum, e os nucleotídeos do terminal 5' restantes podem ser projetados como uma região comum. Se o número “n” de nucleotídeos do terminal 3' for designado como uma região incomum, 4n tipos de iniciadores aleatórios podem ser projetados. O número “n” pode ser de 1 a 5, de preferência 2 a 4, e mais preferencialmente 2 ou 3.

[088]Como iniciadores aleatórios, cada um compreendendo uma região comum e uma região incomum, por exemplo, 16 tipos de iniciadores aleatórios, cada um compreendendo uma sequência de adaptador de terminal 5’ aplicada a um sequenciador de próxima geração (uma região comum) e uma região de terminal 3'

de 2 nucleotídeos (uma região incomum) podem ser projetados no total. Quando uma região de terminal 3’ é projetada para compreender 3 nucleotídeos (uma região incomum), 64 tipos de iniciadores aleatórios podem ser projetados no total. À medida que os tipos de iniciadores aleatórios são aumentados, os fragmentos amplificados podem ser obtidos de forma mais ampla em todo o DNA genômico da espécie de organismo alvo. Ao projetar um iniciador aleatório compreendendo uma região comum e uma região incomum, portanto, é preferencial que uma região 3’ terminal compreenda 3 nucleotídeos.

[089]Alternativamente, 64 tipos de sequências de nucleotídeos, cada uma compreendendo uma região comum e uma região incomum de 3 nucleotídeos, podem ser projetados primeiro, e até 63 tipos de iniciadores aleatórios selecionados entre os 64 tipos de sequências de nucleotídeos podem então ser usados. Em outras palavras, o uso de até 63 tipos de iniciadores aleatórios pode ocasionalmente produzir resultados de análises conduzidas por uma reação de amplificação de ácido nucleico ou com o uso de um sequenciador de próxima geração superior aos obtidos com o uso de todos os 64 tipos de iniciadores.

[090]É preferencial que a concentração do iniciador aleatório seja determinada adequadamente de acordo com um comprimento de base do iniciador aleatório. Quando uma pluralidade de tipos de nucleotídeos com diferentes comprimentos de base é usada como iniciadores aleatórios, o comprimento de base do iniciador aleatório pode ser a média (pode ser uma média simples ou média ponderada levando em consideração a quantidade de nucleotídeos).

[091]Especificamente, uma reação de amplificação de ácido nucleico é realizada com o uso de um iniciador aleatório com um comprimento de base de 9 a 30 de 4 a 200 microM e, de preferência, de 4 a 100 microM. Sob tais condições, muitos fragmentos amplificados e, em particular, muitos fragmentos amplificados de 100 a 500 bases de comprimento, podem ser obtidos com alta reprodutibilidade por meio de uma reação de amplificação de ácido nucleico.

[092]Mais especificamente, a concentração do iniciador aleatório é de preferência de 40 a 60 microM quando um iniciador aleatório tem 9 a 10 comprimento de base. Quando um iniciador aleatório tem comprimento de 10 a 14 base, a concentração do iniciador aleatório é preferencialmente em um nível que satisfaça y> 3E + 08x-6,974 e 100 microM ou inferior, desde que “y” represente o comprimento de base do iniciador aleatório e “x” represente a concentração aleatória do iniciador. Quando um iniciador aleatório tem comprimento de 14 a 18 bases, a concentração do iniciador aleatório é de preferência de 4 a 100 microM. Quando um iniciador aleatório tem 18 a 28 comprimento de base, é preferencial que a concentração do iniciador aleatório seja de 4 microM ou superior e satisfaça y <8E + 08x-5,533. Quando um iniciador aleatório tem de 28 a 29 comprimento de base, a concentração do iniciador aleatório é de preferência de 6 a 10 microM. Ajustando a concentração do iniciador aleatório ao nível descrito acima de acordo com o comprimento de base do iniciador aleatório, muitos fragmentos amplificados podem ser obtidos de forma mais definitiva, ao mesmo tempo que se obtém alta reprodutibilidade.

[093]As inequações descritas acima; ou seja, y> 3E + 08x -6,974 ey <8E + 08x -5,533, foram formadas como resultado de uma investigação completa da correlação entre o comprimento e a concentração de um iniciador aleatório, conforme descrito em WO 2018/003220, de modo que muitos Fragmentos de DNA de 100 a 500 bases de comprimento podem ser amplificados com alta reprodutibilidade.

[094]A quantidade de DNA genômico usado como molde em uma reação de amplificação de ácido nucleico não é particularmente limitada. Quando a quantidade da solução de reação é de 50 microlitros, a quantidade de DNA genômico é de preferência 0,1 a 1.000 ng, mais preferencialmente 1 a 500 ng, ainda mais preferencialmente 5 a 200 ng, e mais preferencialmente 10 a 100 ng. Ajustando a quantidade de DNA genômico usado como molde em tal intervalo, uma reação de amplificação do iniciador aleatório não seria inibida, e muitos fragmentos amplificados podem ser obtidos com alta reprodutibilidade.

[095]De acordo com o método descrito acima, uma biblioteca de DNA pode ser produzida a partir da cana-de-açúcar com excelente resistência a smut, e uma biblioteca de DNA pode ser produzida a partir da cana-de-açúcar com susceptibilidade a smut. As sequências de nucleotídeos nessas bibliotecas de DNA são analisadas com o uso de um sequenciador de última geração, o número lido de fragmentos que constituem a biblioteca é comparado entre si e fragmentos peculiares à biblioteca de DNA produzidos a partir de cana-de-açúcar com excelente resistência a smut podem ser selecionados.

