WO2016148275A1 - イチゴ属植物の四季成り性関連マーカーとその利用 - Google Patents

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WO2016148275A1
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strawberry
strawberry genus
marker
genus plant
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弘明 小石原
宏征 榎
村松　正善
西村　哲
進 由比
正憲 本城
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トヨタ自動車株式会社
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/04—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection
    • A01H1/045—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection using molecular markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a seasonality-related marker capable of selecting a strawberry genus plant line showing seasonality and a method for using the same.
  • DNA markers also referred to as genetic markers or genetic markers
  • development of DNA markers is progressing not only in model plants such as Arabidopsis thaliana and rice, but also in various practical plants, which is very useful in breeding.
  • Strawberries form flower buds in autumn at low temperatures / short days, and bloom and fruit in the next spring, and naturally cultivate flower buds even in long days / high temperatures. It is also known to be a seasonal variety that bears fruit. As the latter, for example, varieties such as “summer berry” are known. Since the seasonal varieties can meet the demand when the seasonal varieties cannot be harvested, the development of better seasonal varieties is required.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 use the F1 progeny obtained by crossing the seasonal varieties “Everberry” and the seasonal varieties “Toyonoka”, and are involved in the seasonal varieties. It is said that the RAPD marker related to the gene to be identified was identified. However, the RAPD markers disclosed in Non-Patent Documents 1 and 2 have a problem that the degree of linkage with the four-season sex gene is weak, the selection efficiency is inferior, and it is not suitable for practical use.
  • Patent Document 1 discloses a DNA marker that sits in the vicinity of a strawberry seasoning gene, a primer for amplifying the marker, and a method for easily determining seasoning and seasoning using the marker. Is disclosed.
  • the DNA marker disclosed in Patent Document 1 is an ISSR marker and has a problem that it is inferior in convenience and discrimination accuracy. For example, when the DNA marker disclosed in Patent Document 1 is amplified, a plurality of bands appear for one specimen. However, there is a problem that the target band and the other bands are very close to each other and are difficult to read, and the selection level is low because the degree of chaining is not strong against the seasonal phenotype. There is.
  • Non-Patent Document 3 discloses an SSR marker that is strongly linked to the seasonality.
  • the SSR marker disclosed in Non-Patent Document 3 requires an expensive high-precision electrophoresis apparatus for analysis, and has been a problem that it cannot be used by simple examination.
  • the present invention has developed a large number of DNA markers for polyploidy and complicated genome structure of Strawberry genus plants, and uses these many DNA markers to determine the seasonality with high accuracy. It is an object of the present invention to provide a seasonality related marker that can be used and a method for using the same.
  • the present inventors prepared a large number of markers in the strawberry genus plant, and by the quantitative analysis of the hybrid progeny line and the linkage analysis between the markers, The chain marker was found and the present invention was completed.
  • the present invention includes the following. (1) A strawberry genus plant seasonality-related marker comprising a continuous nucleic acid region sandwiched between the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the chromosome of a strawberry genus plant. (2) The nucleic acid region includes any one of a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 5 or a part of the base sequence. Related marker. (3) The nucleic acid region is located in a region sandwiched between the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the chromosome of the strawberry genus plant. Four seasons related marker.
  • the present invention it is possible to provide a novel strawberry genus plant seasonality-related marker that is linked to quaternary nature among traits in strawberry plants.
  • the strawberry genus plant seasonality related marker according to the present invention it is possible to test the seasonality of the strawberry genus plant mating line. Thereby, the Strawberry genus plant line which shows seasonality can be identified at a very low cost.
  • FIG. 5 is an electrophoresis photograph showing the results of PCR using a primer that specifically amplifies the marker IB204594R for the progeny (A population) of “Miyazaki Natsuka Haruka” and “08 and ⁇ f”.
  • FIG. 5 is an electrophoresis photograph showing the results of PCR using a primer that specifically amplifies the marker IB204594R for the progeny (A population) of “Miyazaki Natsuka Haruka” and “08 and ⁇ f”.
  • FIG. 6 is an electrophoresis photograph showing the results of PCR using a primer that specifically amplifies the marker IBA38559 for the progeny (cross population A) of “Miya Miyazaki Haruka” and “08 and ⁇ f”.
  • FIG. 6 is an electrophoresis photograph showing the results of PCR using a primer that specifically amplifies the marker IBA38559 for the progeny (cross population A) of “Miya Miyazaki Haruka” and “08 and ⁇ f”.
  • the strawberry genus plant seasonality related marker according to the present invention is a specific region existing on the chromosome of a strawberry genus plant, and has a function capable of discriminating a trait of strawberry genus plant seasonality. That is, in a progeny line obtained using a known strawberry genus plant, it can be determined whether or not it is a quasi-genital line by confirming the presence / absence of a strawberry genus quaternity-related marker. .
  • seasonality means that in flower cultivation in Japanese natural conditions, after flowering in spring, flower buds are differentiated again under high-temperature long-day conditions from spring to early summer, and flowering also occurs from summer to autumn.
  • the determination of seasonality is performed based on the presence or absence of flowering in summer and autumn under natural conditions as described above, and plants are cultivated under artificial long-day conditions (16 to 24 hours). It can also be performed by a method for examining the presence or absence of flowering.
  • a strawberry genus plant seasonality-related marker is a marker linked to a trait that indicates seasonality. For example, in a specific strawberry genus plant, if there is a strawberry genus plant seasonality-related marker, it can be determined that the variety shows seasonality. In particular, the strawberry genus seasonality-related marker is considered to be a region linked to the causal gene (group) of the strawberry genus seasonality trait.
  • the strawberry genus plant is meant to include all plants belonging to the genus Fragaria L. That is, examples of the Strawberry genus plant include hybrids such as Dutch strawberry (Fragaria ⁇ ananassa) which is a general cultivated strawberry.
  • Strawberry genus plants include F. virginiana and F. chiloensis, Ezoxa strawberry (F. iinumae), white snake strawberry (F. nipponica), F. nilgerrensis, which are ancestors of cultivated strawberries.
  • wild species such as F.colanubicola, F. bucharica, F. daltoniana, F. orientalis, F. corimbosa, F. moschata and F. iturupensis.
  • a strawberry genus plant it is the meaning also including the known varieties and strains in cultivated strawberries (F. F x ananassa).
  • cultivated strawberries F. F x ananassa
  • Known varieties / lines of cultivated strawberries are not particularly limited, and include all varieties / lines that can be used in Japan, varieties / lines that are used outside of Japan, and the like.
  • cultivated strawberry cultivated varieties in Japan are not particularly limited, but toyoka, Santigo, pure berry, Nyoho, Peace Toro, Linda Mall, Tochiotome, Ice Toro, Tochinomine, Akihime, Beni Hoppe, Tochi Hime, Sachinoka, Keikise, Sagahonoka, Iberry, Karenberry, Red Pearl, Otome Satsuma, Fukuoka S6 (Amaou), Ninohime, Hinone, and Hyocho Precocious.
  • group should just be a strawberry genus plant in which any one of a mother book and a father's book mentioned above, the system
  • the progeny line may be obtained by so-called backcrossing.
  • the new cultivar is a cultivar obtained from at least one parent having a strawberry seasonality.
  • the strawberry genus plant seasonality related marker according to the present invention is a genetic linkage map comprising 8,218 markers obtained from the strawberry cultivar “Miyazaki Natsuka Haruka” and 8,039 markers obtained from the strawberry line “08 and -f”. It was newly identified by QTL (Quantitative Trait Loci) analysis using strawberry seasoning data. Genetic analysis software QTL Cartographer (Wang S., C. J. Basten, and Z.-B. Zeng (2010). Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC) The Composite interval mapping (CIM) method is applied.
  • a region where the rod score (LOD score) is a predetermined threshold (for example, 2.5) or more was found in the gene linkage map.
  • This region was about 5.5 cM (centiorgan), and was a region included in the 20th linkage group of “Miyazaki Natsuki Haruka”.
  • Morgan (M) is a unit that relatively indicates the distance between genes on a chromosome, and is a value obtained by setting the cross value as a percentage.
  • 1 cM corresponds to about 400 kb.
  • a peak with a rod score of about 47.4 is present, suggesting that a causative gene (group) of the strawberry genus plant is present at or near the peak position.
  • This 5.5cM region contains the five types of markers shown in Table 1 in this order.
  • the marker name is a name given to the marker uniquely acquired in the present invention.
  • the strawberry genus plant seasonality-related marker according to the present invention is a continuous nucleic acid region sandwiched between the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the chromosome of the strawberry genus plant.
  • the peak contained in the 5.5 cM region is present in a region sandwiched by a marker (IBA38559) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a marker (IB204594R) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4. .
  • the five types of markers shown in Table 1 include both a marker linked to a trait that exhibits seasonality (contract marker) and a marker linked to a trait that does not exhibit seasonality (reciprocal marker).
  • the marker consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (IB303507R)
  • the marker consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 (IB204594R)
  • the marker consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 IB303642R
  • the other is a reciprocal marker linked to the trait showing the seasonality.
  • a strawberry genus plant seasonality related marker according to the present invention it is preferable to use a deduction marker.
  • the continuous nucleic acid region included in the 5.5 cM region shown in Table 1 can be used as a strawberry genus plant seasonality-related marker.
  • the nucleic acid region is such that the identity with other regions existing in the chromosome of the strawberry genus plant is 95% or less, preferably 90% or less, more preferably 80% or less, and most preferably 70% or less. This means a region consisting of a simple base sequence. If the identity between the nucleic acid region serving as a strawberry genus plant seasonality-related marker and another region is in the above range, the nucleic acid region can be specifically detected according to a conventional method.
  • the identity value can be calculated using default parameters using, for example, BLAST.
  • the base length of the nucleic acid region serving as a strawberry genus plant seasonality-related marker is at least 8 bases or more, preferably 15 bases or more, more preferably 20 bases or more, and most preferably 30 bases in length. it can. If the base length of the nucleic acid region serving as a strawberry genus plant seasonality-related marker is within the above range, the nucleic acid region can be specifically detected according to a conventional method.
