WO2015034040A1 - イチゴ属植物の炭疽病抵抗性関連マーカーとその利用 - Google Patents

イチゴ属植物の炭疽病抵抗性関連マーカーとその利用 Download PDF

Info

Publication number
WO2015034040A1
WO2015034040A1 PCT/JP2014/073460 JP2014073460W WO2015034040A1 WO 2015034040 A1 WO2015034040 A1 WO 2015034040A1 JP 2014073460 W JP2014073460 W JP 2014073460W WO 2015034040 A1 WO2015034040 A1 WO 2015034040A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
strawberry
plant
marker
genus plant
resistance
Prior art date
Application number
PCT/JP2014/073460
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
宏征 榎
西村　哲
百江 水藤
布目　司
裕司 野口
Original Assignee
トヨタ自動車株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by トヨタ自動車株式会社 filed Critical トヨタ自動車株式会社
Priority to US14/917,045 priority Critical patent/US10982292B2/en
Priority to KR1020167005694A priority patent/KR101789948B1/ko
Priority to CN201480047115.4A priority patent/CN105531369B/zh
Priority to EP14842687.7A priority patent/EP3045533B1/en
Publication of WO2015034040A1 publication Critical patent/WO2015034040A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/08—Fruits
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/74—Rosaceae, e.g. strawberry, apple, almonds, pear, rose, blackberries or raspberries
    • A01H6/7409—Fragaria, i.e. strawberries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to an anthracnose resistance-related marker capable of selecting a strawberry genus plant line exhibiting resistance to strawberry anthracnose and a method for using the same.
  • DNA markers also referred to as genetic markers or genetic markers
  • development of DNA markers is progressing not only in model plants such as Arabidopsis thaliana and rice, but also in various practical plants, which is very useful in breeding.
  • Non-patent document 1 reports that an integrated high-density linkage map has been developed for cultivated strawberries.
  • Non-Patent Document 1 although there is a report of a linkage map consisting of about 300 amplifiedafragment length polymorphism (AFLP) markers, it has an octaploid and a complex genome, so it has a higher density for strawberry cultivation.
  • AFLP amplifiedafragment length polymorphism
  • the development of a simple linkage map is desired.
  • a simple sequence repeat marker is developed for F. vessca and F. ⁇ ananassa, and an integrated high-density linkage map is constructed.
  • Non-Patent Document 1 developed 575 markers for 02-19, 556 markers for Sachinoka, 294 markers for Kaorino, 318 markers for Akihime, and 822 markers for 0212921. ing.
  • the integrated high-density linkage map disclosed in Non-Patent Document 1 there are linkage groups that do not have the number of markers to sit on, and this tendency is particularly noticeable in Kaorino and Akihime where the number of markers is small.
  • the integrated high-density linkage map disclosed in Non-Patent Document 1 considers that not all linkage maps are covered.
  • Non-Patent Document 2 describes that a DNA marker linked to strawberry anthrax resistance has been developed in order to efficiently develop a strawberry anthracnose resistant variety.
  • Non-Patent Document 2 describes that a linkage map was prepared using markers by Random Amplified Polymorphic DNA method (RAPD method), AFLP method and SSR method, and disease resistant linkage markers were analyzed.
  • RAPD method Random Amplified Polymorphic DNA method
  • AFLP method AFLP method
  • SSR method SSR method
  • disease resistant linkage markers were analyzed.
  • the breeding population can be reduced to 1/8 by using the strawberry intermediate mother farm No. 2 in the crossed population, and the disease resistant strain can be established with a probability of about 70%. It has been possible to develop a marker that can be distinguished.
  • Glomerella flarengulate and Colletotrichum acutatum are known as causative bacteria for strawberry anthracnose.
  • Patent Document 1 discloses the development of a sugar beet black rot resistant variety selection marker
  • Patent Document 2 discloses a selection technique using a marker linked to a target trait for corn.
  • Non-Patent Document 1 describes the development of an SSR marker and the construction of an integrated high-density linkage map, it is a DNA marker that is linked to the desired trait in strawberry plants with polyploidy and complex genomic structure It was not enough to select.
  • Non-Patent Document 2 describes that a DNA marker linked to strawberry anthracnose disease resistance has been developed, the results of QTL analysis cannot be said to have a high LOD (logarithym of odds) value or contribution rate. , could not be evaluated as an excellent marker.
  • the present invention has developed a large number of DNA markers for polyploidy and complicated genome structure Strawberry genus plants, and by using these many DNA markers, anthracnose resistance is highly accurate. It aims at providing the anthrax resistance related marker which can be determined, and its utilization method.
  • the present inventors have prepared a large number of markers in the strawberry genus plant, and the linkage analysis between the quantitative traits and the markers in the progeny of the hybrid is an anthracnose resistance.
  • the present inventors have completed the present invention by finding a marker linked to the quantitative trait.
  • the present invention includes the following.
  • a strawberry genus plant anthracnose resistance related marker comprising a continuous nucleic acid region sandwiched between the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the chromosome of a strawberry genus plant.
  • nucleic acid region comprises any one of a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 10 or a part of the base sequence Sex related marker.
  • the nucleic acid region is located in a region sandwiched by the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the chromosome of the strawberry genus plant.
  • Anthrax resistance related marker is located in a region sandwiched by the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the chromosome of the strawberry genus plant.
  • the presence / absence of the strawberry plant anthracnose resistance-related marker is measured by a nucleic acid amplification reaction using a primer that specifically amplifies the strawberry plant anthracnose resistance-related marker.
  • the present invention it is possible to provide a novel strawberry genus plant anthracnose resistance-related marker that is linked to anthracnose resistance among quantitative traits in strawberry plants.
  • the strawberry genus plant anthracnose resistance-related marker according to the present invention the anthracnose resistance in the mating line of the strawberry genus plant can be tested.
  • stock which has the characteristic which the anthracnose resistance improved can be identified at a very low cost.
  • FIG. 4 is a characteristic diagram showing comparison between the anthrax resistance data shown in FIG. 3 and the genotype data of the marker IA200826. It is an electrophoresis photograph which shows the result of PCR-amplifying the marker IA202631 and the marker IA200826 in the strawberry cultivar Sachinoka, Strawberry Middle Mother Farm No. 2 and two progeny lines (A and B).
  • the strawberry genus plant anthracnose resistance related marker according to the present invention is a specific region present on the chromosome of the strawberry genus plant, and has a function capable of discriminating the trait of strawberry genus plant anthracnose resistance. That is, in a progeny line obtained using a known strawberry genus plant, it is a line having a trait of improved anthracnose resistance by confirming the presence / absence of a strawberry genus plant anthracnose resistance related marker Judgment can be made.
  • strawberry anthrax is caused by infection of Glomerella cingulate and / or Colletotrichum acutatum as described in Microbiol. Cult. Coll., 25 (1): 27-32, 2009. It means a disease that forms a disease group.
  • strawberry anthrax may be a disease caused by infection with Glomerella cingulata.
  • the strawberry genus plant anthracnose resistance-related marker includes both a marker linked to a trait that improves anthracnose resistance and a marker linked to a trait that reduces anthracnose resistance.
  • the former marker is present, it can be determined that the variety has improved anthrax resistance.
  • the specific strawberry genus plant when the former marker is present and the latter marker is absent, it can be determined with higher accuracy that the variety has improved anthrax resistance.
  • the former strawberry plant anthracnose resistance-related marker is considered to be a region linked to a trait causal gene (group) such as anthracnose resistance of strawberry plants.
  • the strawberry genus plant is meant to include all plants belonging to the genus Fragaria L. That is, examples of the Strawberry genus plant include hybrids such as Dutch strawberry (Fragaria ⁇ ananassa) which is a general cultivated strawberry. Moreover, as a strawberry genus plant, F. virginiana and F. chiloensis, which are ancestors of cultivated strawberries, white snake strawberry (F. vesca), white strawberry (F. iinumae), Mori strawberry (F. nipponica), F. nubicola, Examples include wild species such as F. bucharica, F. daltoniana, F. orientalis, F. corimbosa, F. moschata, and F.
  • a strawberry genus plant it is the meaning also including the known varieties and strains in cultivated strawberries (F. F x ananassa).
  • cultivated strawberries F. F x ananassa
  • Known varieties / lines of cultivated strawberries are not particularly limited, and include all varieties / lines that can be used in Japan, varieties / lines that are used outside of Japan, and the like.
  • cultivated strawberry cultivated varieties in Japan are not particularly limited, but toyoka, Santigo, pure berry, Nyoho, Peace Toro, Linda Mall, Tochiotome, Ice Toro, Tochinomine, Akihime, Beni Hoppe, Tochi Hime, Sachinoka, Keikise, Sagahonoka, Iberry, Karenberry, Red Pearl, Otome Satsuma, Fukuoka S6 (Amaou), Ninohime, Hinone, and Hyocho Precocious.