[096]Mais especificamente, os presentes inventores submeteram uma linhagem de cana de tipo selvagem (Iriomote 15) ao cruzamento com uma variedade de cana de açúcar conhecida (NiF8) para obter linhagens de progênie (3 linhas), submeteram as linhagens de progênie obtidas ao cruzamento com a linhagem de cana de açúcar de tipo selvagem (JW90) para obter linhagens de progênie (33 linhas, linhagem 35 e 35 linhas, respectivamente) e prepararam uma biblioteca de DNA das mesmas. A biblioteca de DNA resultante foi aplicada a um sequenciador de próxima geração para obter os dados do número de leitura, os dados do genótipo foram obtidos a partir dos mesmos e as informações de posição do marcador no cromossomo foram determinadas com base nos dados do genótipo usando o software AntMap para a construção de mapas de ligação genética (Iwata H, Ninomiya S, 2006, AntMap: Construindo mapas de ligação genética usando um algoritmo de otimização de colônia de formigas, Breed Sci., 56: 371-378) de acordo com a fórmula da distância genética de Kosambi. Além disso, uma planilha de dados do mapa genético foi preparada com base nas informações de posição do marcador obtidas usando Mapmaker/EXP ver. 3.0 (A Whitehead Institute for Biomedical Research Technical Report, Third Edition, January, 1993). Como resultado, os 31.191 marcadores, incluindo os 6 tipos de marcadores mencionados acima associados à resistência a smut da cana-de-açúcar mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 6 foram identificados. Além disso, a etapa de obtenção dos dados de número lidos aplicando a biblioteca de DNA ao sequenciador de próxima geração foi repetida duas vezes para obter uma quantidade maior de dados de número lidos e os dados de genótipo foram obtidos a partir dos dados de número lidos. Assim, 64.757 marcadores, incluindo 9 tipos de marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar, conforme mostrado na SEQ ID NOs: 135 a 143 foram identificados da mesma maneira.

[097]Além disso, os presentes inventores submeteram uma linhagem de cana-de-açúcar de tipo selvagem (Iriomote 8) ao cruzamento com uma variedade de cana-de-açúcar conhecida (NiF8) para obter linhagens de progênie, submeteram uma variedade de cana-de-açúcar “NiTn18” ao cruzamento com uma variedade de cana-de-açúcar “NiTn24” para obter linhagens de progênie, obtiveram 154 linhagens de progênie a partir das mesmas e prepararam uma biblioteca de DNA das mesmas. A biblioteca de DNA resultante foi aplicada a um sequenciador de próxima geração para obter os dados do número de leitura, os dados do genótipo foram obtidos a partir dos mesmos e as informações de posição do marcador no cromossomo foram determinadas com base nos dados do genótipo usando o software AntMap para a construção de mapas de ligação genética (Iwata H, Ninomiya S, 2006, AntMap: Construindo mapas de ligação genética usando um algoritmo de otimização de colônia de formigas, Breed Sci., 56: 371-377) de acordo com a fórmula da distância genética de Kosambi. Além disso, uma planilha de dados do mapa genético foi preparada com base nas informações de posição do marcador obtidas usando Mapmaker/EXP ver. 3.0 (A Whitehead Institute for Biomedical Research Technical Report, Third Edition, January, 1993). Como resultado, 57.444 marcadores, incluindo 7 tipos de marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar, conforme mostrado na SEQ ID NOs: 144 (e 145) a 151 indicados acima foram identificados.

[098]A região adjacente compreendendo o marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar tendo a sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 151 e a região adjacente compreendendo o marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar tendo a sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 1 foram identificados independentemente um do outro; no entanto, essas regiões compreendem uma pluralidade de marcadores tendo a sequência de nucleotídeos idêntica. Uso de marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar

[099]Com o uso de marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar, se ou não uma linhagem de progênie da cana-de-açúcar ou similar cujo fenótipo relativo à resistência a smut permanece desconhecido exibiria um fenótipo para resistência melhorada a smut pode ser determinado. Como o marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar, uma ou mais regiões de ácido nucleico incluídas na região de 8,4 cM mencionada acima podem ser usadas. Alternativamente, uma ou mais regiões de ácido nucleico incluídas na região de 26,6 cM mencionada acima podem ser usadas como marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar. Além disso, uma ou mais regiões de ácido nucleico incluídas na região de 12,27 cM podem ser usadas como os marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar. Além disso, uma ou mais regiões de ácido nucleico incluídas na região de 8,4 cM, uma ou mais regiões de ácido nucleico incluídas na região de 26,6 cM, ou uma ou mais regiões de ácido nucleico incluídas na região de 12,27 cM podem ser utilizadas como marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar. Neste caso, o uso dos marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar engloba uma modalidade envolvendo uma reação de amplificação de ácido nucleico com o uso de um par de iniciadores que amplifica especificamente os marcadores e uma modalidade envolvendo o uso de um microarranjo de DNA com sondas correspondentes aos marcadores.