  • the strawberry genus plant seasonality related marker is not limited to the continuous nucleic acid region sandwiched between the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and A continuous nucleic acid region sandwiched by the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, a base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a continuous nucleic acid region sandwiched by the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 A continuous nucleic acid region sandwiched by the base sequence shown, a base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a continuous nucleic acid region sandwiched by the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, a base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a base sequence shown in SEQ ID NO: 4 A continuous nucleic acid region sandwiched by a base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a base sequence shown in SEQ ID NO: 3 A
  • the strawberry genus plant seasonality-related marker is selected from the region sandwiched between the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 among the five types of markers contained in the 5.5 cM region. It is preferred that This is because the peak exists in a region sandwiched between the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the strawberry genus plant seasonality-related marker can be a nucleic acid region containing one type of marker selected from the five types of markers shown in Table 1 above.
  • a nucleic acid region containing a marker IB204594R
  • the base sequence of the nucleic acid region containing the marker can be specified by an adjacent sequence acquisition method such as inverse PCR using a primer designed based on the base sequence of the marker.
  • a plurality of regions can be used as the strawberry genus plant seasonality related marker.
  • the above-mentioned five kinds of markers can be used as strawberry genus plant seasonality related markers. That is, one or a plurality of regions selected from five regions consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 5 can be used as the strawberry genus plant seasonality-related marker.
  • a marker IBA38559 consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and / or a marker (IB204594R) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 close to the peak position is used. It is preferable. Alternatively, it is more preferable to use a marker (IB204594R) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 closest to the peak position as the strawberry genus plant seasonality related marker.
  • the strawberry genus seasonality related marker is identified from 8,218 markers obtained from the strawberry variety “Miyazaki Natsuka Haruka” and 8,039 markers obtained from the strawberry line “08 and -f”. did. Here, these 8,218 and 8,039 markers will be described.
  • a DNA microarray to which the methods disclosed in JP 2011-120558 A and International Publication 2011/074510 are applied can be used.
  • the design method of the probe used for the DNA microarray first extracts genomic DNA from “Miyazaki Natsuki Haruka” or “08 and -f” (step 1a). Next, the extracted genomic DNA is digested with one or more restriction enzymes (step 1b).
  • genomic DNA is digested using two types of restriction enzymes, restriction enzyme A and restriction enzyme B, in this order.
  • restriction enzyme is not particularly limited, and for example, PstI, EcoRI, HindIII, BstNI, HpaII, HaeIII and the like can be used.
  • the restriction enzyme can be appropriately selected in consideration of the appearance frequency of the recognition sequence so that a genomic DNA fragment having a length of 20 to 10,000 bases is obtained when the genomic DNA is completely digested.
  • a plurality of restriction enzymes it is preferable that the genomic DNA fragment after using all restriction enzymes has a length of 200 to 6000 bases.
  • the order of restriction enzymes to be used for the treatment is not particularly limited, and when the processing conditions (solution composition, temperature, etc.) are common, a plurality of restriction enzymes are used in the same reaction system. May be used in That is, in the example shown in FIG.
  • restriction enzyme A and restriction enzyme B are used in this order to digest genomic DNA, but restriction enzyme A and restriction enzyme B are simultaneously used in the same reaction system.
  • Genomic DNA may be digested, or genomic DNA may be digested using restriction enzyme B and restriction enzyme A in this order. Further, the number of restriction enzymes used may be 3 or more.
  • an adapter is bound to the genomic DNA fragment after the restriction enzyme treatment (step 1c).
  • the adapter is not particularly limited as long as it can bind to both ends of the genomic DNA fragment obtained by the restriction enzyme treatment described above.
  • a primer that has a single strand complementary to the protruding ends (sticky ends) formed at both ends of genomic DNA by restriction enzyme treatment, and is used in the amplification process described in detail later Having a primer binding sequence capable of hybridizing can be used.
  • the adapter one having a single strand complementary to the protruding end (adhesive end) and having a restriction enzyme recognition site for incorporation into a vector for cloning can also be used.
  • a plurality of adapters corresponding to each restriction enzyme can be prepared and used. That is, a plurality of adapters having a single strand complementary to each of a plurality of types of protruding ends generated when genomic DNA is digested with a plurality of restriction enzymes can be used.
  • the plurality of adapters corresponding to the plurality of restriction enzymes may have a common primer binding sequence so that a common primer can hybridize, or different primers can hybridize with each other. May have different primer binding sequences.
  • the adapter when digesting genomic DNA using a plurality of restriction enzymes, may be one restriction enzyme selected from the plurality of restriction enzymes used or a part of the restriction enzymes used. A corresponding adapter can also be prepared and used.
  • a genomic DNA fragment with adapters added to both ends is amplified (step 1d).
  • the genomic DNA fragment can be amplified by using a primer that can hybridize to the primer binding sequence.
  • a genomic DNA fragment to which an adapter has been added can be cloned into a vector using the adapter sequence, and the genomic DNA fragment can be amplified using a primer that can hybridize to a predetermined region in the vector.
  • PCR can be used as an example of the amplification reaction of a genomic DNA fragment using a primer.
  • genomic DNA fragments obtained by treatment with multiple restriction enzymes An adapter will be connected to all of these.
  • all the genomic DNA fragments obtained can be amplified by performing a nucleic acid amplification reaction using the primer binding sequence contained in the adapter.
  • genomic DNA is digested using a plurality of restriction enzymes, and one restriction enzyme selected from the plurality of restriction enzymes used or an adapter corresponding to a part of the restriction enzymes used is used.
  • one restriction enzyme selected from the plurality of restriction enzymes used or an adapter corresponding to a part of the restriction enzymes used is used.
  • the base sequence of the amplified genomic DNA fragment is determined (step 1e), and one or more regions having a base length shorter than the genomic DNA fragment and covering at least a part of the genomic DNA fragment are identified. Then, the specified region or regions are designed as probes in the cultivated strawberry (step 1f).
  • the method for determining the base sequence of the genomic DNA fragment is not particularly limited, and a conventionally known method using a DNA sequencer to which the Sanger method or the like is applied can be used.
  • the region to be designed is, for example, 20 to 100 bases long, preferably 30 to 90 bases long, more preferably 50 to 75 bases long as described above.
  • DNA microarrays can be made. By using the thus prepared DNA microarray, it is possible to identify 8,218 and 8,039 markers including the five kinds of strawberry genus plant seasonality-related markers shown in SEQ ID NOs: 1 to 5 described above.
  • the present inventors have described the DNA microarray described above for 8,218 markers obtained from the strawberry cultivar “Miyazaki Natsuka Haruka”, strawberry lines “08 and -f” and their progeny lines (147 lines). Signal data was acquired using. And genotype data is obtained from the obtained signal data, and based on this genotype data, genetic map creation software AntMap (Iwata H, Ninomiya S (2006) AntMap: constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm (Breed Sci 56: 371-378) was used to calculate the position information of the marker on the chromosome using the genetic distance calculation formula Kosambi.
  • AntMap Iwata H, Ninomiya S (2006) AntMap: constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm (Breed Sci 56: 371-378) was used to calculate the position information of the marker on the chromosome using the genetic distance calculation formula Kosambi.
  • ⁇ Use of strawberry genus plants seasonality-related markers By using the strawberry genus plant seasonality-related marker, it is possible to determine whether the strawberry genus plant whose seasonality is unknown (for example, a progeny line) is a system showing the seasonality.
  • using a strawberry genus plant seasonality-related marker includes a form using a method of specifically amplifying a nucleic acid fragment containing the marker and a form using a DNA microarray having a probe corresponding to the marker. Meaning.
  • the method of specifically amplifying a nucleic acid fragment containing the strawberry genus plant seasonality-related marker means using a so-called nucleic acid amplification method.
  • the nucleic acid amplification method include a method using a primer designed to specifically amplify a target nucleic acid fragment, and a method of specifically amplifying a target nucleic acid fragment without using a primer.
  • the primer that specifically amplifies a target nucleic acid fragment means an oligonucleotide that can amplify a nucleic acid fragment containing the strawberry genus plant seasonality-related marker defined as described above by a nucleic acid amplification method.
  • the nucleic acid amplification method using a primer is not particularly limited, and any method may be used as long as it amplifies a nucleic acid fragment typified by a PCR (Polymerase Chain Reaction) method.
  • RCA RollingRCircle Amplification
  • CPT Cycling Probe Technology
  • ICAN Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic Acids
  • LAMP Loop-Mediated Isothermal Amplificaton of
  • SDA Strand Displacement Amplification
  • NASBA Nucleic acid Sequence-based Amplification method
  • TMA Transcription mediated amplification method
  • a pair of primers is designed so as to interpose the strawberry genus seasonality related marker in the strawberry genus chromosome.
  • four types of primers are designed so as to sandwich the strawberry genus plant seasonality-related marker in the strawberry genus chromosome.
  • the nucleic acid amplification method without using a primer is not particularly limited, and examples thereof include an LCR (LigaseigChain Reaction) method.
  • LCR LiigaseigChain Reaction
  • a plurality of oligonucleotides that hybridize to a nucleic acid fragment containing a strawberry genus quaternary sex-related marker are designed.
  • nucleic acid amplification method when the strawberry genus plant seasonality-related marker is present in the strawberry genus plant to be examined, a nucleic acid fragment containing the marker can be obtained as an amplification product.
  • a desired nucleic acid fragment is amplified by a nucleic acid amplification method using a chromosome extracted from a strawberry genus plant as a template as a template, it is determined that the strawberry genus plant to be examined has seasonality. be able to.
  • a method of observing specific fluorescence by subjecting the solution after amplification reaction to agarose electrophoresis and binding a fluorescent intercalator such as Ethidium Bromide or SYBR Green nucleic acid Examples include adding a fluorescent intercalator to the amplification reaction solution and performing fluorescence detection after the amplification reaction, performing nucleic acid amplification reaction using a fluorescently labeled primer, and performing fluorescence detection after the amplification reaction, etc. Can do.
  • the base length of the amplified fragment containing the marker varies depending on the principle of the nucleic acid amplification method, etc., for example, 30 to 10,000 base lengths.
  • the length is preferably 50 to 5000 bases, more preferably 70 to 2000 bases.
  • a plurality of strawberry genus plants may be detected. That is, a plurality of regions selected from the nucleic acid region sandwiched between the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the chromosome of the strawberry genus plant are used as the strawberry genus plant seasonality related markers, Plant seasonality-related markers may be detected. For example, a plurality of regions selected from five regions consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 5 may be used as the strawberry genus plant seasonality-related markers, and these plurality of regions may be detected.