  • cultivated strawberry varieties there are strawberry intermediate mother farm No. 1 and strawberry intermediate mother farm No. 2, which are intermediate mothers which are breeding materials used for breeding for the purpose of obtaining predetermined characteristics. be able to.
  • anthracnose resistance of Strawberry Middle Mother Honno No. 2 is about the same as or higher than that of resistant cultivars of early mating and Dover, and the incidence of highly resistant individuals in the mating seedling population with susceptible varieties is high. It is used for breeding new varieties having resistance to strawberry anthracnose.
  • a strawberry genus plant described above or a progeny line using the strawberry genus plant described above can be used as a target plant for confirming the presence / absence of the strawberry genus plant anthracnose resistance-related marker.
  • group should just be a strawberry genus plant which either one of a mother book and a father book mentioned above, may be a system
  • the progeny line may be obtained by so-called backcrossing.
  • the new cultivar is a cultivar obtained from at least one parent having strawberry anthracnose resistance. More specifically, for example, for a new cultivar produced with Strawberry Middle Mother Farm 2 as one parent, the presence or absence of a strawberry plant anthracnose resistance related marker is confirmed, and strawberry anthracnose resistance is evaluated. can do.
  • the strawberry genus plant anthracnose resistance-related marker according to the present invention includes a gene linkage map including 1,502 markers obtained from cultivated strawberry: Sachinoka and 2,162 markers obtained from strawberry intermediate mother farm 2, and strawberry. It was newly identified by QTL (Quantitative Trait Loci) analysis using anthrax resistance data. Note that strawberry anthracnose resistance is a quantitative trait that is considered to involve many genes and has a continuous distribution. That is, strawberry anthracnose resistance is evaluated based on the prevalence of strawberry anthracnose with a continuous distribution. Genetic analysis software QTL Cartographer (Wang S., C. J. Basten, and Z.-B. Zeng (2010). Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC) The Composite interval mapping (CIM) method is applied.
  • QTL Cartographer Wang S., C. J. Basten, and Z.-B. Zeng (2010). Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC
  • This 29.0 cM region contains the 10 types of markers shown in Table 1 in this order.
  • the marker name is a name given to the marker uniquely acquired in the present invention.
  • the strawberry genus plant anthracnose resistance related marker according to the present invention is a continuous nucleic acid region sandwiched between the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the chromosome of the strawberry plant.
  • the peak contained in the 29.0 cM region is present in a region sandwiched between a marker (IA200064) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and a marker (IA202631) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8. .
  • This 29.0 cM region includes both a marker linked to a trait that improves anthracnose resistance and a marker linked to a trait that reduces anthracnose resistance.
  • the marker consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 is a marker (reciprocal manufacturer) linked to a trait that reduces anthrax resistance, and all others are anthrax. It is a marker linked to a trait that improves resistance.
  • a continuous nucleic acid region contained in the 29.0 cM region shown in Table 1 can be used as a marker related to resistance to anthracnose plant anthracnose.
  • the nucleic acid region is such that the identity with other regions existing in the chromosome of the strawberry genus plant is 95% or less, preferably 90% or less, more preferably 80% or less, and most preferably 70% or less. This means a region consisting of a simple base sequence. If the identity of the nucleic acid region that is a strawberry genus plant anthracnose resistance related marker and the other region is in the above range, the nucleic acid region can be specifically detected according to a standard method.
  • the identity value can be calculated using default parameters using, for example, BLAST.
  • the base length of the nucleic acid region that is a strawberry genus plant anthracnose resistance related marker should be at least 8 bases long, preferably 15 bases long, more preferably 20 bases long, most preferably 30 bases long. Can do. If the base length of the nucleic acid region that is a strawberry genus plant anthracnose resistance-related marker is in the above range, the nucleic acid region can be specifically detected according to a conventional method.
  • anthracnose resistance-related marker among the 10 markers contained in the 29.0 cM region, from the region sandwiched between the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 It is preferable to be selected. This is because the peak exists in a region sandwiched between the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and the base sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • the strawberry genus plant anthracnose resistance-related marker can be a nucleic acid region containing one type of marker selected from the ten types of markers shown in Table 1 above.
  • a strawberry genus plant anthracnose resistance-related marker it is preferable to use a nucleic acid region containing a marker (IA202631) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 closest to the peak position.
  • the base sequence of the nucleic acid region containing the marker can be specified by an adjacent sequence acquisition method such as inverse PCR using a primer designed based on the base sequence of the marker.
  • a plurality of regions can be used as a marker related to resistance to anthracnose plant anthracnose from the nucleic acid region sandwiched between the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the chromosome of the strawberry genus plant.
  • the above 10 kinds of markers themselves can be used as strawberry genus plant anthracnose resistance related markers. That is, one or a plurality of regions selected from 10 regions consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 10 can be used as a strawberry plant anthracnose resistance-related marker.
  • a marker IA202631 consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 closest to the peak position.
  • a region sandwiched between a marker consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 7 (IA200826) and a marker consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 8 (IA202631) can be used as a strawberry plant anthracnose resistance-related marker.
  • a strawberry genus plant anthracnose resistance-related marker was identified from 1,502 markers obtained from Sachinoka and 2,162 markers obtained from Strawberry Middle Mother Honno No.2. Here, these 1,502 and 2,162 markers will be described.
  • a DNA microarray to which the methods disclosed in JP 2011-120558 A and International Publication 2011/074510 are applied can be used.
  • the design method of the probe used for the DNA microarray is as follows. First, genomic DNA is extracted from Sachinoka or Ichigo Intermediate Mother Farm 2 (step 1a). Next, the extracted genomic DNA is digested with one or more restriction enzymes (step 1b). In the example shown in FIG. 1, genomic DNA is digested using two types of restriction enzymes, restriction enzyme A and restriction enzyme B, in this order.
  • restriction enzyme is not particularly limited, and for example, PstI, EcoRI, HindIII, BstNI, HpaII, HaeIII and the like can be used.
  • the restriction enzyme can be appropriately selected in consideration of the appearance frequency of the recognition sequence so that a genomic DNA fragment having a length of 20 to 10,000 bases is obtained when the genomic DNA is completely digested.
  • a plurality of restriction enzymes it is preferable that the genomic DNA fragment after using all restriction enzymes has a length of 200 to 6000 bases.
  • the order of restriction enzymes to be used for the treatment is not particularly limited, and when the processing conditions (solution composition, temperature, etc.) are common, a plurality of restriction enzymes are used in the same reaction system. May be used in That is, in the example shown in FIG.
  • restriction enzyme A and restriction enzyme B are used in this order to digest genomic DNA, but restriction enzyme A and restriction enzyme B are simultaneously used in the same reaction system.
  • Genomic DNA may be digested, or genomic DNA may be digested using restriction enzyme B and restriction enzyme A in this order. Further, the number of restriction enzymes used may be 3 or more.
  • an adapter is bound to the genomic DNA fragment after the restriction enzyme treatment (step 1c).
  • the adapter is not particularly limited as long as it can bind to both ends of the genomic DNA fragment obtained by the restriction enzyme treatment described above.
  • a primer that has a single strand complementary to the protruding ends (sticky ends) formed at both ends of genomic DNA by restriction enzyme treatment, and is used in the amplification process described in detail later Having a primer binding sequence capable of hybridizing can be used.
  • the adapter one having a single strand complementary to the protruding end (adhesive end) and having a restriction enzyme recognition site for incorporation into a vector for cloning can also be used.
  • a plurality of adapters corresponding to each restriction enzyme can be prepared and used. That is, a plurality of adapters having a single strand complementary to each of a plurality of types of protruding ends generated when genomic DNA is digested with a plurality of restriction enzymes can be used.
  • the plurality of adapters corresponding to the plurality of restriction enzymes may have a common primer binding sequence so that a common primer can hybridize, or different primers can hybridize with each other. May have different primer binding sequences.
  • the adapter when digesting genomic DNA using a plurality of restriction enzymes, may be one restriction enzyme selected from the plurality of restriction enzymes used or a part of the restriction enzymes used. A corresponding adapter can also be prepared and used.
  • a genomic DNA fragment with adapters added to both ends is amplified (step 1d).
  • the genomic DNA fragment can be amplified by using a primer that can hybridize to the primer binding sequence.
  • a genomic DNA fragment to which an adapter has been added can be cloned into a vector using the adapter sequence, and the genomic DNA fragment can be amplified using a primer that can hybridize to a predetermined region in the vector.
  • PCR can be used as an example of the amplification reaction of a genomic DNA fragment using a primer.
  • genomic DNA fragments obtained by treatment with multiple restriction enzymes An adapter will be connected to all of these.
  • all the genomic DNA fragments obtained can be amplified by performing a nucleic acid amplification reaction using the primer binding sequence contained in the adapter.
  • genomic DNA is digested using a plurality of restriction enzymes, and one restriction enzyme selected from the plurality of restriction enzymes used or an adapter corresponding to a part of the restriction enzymes used is used.
  • one restriction enzyme selected from the plurality of restriction enzymes used or an adapter corresponding to a part of the restriction enzymes used is used.