[0100]Um par de iniciadores que amplifica especificamente os marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar pode ser adequadamente projetado de acordo com a sequência de nucleotídeos da região de 8,4 cM, a sequência de nucleotídeos da região de 26,6 cM e a sequência de nucleotídeos da região de 12,27 cM. Por exemplo, um par de iniciadores pode ser projetado para amplificar uma região incluída na sequência de nucleotídeos da região de 8,4 cM, a sequência de nucleotídeos da região de 26,6 cM e a sequência de nucleotídeos da região de 12,27 cM, como uma região de 1 kbp ou menor, 800 bp ou menor, 500 bp ou menor ou 350 bp ou menor. Alternativamente, um par de iniciadores pode ser projetado para amplificar uma parte ou toda a região de ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos como mostrado em qualquer uma das SEQ ID NO: 1 a 6, 135 a 143, e 144 (145) a 151. Uma parte da região de ácido nucleico pode ser composta por 10 bases contínuas, 20 bases contínuas, 40 bases contínuas, 80 bases contínuas, 100 bases contínuas ou 140 bases contínuas incluídas na sequência de nucleotídeos como mostrado em qualquer uma das SEQ ID NO: 1 a 6, 135 a 143, e 144 (145) a 151.

[0101]Uma sonda correspondente ao marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar é um oligonucleotídeo que pode hibridizar especificamente sob condições rigorosas com o marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar conforme definido acima. Por exemplo, tal oligonucleotídeo pode ser projetado como uma região parcial de pelo menos 10 bases contínuas, 15 bases contínuas, 20 bases contínuas, 25 bases contínuas, 30 bases contínuas, 35 bases contínuas, 40 bases contínuas, 45 bases contínuas ou 50 bases contínuas de toda a região da sequência de nucleotídeos do marcador associado com a resistência a smut da cana-de-açúcar como definido acima ou uma fita complementar da mesma. A sonda pode ser imobilizada em um suporte. Especificamente, qualquer tipo de microarranjo, tal como um microarranjo tendo um substrato plano feito de vidro ou silicone como um transportador, uma matriz de grânulos compreendendo microarranjo como transportadores ou um microarranjo tridimensional compreendendo uma sonda imobilizada em uma parede interna de uma fibra oca, pode ser usado.

[0102]Com o uso do microarranjo de DNA assim preparado, se ou não uma linhagem de cana-de-açúcar cujo fenótipo relativo à resistência a smut permanece desconhecido, conforme tipificado por uma linhagem de progênie ou semelhante, exibiria um fenótipo para resistência melhorada a smut pode ser determinado. Por qualquer método diferente do método que envolve o uso de um microarranjo de DNA como descrito acima, se uma linhagem de cana-de-açúcar cujo fenótipo em relação à resistência a smut permanece desconhecido exibiria um fenótipo para resistência aprimorada a smut pode ser determinado pela detecção do marcador associado a smut da cana-de-açúcar resistência de acordo com uma técnica convencional.

[0103]Mais especificamente, o DNA genômico é primeiro extraído de uma amostra de cana-de-açúcar. Nesse caso, uma amostra de cana-de-açúcar é uma linhagem de cana-de-açúcar, como uma linhagem de progênie de cana-de-açúcar cujo fenótipo relativo à resistência a smut permanece desconhecido e/ou uma linhagem de cana-de-açúcar parental usada para produzir uma linhagem de progênie. Essas linhagens de cana-de-açúcar devem ser avaliadas como tendo uma característica de resistência aprimorada ao smut. Além disso, outras plantas que não a cana-de-açúcar, como gramíneas, incluindo sorgo ou Erianthus, podem ser empregadas como amostras de plantas e a resistência a smut dessas amostras de plantas pode ser avaliada.

[0104]Posteriormente, é realizada uma reação de amplificação do ácido nucleico com a utilização do DNA genômico extraído como molde e o par de iniciadores descritos acima, de modo a amplificar o marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar. Neste caso, um dos iniciadores pode ser marcado com um corante fluorescente e assim por diante, de modo que o fragmento de DNA genômico amplificado possa ser marcado. Qualquer substância convencional pode ser usada como um marcador. Exemplos de marcadores que podem ser usados incluem moléculas fluorescentes, moléculas de corante, moléculas radioativas e assim por diante.

[0105]Subsequentemente, um fragmento de DNA genômico marcado é colocado em contato com o microarranjo de DNA sob determinadas condições, de modo a permitir que uma sonda imobilizada no microarranjo de DNA hibridize com o fragmento de DNA genômico marcado. Nesse caso, a hibridização é preferencialmente realizada em condições altamente restringentes. Assim, se uma amostra de cana-de-açúcar tem ou não o marcador associado à resistência de smut da cana-de-açúcar pode ser determinado com maior precisão. Além disso, condições rigorosas podem ser ajustadas em termos de temperatura de reação e concentração de sal. Ou seja, maior rigor pode ser obtido aumentando a temperatura ou diminuindo a concentração de sal. Quando uma sonda de comprimento de 50 a 75 bases é usada, por exemplo, um rigor mais alto pode ser realizado realizando a hibridização a 40 ºC a 44 ºC em 0,21 SDS e 6 × SSC.

[0106]Além disso, a hibridização entre uma sonda e um fragmento de DNA genômico marcado pode ser confirmada pela detecção de um marcador. Após a reação de hibridização acima entre o fragmento de DNA genômico marcado e a sonda, especificamente, um fragmento de DNA genômico que não reagiu ou semelhante é lavado e o marcador ligado ao fragmento de DNA genômico especificamente hibridizado com a sonda é então observado. Quando o marcador é um material fluorescente, por exemplo, o comprimento de onda de fluorescência é detectado. Quando o marcador é uma molécula de corante, o comprimento de onda do corante é detectado. Mais especificamente, um aparelho, como um detector fluorescente ou um analisador de imagem usado para análise convencional de microarranjo de DNA, pode ser usado.