  • a region consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 3 (IBA38559) and a region consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4 (IB204594R) are used as strawberry genus plant seasonality-related markers, respectively, and these regions are obtained by nucleic acid amplification. Amplification can be made to confirm the presence or absence of a strawberry genus plant seasonality-related marker.
  • a region sandwiched between a region consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 3 (IBA38559) and a region consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4 (IB204594R) is used as a strawberry genus plant seasonality-related marker, and this region is nucleic acid amplified. It can be amplified by the method and the presence or absence of the strawberry genus plant seasonality related marker can be confirmed.
  • the probe is a stringent to the strawberry genus plant quaternary sex-related marker defined above.
  • the DNA microarray having the probe may be any microarray using a flat substrate such as glass or silicone as a carrier, a bead array using a microbead as a carrier, or a three-dimensional microarray in which a probe is fixed to the inner wall of a hollow fiber. It may be a type of microarray.
  • genomic DNA is extracted from the strawberry genus plant.
  • This strawberry genus plant is a strawberry genus plant whose phenotype is unknown and / or a parent strawberry genus plant used to produce a progeny line, such as a progeny line. It is a strawberry genus plant for which it is determined whether it has a trait such as excellent in
  • the extracted genomic DNA is digested with the restriction enzymes used in preparing the DNA microarray described in the above section ⁇ Identification of Markers in Strawberry Plant> to prepare a plurality of genomic DNA fragments.
  • the obtained genomic DNA fragment is ligated to the adapter used in preparing the DNA microarray.
  • the genomic DNA fragment with adapters added to both ends is amplified using the primers used in preparing the DNA microarray. Thereby, the genomic DNA fragment derived from the strawberry genus plant corresponding to the genomic DNA fragment amplified in step 1d when preparing the DNA microarray can be amplified.
  • a predetermined genomic DNA fragment may be selectively amplified among the genomic DNA fragments to which the adapter is added.
  • a genomic DNA fragment to which a specific adapter is added can be selectively amplified.
  • the adapter is added by adding the adapter only to the genomic DNA fragment having a protruding end corresponding to the predetermined restriction enzyme. Genomic DNA fragments can be selectively amplified. Thus, it can concentrate by selectively amplifying a predetermined genomic DNA fragment.
  • a label is added to the amplified genomic DNA fragment.
  • Any conventionally known substance may be used as the label.
  • the label for example, fluorescent molecules, dye molecules, radioactive molecules and the like can be used.
  • This step can be omitted by using a nucleotide having a label in the step of amplifying the genomic DNA fragment. This is because the amplified DNA fragment is labeled by amplifying the genomic DNA fragment using a nucleotide having a label in the above step.
  • the genomic DNA fragment having the label is brought into contact with the DNA microarray under predetermined conditions, and the probe immobilized on the DNA microarray and the genomic DNA fragment having the label are hybridized.
  • high stringency conditions for hybridization.
  • Stringency conditions can be adjusted by reaction temperature and salt concentration. That is, higher stringency conditions are achieved at higher temperatures, and higher stringency conditions are achieved at lower salt concentrations. For example, when a probe having a length of 50 to 75 bases is used, higher stringency conditions can be obtained by setting the hybridization conditions to 40 to 44 ° C., 0.2% SDS, and 6 ⁇ SSC.
  • hybridization between the probe and the genomic DNA fragment having a label can be detected based on the label. That is, after the hybridization reaction of the genomic DNA fragment having the above-described label and the probe, the unreacted genomic DNA fragment is washed, and then the label of the genomic DNA fragment specifically hybridized to the probe is observed. .
  • the label is a fluorescent substance
  • the fluorescence wavelength is detected
  • the label is a dye molecule
  • the dye wavelength is detected.
  • an apparatus such as a fluorescence detection apparatus or an image analyzer that is used for normal DNA microarray analysis can be used.
  • the strawberry genus plant seasonality-related marker is linked to the traits such as quasi-seasonality, so if the strawberry genus plant seasonality-related marker exists, It can be judged.
  • the presence or absence of a strawberry genus plant seasonality-related marker in the parent varieties used for mating can be determined, and a parent cultivar with excellent seasonality can be selected. It is expected that progeny lines with excellent seasonality will appear frequently by creating a progeny line with priority using parent varieties with excellent seasonality. Thereby, the number which cultivates an excellent system
  • DNA Ligase (NEB, 200 unit) was added, and a ligation reaction was performed at 16 ° C. for 1 hour, then at 55 ° C. for 20 minutes, and then at 37 ° C. for 30 minutes.
  • restriction enzyme BstNI (NEB, 6 units) was added to the treated sample and treated at 60 ° C. for 1 hour.
  • Quantitative trait loci (QTL) analysis Based on the genetic map data obtained in (1) above and the four seasons test data obtained in (2) above, genetic analysis software QTL Cartographer (Wang S., CJ Basten, and Z.-B. Zeng (2010). Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC) and QTL by the Composite interval mapping (CIM) method. Analysis was performed. The LOD threshold was 2.5. As a result, the presence of a gene related to the strawberry seasoning having a LOD value of 47.4 was confirmed in the section from the markers IB303507R to IB303642R of the 20th linkage group of “Miyazaki Natsuka Haruka” (Table 2, FIG. 4). (4) Selection of selection marker A marker around the strawberry four seasons gene region in the 20th linkage group from 0 cM to 5.45 cM was selected as a selection marker (Fig. 4, Table 1).
  • the effect column indicates the influence of the gene linked to this marker on the seasonality (four seasons probability 1, one season probability 0). That is, when the numerical value is positive, it means that the gene acts in a direction in which the strawberry individual expresses the seasonality.
  • Genomic DNA was newly extracted from the strawberry cultivars “Miyazaki Natsuka Haruka”, “08 and -f” and Group A using the Dneasy Plant Mini kit (QIAGEN).
  • Restriction enzyme treatment and adapter ligation After the extracted genomic DNA (150 ng) was treated with restriction enzyme PstI (NEB, 5unit) at 37 ° C for 1 hour, the PstI sequence adapter (5'-CACGATGGATCCAGTGCA-3 '(SEQ ID NO: 6), 5'-CTGGATCCATCGTGCA-3' (SEQ ID NO: 7)) and T4 DNA Ligase (NEB, 200 units) were added, treated at 16 ° C for 1 hour, then at 55 ° C for 20 minutes, Treated at 37 ° C.
  • Primer preparation Primer 3 was used to prepare primers that identify IB204594R from the sequence information (SEQ ID NO: 4) of IB204594R (S40884 _v1F: CCGGAGTACATGGTAACCTATGC (SEQ ID NO: 9), S40884 _v1R: TTTTCTGCCTCGGTCATCTG (SEQ ID NO: 10)).
  • IB204594R is a reciprocal marker that is not found in the system showing seasonality.
  • FIGS. 9-1 and 9-2 what is enclosed by a square means a seasonal phenotype.
  • the M lane indicates “Miyazaki Natsuka Haruka”
  • the Z lane indicates “08 and ⁇ f”.
  • FIGS. 9A and 9B the underline indicates a case where the phenotype and the PCR base marker result do not match.
  • the coincidence rate between the band pattern and the phenotype is very high (96.7%), and the nucleic acid amplification method using a primer that specifically amplifies IB204594R is used for the four seasons. It was clarified that it is possible to select a system that exhibits sex and a system that exhibits seasonal characteristics.
  • FIGS. 10-1 and 10-2 and FIGS. 11-1 and 11-2 respectively.
  • a box surrounded by a square means a phenotype of seasonality.
  • the M lane indicates “Miyazaki Natsuka Haruka”
  • the Z lane indicates “08 and ⁇ f”.
  • the coincidence rate between the band pattern and the phenotype is very high (95.6%), and the nucleic acid amplification method using a primer that specifically amplifies IBA38559 is effective for the four seasons. It was clarified that it is possible to select a system that exhibits sex and a system that exhibits seasonal characteristics.