  • the base sequence of the amplified genomic DNA fragment is determined (step 1e), and one or more regions having a base length shorter than the genomic DNA fragment and covering at least a part of the genomic DNA fragment are identified. Then, the specified region or regions are designed as probes in the cultivated strawberry (step 1f).
  • the method for determining the base sequence of the genomic DNA fragment is not particularly limited, and a conventionally known method using a DNA sequencer to which the Sanger method or the like is applied can be used.
  • the region to be designed is, for example, 20 to 100 bases long, preferably 30 to 90 bases long, more preferably 50 to 75 bases long as described above.
  • DNA microarrays can be made.
  • 1,502 and 2,162 markers including the 10 types of strawberry genus plant anthracnose resistance-related markers shown in SEQ ID NOs: 1 to 10 described above can be identified. .
  • the present inventors obtained signal data using the above-described DNA microarray for the known cultivated strawberry varieties Sachinoka, strawberry intermediate mother farm No. 2 and their progeny lines (133 lines). .
  • genotype data is obtained from the obtained signal data, and based on this genotype data, genetic map creation software AntMap (Iwata H, Ninomiya S (2006) AntMap: constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm (Breed Sci 56: 371-378) was used to calculate the position information of the marker on the chromosome using the genetic distance calculation formula Kosambi.
  • ⁇ Use of strawberry plant anthracnose resistance related marker> By using the strawberry genus plant anthracnose resistance-related marker, it is possible to determine whether the strawberry genus plant (for example, a progeny line) whose anthracnose resistance is unknown is a line showing anthrax resistance.
  • using a strawberry genus plant anthracnose resistance related marker means a form using a method of specifically amplifying a nucleic acid fragment containing the marker, a form using a DNA microarray having a probe corresponding to the marker. Including meaning.
  • the method of specifically amplifying a nucleic acid fragment containing a strawberry genus plant anthracnose resistance-related marker means using a so-called nucleic acid amplification method.
  • the nucleic acid amplification method include a method using a primer designed to specifically amplify a target nucleic acid fragment, and a method of specifically amplifying a target nucleic acid fragment without using a primer.
  • the primer that specifically amplifies a target nucleic acid fragment means an oligonucleotide that can amplify a nucleic acid fragment containing a strawberry plant anthracnose resistance-related marker defined as described above by a nucleic acid amplification method.
  • the nucleic acid amplification method using a primer is not particularly limited, and any method may be used as long as it amplifies a nucleic acid fragment typified by a PCR (Polymerase Chain Reaction) method.
  • the RCA Rolling Circle Amplification
  • CPT Chiping Probe Technology
  • ICAN Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic Acids
  • LAMP Loop-Mediated Isothermal Amplificaton of
  • SDA Strand Displacement Amplification
  • NASBA Nucleic acid Sequence-based Amplification method
  • TMA Transcription mediated amplification method
  • nucleic acid amplification reactions for example, when PCR is used, a pair of primers is designed so as to sandwich a strawberry plant anthracnose resistance related marker in the chromosome of a strawberry plant.
  • a pair of primers is designed so as to sandwich a strawberry plant anthracnose resistance related marker in the chromosome of a strawberry plant.
  • four types of primers are designed so as to interpose a strawberry genus plant anthracnose resistance related marker in the chromosome of a strawberry genus plant.
  • the nucleic acid amplification method without using a primer is not particularly limited, and examples thereof include an LCR (LigaseigChain Reaction) method.
  • LCR LiigaseigChain Reaction
  • a plurality of oligonucleotides that hybridize to a nucleic acid fragment containing a strawberry genus plant anthracnose resistance-related marker are designed.
  • nucleic acid amplification method when the strawberry genus plant anthracnose resistance-related marker is present in the strawberry genus plant to be examined, a nucleic acid fragment containing the marker can be obtained as an amplification product. .
  • a desired nucleic acid fragment is amplified by a nucleic acid amplification method using a chromosome extracted from a strawberry plant to be tested as a template, it is determined that the strawberry plant to be tested has anthrax resistance. be able to.
  • a method of observing specific fluorescence by subjecting the solution after amplification reaction to agarose electrophoresis and binding a fluorescent intercalator such as Ethidium Bromide or SYBR Green nucleic acid Examples include adding a fluorescent intercalator to the amplification reaction solution and performing fluorescence detection after the amplification reaction, performing nucleic acid amplification reaction using a fluorescently labeled primer, and performing fluorescence detection after the amplification reaction, etc. Can do.
  • the base length of the amplified fragment containing the marker varies depending on the principle of the nucleic acid amplification method, etc., for example, 30 to 10000 bases
  • the length may be 50 to 5000 bases, more preferably 70 to 2000 bases.
  • a plurality of strawberry plant anthracnose resistance-related markers may be detected. That is, a plurality of regions selected from the nucleic acid region sandwiched between the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the chromosome of the strawberry genus plant are used as the strawberry genus plant anthracnose resistance related markers, and the plurality of strawberry A marker related to the genus plant anthracnose resistance may be detected. For example, a plurality of regions selected from 10 regions consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 10 may be used as a strawberry genus plant anthracnose resistance related marker, and the plurality of regions may be detected.
  • the region consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 7 (IA200826) and the region consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 8 (IA202631) are used as strawberry genus plant anthracnose resistance-related markers, respectively.
  • the presence or absence of a strawberry genus plant anthracnose resistance related marker can be confirmed.
  • a region sandwiched between a region consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 7 (IA200826) and a region consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 8 (IA202631) is used as a strawberry plant anthracnose resistance related marker.
  • the presence or absence of a strawberry genus plant anthracnose resistance related marker can be confirmed by amplification by a nucleic acid amplification method.
  • the probe is a strawberry genus plant anthracnose resistance-related marker defined as described above.
  • the DNA microarray having the probe may be any microarray using a flat substrate such as glass or silicone as a carrier, a bead array using a microbead as a carrier, or a three-dimensional microarray in which a probe is fixed to the inner wall of a hollow fiber. It may be a type of microarray.
  • strawberry genus plants with an unknown anthracnose resistance phenotype represented by progeny strains, etc. Judgment can be made.
  • the strawberry genus plant anthracnose resistance-related marker described above is detected using a conventionally known method, and the test strawberry genus plant is made resistant to anthracnose disease. You may judge whether it is a strain
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • genomic DNA is extracted from the strawberry genus plant.
  • This test strawberry genus plant is a strawberry genus plant with an unknown anthracnose resistance phenotype such as a progeny strain and / or a parent strawberry genus plant used in producing a progeny strain, and anthrax It is the strawberry genus plant used as the object which determines whether it has the character of being excellent in resistance.
  • the extracted genomic DNA is digested with the restriction enzymes used in preparing the DNA microarray described in the above section ⁇ Identification of Markers in Strawberry Plant> to prepare a plurality of genomic DNA fragments.
  • the obtained genomic DNA fragment is ligated to the adapter used in preparing the DNA microarray.
  • the genomic DNA fragment with adapters added to both ends is amplified using the primers used in preparing the DNA microarray. Thereby, the genomic DNA fragment derived from the strawberry genus plant corresponding to the genomic DNA fragment amplified in step 1d when preparing the DNA microarray can be amplified.
  • a predetermined genomic DNA fragment may be selectively amplified among the genomic DNA fragments to which the adapter is added.
  • a genomic DNA fragment to which a specific adapter is added can be selectively amplified.
  • the adapter is added by adding the adapter only to the genomic DNA fragment having a protruding end corresponding to the predetermined restriction enzyme. Genomic DNA fragments can be selectively amplified. Thus, it can concentrate by selectively amplifying a predetermined genomic DNA fragment.
  • a label is added to the amplified genomic DNA fragment.
  • Any conventionally known substance may be used as the label.
  • the label for example, fluorescent molecules, dye molecules, radioactive molecules and the like can be used.
  • This step can be omitted by using a nucleotide having a label in the step of amplifying the genomic DNA fragment. This is because the amplified DNA fragment is labeled by amplifying the genomic DNA fragment using a nucleotide having a label in the above step.
  • the genomic DNA fragment having the label is brought into contact with the DNA microarray under predetermined conditions, and the probe immobilized on the DNA microarray and the genomic DNA fragment having the label are hybridized.
  • high stringency conditions for hybridization.
  • Stringency conditions can be adjusted by reaction temperature and salt concentration. That is, higher stringency conditions are achieved at higher temperatures, and higher stringency conditions are achieved at lower salt concentrations. For example, when a probe having a length of 50 to 75 bases is used, higher stringency conditions can be obtained by setting the hybridization conditions to 40 to 44 ° C., 0.2% SDS, and 6 ⁇ SSC.
  • hybridization between the probe and the genomic DNA fragment having a label can be detected based on the label. That is, after the hybridization reaction of the genomic DNA fragment having the above-described label and the probe, the unreacted genomic DNA fragment is washed, and then the label of the genomic DNA fragment specifically hybridized to the probe is observed. .