[0107]Também é possível detectar o marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar no DNA genômico extraído de uma amostra de cana-de-açúcar por um método diferente do método que envolve o uso de microarranjos de DNA descrito acima. Por exemplo, o DNA genômico extraído de uma amostra de cana-de-açúcar é usado como modelo e o número de leitura do marcador associado à resistência de smut da cana-de-açúcar é medido usando um sequenciador de última geração. Assim, a presença ou ausência do marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar pode ser determinada com alta precisão.

[0108]Com o uso do microarranjo de DNA ou sequenciador de última geração, conforme descrito acima, pode-se determinar se a amostra de cana-de-açúcar tem ou não o marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar. O marcador associado à resistência de smut da cana-de-açúcar está ligado a uma característica de melhorar a resistência a smut. Se o marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar estiver presente em uma amostra de cana-de-açúcar, a amostra de cana-de-açúcar pode ser identificada como uma variedade com resistência aprimorada a smut.

[0109]De acordo com o método descrito acima, em particular, não é necessário cultivar amostras de cana-de-açúcar a tal ponto que um teste real de resistência a smut possa ser realizado. Por exemplo, sementes de uma linhagem de progênie ou uma muda jovem obtida como resultado da germinação de tais sementes podem ser usadas. Portanto, a área de um campo destinada ao cultivo de amostras de cana-de-açúcar e outros fatores como o custo do cultivo podem ser significativamente reduzidos com o uso de marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar. Além disso, o uso de marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar elimina a necessidade de infecção real com um micro-organismo causador de smut (Ustilago scitaminea), e o custo de instalações como uma estufa de grande escala para fins especiais, um campo para fins especiais, ou uma instalação isolada de um ambiente externo, pode ser reduzido.

[0110]Ao produzir uma nova variedade de cana-de-açúcar, é particularmente preferencial que várias dezenas de milhares de híbridos sejam produzidos primeiro por meio de cruzamentos e avaliados com o uso de marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar antes ou em vez da seleção de mudas. Assim, o número de linhagens de elite a serem cultivadas em campos reais pode ser reduzido em uma extensão significativa, e os esforços demorados e o custo necessário para a produção de uma nova variedade de cana-de-açúcar podem ser reduzidos de forma significativa.

[0111]Ao produzir uma nova variedade de cana-de-açúcar, alternativamente, se um marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar está ou não presente em uma variedade parental submetida a cruzamento pode ser determinado primeiro, de modo a selecionar uma variedade parental com excelente resistência a smut. Uma variedade parental com excelente resistência a smut pode ser preferencialmente usada para produzir uma linhagem de progênie, de modo que o desenvolvimento de uma linhagem com excelente resistência a smut com alta frequência possa ser esperado. Assim, o número de linhagens de elite a serem cultivadas pode ser reduzido em uma extensão significativa, e os esforços demorados e o custo necessário para a produção de uma nova variedade de cana-de-açúcar podem ser reduzidos de forma significativa.

EXEMPLOS

[0112]A presente invenção é a seguir descrita em maiores detalhes com referência aos seguintes exemplos, embora o escopo técnico da presente invenção não esteja limitado a estes. Exemplo 1 (1) Materiais

[0113]DNAs genômicos foram extraídos da variedade de cana-de-açúcar (NiF8), da variedade de cana-de-açúcar tipo selvagem (Iriomote 15), 3 linhagens de progênie (KY08-6023), (KY08-6039) e (KY08-6041) resultantes de cruzamentos entre (NiF8 ) e (Iriomote 15), e 33, 35 e 35 linhagens de progênies resultantes do cruzamento entre (KY08-6023) e a variedade de cana-de-açúcar tipo selvagem (JW90), entre (KY08-6039) e a variedade de cana-de-açúcar selvagem ( JW90), e entre (KY08-6041) e a variedade de cana-de-açúcar tipo selvagem (JW90), respectivamente. Os DNAs genômicos extraídos foram purificados com o uso do

DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN). (2) Preparação da biblioteca de DNA

[0114]Neste exemplo, uma biblioteca de DNA foi preparada de acordo com o método de preparação de uma biblioteca de DNA descrito em WO 2018/003220. Especificamente, uma mistura de dNTP (concentração final de 0,2 mM) foi adicionada a 15,0 ng do DNA genômico obtido em (1) acima, um iniciador aleatório de 60 microM foi adicionado a 0,625 unidades de Prime STAR DNA Polimerase (Takara Bio Inc.), e as misturas resultantes foram, cada uma, submetidas a PCR na quantidade de reação final de 25 microlitros. A PCR foi realizada através de tratamento a 98 ºC por 2 minutos, e 30 ciclos de 98 ºC por 10 segundos, 50 ºC por 15 segundos e 72 ºC por 20 segundos, seguido de armazenamento a 4 ºC.

[0115]Os iniciadores aleatórios uasdos neste exemplo estão resumidos na Tabela 4. Tabela 4 (3) Preparação da biblioteca de DNA para o sequenciador de próxima geração

[0116]Uma mistura de dNTP (concentração final de 0,2 mM), 1,25 unidade de PrimeSTAR HS DNA Polimerase (Takara Bio Inc.) e um conjunto de iniciadores foram adicionados a 1,5 microlitro da solução após a reação de (2) e as misturas resultantes foram, cada uma, submetidas a PCR na quantidade final de reação de 50 microlitros.

A PCR foi realizada através de tratamento a 95 ºC por 2 minutos, e 25 ciclos de 98 ºC por 15 segundos, 55 ºC por 15 segundos e 72 ºC por 20 segundos, seguido de armazenamento a 4 ºC.