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Abstract

　イチゴ属植物について多数のDNAマーカーを開発し、これら多数のDNAマーカーを用いることで四季成り性を高精度に判定する。イチゴ属植物の染色体における配列番号１に示す塩基配列及び配列番号５に示す塩基配列により挟まれる連続する核酸領域からなる、イチゴ属植物四季成り性関連マーカー。

Description

イチゴ属植物の四季成り性関連マーカーとその利用
　本発明は、四季成り性を示すイチゴ属植物系統を選抜することができる四季成り性関連マーカー及びその利用方法に関する。
　DNAマーカー（遺伝マーカーや遺伝子マーカーとも称される）の開発により、植物の品種改良において、有用形質や不良形質の有無を迅速に且つ効率的に判別することが可能となっている。DNAマーカーの開発は、シロイヌナズナやイネといったモデル植物のみならず、様々な実用植物においても進展しており、品種改良において大いに役立っている。
　イチゴには、秋の低温/短日で花芽を形成し、翌春に開花・結実する一季成り性品種と、長日/高温でも自然に花芽を分化するため、春に加えて夏から秋にかけても結実する四季成り性品種とが知られている。後者としては、例えば「サマーベリー」等の品種が知られている。四季成り性品種は、一季成り性品種の収穫ができない時期の需要に対応することができるため、より優れた四季成り性品種の開発が求められている。
　非特許文献１及び２には、四季成り性品種である「エバーベリー」と一季成り性品種である「とよのか」を交配して得られたF1後代を使用して、四季成り性に関与する遺伝子に関するRAPDマーカーを同定したとある。ただし、非特許文献１及び２に開示されたRAPDマーカーは、四季成り性遺伝子との連鎖程度が弱く、選抜効率が劣り、実用に向かないといった問題がある。
　また、特許文献１には、イチゴの四季成り性遺伝子の近傍に座乗するDNAマーカー、該マーカーを増幅するためのプライマー、該マーカーを利用した四季成り性と一季成り性を簡便に判定する方法が開示されている。特許文献１に開示されたDNAマーカーは、ISSRマーカーであり、簡便性や判別精度が劣る点が問題である。例えば、特許文献１に開示されたDNAマーカーを増幅すると、１つの検体につき複数のバンドが出現する。しかし、目的のバンドとそれ以外のバンドが非常に近接しており判読が困難である問題があり、更に四季成り性の表現型に対して連鎖程度も強くないことから、選抜精度が低いといった問題がある。
　さらに、非特許文献３には、四季成り性に強く連鎖するSSRマーカーが開示されている。非特許文献３に開示されたSSRマーカーは、解析に高価な高精度電気泳動装置が必要であり、簡便な検査により利用できるものでは無いことが問題であった。
Sugimoto et al. (2005) Plant Breeding 124:498-501 山元ら（2003）近畿中国四国農業研究2：42-44 本城ら（2011）育種学研究13（別2）:265
特開２００６－４２６２２号公報
　ところが、イチゴ属植物における四季成り性に関するDNAマーカー技術は、LOD値や寄与率が高いとは言えず、優れたマーカーとは評価できなかった。
　そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、多倍数性で複雑なゲノム構造のイチゴ属植物について多数のDNAマーカーを開発し、これら多数のDNAマーカーを用いることで四季成り性を高精度に判定することができる四季成り性関連マーカー及びその利用方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、イチゴ属植物における多数のマーカーを準備し、交雑後代系統における量的形質とマーカーとの連鎖解析によって、四季成り性に連鎖するマーカーを見いだし、本発明を完成するに至った。
　本発明は以下を包含する。
（１）イチゴ属植物の染色体における配列番号１に示す塩基配列及び配列番号５に示す塩基配列により挟まれる連続する核酸領域からなる、イチゴ属植物四季成り性関連マーカー。
（２）上記核酸領域は、配列番号１～５からなる群から選ばれるいずれか１の塩基配列又は当該塩基配列の一部を含むことを特徴とする（１）記載のイチゴ属植物四季成り性関連マーカー。
（３）上記核酸領域は、イチゴ属植物の染色体における配列番号３に示す塩基配列と配列番号４に示す塩基配列とにより挟み込まれる領域に位置することを特徴とする（１）記載のイチゴ属植物四季成り性関連マーカー。
（４）少なくとも一方の親がイチゴ属植物である後代植物の染色体及び/又は当該親のイチゴ属植物の染色体を抽出する工程と、
　上記で得られた染色体における上記（１）乃至（３）いずれか１に記載のイチゴ属植物四季成り性関連マーカーの存在・非存在を判定する工程とを含む、四季成り性を示すイチゴ属植物系統の製造方法。
（５）上記判定する工程では、上記イチゴ属植物四季成り性関連マーカーを特異的に増幅するプライマーを用いた核酸増幅反応により当該イチゴ属植物四季成り性関連マーカーの存在・非存在を判定することを特徴とする（４）記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
（６）上記判定する工程では、上記イチゴ属植物四季成り性関連マーカーに対応するプローブを備えるDNAチップを使用することを特徴とする（４）記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
（７）上記後代植物は種子又は幼苗であり、当該種子又は幼苗から染色体を抽出することを特徴とする（４）記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2015-054707号及び日本国特許出願2016-42009号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
　本発明によれば、イチゴ属植物における形質の中でも四季成り性に連鎖する新規なイチゴ属植物四季成り性関連マーカーを提供することができる。本発明に係るイチゴ属植物四季成り性関連マーカーを利用することによって、イチゴ属植物の交配系統における四季成り性を検定することができる。これにより、四季成り性を示すイチゴ属植物系統を非常に低コストに識別することができる。
イチゴ属植物染色体のマーカーを得る際に使用したDNAマイクロアレイの製造フローを示す模式図である。 DNAマイクロアレイを使用したシグナル検出の工程を示す模式図である。 「みやざきなつはるか」と「０８と－ｆ」との交雑後代について四季成り性を調査した結果を示す特性図である。 四季成り性に関するQTL解析の結果（「０８と－ｆ」における第２０連鎖群）を示す特性図である。 「みやざきなつはるか」と「０８と－ｆ」との交雑後代（Ａ集団）、「みやざきなつはるか」と「おおきみ」との交雑後代（Ｂ集団）について、四季成り性を調査した結果を示す特性図である。 「みやざきなつはるか」と「０８と－ｆ」との交雑後代（Ａ集団）、「みやざきなつはるか」と「おおきみ」との交雑後代（Ｂ集団）について、四季成り性を調査した結果を示す特性図である。 「みやざきなつはるか」と「０８と－ｆ」との交雑後代（Ａ集団）における、イチゴ四季成り性関連マーカーのアレイシグナル値とＡ集団の表現型とを比較した結果を示す特性図である。 「みやざきなつはるか」と「０８と－ｆ」との交雑後代（Ａ集団）における、イチゴ四季成り性関連マーカーのアレイシグナル値とＡ集団の表現型とを比較した結果を示す特性図である。 「みやざきなつはるか」と「０８と－ｆ」との交雑後代（Ａ集団）における、イチゴ四季成り性関連マーカーのアレイシグナル値とＡ集団の表現型とを比較した結果を示す特性図である。 「みやざきなつはるか」と「０８と－ｆ」との交雑後代（Ａ集団）について、マーカーIB204594Rを特異的に増幅するプライマーを用いたPCRの結果を示す電気泳動写真である。 「みやざきなつはるか」と「０８と－ｆ」との交雑後代（Ａ集団）について、マーカーIB204594Rを特異的に増幅するプライマーを用いたPCRの結果を示す電気泳動写真である。 「みやざきなつはるか」と「おおきみ」との交雑後代（Ｂ集団）について、マーカーIB204594Rを特異的に増幅するプライマーを用いたPCRの結果を示す電気泳動写真である。 「みやざきなつはるか」と「おおきみ」との交雑後代（Ｂ集団）について、マーカーIB204594Rを特異的に増幅するプライマーを用いたPCRの結果を示す電気泳動写真である。 「みやざきなつはるか」と「０８と－ｆ」との交雑後代（Ａ集団）、「みやざきなつはるか」と「おおきみ」との交雑後代（Ｂ集団）について、マーカーIB204594Rを特異的に増幅するプライマーを用いたPCRの結果をまとめた特性図である。 「みやざきなつはるか」と「０８と－ｆ」との交雑後代（Ａ集団）、「みやざきなつはるか」と「おおきみ」との交雑後代（Ｂ集団）について、マーカーIB204594Rを特異的に増幅するプライマーを用いたPCRの結果をまとめた特性図である。 「みやざきなつはるか」と「０８と－ｆ」との交雑後代（Ａ集団）について、マーカーIBA38559を特異的に増幅するプライマーを用いたPCRの結果を示す電気泳動写真である。 「みやざきなつはるか」と「０８と－ｆ」との交雑後代（Ａ集団）について、マーカーIBA38559を特異的に増幅するプライマーを用いたPCRの結果を示す電気泳動写真である。 「みやざきなつはるか」と「おおきみ」との交雑後代（Ｂ集団）について、マーカーIBA38559を特異的に増幅するプライマーを用いたPCRの結果を示す電気泳動写真である。 「みやざきなつはるか」と「おおきみ」との交雑後代（Ｂ集団）について、マーカーIBA38559を特異的に増幅するプライマーを用いたPCRの結果を示す電気泳動写真である。 「みやざきなつはるか」と「０８と－ｆ」との交雑後代（Ａ集団）、「みやざきなつはるか」と「おおきみ」との交雑後代（Ｂ集団）について、マーカーIBA38559を特異的に増幅するプライマーを用いたPCRの結果をまとめた特性図である。 「みやざきなつはるか」と「０８と－ｆ」との交雑後代（Ａ集団）、「みやざきなつはるか」と「おおきみ」との交雑後代（Ｂ集団）について、マーカーIBA38559を特異的に増幅するプライマーを用いたPCRの結果をまとめた特性図である。
　以下、本発明に係るイチゴ属植物四季成り性関連マーカー及びその利用方法、特にイチゴ属植物四季成り性関連マーカーを用いたイチゴ属植物系統の製造方法について説明する。
＜イチゴ属植物四季成り性関連マーカー＞
　本発明に係るイチゴ属植物四季成り性関連マーカーとは、イチゴ属植物の染色体上に存在する特定の領域であり、イチゴ属植物四季成り性という形質を判別できる機能を有する。すなわち、既知のイチゴ属植物を用いて得られた後代系統において、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーの存在・非存在を確認することで四季成り性系統であるか否かを判断することができる。なお、本発明において、四季成り性とは、日本の自然条件下における露地栽培において、春季に開花したのち、春季から初夏にかけての高温長日条件下において再び花芽分化し、夏季～秋季にかけても開花が認められる形質をさす。四季成り性の判定は、上述のとおり自然条件下における夏季～秋季の開花の有無に基づいて行われるほかに、人為的な長日条件下（16～24時間日長）で植物体を栽培し、開花の有無を調べる方法によっても行うことができる。
　イチゴ属植物四季成り性関連マーカーとは、四季成り性を示す形質に連鎖するマーカーの意味である。例えば、特定のイチゴ属植物において、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーが存在していれば四季成り性を示す品種と判断できる。特に、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーは、イチゴ属植物の四季成り性形質の原因遺伝子（群）に連鎖した領域と考えられる。