  • the label is a fluorescent substance
  • the fluorescence wavelength is detected
  • the label is a dye molecule
  • the dye wavelength is detected.
  • an apparatus such as a fluorescence detection apparatus or an image analyzer that is used for normal DNA microarray analysis can be used.
  • the strawberry genus plant has the above-mentioned strawberry genus plant anthracnose resistance-related marker by a method using a nucleic acid amplification method or a method using a DNA microarray.
  • anthracnose resistance It can be judged that it is an excellent lineage and variety.
  • anthracnose resistance As described above, among the strawberry genus plant anthracnose resistance related markers, if there is no strawberry genus plant anthracnose resistance related marker linked to a trait that reduces anthracnose resistance, anthracnose resistance It can be judged that it is an excellent line and variety.
  • the strawberry genus plant anthracnose resistance related marker was used prior to seedling selection or instead of seedling selection. It is preferable to make a judgment. Thereby, in an actual field, the number which grows a good system
  • Genomic DNA was extracted from each of these cultivated strawberry varieties by the CTAB method (Cetyl trimethyl ammonium bromide method). The extracted genomic DNA (180 ng) was treated with restriction enzyme PstI (NEB, 6unit) at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, genomic DNA (150 ng) after PstI treatment was added with restriction enzyme BstNI (NEB, 5 units) and treated at 60 ° C. for 1 hour.
  • genomic DNA fragment (15 ng) having the adapter obtained in (3) was added to a PstI sequence adapter recognition primer (5′-GATGGATCCAGTGCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 13)) and Taq polymerase (Takara Bio PrimeSTAR, 1.25unit) and genomic DNA by PCR (30 cycles of 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds, 72 ° C for 1 minute, treated at 72 ° C for 3 minutes, and stored at 4 ° C) The fragment was amplified.
  • PstI sequence adapter recognition primer (5′-GATGGATCCAGTGCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 13)
  • Taq polymerase Takara Bio PrimeSTAR, 1.25unit
  • Probe design and preparation of DNA microarray A 50-75 bp probe was designed based on the genomic sequence information of (5). Based on the nucleotide sequence information of the designed probes, a DNA microarray having these probes was prepared.
  • Genomic DNA was extracted from these cultivated strawberry varieties and hybrid progeny by the CTAB method.
  • the extracted genomic DNA 180 ng
  • the extracted genomic DNA (180 ng) was treated with restriction enzyme PstI (NEB, 6unit) at 37 ° C. for 1 hour.
  • genomic DNA 150 ng
  • BstNI restriction enzyme BstNI
  • genomic DNA fragment (15 ng) having the adapter obtained in (3) was added to a PstI sequence adapter recognition primer (5′-GATGGATCCAGTGCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 13)) and Taq polymerase (Takara Bio PrimeSTAR, 1.25unit) and genomic DNA by PCR (30 cycles of 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds, 72 ° C for 1 minute, treated at 72 ° C for 3 minutes, and stored at 4 ° C) The fragment was amplified.
  • PstI sequence adapter recognition primer (5′-GATGGATCCAGTGCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 13)
  • Taq polymerase Takara Bio PrimeSTAR, 1.25unit
  • Hybrid signal detection Using the labeled sample of (5), according to NimbleGen Array User's Guide, 1. Hybridization was carried out using the DNA microarray prepared in step 1, and a signal based on the label was detected.
  • the strawberry anthracnose strain (Glomerella cingulate) owned by the National Institute of Agricultural and Food Research, National Institute of Agricultural and Food Industry is in PS liquid medium (20g mashed potato and 2% sucrose per 1000ml). The culture was shaken (120 rpm) for 5 days. The culture broth was filtered through gauze, and conidia were adjusted to a concentration of 10 5 cells / ml as an inoculum (conidia spore suspension). On September 19, 2012, from 3:00 pm, when the temperature began to drop, the plant body without adjusting the inoculation source (conidial spore suspension) with a battery-operated shoulder power sprayer was sprayed to such an extent that it was totally wet.
  • the effect (%) column indicates the anthracnose wilt / dead strain rate. Therefore, when the numerical value of the effect (%) is negative, it means that the QTL is linked to a trait that improves anthracnose resistance.
  • the marker located in the vicinity of the said peak is inherited in connection with the causative gene (group) which has the function to improve anthrax resistance, it is related with an anthracnose plant anthracnose resistance. It was shown that it can be used as a marker. That is, it has been clarified that the ten types of markers shown in FIG. 4 can be used as strawberry genus plant anthrax resistance-related markers.
  • Table 3 shows the base sequence of the probe prepared in this example and the threshold value of the signal value.
  • FIG. 5 to FIG. 14 show the results of detecting signals from markers IA204069 to IA201502 for Sachinoka and Strawberry Middle Mother Farm No. 2 and their progeny using the probes shown in Table 3, respectively.
  • Nakamother No. 2 * means strawberry intermediate mother farm No. 2). The detection results are summarized in Table 4.
  • primers were designed to amplify the markers IA202631 and IA200826 by PCR from the region of the markers IA204069 to IA201502 in the 23rd linkage group of Strawberry Intermediate Mother Farm No.2.
  • Primer preparation Using sequence assembly software ATGC ver.6, primers were prepared for identifying each sequence from the sequence information of markers IA202631 and IA200826. Specifically, CGGTTAACCCCTCCTAGAAAATC (IA202631F_2A: SEQ ID NO: 24) and TGCAGCTGTGAGGTTGTCTTTAT (IA202631R_111A: SEQ ID NO: 25) were designed for IA202631, and CTGCAGAAAAGGGAGAAGAAGTTC (IA200826F_1A: SEQ ID NO: 26) and GCCAGATG Similarly, using the sequence assembly software ATGC ver.6, primers for identifying the respective sequences were prepared from the sequence information of the markers IA202531 and IA200064.
  • GCTACTCATAGTAGGTCGATTGGAAG SEQ ID NO: 28 and CTGCAGTTTACATGCAGCAGA: SEQ ID NO: 29 were designed for IA202531
  • AAGTTCAACATTATCAAGGAAAATGAA SEQ ID NO: 30
  • AATTGATAACTATTAACAGCAGTCAGG SEQ ID NO: 31 were designed for IA200064.
  • the results of PCR amplification of the marker IA202531 are shown in FIG. As shown in FIG. 20, the marker IA202531 also showed that the target band pattern could be amplified by the primer pair designed as described above, in agreement with the signal data shown in Table 4.
  • the PCR-amplified DNA fragments were sequenced by the Sanger method after PCR using the strawberry cultivar Sachinoka or Strawberry Intermediate Mother Farm 2 Genomic DNA as a template.
  • the sequence information shown in SEQ ID NO: 32 was obtained from the Sachikawa genome, and the sequence information shown in SEQ ID NO: 32 and the sequence information shown in SEQ ID NO: 4 were obtained from the intermediate mother farm 2 genome.
  • the 257th position in SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 4 was found to be SNP (A in SEQ ID NO: 32, T in SEQ ID NO: 4).
  • the 257th A to 6 bases coincided with the recognition sequence (ATGCAT) of the restriction enzyme Nsi I.
  • the marker IA200064 was PCR amplified in the same manner as the other markers described above, and NsiI (NEB, 2 units) was added to the PCR-amplified DNA fragment and treated at 37 ° C for 1 hour.
  • the DNA fragment treated with the restriction enzyme was confirmed by electrophoresis (2.0% agarose gel, TAE, 100% v 30 minutes).
  • the results of PCR amplification of the marker IA200064 and restriction enzyme treatment are shown in FIG.
  • In Sachinoka which has a restriction enzyme recognition site, bands appeared near 247 bases and 261 bases.
  • Nakamahon No. 2 showed bands near 500 bases in addition to bands near 247 bases and 261 bases. .
  • the band near 500 bases coincided with the signal data shown in Table 4, indicating that the target band pattern can be amplified by the primer pair designed as described above.
  • Genomic DNA extraction Newly, genomic DNA was extracted by the CTAB method for the two progeny lines (A and B) of the strawberry cultivar Sachinoka and Strawberry Intermediate Mother Farm No. 2. II. Examination with selected markers The genomic DNA (15 ng) of the strawberry cultivar Sachinoka, Strawberry Middle Mother Farm No.
  • IA202631 primer pair IA202631F_2A and IA202631R_111A
  • IA200826 primer pair IA200826F_1A and IA200826R_259A
  • Taq polymerase Takara Bio Inc., PrimeSTAR, 0.5 unit
  • PCR 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 5 seconds
  • Amplification was performed at 72 ° C for 1 minute, 30 cycles, treated at 72 ° C for 3 minutes, and stored at 4 ° C.
  • the PCR amplified DNA fragment was confirmed by electrophoresis (2.0% agarose gel, TAE, 100 v 30 minutes).
  • the progeny A of the hybrid did not have any of the markers IA202631 and IA200826.
  • the progeny line B of the hybrid had both IA202631 and IA200826 markers.