Neste exemplo, os iniciadores diretos (SEQ ID NOs: 19 a 133) mostrados na Tabela 5 e o iniciador reverso (5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCGCGCAGATCGTCGGCAGCGTCA GATGTGTATAAGAGACAG-3' (SEQ ID NO: 134)) foram usados em combinação para um total de 115 combinações de 103 linhagens resultantes do cruzamento entre (KY08-6023), (KY08-6039) ou (KY08-6041) e (JW90) (33, 35 e 35 linhas, respectivamente) e 6 linhas das linhagens parentais e de avôs (ou seja, (NiF8), (Iriomote 15), (KY08-6023), (KY08-6039), (KY08-6041) e (JW90)) (2 repetições cada). Tabela 5

(4) Purificação e eletroforese

[0117]Quantidades equivalentes das soluções após a reação em (3) acima foram misturadas em um tubo, 50 microlitros foram separados e purificados usando o MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN), e o resultante foi submetido a eletroforese usando o bioanalisador Agilent 2100 (Agilent Technology) para obter uma unidade de fluorescência (FU). (5) Análise usando sequenciador de próxima geração

[0118]A biblioteca de DNA obtida em (3) foi analisada usando o Hiseq4000 Sequence System (Illumina) usando leituras de 100 bp de extremidade pareada. (6) Análise de dados lidos

[0119]Os dados lidos obtidos em (5) acima foram analisados usando um software analítico (GRAS-Di, Toyota Motor Corporation) para obter os dados do genótipo de 31.191 marcadores. (7) Preparação do mapa genético

[0120]Com base nos dados do genótipo obtidos a partir de JW90 em (6) acima, os dados do mapa genético compreendendo 86 grupos de ligação foram obtidos com o uso do software AntMap para a construção de mapas de ligação genética (Iwata H, Ninomiya, S., 2006, AntMap: Construindo mapas de ligação genética usando um algoritmo de otimização de colônia de formigas, Breed Sci., 56: 371-377) por cálculo usando a fórmula da distância genética de Kosambi. Os 86 grupos de ligação incluem dados de genótipo de 4.503 marcadores de JW90. (8) Aquisição de dados de teste de resistência a smut

[0121]Os caules foram coletados das 3 linhagens de progênie resultantes do cruzamento entre a variedade de cana-de-açúcar (NiF8) e a variedade de cana-de-açúcar selvagem (Iriomote 15); ou seja, (KY08-6023), (KY08-6039) e (KY08-6041), e 33, 35 e 35 linhagens de progênie resultantes do cruzamento entre (KY08-6023), (KY08-6039) e (KY08- 6041) e da variedade de cana-de-açúcar tipo selvagem (JW90), e os caules coletados foram submetidos a estimulação de germinação em temperatura ambiente e alta umidade por 2 a 3 dias, seguida de inoculação da ferida com esporos de smut. Para a inoculação da ferida, as feridas foram feitas em ambos os lados dos botões (6 feridas no total; aproximadamente 4,0 mm de profundidade), e uma suspensão de esporos (10 7 a 10 8 esporos/ml) foi então aplicada às feridas usando uma escova. Mudas submetidas à inoculação na ferida foram cultivadas por 2 a 3 dias em temperatura ambiente e alta umidade e plantadas em caixas de viveiro (40 gemas/caixa, 2 caixas/linhagem). As mudas plantadas foram cultivadas em ambiente úmido em estufa. O grau de desenvolvimento da smut foi investigado contando, como o número de mudas afetadas, o número de mudas que apresentavam um sintoma de smut, que é o resultado de um chicote de smut no ápice de um caule. Após a investigação do número de mudas afetadas, os corpos das plantas das mudas afetadas foram colhidos no nível do solo e removidos. A morbidade de smut foi calculada como uma porcentagem do número de estoques em germinação (excluindo estoques mortos por causas não-fuliginosas) contabilizados pelo número de estoques afetados. A Fig. 1 (A) mostra os resultados do cálculo da morbidade de smut da linhagem de progênie resultante do cruzamento entre (KY08-6023) e (JW90), a Fig. 1 (B) mostra os resultados do cálculo da morbidade de smut da linhagem de progênie resultante do cruzamento entre (KY08-6039) e (JW90), e a Fig. 1 (C) mostra os resultados do cálculo da morbidade de smut da linhagem de progênie resultante do cruzamento entre (KY08-6041) e (JW90). (9) Análise de loci de características quantitativas (QTL)

[0122]Com base nos dados do mapa genético obtidos do JW90 em (7) acima e nos dados do teste de resistência a smut obtidos em (8) acima, a análise de QTL foi realizada pelo método de mapeamento de intervalo composto (CIM) usando o software de análise de gene QTL Cartographer (http : //statgen.ncsu.edu/qtlcart/cartographer.html). O limite LOD foi determinado como 2,5. Como resultado, a presença de QTL ligada à resistência a smut da cana-de-açúcar foi confirmada em uma região de aproximadamente 8,4 cM incluindo os marcadores AMP0121265 a AMP0100370 no 42º grupo de ligação da variedade de cana-de-açúcar tipo selvagem (JW90) (Tabela 6 e Fig. 2 ) Quando o valor que indica o efeito é negativo, o QTL está vinculado a uma característica de melhorar a resistência a smut. Tabela 6

[0123]Como mostrado na Tabela 6 e na Fig. 2, a faixa incluindo os marcadores AMP0121265 a AMP0100370 no 42º grupo de ligação observada no presente exemplo exibe um valor LOD significativamente mais alto e efeitos significativamente melhorados, em comparação com aqueles descritos em WO 2012/147635. (10) Seleção do marcador de seleção de resistência a smut

[0124]Os marcadores incluídos na região QTL ligada à resistência a smut da cana-de-açúcar confirmada em (9) acima (ou seja, AMP0121265, AMP0120752, AMP0035185, AMP0114852, AMP0089904 e AMP0100370) foram selecionados como marcadores de seleção (Tabela 7). Tabela 7

[0125]Se genótipos dos marcadores ou não; ou seja, as amostras de linhagem, os marcadores de seleção foram determinados designando o limite de cada número de leituras como 10, avaliando como “presente” quando o número de leituras é 10 ou mais, e avaliando como “ausente” quando o número de leituras é menor que 10 (Figs. 3 a 8, Tabela 8).