　ここで、イチゴ属植物とは、バラ科イチゴ属(Fragaria L.)に属する植物の全てを含む意味である。すなわち、イチゴ属植物としては、一般的な栽培イチゴであるオランダイチゴ(Fragaria × ananassa)等の交雑種を挙げることができる。また、イチゴ属植物としては、栽培イチゴの祖先種となるF. virginiana並びにF. chiloensis、エゾクサイチゴ（F. vesca）、ノウゴウイチゴ（F. iinumae）、シロバナノヘビイチゴ（F. nipponica）、F. nilgerrensis、F. nubicola、F. bucharica、F. daltoniana、F. orientalis、F. corimbosa、F. moschata及びF. iturupensis等の野生種を挙げることができる。さらに、イチゴ属植物としては、栽培イチゴ（F. × ananassa）における既知の品種・系統も含む意味である。栽培イチゴにおける既知の品種・系統としては、特に限定されず、日本国内にて使用可能なあらゆる品種・系統、日本国外において使用されている品種・系統等を含む意味である。例えば、栽培イチゴの日本国内育成品種としては、特に限定されないが、とよのか、サンチーゴ、純ベリー、女峰、ピーストロ、リンダモール、とちおとめ、アイストロ、栃の峰、章姫、紅ほっぺ、とちひめ、さちのか、けいきわせ、さがほのか、アイベリー、カレンベリー、レッドパール、さつまおとめ、福岡S6（あまおう）、濃姫、ひのみね及び宝交早生等を挙げることができる。
　イチゴ属植物四季成り性関連マーカーの存在・非存在を確認する対象の植物としては、上述したイチゴ属植物、上述したイチゴ属植物を利用した後代系統とすることができる。後代系統は、母本及び父本のいずれか一方が上述したイチゴ属植物であればよく、いわゆる同種交配による系統であっても良いし、種間交雑系統であっても良い。また、後代系統は、いわゆる戻し交配によって得られたものでも良い。
　特に、栽培イチゴ（F. × ananassa）を対象として、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーの存在・非存在を確認することが好ましい。さらに、栽培イチゴの中でも上述した各種の品種・系統を用いた品種改良において、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーの存在・非存在を確認することが好ましい。すなわち、この場合、作出した新品種についてイチゴ四季成り性を判別することができる。よって、新品種としては、イチゴ四季成り性を有する品種を少なくとも一方の親として得た品種であることが好ましい。
　本発明に係るイチゴ属植物四季成り性関連マーカーは、イチゴ品種「みやざきなつはるか」から取得した8,218個のマーカー及びイチゴ系統「０８と－ｆ」から取得した8,039個のマーカーを含む遺伝子連鎖地図と、イチゴ四季成り性データとを用いたQTL（Quantitative Trait Loci）解析によって新たに同定されたものである。QTL解析には、遺伝解析ソフトQTL Cartographer（Wang S., C. J. Basten, and Z.-B. Zeng (2010). Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC）を使用し、Composite interval mapping（CIM）法を適用している。
　具体的に、上述したQTL解析により、ロッドスコア（LOD score）が所定の閾値（例えば2.5）以上となる領域を上記遺伝子連鎖地図に見いだした。この領域は約5.5cM（センチモルガン）であり、「みやざきなつはるか」の第２０連鎖群に含まれる領域であった。ここで、「モルガン（Ｍ）」は、染色体上の遺伝子間の距離を相対的に示した単位であり、交叉価をパーセントにした値である。イチゴ属植物の染色体において、1cMは、約400kbに相当する。なお、この領域には、ロッドスコアが約47.4のピークが存在しており、当該ピーク位置又はその近傍にイチゴ属植物四季成り性を発現させる形質の原因遺伝子（群）が存在することが示唆される。
　この5.5cMの領域には、表１に示す５種類のマーカーがこの順で含まれている。なお、表１において、マーカー名とは、本発明で独自に取得したマーカーに付された名称である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　すなわち、本発明に係るイチゴ属植物四季成り性関連マーカーは、イチゴ属植物の染色体における配列番号１に示す塩基配列及び配列番号５に示す塩基配列により挟まれる連続する核酸領域である。ここで、上記5.5cMの領域に含まれるピークは、配列番号３に示す塩基配列からなるマーカー（IBA38559）及び配列番号４に示す塩基配列からなるマーカー（IB204594R）により挟み込まれる領域に存在している。
　また、表１に示す５種類のマーカーには、四季成り性を示す形質に連鎖するマーカー（相引マーカー）と、四季成り性を示さない形質に連鎖するマーカー（相反マーカー）の両者を含んでいる。配列番号１に示す塩基配列からなるマーカー（IB303507R）、配列番号４に示す塩基配列からなるマーカー（IB204594R）及び配列番号５に示す塩基配列からなるマーカー（IB303642R）は、四季成り性を示さない形質に連鎖する相反マーカーであり、その他は四季成り性を示す形質に連鎖する相引マーカーである。特に、本発明に係るイチゴ属植物四季成り性関連マーカーとしては相引マーカーを使用することが好ましい。
　表１に示した5.5cMの領域に含まれる連続した核酸領域を、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーとして使用することができる。ここで、核酸領域とは、イチゴ属植物の染色体に存在する他の領域との同一性が９５％以下、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、最も好ましくは７０％以下となるような塩基配列からなる領域を意味する。イチゴ属植物四季成り性関連マーカーとなる核酸領域と他の領域との同一性が上記範囲であれば、定法に従って、当該核酸領域を特異的に検出することができる。ここで、同一性の値は、例えばＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出することができる。
　また、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーとなる核酸領域の塩基長は、少なくとも８塩基長以上、好ましくは１５塩基長以上、より好ましくは２０塩基長以上、最も好ましくは３０塩基長とすることができる。イチゴ属植物四季成り性関連マーカーとなる核酸領域の塩基長が上記範囲であれば、定法に従って、当該核酸領域を特異的に検出することができる。
　さらに、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーとしては、配列番号１に示す塩基配列及び配列番号５に示す塩基配列により挟まれる連続する核酸領域に限定されず、例えば、配列番号１に示す塩基配列及び配列番号４に示す塩基配列により挟まれる連続する核酸領域、配列番号１に示す塩基配列及び配列番号３に示す塩基配列により挟まれる連続する核酸領域、配列番号１に示す塩基配列及び配列番号２に示す塩基配列により挟まれる連続する核酸領域、配列番号２に示す塩基配列及び配列番号５に示す塩基配列により挟まれる連続する核酸領域、配列番号２に示す塩基配列及び配列番号４に示す塩基配列により挟まれる連続する核酸領域、配列番号２に示す塩基配列及び配列番号３に示す塩基配列により挟まれる連続する核酸領域、配列番号３に示す塩基配列及び配列番号５に示す塩基配列により挟まれる連続する核酸領域、配列番号３に示す塩基配列及び配列番号４に示す塩基配列により挟まれる連続する核酸領域、配列番号４に示す塩基配列及び配列番号５に示す塩基配列により挟まれる連続する核酸領域であってもよい。
　特に、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーとしては、上記5.5cMの領域に含まれる５種類のマーカーのうち、配列番号３に示す塩基配列と配列番号４に示す塩基配列とにより挟み込まれる領域から選ばれることが好ましい。上記ピークが配列番号３に示す塩基配列と配列番号４に示す塩基配列とにより挟み込まれる領域に存在するためである。
　また、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーとしては、上記表１に示した５種類のマーカーから選ばれる１種類のマーカーを含む核酸領域とすることもできる。例えば、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーとしては、ピークの位置に最も近い配列番号４に示す塩基配列からなるマーカー（IB204594R）を含む核酸領域を使用することが好ましい。このとき、マーカーを含む核酸領域の塩基配列は、当該マーカーの塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いたインバースPCR等の隣接配列取得法によって特定することができる。
　さらに、イチゴ属植物の染色体における配列番号１に示す塩基配列及び配列番号５に示す塩基配列により挟まれる核酸領域から、複数の領域をイチゴ属植物四季成り性関連マーカーとすることもできる。
　さらにまた、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーとしては、上記５種類のマーカーそのものを使用することができる。すなわち、配列番号１～５の塩基配列からなる５個の領域から選ばれる１又は複数の領域をイチゴ属植物四季成り性関連マーカーとすることができる。例えば、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーとしては、ピークの位置に近い配列番号３に示す塩基配列からなるマーカー（IBA38559）及び/又は配列番号４に示す塩基配列からなるマーカー（IB204594R）を使用することが好ましい。或いは、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーとしては、ピークの位置に最も近い配列番号４に示す塩基配列からなるマーカー（IB204594R）を使用することがより好ましい。
＜イチゴ属植物におけるマーカーの同定＞
　本発明では、上述したように、イチゴ品種「みやざきなつはるか」から取得した8,218個のマーカー及びイチゴ系統「０８と－ｆ」から取得した8,039個のマーカーからイチゴ属植物四季成り性関連マーカーを特定した。ここでは、これら8,218個と8,039個のマーカーについて説明する。このマーカーを同定する際には、特開2011-120558号公報や国際公開公報2011/074510に開示された方法を適用したDNAマイクロアレイを使用することができる。
　具体的に、当該DNAマイクロアレイに使用するプローブの設計方法は、図１に示すように、先ず、「みやざきなつはるか」或いは「０８と－ｆ」からゲノムDNAを抽出する（工程1a）。次に、抽出したゲノムDNAを１又は複数の制限酵素により消化する（工程1b）。なお、図１に示した例では、制限酵素Ａ及び制限酵素Ｂの２種類の制限酵素をこの順で用いてゲノムDNAを消化している。ここで、制限酵素としては、特に限定されないが、例えば、PstI、EcoRI、HindIII、BstNI、HpaII、HaeIII等を使用することができる。特に制限酵素としては、ゲノムDNAを完全に消化した際に20～10000塩基長のゲノムDNA断片となるよう、認識配列の出現頻度等を考慮して適宜選択することができる。また、複数の制限酵素を使用する場合、全ての制限酵素を使用した後のゲノムDNA断片が200～6000塩基長となっていることが好ましい。さらに、複数の制限酵素を使用する場合、処理に供する制限酵素の順序は特に限定されず、また、処理条件（溶液組成や温度等）が共通する場合には複数の制限酵素を同一の反応系で使用しても良い。すなわち、図１に示した例においては、制限酵素Ａ及び制限酵素Ｂをこの順で使用してゲノムDNAを消化しているが、制限酵素Ａ及び制限酵素Ｂを同じ反応系で同時に使用してゲノムDNAを消化しても良いし、制限酵素Ｂ及び制限酵素Ａをこの順で使用してゲノムDNAを消化してもよい。さらに、使用する制限酵素の数は３以上であってもよい。