  • III. Comparison with Anthrax Test Data As a result of the anthracnose test, the anthracnose wilt / dead strains of the progeny A line and the progeny B line were 80.0% and 13.3%, respectively. As a result of the T test, a significant difference was observed in the anthracnose wilt / dead strain rates of line A and line B at a significance level of 1%.
  • the progeny line B of the hybrid carrying the IA202631 and IA200826 markers had a low anthracnose wilt / dead strain rate and was excellent in resistance to strawberry anthracnose.
  • the progeny line A of the hybrid that did not possess any of the markers of IA202631 and IA200826 had a high anthracnose wilt / dead strain rate and was inferior in resistance to strawberry anthracnose. From the above results, it has been clarified that by using these markers, it is possible to discriminate strains excellent in anthrax resistance and strains inferior in anthrax resistance.
  • PCR amplification in the inter-marker region The primer pair (IA200826F_1A and IA202631R_111A) and Taq polymerase (Takara Bio Inc., PrimeSTAR, 0.5 unit) were added to the genomic DNA (15 ng) of the strawberry cultivar Sachinoka or Strawberry Intermediate Mother Farm 2 In addition, amplification was performed by PCR (98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 5 seconds, 72 ° C for 2 minutes, 25 cycles, treated at 72 ° C for 3 minutes, and stored at 4 ° C). The PCR amplified DNA fragment was confirmed by electrophoresis (2.0% agarose gel, TAE, 100 v 30 minutes). The results are shown in FIG. As shown in FIG.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

　イチゴ属植物について多数のDNAマーカーを開発し、これら多数のDNAマーカーを用いることで炭疽病抵抗性を高精度に判定する。　イチゴ属植物の染色体における配列番号１に示す塩基配列及び配列番号１０に示す塩基配列により挟まれる連続する核酸領域からなる、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカー。

Description

イチゴ属植物の炭疽病抵抗性関連マーカーとその利用
　本発明は、イチゴ炭疽病に対する抵抗性を示すイチゴ属植物系統を選抜することができる炭疽病抵抗性関連マーカー及びその利用方法に関する。
　DNAマーカー（遺伝マーカーや遺伝子マーカーとも称される）の開発により、植物の品種改良において、有用形質や不良形質の有無を迅速に且つ効率的に判別することが可能となっている。DNAマーカーの開発は、シロイヌナズナやイネといったモデル植物のみならず、様々な実用植物においても進捗しており、品種改良において大いに役立っている。
　非特許文献１には、栽培イチゴにおいて統合型高密度連鎖地図を開発したとの報告がある。非特許文献１によれば、以前より約300個のamplified fragment length polymorphism (AFLP)マーカーからなる連鎖地図の報告があるものの、８倍体と複雑なゲノムを有するため、栽培イチゴについてはより高密度な連鎖地図の開発が望まれているとある。また、非特許文献１では、F. vessca及びF.×ananassaについて単純反復配列（simple sequence repeat）マーカーを開発し、統合型高密度連鎖地図を構築している。具体的には、02-19、Sachinoka、Kaorino、Akihime及び0212921の5品種・系統を用いて連鎖地図を作製し、これを統合して１つの統合型高密度連鎖地図を作成している。非特許文献１では、02-19については575個のマーカー、Sachinokaについては556個のマーカー、Kaorinoについては294個のマーカー、Akihimeについては318個のマーカー及び0212921については822個のマーカーを開発している。しかし、非特許文献１に開示された統合型高密度連鎖地図では、座上するマーカー数が無い連鎖群が存在しており、特にマーカー数が少ないKaorinoやAkihimeではその傾向は顕著である。さらに、非特許文献１に開示された統合型高密度連鎖地図は、すべての連鎖地図がカバーされていないと考察している。
　また、非特許文献２には、イチゴ炭疽病抵抗性品種の開発を効率的に進めるため、イチゴ炭疽耐病性と連鎖するDNAマーカーを開発したと記載されている。非特許文献２には、Random Amplified Polymorphic DNA法（RAPD法）、AFLP法及びSSR法によりマーカーを用いて連鎖地図を作製し、耐病性連鎖マーカーを解析したとある。その結果、非特許文献２によれば、いちご中間母本農２号を交配した集団に利用することで、育種集団を１／８に減らすことができ、約７０％の確率で耐病性系統を判別できるマーカーを開発できたとある。
　なお、イチゴ炭疽病については、非特許文献３に記載されるように、Glomerella cingulate及びColletotrichum acutatumがその原因菌として知られている。
　一方、例えば、特許文献１にはテンサイ黒根病抵抗性品種選抜マーカーを開発したことが開示され、特許文献２にはトウモロコシについて目的の形質に連鎖したマーカーを利用する選抜技術が開示されている。
DNA Research 20, 79-92, (2013) 栃木県農業試験場　研究成果集第２９号、第５１～５２頁 Microbiol. Cult. Coll., 25(1): 27-32, 2009
WO2007/125958 特開2010-516236号公報
　ところが、上述したテンサイやトウモロコシで開発されてきたDNAマーカー技術は、イチゴ属植物において殆ど進んでいないのが現状であった。非特許文献１にはSSRマーカーを開発し、統合型高密度連鎖地図を構築したことが記載されるものの、多倍数性で複雑なゲノム構造のイチゴ属植物において目的とする形質に連鎖するDNAマーカーを選抜するには十分とは言えなかった。また、非特許文献２には、イチゴ炭疽病耐病性と連鎖するDNAマーカーを開発したと記載されるものの、QTL解析の結果としてはLOD（logarithym of odds）値や寄与率が高いとは言えず、優れたマーカーとは評価できなかった。
　そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、多倍数性で複雑なゲノム構造のイチゴ属植物について多数のDNAマーカーを開発し、これら多数のDNAマーカーを用いることで炭疽病抵抗性を高精度に判定することができる炭疽病抵抗性関連マーカー及びその利用方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、イチゴ属植物における多数のマーカーを準備し、交雑後代系統における量的形質とマーカーとの連鎖解析によって、炭疽病抵抗性といった量的形質に連鎖するマーカーを見いだし、本発明を完成するに至った。
　本発明は以下を包含する。
（１）イチゴ属植物の染色体における配列番号１に示す塩基配列及び配列番号１０に示す塩基配列により挟まれる連続する核酸領域からなる、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカー。
（２）上記核酸領域は、配列番号１～１０からなる群から選ばれるいずれか１の塩基配列又は当該塩基配列の一部を含むことを特徴とする（１）記載のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカー。
（３）上記核酸領域は、イチゴ属植物の染色体における配列番号４に示す塩基配列と配列番号８に示す塩基配列とにより挟み込まれる領域に位置することを特徴とする（１）記載のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカー。
（４）少なくとも一方の親がイチゴ属植物である後代植物の染色体及び/又は当該親のイチゴ属植物の染色体を抽出する工程と、
　上記で得られた染色体における上記（１）乃至（３）いずれか１に記載のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を測定する工程とを含む、炭疽病抵抗性が向上したイチゴ属植物系統の製造方法。
（５）上記測定する工程では、上記イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを特異的に増幅するプライマーを用いた核酸増幅反応により当該イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を測定することを特徴とする（４）記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
（６）上記測定する工程では、上記イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーに対応するプローブを備えるDNAチップを使用することを特徴とする（４）記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
（７）上記後代植物は種子又は幼苗であり、当該種子又は幼苗から染色体を抽出することを特徴とする（４）記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013-186688号、2014-165405号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明によれば、イチゴ属植物における量的形質の中でも炭疽病抵抗性に連鎖する新規なイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを提供することができる。本発明に係るイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを利用することによって、イチゴ属植物の交配系統における炭疽病抵抗性を検定することができる。これにより、炭疽病抵抗性が向上した特性を有するイチゴ属植物系統を非常に低コストに識別することができる。