Tabela 8

[0126]Conforme mostrado na Tabela 8 e Figs. 3 a 8, uma amostra linear que exibe uma morbidade de poluição mais baixa tem um número significativamente maior de marcadores do que uma amostra linear que exibe uma morbidade de poluição mais alta. Tais resultados demonstram que regiões de ácido nucleico contínuas selecionadas a partir da região de aproximadamente 8,4 cM incluindo AMP0121265, AMP0120752, AMP0035185, AMP0114852, AMP0089904 e AMP0100370 podem ser usadas como os marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar. Exemplo 2

[0127]No Exemplo 1, o marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar foi identificado com base nos dados do genótipo de 4.503 marcadores de JW90 entre os dados do genótipo dos 31.191 marcadores. Neste exemplo, os dados do genótipo de Iriomote 15 foram coletados e o marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar foi identificado da mesma maneira.

[0128]Neste exemplo, a biblioteca de DNA preparada no Exemplo 1 foi submetida à análise usando um sequenciador de próxima geração, conforme descrito em (5), duas vezes a fim de aumentar a quantidade de dados de genótipo de Iriomote

15. Os dados lidos assim obtidos foram analisados usando um software analítico (GRAS-Di, Toyota Motor Corporation) para obter os dados do genótipo de 64.757 marcadores.

[0129]Com base nos dados genotípicos obtidos de linhagens de progênie; ou seja, KY08-6023, KY08-6039 e KY08-6041, de Iriomote 15, os dados do mapa genético compreendendo 58 grupos de ligação foram obtidos com o uso do software AntMap para a construção de mapas de ligação genética (Iwata H, Ninomiya, S., 2006, AntMap: Construindo mapas de ligação genética usando um algoritmo de otimização de colônia de formigas, Breed Sci., 56: 371-377) por cálculo usando a fórmula da distância genética de Kosambi da mesma maneira que no Exemplo 1. Os 58 grupos de ligação incluem dados de genótipo de 4.503 marcadores das linhagens de progênie; ou seja, KY08-6023, KY08-6039 e KY08-6041, de Iriomote 15.

[0130]Com base nos dados do mapa genético assim obtidos e nos dados do teste de resistência a smut obtidos no Exemplo 1, a análise de QTL foi realizada pelo método de mapeamento de intervalo composto (CIM) usando o software de análise de gene QTL Cartographer (http://statgen.ncsu.edu /qtlcart/cartographer.html). O limite LOD foi determinado como 2,5. Como resultado, a presença de QTL ligado à resistência a smut da cana-de-açúcar foi confirmada em uma região entre os marcadores AMP0014532 e AMP0015886 no 15º grupo de ligação da variedade de cana-de-açúcar tipo selvagem (Iriomote 15) (Tabela 9 e Fig. 9). Quando o valor que indica o efeito é negativo, o QTL está associado a uma característica de melhorar a resistência a smut. Tabela 9

[0131]Como mostrado na Tabela 9 e na Fig. 9, o intervalo incluindo os marcadores AMP0014532 a AMP0015886 no 15º grupo de ligação observado no Exemplo 2 mostrou exibir um valor LOD significativamente mais alto e efeitos significativamente melhorados, em comparação com aqueles descritos em WO 2012/147635. Neste exemplo, os marcadores incluídos na região QTL ligada à resistência a smut da cana-de-açúcar assim confirmada (ou seja, AMP0014532,

AMP0043152, AMP0069135, AMP0032477, AMP0018405, AMP0002312, AMP0007121, AMP0090108 e AMP0015886) foram selecionados como marcadores (Tabela 10). Tabela 10

[0132]Se genótipos dos marcadores ou não; ou seja, as amostras de linhagem, os marcadores de seleção foram determinados designando o limite de cada número de leituras como 10, avaliando como “presente” quando o número de leituras é 10 ou mais, e avaliando como “ausente” quando o número de leituras é menor que 10 (Figs. 10 a 18, Tabela 11). Tabela 11

[0133]Conforme mostrado na Tabela 11 e Figs. 10 a 18, uma amostra linear exibindo uma morbidade mais baixa de smut teve um número significativamente maior de marcadores do que uma amostra linear exibindo uma morbidade mais alta de smut. Tais resultados demonstram que regiões de ácido nucleico contínuas selecionadas da região de aproximadamente 26,6 cM incluindo AMP0014532, AMP0043152, AMP0069135, AMP0032477, AMP0018405, AMP0002312,

AMP0007121, AMP0090108 e AMP0015886 podem ser usadas como os marcadores associados à resistência a smut na cana-de-açúcar. Exemplo 3

[0134]Neste exemplo, o marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar derivado da linhagem de cana-de-açúcar selvagem “Iriomote 8” foi identificado da mesma maneira que no Exemplo 1, exceto pelo uso da linhagem de progênie “KY09-6092” resultante de cruzamento entre a variedade de cana-de-açúcar “NiF8” e a linhagem de cana selvagem “Iriomote 8”, a linhagem de progênie “KY08-129” resultante do cruzamento entre a variedade de cana-de-açúcar “NiTn18” e a variedade de cana-de-açúcar “NiN24” e as 154 linhagens de progênie resultante do cruzamento entre “KY09-6092” e “KY08-129.”