　次に、制限酵素処理後のゲノムDNA断片に対してアダプターを結合する（工程1c）。ここで、アダプターとは、上述した制限酵素処理によって得られたゲノムDNA断片の両端に結合できるものであれば特に限定されない。アダプターとしては、例えば、制限酵素処理によってゲノムDNAの両末端に形成される突出末端（粘着末端）に対して相補的な一本鎖を有し、詳細を後述する増幅処理の際に使用するプライマーがハイブリダイズしうるプライマー結合配列を有するものを使用することができる。また、アダプターとしては、上記突出末端（粘着末端）に対して相補的な一本鎖を有し、クローニングする際のベクターに組み入れるための制限酵素認識部位を有するものを使用することもできる。
　また、複数の制限酵素を使用してゲノムDNAを消化した場合には、各制限酵素に対応する複数のアダプターを準備して使用することができる。すなわち、複数の制限酵素でゲノムDNAを消化した場合に生ずる複数種類の突出末端のそれぞれに対して、相補的な一本鎖を有する複数のアダプターを使用することができる。このとき、複数の制限酵素に対応する複数のアダプターは、共通するプライマーがハイブリダイズできるように共通するプライマー結合配列を有しているものであっても良いし、それぞれ異なるプライマーがハイブリダイズできるように異なるプライマー結合配列を有するものであっても良い。
　さらに、複数の制限酵素を使用してゲノムDNAを消化した場合、アダプターとしては、使用した複数の制限酵素のなかから選ばれる１つの制限酵素若しくは、使用した制限酵素のうち一部の制限酵素に対応するアダプターを準備して使用することもできる。
　次に、両末端にアダプターが付加されたゲノムDNA断片を増幅する（工程1d）。プライマー結合配列を有するアダプターを使用した場合には、当該プライマー結合配列にハイブリダイズできるプライマーを使用することで上記ゲノムDNA断片を増幅することができる。或いは、アダプターを付加したゲノムDNA断片を、アダプター配列を利用してベクターにクローニングし、当該ベクターにおける所定の領域にハイブリダイズできるプライマーを用いてゲノムDNA断片を増幅することができる。なお、プライマーを用いたゲノムDNA断片の増幅反応としては、一例としてPCRを使用することができる。
　また、複数の制限酵素を使用してゲノムDNAを消化するとともに、各制限酵素に対応する複数のアダプターをゲノムDNA断片に連結した場合、複数の制限酵素を用いた処理によって得られたゲノムDNA断片の全てにアダプターが連結されることとなる。この場合、アダプターに含まれるプライマー結合配列を用いて核酸増幅反応を行うことで、得られた全てのゲノムDNA断片を増幅することができる。
　或いは、複数の制限酵素を使用してゲノムDNAを消化するとともに、使用した複数の制限酵素のなかから選ばれる１つの制限酵素若しくは、使用した制限酵素のうち一部の制限酵素に対応するアダプターをゲノムDNA断片に連結した場合、得られたゲノムDNA断片のうち、選ばれた制限酵素の認識配列を両末端に有するゲノムDNA断片のみを増幅することができる。
　次に、増幅されたゲノムDNA断片の塩基配列を決定し（工程1e）、当該ゲノムDNA断片より短い塩基長を有し、ゲノムDNA断片内の少なくとも一部をカバーする１又は複数の領域を特定し、特定した１又は複数の領域を、栽培いちごにおけるプローブとして設計する（工程1f）。ゲノムDNA断片の塩基配列を決定する方法は、特に限定されず、サンガー法等を適用したDNAシークエンサーを利用した従来公知の方法を使用することができる。ここで、設計する領域としては、上述したように、例えば20～100塩基長、好ましくは30～90塩基長、より好ましくは50～75塩基長とする。
　以上のように、栽培いちごから抽出したゲノムDNAを使用して多数のプローブを設計し、設計したプローブの塩基配列に基づいて、担体上にて目的の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成することでDNAマイクロアレイを作製することができる。このように作製したDNAマイクロアレイを使用することで、上述した配列番号１～５に示した５種類のイチゴ属植物四季成り性関連マーカーを含む8,218個と8,039個のマーカーを同定することができる。
　より具体的に、本発明者らは、イチゴ品種「みやざきなつはるか」から取得した8,218個のマーカー、イチゴ系統「０８と－ｆ」及びこれらの交配後代系統（147系統）について、上述したDNAマイクロアレイを用いてシグナルデータを取得した。そして、得られたシグナルデータから遺伝子型データを取得し、この遺伝子型データを元にして、遺伝地図作成ソフトウェアAntMap（Iwata H, Ninomiya S (2006) AntMap: constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm. Breed Sci 56: 371-378）を使用し、遺伝距離計算式Kosambiにより染色体におけるマーカーの位置情報を算出した。さらに、取得したマーカーの位置情報をもとに、Mapmaker/EXP ver.3.0（A Whitehead Institute for Biomedical Research Technical Report, Third Edition, January, 1993）により遺伝地図データシートを作成した。その結果、上述した配列番号１～５に示した５種類のイチゴ属植物四季成り性関連マーカーを含む8,218個と8,039個のマーカーを同定している。
＜イチゴ属植物四季成り性関連マーカーの利用＞
　イチゴ属植物四季成り性関連マーカーを利用することで、四季成り性が未知であるイチゴ属植物（例えば、後代系統）について四季成り性を示す系統であるか判断することができる。ここで、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーを利用するとは、当該マーカーを含む核酸断片を特異的に増幅する方法を利用する形態、当該マーカーに対応するプローブを有するDNAマイクロアレイを利用する形態を含む意味である。
　イチゴ属植物四季成り性関連マーカーを含む核酸断片を特異的に増幅する方法とは、いわゆる核酸増幅法を利用することを意味する。核酸増幅法としては、目的とする核酸断片を特異的に増幅するように設計したプライマーを使用する方法、プライマーを使用することなく目的とする核酸断片を特異的に増幅する方法が挙げられる。
　目的とする核酸断片を特異的に増幅するプライマーとは、核酸増幅法によって、上述のように定義されたイチゴ属植物四季成り性関連マーカーを含む核酸断片を増幅できるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーを使用する核酸増幅法としては、特に限定されず、PCR(Polymerase Chain Reaction)法に代表される核酸断片を増幅させるものであればどのようなものでもかまわない。例えば、PCR法以外に、RCA(Rolling Circle Amplification)法、CPT(Cycling Probe Technology)法、ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic Acids)法、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplificaton of DNA)法、SDA(Strand Displacement Amplification)法、NASBA(Nucleic acid Sequence-based Amplification method)法、及びTMA(Transcription mediated amplification method)法等の公知の方法が例示できるが、これらに限定されるものではない。
　これら核酸増幅反応のうち例えばPCR法を利用する場合、イチゴ属植物の染色体におけるイチゴ属植物四季成り性関連マーカーを挟み込むように一対のプライマーを設計する。また、LAMP法を利用する場合、イチゴ属植物の染色体におけるイチゴ属植物四季成り性関連マーカーを挟み込むように４種類のプライマーを設計する。
　プライマーを使用しない核酸増幅法としては、特に限定されないが、LCR(Ligase Chain Reaction)法を挙げることができる。ただし、LCR法においても、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーを含む核酸断片にハイブリダイズする複数のオリゴヌクレオチドを設計する。
　以上のように、核酸増幅法によれば、検査対象のイチゴ属植物に上記イチゴ属植物四季成り性関連マーカーが存在している場合、当該マーカーを含む核酸断片を増幅産物として得ることができる。言い換えると、検査対象のイチゴ属植物から抽出した染色体を鋳型とした核酸増幅法によって所期の核酸断片が増幅された場合には、当該検査対象のイチゴ属植物が四季成り性を有すると判断することができる。
　増幅した核酸断片を検出するには、特に限定されないが、増幅反応後の溶液をアガロース電気泳動にかけ、Ethidium BromideやSYBR Greenなどの蛍光性インターカレーターを結合させ特異的な蛍光を観察する方法、核酸増幅反応の溶液に蛍光性インターカレーターを添加し、増幅反応後の蛍光検出を行う方法、蛍光標識されたプライマーを用いて核酸増幅反応を行い、増幅反応後の蛍光検出を行う方法等を挙げることができる。
　なお、核酸増幅法を利用してイチゴ属植物四季成り性関連マーカーを検出する場合、当該マーカーを含む増幅断片の塩基長は、核酸増幅方法の原理等によっても異なるが、例えば30～10000塩基長とすることができ、50～5000塩基長とすることが好ましく、70～2000塩基長とすることがより好ましい。
　また、イチゴ属植物における四季成り性を判定する際、複数のイチゴ属植物四季成り性関連マーカーを検出しても良い。すなわち、イチゴ属植物の染色体における配列番号１に示す塩基配列及び配列番号５に示す塩基配列により挟まれる核酸領域から選ばれる複数の領域をイチゴ属植物四季成り性関連マーカーとし、これら複数のイチゴ属植物四季成り性関連マーカーを検出しても良い。例えば、配列番号１～５の塩基配列からなる５個の領域から選ばれる複数の領域をイチゴ属植物四季成り性関連マーカーとし、これら複数の領域を検出しても良い。
　一例としては、配列番号３の塩基配列からなる領域（IBA38559）と配列番号４の塩基配列からなる領域（IB204594R）とをそれぞれイチゴ属植物四季成り性関連マーカーとし、これら各領域を核酸増幅法により増幅してイチゴ属植物四季成り性関連マーカーの存否を確認することができる。或いは、一例として配列番号３の塩基配列からなる領域（IBA38559）と配列番号４の塩基配列からなる領域（IB204594R）とで挟み込まれる領域をイチゴ属植物四季成り性関連マーカーとし、この領域を核酸増幅法により増幅してイチゴ属植物四季成り性関連マーカーの存否を確認することができる。
　一方、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーに対応するプローブを有するDNAマイクロアレイを利用する形態において、当該プローブとは、上述のように定義されたイチゴ属植物四季成り性関連マーカーに対して、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを意味する。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、上述のように定義されたイチゴ属植物四季成り性関連マーカーの塩基配列又はその相補鎖の少なくとも連続する１０塩基、１５塩基、２０塩基、２５塩基、３０塩基、３５塩基、４０塩基、４５塩基、５０塩基又はそれ以上の塩基長の部分領域若しくは全領域として設計することができる。なお、このプローブを有するDNAマイクロアレイとしては、ガラスやシリコーン等の平面基板を担体とするマイクロアレイや、マイクロビーズを担体とするビーズアレイ、或いは中空繊維の内壁にプローブを固定する３次元マイクロアレイ等の如何なるタイプのマイクロアレイであってもよい。