イチゴ属植物染色体のマーカーを得る際に使用したDNAマイクロアレイの製造フローを示す模式図である。 DNAマイクロアレイを使用したシグナル検出の工程を示す模式図である。 実施例で使用したイチゴ属植物品種・系統群について2012年10月19日に調査した炭疽病抵抗性データを示す特性図である。 炭疽病抵抗性に関するQTL解析の結果（いちご中間母本農２号における第２３連鎖群）を示す特性図である。 各系統におけるIA204069のシグナル値を示す特性図である。 各系統におけるIA204291のシグナル値を示す特性図である。 各系統におけるIA202531のシグナル値を示す特性図である。 各系統におけるIA200064のシグナル値を示す特性図である。 各系統におけるIA205184のシグナル値を示す特性図である。 各系統におけるIA202854のシグナル値を示す特性図である。 各系統におけるIA200826のシグナル値を示す特性図である。 各系統におけるIA202631のシグナル値を示す特性図である。 各系統におけるIA202517Rのシグナル値を示す特性図である。 各系統におけるIA201502のシグナル値を示す特性図である。 マーカーIA200826をPCR増幅した結果を示す電気泳動写真である。 マーカーIA202631をPCR増幅した結果を示す電気泳動写真である。 図３に示した炭疽病抵抗性データとマーカーIA200826の遺伝子型データとを比較して示す特性図である。 イチゴ品種さちのか、いちご中間母本農２号および交雑後代2系統(A及びB)において、マーカーIA202631及びマーカーIA200826をPCR増幅した結果を示す電気泳動写真である。 イチゴ品種さちのか、いちご中間母本農２号および交雑後代2系統(A及びB)において、マーカーIA202631及びマーカーIA200826を含む領域をPCR増幅した結果を示す電気泳動写真である。 マーカーIA202531をPCR増幅した結果を示す電気泳動写真である。 マーカーIA200064をPCR増幅し、制限酵素処理した結果を示す電気泳動写真である。
　以下、本発明に係るイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカー及びその利用方法、特にイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを用いたイチゴ属植物系統の製造方法について説明する。
＜イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカー＞
　本発明に係るイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとは、イチゴ属植物の染色体上に存在する特定の領域であり、イチゴ属植物炭疽病抵抗性という形質を判別できる機能を有する。すなわち、既知のイチゴ属植物を用いて得られた後代系統において、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を確認することで炭疽病抵抗性の向上という形質を有する系統であると判断することができる。なお、本発明において、イチゴ炭疽病とは、Microbiol. Cult. Coll., 25(1): 27-32, 2009に記載されるように、Glomerella cingulate及び/又はColletotrichum acutatumが感染することに起因して病班が形成される病気を意味している。特に、本発明において、イチゴ炭疽病とは、Glomerella cingulataの感染を原因とする病気としても良い。
　また、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとは、炭疽病抵抗性が向上する形質に連鎖するマーカーと、炭疽病抵抗性が低下する形質に連鎖するマーカーの両者を含む意味である。例えば、特定のイチゴ属植物において、前者のマーカーが存在していれば炭疽病抵抗性が向上した品種と判断できる。さらに、特定のイチゴ属植物において、前者のマーカーが存在し、且つ、後者のマーカーが非存在である場合には炭疽病抵抗性が向上した品種であるとより高精度に判断できる。なお、特定のイチゴ属植物において、後者のマーカーが非存在であることのみをもって、炭疽病抵抗性が向上した品種であると判断しても良い。
　特に、前者のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーは、イチゴ属植物の炭疽病抵抗性といった形質の原因遺伝子（群）に連鎖した領域と考えられる。
　ここで、イチゴ属植物とは、バラ科イチゴ属(Fragaria L.)に属する植物の全てを含む意味である。すなわち、イチゴ属植物としては、一般的な栽培イチゴであるオランダイチゴ(Fragaria × ananassa)等の交雑種を挙げることができる。また、イチゴ属植物としては、栽培イチゴの祖先種となるF. virginiana並びにF. chiloensis、シロバナノヘビイチゴ（F. vesca）、ノウゴウイチゴ（F. iinumae）、モリイチゴ（F. nipponica）、F. nubicola、F. bucharica、F. daltoniana、F. orientalis、F. corimbosa、F. moschata及びF. iturupensis等の野生種を挙げることができる。さらに、イチゴ属植物としては、栽培イチゴ（F. × ananassa）における既知の品種・系統も含む意味である。栽培イチゴにおける既知の品種・系統としては、特に限定されず、日本国内にて使用可能なあらゆる品種・系統、日本国外において使用されている品種・系統等を含む意味である。例えば、栽培イチゴの日本国内育成品種としては、特に限定されないが、とよのか、サンチーゴ、純ベリー、女峰、ピーストロ、リンダモール、とちおとめ、アイストロ、栃の峰、章姫、紅ほっぺ、とちひめ、さちのか、けいきわせ、さがほのか、アイベリー、カレンベリー、レッドパール、さつまおとめ、福岡S6（あまおう）、濃姫、ひのみね及び宝交早生等を挙げることができる。また、栽培イチゴの品種としては、所定の特性の獲得を目的とした品種改良に利用する育種素材である中間母本である、いちご中間母本農１号及びいちご中間母本農２号を挙げることができる。いちご中間母本農２号は炭疽病抵抗性の育成系統である83118-41と抵抗性品種Doverの交配から育成された育種素材である。なお、いちご中間母本農２号の炭疽病抵抗性は、抵抗性品種宝交早生やDoverと同程度以上であり、また罹病性品種との交配実生集団において高度抵抗性個体の出現率が高く、イチゴ炭疽病抵抗性を有する新品種育成へ利用されている。
　イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を確認する対象の植物としては、上述したイチゴ属植物、上述したイチゴ属植物を利用した後代系統とすることができる。後代系統は、母本及び父本のいずれか一方が上述したイチゴ属植物であればよく、いわゆる同種交配による系統であっても良いし、交雑系統であっても良い。また、後代系統は、いわゆる戻し交配によって得られたものでも良い。
　特に、栽培イチゴ（F. × ananassa）を対象として、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を確認することが好ましい。さらに、栽培イチゴの中でも上述した各種の品種・系統を用いた品種改良において、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を確認することが好ましい。すなわち、この場合、作出した新品種についてイチゴ炭疽病抵抗性を判別することができる。よって、新品種としては、イチゴ炭疽病抵抗性を有する品種を少なくとも一方の親として得た品種であることが好ましい。より詳細には、例えば、いちご中間母本農２号を一方の親として作出した新品種について、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を確認し、イチゴ炭疽病抵抗性を評価することができる。
　本発明に係るイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーは、栽培いちご：さちのかから取得した1,502個のマーカー及びいちご中間母本農２号から取得した2,162個のマーカーを含む遺伝子連鎖地図と、イチゴ炭疽病抵抗性データとを用いたQTL（Quantitative Trait Loci）解析によって新たに同定されたものである。なお、イチゴ炭疽病抵抗性は、多数の遺伝子が関与していると考えられ、連続分布をとる量的形質である。すなわち、イチゴ炭疽病抵抗性は、連続分布をとるイチゴ炭疽病への罹患率に基づいて評価される。QTL解析には、遺伝解析ソフトQTL Cartographer（Wang S., C. J. Basten, and Z.-B. Zeng (2010). Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC）を使用し、Composite interval mapping（CIM）法を適用している。
　具体的に、上述したQTL解析により、ロッドスコア（LOD score）が所定の閾値（例えば2.5）以上となる領域を上記遺伝子連鎖地図に見いだした。この領域は約29.0cM（センチモルガン）であり、いちご中間母本農２号の第２３連鎖群に含まれる領域であった。ここで、「モルガン（Ｍ）」は、染色体上の遺伝子間の距離を相対的に示した単位であり、交叉価をパーセントにした値である。イチゴ属植物の染色体において、1cMは、約400kbに相当する。なお、この領域には、ロッドスコアが約18.3のピークが存在しており、当該ピーク位置又はその近傍にイチゴ属植物炭疽病抵抗性を向上させる形質の原因遺伝子（群）が存在することが示唆される。
　この29.0cMの領域には、表１に示す１０種類のマーカーがこの順で含まれている。なお、表１において、マーカー名とは、本発明で独自に取得したマーカーに付された名称である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　すなわち、本発明に係るイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーは、イチゴ属植物の染色体における配列番号１に示す塩基配列及び配列番号１０に示す塩基配列により挟まれる連続する核酸領域である。ここで、上記29.0cMの領域に含まれるピークは、配列番号４に示す塩基配列からなるマーカー（IA200064）及び配列番号８に示す塩基配列からなるマーカー（IA202631）により挟み込まれる領域に存在している。
　また、この29.0cMの領域には、炭疽病抵抗性が向上する形質に連鎖するマーカーと、炭疽病抵抗性が低下する形質に連鎖するマーカーの両者を含んでいる。表１に示す１０種類のマーカーのうち、配列番号９に示す塩基配列からなるマーカー（IA202517R）は、炭疽病抵抗性が低下する形質に連鎖するマーカー（相反メーカー）であり、その他は全て炭疽病抵抗性が向上する形質に連鎖するマーカーである。
　表１に示した29.0cMの領域に含まれる連続した核酸領域を、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとして使用することができる。ここで、核酸領域とは、イチゴ属植物の染色体に存在する他の領域との同一性が９５％以下、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、最も好ましくは７０％以下となるような塩基配列からなる領域を意味する。イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとなる核酸領域と他の領域との同一性が上記範囲であれば、定法に従って、当該核酸領域を特異的に検出することができる。ここで、同一性の値は、例えばＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出することができる。