[0135]Neste exemplo, os dados lidos obtidos da mesma maneira que no Exemplo 1, exceto para o uso dos iniciadores diretos mostrados na Tabela 12 em vez dos iniciadores diretos mostrados na Tabela 5 para a preparação da biblioteca de DNA para um sequenciador de próxima geração foram analisados usando software analítico (GRAS-Di, Toyota Motor Corporation) para obter os dados do genótipo de

57.444 marcadores. Tabela 12

[0136]Entre eles, foram obtidos 2.936 genótipos de KY09-6092 e 1.877 genótipos de KY08-129. Os dados do mapa genético compreendendo 117 grupos de ligação derivados de “KY09-6092” e os dados do mapa genético compreendendo 123 grupos de ligação derivados de “KY08-129” foram obtidos. Além disso, os dados do teste de resistência a smut das 154 linhagens de progênie resultantes do cruzamento entre “KY09-6092” e “KY08-129” foram obtidos nas mesmas condições que no Exemplo 1, e os resultados do cálculo da morbidade de smut foram mostrados na Fig.

19. Com base nos dados do mapa genético e nos dados do teste de resistência a smut, a análise de QTL foi realizada pelo método de mapeamento de intervalo composto (CIM) usando o software de análise de genes QTL Cartographer (http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/cartographer.html ) O limite LOD foi determinado como 2,5.

[0137]Como resultado, a presença de QTL ligado à resistência a smut da cana-de-açúcar foi confirmada em uma região de aproximadamente 12,27 cM incluindo os marcadores AMP0063683 a AMP0091501 no 8º grupo de ligação de “KY09-6092” (Tabela 13 e Fig. 20). Quando o valor que indica o efeito é negativo, o QTL está vinculado a uma característica de melhorar a resistência a smut. Tabela 13

[0138]Conforme mostrado na Tabela 13 e Fig. 20, o intervalo incluindo os marcadores AMP0063683 a AMP0091501 no 8º grupo de ligação observado neste exemplo exibiu um valor LOD significativamente mais alto e efeitos significativamente melhorados, em comparação com aqueles descritos em WO 2012/147635. Os marcadores incluídos na região QTL ligada à resistência a smut da cana-de-açúcar confirmada neste exemplo (ou seja, AMP0063683, AMP0082090, AMP0013802, AMP0083204, AMP0043774, AMP0094596 e AMP0091501) foram selecionados como marcadores de seleção (Tabela 14). Tabela 14

[0139]Entre os marcadores mostrados na Tabela 14, o produto de PCR de AMP0063683 é 200 bp ou maior.

Assim, AMP0063683 é definido como uma região de ácido nucleico que compreende Read 1 (SEQ ID NO: 144) e Read 2 (SEQ ID NO: 145) com as sequências de nucleotídeos sendo determinadas usando o sequenciador de próxima geração em ambas as extremidades.

[0140]Se genótipos dos marcadores ou não; ou seja, as amostras de linhagem, os marcadores de seleção foram determinados designando o limite de cada número de leituras como 10, avaliando como “presente” quando o número de leituras é 10 ou mais, e avaliando como “ausente” quando o número de leituras é menor que 10 (Figs. 21 a 27, Tabela 15). Tabela 15

[0141]Conforme mostrado na Tabela 15 e Figs. 21 a 27, as amostras de linhagens com baixa morbidade de smut têm um número significativamente maior de marcadores do que as amostras de linhagens com alta morbidade de smut. Isso demonstra que regiões de ácido nucleico contínuas selecionadas de uma região de aproximadamente 12,27 cM compreendendo AMP0063683, AMP0082090, AMP0013802, AMP0083204, AMP0043774, AMP0094596 e AMP0091501 podem ser usadas como os marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar. Exemplo 4

[0142]Neste exemplo, a sequência de nucleotídeos da região de aproximadamente 8,4 cM compreendendo o marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar derivada de JW90 identificada no Exemplo 1 foi comparada com a sequência de nucleotídeos da região de aproximadamente 12,27 cM compreendendo o marcador associado à resistência de smut da cana-de-açúcar derivado de Iriomote 8 identificado no Exemplo 3. Como resultado, a região adjacente compreendendo AMP0121265 localizada a 0 cM entre os marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar derivada de JW90 identificada no Exemplo 1 e a região adjacente compreendendo AMP0091501 localizada a 83,76 cM entre os marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar derivada de Iriomote 8 identificados no Exemplo 3 foram encontrados para compreender uma pluralidade de marcadores tendo a sequência de nucleotídeos idêntica.

[0143]A Tabela 16 resume os marcadores incluídos na região adjacente compreendendo AMP0121265 localizado a 0 cM entre os marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar derivada de JW90 identificada no Exemplo 1. A Tabela 17 resume os marcadores incluídos na região adjacente compreendendo AMP0091501 localizado a 83,76 cM entre os marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar derivado de Iriomote 8 identificado no Exemplo 3. Nas Tabelas 16 e 17, a coluna que indica as informações da sequência de nucleotídeos dos marcadores mostra as sequências de nucleotídeos das sequências contíguas quando as sequências contíguas podem ser conduzidas a partir de um par de dados lidos obtidos por meio de análise usando um sequenciador de próxima geração ou um par de sequências lidas (a sequência lida 1 e a sequência lida 2) quando a sequência contígua não pode ser conduzida. Especificamente, os marcadores mostrados nas Tabelas 16 e 17 podem ser definidos pelas sequências de nucleotídeos das sequências contíguas ou pelas sequências de nucleotídeos da sequência lida 1 e da sequência lida 2.