　以上のように作製されたDNAマイクロアレイを使用することで、後代系統等に代表される四季成り性の表現型が未知のイチゴ属植物について、四季成り性を示すといった表現型を示す系統であるか判断することができる。なお、上述したDNAマイクロアレイを使用する方法以外であっても、従来公知の手法を用いて上述したイチゴ属植物四季成り性関連マーカーを検出して、供試イチゴ属植物について四季成り性に優れるという形質を有する系統であるか判断してもよい。DNAマイクロアレイを使用する方法以外の方法としては、例えば、上述したプローブを用いた、いわゆるFISH（fluorescence in situ hybridization）法を適用することができる。
　DNAマイクロアレイを使用する方法をより詳細に説明する。図２に示すように、先ず供試イチゴ属植物からゲノムDNAを抽出する。この供試イチゴ属植物とは、後代系統等の四季成り性の表現型が未知のイチゴ属植物及び/又は後代系統を作製する際に使用した親のイチゴ属植物のことであり、四季成り性に優れるといった形質を有するか判定する対象となるイチゴ属植物である。
　次に、抽出したゲノムDNAを、上記＜イチゴ属植物におけるマーカーの同定＞の欄で説明したDNAマイクロアレイを作製する際に使用した制限酵素で消化して複数のゲノムDNA断片を調整する。次に、得られたゲノムDNA断片と、DNAマイクロアレイを作製する際に使用したアダプターとを連結する。次に、両末端にアダプターが付加されたゲノムDNA断片を、DNAマイクロアレイを作製する際に使用したプライマーを用いて増幅する。これにより、DNAマイクロアレイを作製する際の工程1dで増幅したゲノムDNA断片に対応する、供試イチゴ属植物由来のゲノムDNA断片を増幅することができる。
　この工程においては、アダプターが付加されたゲノムDNA断片のうち、所定のゲノムDNA断片を選択的に増幅してもよい。例えば、複数の制限酵素に対応する複数のアダプターを使用した場合には、特定のアダプターが付加されたゲノムDNA断片を選択的に増幅することができる。また、複数の制限酵素でゲノムDNAを消化した場合、得られたゲノムDNA断片のうち、所定の制限酵素に対応する突出末端を有するゲノムDNA断片のみにアダプターを付加することで、アダプターが付加されたゲノムDNA断片を選択的に増幅することができる。このように、所定のゲノムDNA断片を選択的に増幅することで濃縮することができる。
　次に、増幅したゲノムDNA断片に標識を付加する。標識としては、従来公知の如何なる物質を使用しても良い。標識としては、例えば蛍光分子、色素分子、放射性分子等を使用することができる。なお、本工程は、ゲノムDNA断片を増幅する工程において標識を有するヌクレオチドを用いることで省略することができる。上記工程において標識を有するヌクレオチドを用いてゲノムDNA断片を増幅することで、増幅されたDNA断片が標識化されるためである。
　次に、標識を有するゲノムDNA断片を所定の条件下でDNAマイクロアレイに接触させ、DNAマイクロアレイに固定されたプローブと標識を有するゲノムDNA断片とをハイブリダイズさせる。このとき、ハイブリダイズさせる際には高いストリンジェンシー条件とすることが好ましい。このような高いストリンジェンシー条件とすることによって、供試イチゴ属植物にイチゴ属植物四季成り性関連マーカーが存在しているか否かを、より高精度に判定することができる。なお、ストリンジェンシー条件は、反応温度及び塩濃度で調節することができる。すなわち、より高温とすることでより高いストリンジェンシー条件となり、またより低い塩濃度でより高いストリンジェンシー条件となる。例えば、50～75塩基長のプローブを使用する場合、ハイブリダイゼーション条件としては、40～44℃、0.2%SDS、6×SSCの条件とすることでより高いストリンジェンシー条件とすることができる。
　また、プローブと標識を有するゲノムDNA断片とのハイブリダイズは、標識に基づいて検出することができる。すなわち、上述した標識を有するゲノムDNA断片とプローブのハイブリダイズ反応の後、未反応のゲノムDNA断片等を洗浄し、その後、プローブに対して特異的にハイブリダイズしたゲノムDNA断片の標識を観察する。例えば、標識が蛍光物質である場合にはその蛍光波長を検出し、標識が色素分子であればその色素波長を検出する。より具体的には、通常のDNAマイクロアレイ解析に使用している、蛍光検出装置やイメージアナライザー等の装置を使用することができる。
　以上のように、核酸増幅法を利用する方法或いはDNAマイクロアレイを使用する方法により、供試イチゴ属植物が上述したイチゴ属植物四季成り性関連マーカーを有するか否か判断することができる。ここで、上述したように、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーは四季成り性を示すといった形質に連鎖するため、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーが存在していれば、四季成り性系統・品種と判断できる。
　特に、上述した方法では、供試イチゴ属植物を用いて実際の四季成り性試験を実施する必要はなく、例えば後代系統の種子や当該種子を発芽させた幼苗を使用することができる。したがって、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーを利用することによって、供試イチゴ属植物を生育させるための圃場やその他、生育のためのコストを大幅に削減することができる。また、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーを利用することによって、実際に高温/長日条件下で花芽が形成されるか検討する必要がなく、大規模専用温室や専用圃場、外部との隔離施設など設備等にかかるコストを削減できる。
　特に、イチゴ属植物の新品種作出に際して、先ず、交配により数万種類の交配種を作製した後、実生選抜に先立って若しくは実生選抜に代えて、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーを利用した判断を行うことが好ましい。これにより、実際の圃場において、栽培する個体数を大幅に削減することができ、イチゴ属植物の新品種作出に係る手間やコストを大幅に抑制することができる。
　或いは、イチゴ属植物の新品種作出に際して、先ず、交配に使用する親品種におけるイチゴ属植物四季成り性関連マーカーの存在の有無を判定し、四季成り性に優れた親品種を選抜することもできる。四季成り性に優れた親品種を優先的に使用して後代系統を作出することで、四季成り性に優れた後代系統が高頻度に出現すると期待できる。これにより、優良な系統を栽培する数を大幅に削減することができ、イチゴ属植物の新品種作出に係る手間やコストを大幅に抑制することができる。
　以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
１．DNAマイクロアレイ用プローブの作成
(1)材料
　イチゴ品種「みやざきなつはるか」と「０８と－ｆ」を用いた。
(2)制限酵素処理 
　これらイチゴ品種それぞれについて、Dneasy Plant Mini kit（QIAGEN社）を使用してゲノムDNAを抽出した。抽出したゲノムDNA(150ng)を制限酵素PstI(NEB社、5unit)で37℃、1時間処理した。
(3)アダプターライゲーション 
　(2)で処理したゲノムDNA断片(150ng)にPstI配列アダプター（5’-CACGATGGATCCAGTGCA-3’（配列番号６）、5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’（配列番号７））とT4 DNA Ligase（NEB社、200 unit）を加え、16℃で1時間、その後55℃で20分間、その後37℃で30分間の条件でライゲーション反応を行った。次に、処理したサンプルに制限酵素BstNI（NEB社、6 unit）を添加、60℃で1時間処理した。
(4)PCR増幅
　(3)で得られた、BstNI処理後のサンプル（15ng）にPstI配列アダプター認識プライマー（5’-GATGGATCCAGTGCAG-3’（配列番号８））とTaq polymerase（タカラバイオ社、PrimeSTAR、1.25unit）を加え、PCR（98℃を10秒間、55℃を15秒間、72℃を1分間、30サイクル後、72℃で3分間処理後、4℃で保存）でDNA断片を増幅した。
(5)ゲノムシークエンス取得
　(4)においてPCR増幅したゲノムDNA断片について、Hiseq2000、Miseq（Illumina社）により塩基配列情報を取得した。
(6)プローブ設計及びDNAマイクロアレイの作成
　(5)のゲノムシークエンス情報をもとに50～60bpのプローブを設計した。設計したプローブの塩基配列情報をもとに、これらプローブを有するDNAマイクロアレイを作製した。
２．シグナルデータ取得
(1)材料
　イチゴ品種「みやざきなつはるか」、「０８と－ｆ」及びこれらの交雑後代147系統を用いた。
(2)制限酵素処理
　これらイチゴ品種及び交雑後代からそれぞれゲノムDNAをDneasy Plant Mini kit（QIAGEN社）により抽出した。抽出したゲノムDNA(150ng)を制限酵素PstI(NEB社、6unit)で37℃、1時間処理した。
(3)アダプターライゲーション
　(2)で処理したゲノムDNA断片(150ng)にPstI配列アダプター(5’-CACGATGGATCCAGTGCA-3’（配列番号６）、5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’（配列番号７）)とT4 DNA Ligase(NEB社、200 unit)を加え、16℃で1時間、その後55℃で20分間、その後37℃で30分間の条件でライゲーション反応を行った。次に、処理したサンプルに制限酵素BstNI（NEB社、6 unit）を添加、60℃で1時間処理した。
(4)PCR増幅
　(3)で得られたBstNI処理後のサンプル(15ng)にPstI配列アダプター認識プライマー(5’-GATGGATCCAGTGCAG-3’（配列番号８）)とTaq polymerase(タカラバイオ社PrimeSTAR、1.25unit)を加え、PCR(98℃を10秒間、55℃を15秒間、72℃を1分間を1サイクルとして30サイクル実施後、72℃で3分間処理後、4℃で保存)でゲノムDNA断片を増幅した。
(5)ラベル化
　上述した(4)で増幅したDNA断片をカラム（QIAGEN社）で精製後、 NimbleGen Arrays User’s Guideに従い、NimbleGen One-Color DNA Labeling Kit（ロシュ・ダイアグノステックス社）を用いラベル化した。
(6)ハイブリ・シグナル検出 
　(5)のラベル化サンプルと、上記１．で作製したDNAマイクロアレイとを用いて、アジレントIn-situ オリゴDNAマイクロアレイ キット アレイCGH(aCGH)法に従いハイブリ処理をし、各サンプルのシグナルを検出した。
３．イチゴ四季成り性のQTLの同定、および選抜マーカーの選定
(1)遺伝地図データシート作成
　「みやざきなつはるか」と「０８と－ｆ」との交雑後代147系統のシグナルデータから、「みやざきなつはるか」型の8,218マーカー及び「０８と－ｆ」型の8,039マーカーの遺伝子型データを取得した。遺伝子型データをもとに、遺伝地図作成ソフトAntMap (（Iwata H, Ninomiya S 2006） AntMap: constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm. Breed Sci 56: 371-378）を用い、遺伝距離計算式Kosambiによりマーカーの遺伝地図データを取得した。
(2)イチゴ四季成り性表現型データの取得