　また、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとなる核酸領域の塩基長は、少なくとも８塩基長以上、好ましくは１５塩基長以上、より好ましくは２０塩基長以上、最も好ましくは３０塩基長とすることができる。イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとなる核酸領域の塩基長が上記範囲であれば、定法に従って、当該核酸領域を特異的に検出することができる。
　特に、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとしては、上記29.0cMの領域に含まれる１０種類のマーカーのうち、配列番号４に示す塩基配列と配列番号８に示す塩基配列とにより挟み込まれる領域から選ばれることが好ましい。上記ピークが配列番号４に示す塩基配列と配列番号８に示す塩基配列とにより挟み込まれる領域に存在するためである。
　また、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとしては、上記表１に示した１０種類のマーカーから選ばれる１種類のマーカーを含む核酸領域とすることもできる。例えば、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとしては、ピークの位置に最も近い配列番号８に示す塩基配列からなるマーカー（IA202631）を含む核酸領域を使用することが好ましい。このとき、マーカーを含む核酸領域の塩基配列は、当該マーカーの塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いたインバースPCR等の隣接配列取得法によって特定することができる。
　さらに、イチゴ属植物の染色体における配列番号１に示す塩基配列及び配列番号１０に示す塩基配列により挟まれる核酸領域から、複数の領域をイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとすることもできる。
　さらにまた、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとしては、上記１０種類のマーカーそのものを使用することができる。すなわち、配列番号１～１０の塩基配列からなる１０個の領域から選ばれる１又は複数の領域をイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとすることができる。例えば、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとしては、ピークの位置に最も近い配列番号８に示す塩基配列からなるマーカー（IA202631）を使用することが好ましい。或いは、例えば、配列番号７の塩基配列からなるマーカー（IA200826）と配列番号８の塩基配列からなるマーカー（IA202631）とで挟み込まれる領域をイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとすることもできる。
＜イチゴ属植物におけるマーカーの同定＞
　本発明では、上述したように、さちのかから取得した1,502個のマーカー及びいちご中間母本農２号から取得した2,162個のマーカーからイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを特定した。ここでは、これら1,502個と2,162個のマーカーについて説明する。このマーカーを同定する際には、特開2011-120558号公報や国際公開公報2011/074510に開示された方法を適用したDNAマイクロアレイを使用することができる。
　具体的に、当該DNAマイクロアレイに使用するプローブの設計方法は、図１に示すように、先ず、さちのか或いはいちご中間母本農２号からゲノムDNAを抽出する（工程1a）。次に、抽出したゲノムDNAを１又は複数の制限酵素により消化する（工程1b）。なお、図１に示した例では、制限酵素Ａ及び制限酵素Ｂの２種類の制限酵素をこの順で用いてゲノムDNAを消化している。ここで、制限酵素としては、特に限定されないが、例えば、PstI、EcoRI、HindIII、BstNI、HpaII、HaeIII等を使用することができる。特に制限酵素としては、ゲノムDNAを完全に消化した際に20～10000塩基長のゲノムDNA断片となるよう、認識配列の出現頻度等を考慮して適宜選択することができる。また、複数の制限酵素を使用する場合、全ての制限酵素を使用した後のゲノムDNA断片が200～6000塩基長となっていることが好ましい。さらに、複数の制限酵素を使用する場合、処理に供する制限酵素の順序は特に限定されず、また、処理条件（溶液組成や温度等）が共通する場合には複数の制限酵素を同一の反応系で使用しても良い。すなわち、図１に示した例においては、制限酵素Ａ及び制限酵素Ｂをこの順で使用してゲノムDNAを消化しているが、制限酵素Ａ及び制限酵素Ｂを同じ反応系で同時に使用してゲノムDNAを消化しても良いし、制限酵素Ｂ及び制限酵素Ａをこの順で使用してゲノムDNAを消化してもよい。さらに、使用する制限酵素の数は３以上であってもよい。
　次に、制限酵素処理後のゲノムDNA断片に対してアダプターを結合する（工程1c）。ここで、アダプターとは、上述した制限酵素処理によって得られたゲノムDNA断片の両端に結合できるものであれば特に限定されない。アダプターとしては、例えば、制限酵素処理によってゲノムDNAの両末端に形成される突出末端（粘着末端）に対して相補的な一本鎖を有し、詳細を後述する増幅処理の際に使用するプライマーがハイブリダイズしうるプライマー結合配列を有するものを使用することができる。また、アダプターとしては、上記突出末端（粘着末端）に対して相補的な一本鎖を有し、クローニングする際のベクターに組み入れるための制限酵素認識部位を有するものを使用することもできる。
　また、複数の制限酵素を使用してゲノムDNAを消化した場合には、各制限酵素に対応する複数のアダプターを準備して使用することができる。すなわち、複数の制限酵素でゲノムDNAを消化した場合に生ずる複数種類の突出末端のそれぞれに対して、相補的な一本鎖を有する複数のアダプターを使用することができる。このとき、複数の制限酵素に対応する複数のアダプターは、共通するプライマーがハイブリダイズできるように共通するプライマー結合配列を有しているものであっても良いし、それぞれ異なるプライマーがハイブリダイズできるように異なるプライマー結合配列を有するものであっても良い。
　さらに、複数の制限酵素を使用してゲノムDNAを消化した場合、アダプターとしては、使用した複数の制限酵素のなかから選ばれる１つの制限酵素若しくは、使用した制限酵素のうち一部の制限酵素に対応するアダプターを準備して使用することもできる。
　次に、両末端にアダプターが付加されたゲノムDNA断片を増幅する（工程1d）。プライマー結合配列を有するアダプターを使用した場合には、当該プライマー結合配列にハイブリダイズできるプライマーを使用することで上記ゲノムDNA断片を増幅することができる。或いは、アダプターを付加したゲノムDNA断片を、アダプター配列を利用してベクターにクローニングし、当該ベクターにおける所定の領域にハイブリダイズできるプライマーを用いてゲノムDNA断片を増幅することができる。なお、プライマーを用いたゲノムDNA断片の増幅反応としては、一例としてPCRを使用することができる。
　また、複数の制限酵素を使用してゲノムDNAを消化するとともに、各制限酵素に対応する複数のアダプターをゲノムDNA断片に連結した場合、複数の制限酵素を用いた処理によって得られたゲノムDNA断片の全てにアダプターが連結されることとなる。この場合、アダプターに含まれるプライマー結合配列を用いて核酸増幅反応を行うことで、得られた全てのゲノムDNA断片を増幅することができる。
　或いは、複数の制限酵素を使用してゲノムDNAを消化するとともに、使用した複数の制限酵素のなかから選ばれる１つの制限酵素若しくは、使用した制限酵素のうち一部の制限酵素に対応するアダプターをゲノムDNA断片に連結した場合、得られたゲノムDNA断片のうち、選ばれた制限酵素の認識配列を両末端に有するゲノムDNA断片のみを増幅することができる。
　次に、増幅されたゲノムDNA断片の塩基配列を決定し（工程1e）、当該ゲノムDNA断片より短い塩基長を有し、ゲノムDNA断片内の少なくとも一部をカバーする１又は複数の領域を特定し、特定した１又は複数の領域を、栽培いちごにおけるプローブとして設計する（工程1f）。ゲノムDNA断片の塩基配列を決定する方法は、特に限定されず、サンガー法等を適用したDNAシークエンサーを利用した従来公知の方法を使用することができる。ここで、設計する領域としては、上述したように、例えば20～100塩基長、好ましくは30～90塩基長、より好ましくは50～75塩基長とする。
　以上のように、栽培いちごから抽出したゲノムDNAを使用して多数のプローブを設計し、設計したプローブの塩基配列に基づいて、担体上にて目的の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成することでDNAマイクロアレイを作製することができる。このように作製したDNAマイクロアレイを使用することで、上述した配列番号１～１０に示した１０種類のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを含む1,502個と2,162個のマーカーを同定することができる。
　より具体的に、本発明者らは、既知の栽培いちご品種さちのか、いちご中間母本農２号及びこれらの交配後代系統（133系統）について、上述したDNAマイクロアレイを用いてシグナルデータを取得した。そして、得られたシグナルデータから遺伝子型データを取得し、この遺伝子型データを元にして、遺伝地図作成ソフトウェアAntMap（Iwata H, Ninomiya S (2006) AntMap: constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm. Breed Sci 56: 371-378）を使用し、遺伝距離計算式Kosambiにより染色体におけるマーカーの位置情報を算出した。さらに、取得したマーカーの位置情報をもとに、Mapmaker/EXP ver.3.0（A Whitehead Institute for Biomedical Research Technical Report, Third Edition, January, 1993）により遺伝地図データシートを作成した。その結果、上述した配列番号１～１０に示した１０種類のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを含む1,502個と2,162個のマーカーを同定している。
＜イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの利用＞
　イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを利用することで、炭疽病抵抗性が未知であるイチゴ属植物（例えば、後代系統）について炭疽病抵抗性を示す系統であるか判断することができる。ここで、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを利用するとは、当該マーカーを含む核酸断片を特異的に増幅する方法を利用する形態、当該マーカーに対応するプローブを有するDNAマイクロアレイを利用する形態を含む意味である。
　イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを含む核酸断片を特異的に増幅する方法とは、いわゆる核酸増幅法を利用することを意味する。核酸増幅法としては、目的とする核酸断片を特異的に増幅するように設計したプライマーを使用する方法、プライマーを使用することなく目的とする核酸断片を特異的に増幅する方法が挙げられる。