[0144]Entre os marcadores mostrados na Tabela 16, em relação aos marcadores tendo a sequência de nucleotídeos idêntica com os marcadores incluídos na região adjacente, incluindo AMP0179276 mostrado na Tabela 17, a coluna indicando “Presença ou ausência de marcador de DNA derivado de Iriomote 8 (): Iriomote 8 marcador ID” mostra “Presente” e ID do marcador derivado de Iriomote 8 tendo a sequência de nucleotídeos idêntica. Da mesma forma, entre os marcadores mostrados na Tabela 17, em relação aos marcadores com a sequência de nucleotídeos idêntica com os marcadores incluídos na região adjacente, incluindo

AMP0121265 mostrado na Tabela 16, a coluna indicando “Presença ou ausência de marcador de DNA derivado de JW90 (): JW90 marcador ID” mostra “Presente” e ID do marcador derivado de JW90 tendo a sequência de nucleotídeos idêntica.

Tabela 16

Tabela 17

[0145]Conforme mostrado na Tabela 16, a região adjacente compreendendo AMP0121265 localizada a 0 cM entre os marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar derivada de JW90 foi encontrada para compreender 36 marcadores.

Conforme mostrado na Tabela 17, a região adjacente compreendendo AMP0091501 localizada a 83,76 cM entre os marcadores associados à resistência a smut da cana-de-açúcar derivada de Iriomote 8 demonstrou compreender 18 marcadores. Entre eles, 5 marcadores demonstraram compreender a sequência de nucleotídeos idêntica. Com base em tais resultados, a região que compreende os 36 marcadores mostrados na Tabela 16 e a região que compreende os 18 marcadores mostrados na Tabela 17 podem ser consideradas como QTLs que estão altamente correlacionados com a resistência a smut da cana-de-açúcar. Em particular, o JW90 e o Iriomote 8 têm o QTL de resistência a smut da cana-de-açúcar identificado neste exemplo. Consequentemente, esse QTL é considerado presente em uma ampla gama de variedades de cana-de-açúcar, sem limitação particular.

[0146]Em particular, este exemplo demonstra que os 36 marcadores mostrados na Tabela 16 e os 18 marcadores mostrados na Tabela 17 podem ser usados como marcadores particularmente excelentes associados à resistência a smut da cana-de-açúcar.

[0147]Entre os 36 marcadores mostrados na Tabela 16 e os 18 marcadores mostrados na Tabela 17, além disso, 5 marcadores que demonstraram ter a sequência de nucleotídeos idêntica (ou seja, AMP0016471 (SEQ ID NO: 298) = AMP0020554 (SEQ ID NO: 248), AMP0036426 (SEQ ID NO: 303) = AMP0045000 (SEQ ID NO: 270), AMP0046626 (SEQ ID NO: 307) = AMP0057239 (SEQ ID NO: 271), AMP0052709 (SEQ ID NO: 311) = AMP0062853 (SEQ ID NO: 273), e AMP0091501 (SEQ ID NO: 316) = AMP0111891 (SEQ ID NO: 292)) foram considerados úteis como os marcadores mais excelentes associados à resistência a smut da cana-de-açúcar.

[0148]Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes citados neste documento são incorporados neste documento por referência em sua totalidade.

Claims (9)

REIVINDICAÇÕES

1. Marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar, CARACTERIZADO pelo fato de que consiste em uma região contínua de ácido nucleico existente em uma região entre a sequência de nucleotídeos, conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 e a sequência de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NO: 6, uma região entre a sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 135 e a sequência de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NO: 143, ou uma região entre a sequência de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NO: 144 ou 145 e a sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 151 de um cromossomo de cana-de-açúcar.

2. Marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a região de ácido nucleico compreende qualquer sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NOs: 1 a 6, 135 a 143 e 144 a 151 ou uma parte da sequência de nucleotídeos.

3. Marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a região de ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NO: 1 ou 2 de um cromossomo de cana-de-açúcar ou uma parte da sequência de nucleotídeos.

4. Marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a região de ácido nucleico compreende qualquer sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NOs: 138 a 140 de um cromossomo de cana-de-açúcar ou uma parte da sequência de nucleotídeos.

5. Marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a região de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NO: 149 ou 151 de um cromossomo de cana-de-açúcar ou uma parte da sequência de nucleotídeos.

6. Marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a região de ácido nucleico compreende qualquer sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NOs: 298, 303, 307, 311 e 316 de um cromossomo de cana-de-açúcar ou uma parte da sequência de nucleotídeos.

7. Método para produzir uma linhagem de cana-de-açúcar com resistência aprimorada a smut, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: uma etapa de extração de um cromossomo de uma planta progênie obtida de plantas parentais, pelo menos uma das quais é uma planta de cana-de-açúcar e/ou um cromossomo de uma planta parental de cana-de-açúcar; e uma etapa de determinação da presença ou ausência do marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, no cromossomo obtido.

8. Método para produzir linhagem de cana-de-açúcar, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de determinação envolve o uso de um chip de DNA que compreende uma sonda correspondente ao marcador associado à resistência a smut da cana-de-açúcar.

9. Método para produzir uma linhagem de cana-de-açúcar, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a planta de progênie é uma semente ou muda jovem e o cromossomo é extraído da semente ou muda jovem.