　「みやざきなつはるか」と「０８と－ｆ」との交雑後代147系統について、最低気温17℃、24時間日長条件下にあるハウス内において栽培し開花の有無を調べることによって季性を判定した（図３）。四季成り性については、この実験条件にて花芽を形成したものを「四季成り」とし、花芽を形成しなかったものを「一季成り」とした。
(3)量的形質 （quantitative trait loci：QTL）の解析
　上記(1)で得られた遺伝地図データ及び上記(2)で得られた四季成り性試験データをもとに、遺伝解析ソフトQTL Cartographer （Wang S., C. J. Basten, and Z.-B. Zeng (2010). Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC）を使い、Composite interval mapping （CIM）法により、QTL解析を行った。LODの閾値は2.5を用いた。その結果、「みやざきなつはるか」の第２０連鎖群のマーカーIB303507RからIB303642Rの区間にLOD値が47.4のイチゴ四季成り性に関する遺伝子の存在を確認した（表２、図４）。
(4)選抜マーカーの選定
　第２０連鎖群の0cM～5.45cMの区間にあるイチゴ四季成り性遺伝子領域周辺のマーカーを選抜マーカーとして選定した（図４、表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　なお、表２において効果の欄は、本マーカーが連鎖している遺伝子が季性（四季成り性1、一季成り性0）に及ぼす影響をあらわしている。すなわち、数値が正である場合、イチゴ個体が四季成り性を発現する方向に遺伝子が作用することを意味している。
　そして、図４に示すように、当該ピークの近傍に位置するマーカーは、四季成り性の発現に関与する原因遺伝子（群）と連鎖して遺伝するため、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーとして使用できることが示された。すなわち、図４に示した５種類のマーカーは、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーとして使用できることが明らかとなった。
４．未知系統の選抜
(1)イチゴ四季成り性表現型データの取得
　上記３．(2)イチゴ四季成り性表現型データの取得で記載した系統とは別に、「みやざきなつはるか」と「０８と－ｆ」との交雑後代種子をハウス内で育苗し（50系統：以降Ａ集団とする）、秋季に野外圃場に定植して、翌年の夏季に自然日長下において季性を調査した。また、「みやざきなつはるか」と「おおきみ」との交雑後代種子（42系統：以降Ｂ集団とする）についても同様に育苗、定植し、翌年夏季に自然日長下において季性を調査した（図５－１及び図５－２）。
(2)ゲノムDNAの抽出
　新たに、イチゴ品種「みやざきなつはるか」、「０８と－ｆ」及びＡ集団について、Dneasy Plant Mini kit（QIAGEN社）によりゲノムDNAを抽出した。
(3)制限酵素処理及びアダプターライゲーション
　抽出したゲノムDNA（150ng）を制限酵素PstI（NEB社、5unit）で37℃、1時間処理後、PstI処理したサンプルにPstI配列アダプター(5’-CACGATGGATCCAGTGCA-3’（配列番号６）、5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’ （配列番号７）)とT4 DNA Ligase（NEB社、200 unit）を加え、16℃で1時間処理後、55℃で20分、その後、37℃で30分処理した。処理したサンプルに制限酵素BstNI（NEB社、6 unit）を添加、60℃で1時間処理した。
(4)DNA断片の増幅
　上記(3)にてBstNI処理したサンプル（15ng）にPstI配列アダプター認識プライマー（5’-GATGGATCCAGTGCAG-3’（配列番号８））とTaq polymerase（タカラバイオ社、PrimeSTAR、1.25 unit）を加え、PCR(98℃を10秒間、55℃を15秒間、72℃を1分間、を1サイクルとして30サイクル実施後、72℃で3分間処理後、4℃で保存)でDNA断片を増幅した。
(5)ラベル化
　上記(4)にて増幅したDNA断片をカラム（QIAGEN社）で精製後、 NimbleGen Arrays User’s Guideに従い、NimbleGen One-Color DNA Labeling Kit（ロシュ・ダイアグノステックス社）を用いラベル化した。
(6)ハイブリ・シグナル検出
　上記(5)で蛍光標識したサンプルと上記１．で作成したアレイを用い、アジレントIn-situ オリゴDNAマイクロアレイ キット アレイCGH (aCGH) 法に従いハイブリ処理をし、各サンプルのシグナルを検出した。
(7)選定した選抜マーカーの検定
　上記Ａ集団中で、イチゴ四季成り性遺伝子領域周辺のマーカーを選定し（表１）、選抜マーカーとしたものでアレイシグナル値とＡ集団の表現型とを比較すると92.0%～98.0%一致していた（図６－１～図６－３）。なお、図６－１～図６－３において、高いアレイシグナル値には下線を付した。これらの結果から、表１に示したマーカーを利用することで、四季成り性を示す系統、一季成り性を示す系統の選抜が可能と考えられた。
５．PCRベースマーカーよる選抜・検定１
(1)ゲノムDNAの抽出
　イチゴ品種「みやざきなつはるか」、「０８と－ｆ」、「おおきみ」、「みやざきなつはるか」と「０８と－ｆ」との交雑後代（Ａ集団）、「みやざきなつはるか」と「おおきみ」との交雑後代（Ｂ集団）について、Dneasy Plant Mini kit（QIAGEN社）によりゲノムDNAを抽出した。
(2)プライマー作製
　PCRプライマー解析ソフトPrimer3を使い、IB204594Rの配列情報（配列番号４）から、IB204594Rを識別するプライマーを作製した（S40884 _v1F： CCGGAGTACATGGTAACCTATGC（配列番号９）、S40884 _v1R： TTTTCTGCCTCGGTCATCTG（配列番号１０））。なお、IB204594Rは、四季成り性を示す系統には見られない相反マーカーである。
(3)PCR増幅と選抜マーカーの検定
　交雑後代Ａ集団、Ｂ集団のゲノムDNA（15 ng）に、上記プライマー（S40884 _v1F及びS40884 _v1R）とTaq polymerase（タカラバイオ社、Tks Gflex DNA Polymerase、1.25 unit）を加え、PCR（94℃で1分間、98℃で10秒間、60℃で15秒間、68℃で30秒間を１サイクルとして30サイクル実施後、4℃で保存）で増幅した。PCR増幅したDNA断片は、TapeStation D1000（アジレント社）により確認した。Ａ集団及びＢ集団について行った結果を図７－１及び図７－２並びに図８－１及び図８－２にそれぞれ示した。なお、図７－１及び図７－２並びに図８－１及び図８－２において、四角で囲ったものは四季成り性の表現型を意味している。なお、図７－１～図８－２において、Ｍのレーンは「みやざきなつはるか」を示し、Ｚのレーンは「０８と－ｆ」を示している。また、これらの結果を図９－１及び図９－２にまとめて示した。なお、図９－１及び図９－２において下線は、表現型とPCRベースマーカーの結果とが一致しなかった場合を示している。図７－１～図９－２に示したように、バンドパターンと表現型の一致率は非常に高く（96.7%）、IB204594Rを特異的に増幅するプライマーを用いた核酸増幅方法により、四季成り性を示す系統、一季成り性を示す系統の選抜ができることが明らかとなった。
６．PCRベースマーカーよる選抜・検定２
(1)ゲノムDNAの抽出
　イチゴ品種「みやざきなつはるか」、「０８と－ｆ」、「おおきみ」、「みやざきなつはるか」と「０８と－ｆ」との交雑後代（Ａ集団）、「みやざきなつはるか」と「おおきみ」との交雑後代（Ｂ集団）について、Dneasy Plant Mini kit（QIAGEN社）によりゲノムDNAを抽出した。
(2)プライマー作製
　PCRプライマー解析ソフトPrimer3を使い、IBA38559の配列情報（配列番号３）から、 、IBA38559を識別するプライマーを作製した（S2430859_v1F： CGCCCATGTCTTGATTCC （配列番号１１）、S2430859_v1R： ATGAATTATTGCGCAGGCT （配列番号１２））。なお、 IBA38559は、四季成り性を示す系統に見られる相引マーカーである。
(3)PCR増幅と選抜マーカーの検定
　交雑後代Ａ集団、Ｂ集団のゲノムDNA（15 ng）に、上記プライマー（S2430859_v1F及びS2430859_v1R）とTaq polymerase（タカラバイオ社、Tks Gflex DNA Polymerase、1.25 unit）を加え、PCR（94℃で1分間、98℃で10秒間、61℃で15秒間、68℃で30秒間を１サイクルとして30サイクル実施後、4℃で保存）で増幅した。PCR増幅したDNA断片は、TapeStation D1000（アジレント社）により確認した。Ａ集団及びＢ集団について行った結果を図１０－１及び図１０－２並びに図１１－１及び図１１－２にそれぞれ示した。なお、図１０－１及び図１０－２並びに図１１－１及び図１１－２において、四角で囲ったものは四季成り性の表現型を意味している。なお、図１０－１～図１１－２において、Ｍのレーンは「みやざきなつはるか」を示し、Ｚのレーンは「０８と－ｆ」を示している。また、これらの結果を図１２－１及び図１２－２にまとめて示した。なお、図１２－１及び図１２－２において下線は、表現型とPCRベースマーカーの結果とが一致しなかった場合を示している。図１０－１～図１２－２に示したように、バンドパターンと表現型の一致率は非常に高く（95.6%）、 IBA38559を特異的に増幅するプライマーを用いた核酸増幅方法により、四季成り性を示す系統、一季成り性を示す系統の選抜ができることが明らかとなった。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (7)

  1. 　イチゴ属植物の染色体における配列番号１に示す塩基配列及び配列番号５に示す塩基配列により挟まれる連続する核酸領域からなる、イチゴ属植物四季成り性関連マーカー。
  2. 　上記核酸領域は、配列番号１～５からなる群から選ばれるいずれか１の塩基配列又は当該塩基配列の一部を含むことを特徴とする請求項１記載のイチゴ属植物四季成り性関連マーカー。
  3. 　上記核酸領域は、イチゴ属植物の染色体における配列番号３に示す塩基配列と配列番号４に示す塩基配列とにより挟み込まれる領域に位置することを特徴とする請求項１記載のイチゴ属植物四季成り性関連マーカー。
  4. 　少なくとも一方の親がイチゴ属植物である後代植物の染色体及び/又は当該親のイチゴ属植物の染色体を抽出する工程と、
    　上記で得られた染色体における請求項１乃至３いずれか一項記載のイチゴ属植物四季成り性関連マーカーの存在・非存在を判定する工程とを含む、四季成り性を示すイチゴ属植物系統の製造方法。
  5. 　上記判定する工程では、上記イチゴ属植物四季成り性関連マーカーを特異的に増幅するプライマーを用いた核酸増幅反応により当該イチゴ属植物四季成り性関連マーカーの存在・非存在を判定することを特徴とする請求項４記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
  6. 　上記判定する工程では、上記イチゴ属植物四季成り性関連マーカーに対応するプローブを備えるDNAチップを使用することを特徴とする請求項４記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
  7. 　上記後代植物は種子又は幼苗であり、当該種子又は幼苗から染色体を抽出することを特徴とする請求項４記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
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