　目的とする核酸断片を特異的に増幅するプライマーとは、核酸増幅法によって、上述のように定義されたイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを含む核酸断片を増幅できるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーを使用する核酸増幅法としては、特に限定されず、PCR(Polymerase Chain Reaction)法に代表される核酸断片を増幅させるものであればどのようなものでもかまわない。例えば、PCR法以外に、RCA(Rolling Circle Amplification)法、CPT(Cycling Probe Technology)法、ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic Acids)法、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplificaton of DNA)法、SDA(Strand Displacement Amplification)法、NASBA(Nucleic acid Sequence-based Amplification method)法、及びTMA(Transcription mediated amplification method)法等の公知の方法が例示できるが、これらに限定されるものではない。
　これら核酸増幅反応のうち例えばPCR法を利用する場合、イチゴ属植物の染色体におけるイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを挟み込むように一対のプライマーを設計する。また、LAMP法を利用する場合、イチゴ属植物の染色体におけるイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを挟み込むように４種類のプライマーを設計する。
　プライマーを使用しない核酸増幅法としては、特に限定されないが、LCR(Ligase Chain Reaction)法を挙げることができる。ただし、LCR法においても、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを含む核酸断片にハイブリダイズする複数のオリゴヌクレオチドを設計する。
　以上のように、核酸増幅法によれば、検査対象のイチゴ属植物に上記イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーが存在している場合、当該マーカーを含む核酸断片を増幅産物として得ることができる。言い換えると、検査対象のイチゴ属植物から抽出した染色体を鋳型とした核酸増幅法によって所期の核酸断片を増幅した場合には、当該検査対象のイチゴ属植物が炭疽病抵抗性を有すると判断することができる。
　増幅した核酸断片を検出するには、特に限定されないが、増幅反応後の溶液をアガロース電気泳動にかけ、Ethidium BromideやSYBR Greenなどの蛍光性インターカレーターを結合させ特異的な蛍光を観察する方法、核酸増幅反応の溶液に蛍光性インターカレーターを添加し、増幅反応後の蛍光検出を行う方法、蛍光標識されたプライマーを用いて核酸増幅反応を行い、増幅反応後の蛍光検出を行う方法等を挙げることができる。
　なお、核酸増幅法を利用してイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを検出する場合、当該マーカーを含む増幅断片の塩基長は、核酸増幅方法の原理等によっても異なるが、例えば30～10000塩基長とすることができ、50～5000塩基長とすることが好ましく、70～2000塩基長とすることがより好ましい。
　また、イチゴ属植物における炭疽病抵抗性を判定する際、複数のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを検出しても良い。すなわち、イチゴ属植物の染色体における配列番号１に示す塩基配列及び配列番号１０に示す塩基配列により挟まれる核酸領域から選ばれる複数の領域をイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとし、これら複数のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを検出しても良い。例えば、配列番号１～１０の塩基配列からなる１０個の領域から選ばれる複数の領域をイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとし、これら複数の領域を検出しても良い。
　一例としては、配列番号７の塩基配列からなる領域（IA200826）と配列番号８の塩基配列からなる領域（IA202631）とをそれぞれイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとし、これら各領域を核酸増幅法により増幅してイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存否を確認することができる。或いは、一例として、配列番号７の塩基配列からなる領域（IA200826）と配列番号８の塩基配列からなる領域（IA202631）とで挟み込まれる領域をイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとし、この領域を核酸増幅法により増幅してイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存否を確認することができる。
　一方、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーに対応するプローブを有するDNAマイクロアレイを利用する形態において、当該プローブとは、上述のように定義されたイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーに対して、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを意味する。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、上述のように定義されたイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの塩基配列又はその相補鎖の少なくとも連続する１０塩基、１５塩基、２０塩基、２５塩基、３０塩基、３５塩基、４０塩基、４５塩基、５０塩基又はそれ以上の塩基長の部分領域若しくは全領域として設計することができる。なお、このプローブを有するDNAマイクロアレイとしては、ガラスやシリコーン等の平面基板を担体とするマイクロアレイや、マイクロビーズを担体とするビーズアレイ、或いは中空繊維の内壁にプローブを固定する３次元マイクロアレイ等の如何なるタイプのマイクロアレイであってもよい。
　以上のように作製されたDNAマイクロアレイを使用することで、後代系統等に代表される炭疽病抵抗性の表現型が未知のイチゴ属植物について、炭疽病抵抗性に優れるという表現型を示す系統であるか判断することができる。なお、上述したDNAマイクロアレイを使用する方法以外であっても、従来公知の手法を用いて上述したイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを検出して、供試イチゴ属植物について炭疽病抵抗性に優れるという形質を有する系統であるか判断してもよい。DNAマイクロアレイを使用する方法以外の方法としては、例えば、上述したプローブを用いた、いわゆるFISH（fluorescence in situ hybridization）法を適用することができる。
　DNAマイクロアレイを使用する方法をより詳細に説明する。図２に示すように、先ず供試イチゴ属植物からゲノムDNAを抽出する。この供試イチゴ属植物とは、後代系統等の炭疽病抵抗性の表現型が未知のイチゴ属植物及び/又は後代系統を作製する際に使用した親のイチゴ属植物のことであり、炭疽病抵抗性に優れるといった形質を有するか判定する対象となるイチゴ属植物である。
　次に、抽出したゲノムDNAを、上記＜イチゴ属植物におけるマーカーの同定＞の欄で説明したDNAマイクロアレイを作製する際に使用した制限酵素で消化して複数のゲノムDNA断片を調整する。次に、得られたゲノムDNA断片と、DNAマイクロアレイを作製する際に使用したアダプターとを連結する。次に、両末端にアダプターが付加されたゲノムDNA断片を、DNAマイクロアレイを作製する際に使用したプライマーを用いて増幅する。これにより、DNAマイクロアレイを作製する際の工程1dで増幅したゲノムDNA断片に対応する、供試イチゴ属植物由来のゲノムDNA断片を増幅することができる。
　この工程においては、アダプターが付加されたゲノムDNA断片のうち、所定のゲノムDNA断片を選択的に増幅してもよい。例えば、複数の制限酵素に対応する複数のアダプターを使用した場合には、特定のアダプターが付加されたゲノムDNA断片を選択的に増幅することができる。また、複数の制限酵素でゲノムDNAを消化した場合、得られたゲノムDNA断片のうち、所定の制限酵素に対応する突出末端を有するゲノムDNA断片のみにアダプターを付加することで、アダプターが付加されたゲノムDNA断片を選択的に増幅することができる。このように、所定のゲノムDNA断片を選択的に増幅することで濃縮することができる。
　次に、増幅したゲノムDNA断片に標識を付加する。標識としては、従来公知の如何なる物質を使用しても良い。標識としては、例えば蛍光分子、色素分子、放射性分子等を使用することができる。なお、本工程は、ゲノムDNA断片を増幅する工程において標識を有するヌクレオチドを用いることで省略することができる。上記工程において標識を有するヌクレオチドを用いてゲノムDNA断片を増幅することで、増幅されたDNA断片が標識化されるためである。
　次に、標識を有するゲノムDNA断片を所定の条件下でDNAマイクロアレイに接触させ、DNAマイクロアレイに固定されたプローブと標識を有するゲノムDNA断片とをハイブリダイズさせる。このとき、ハイブリダイズさせる際には高いストリンジェンシー条件とすることが好ましい。このような高いストリンジェンシー条件とすることによって、供試イチゴ属植物にイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーが存在しているか否かを、より高精度に判定することができる。なお、ストリンジェンシー条件は、反応温度及び塩濃度で調節することができる。すなわち、より高温とすることでより高いストリンジェンシー条件となり、またより低い塩濃度でより高いストリンジェンシー条件となる。例えば、50～75塩基長のプローブを使用する場合、ハイブリダイゼーション条件としては、40～44℃、0.2%SDS、6×SSCの条件とすることでより高いストリンジェンシー条件とすることができる。
　また、プローブと標識を有するゲノムDNA断片とのハイブリダイズは、標識に基づいて検出することができる。すなわち、上述した標識を有するゲノムDNA断片とプローブのハイブリダイズ反応の後、未反応のゲノムDNA断片等を洗浄し、その後、プローブに対して特異的にハイブリダイズしたゲノムDNA断片の標識を観察する。例えば、標識が蛍光物質である場合にはその蛍光波長を検出し、標識が色素分子であればその色素波長を検出する。より具体的には、通常のDNAマイクロアレイ解析に使用している、蛍光検出装置やイメージアナライザー等の装置を使用することができる。
　以上のように、核酸増幅法を利用する方法或いはDNAマイクロアレイを使用する方法により、供試イチゴ属植物が上述したイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを有するか否か判断することができる。ここで、上述したように、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーのうち、炭疽病抵抗性に優れるという形質に連鎖するイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーが存在していれば、炭疽病抵抗性に優れる系統・品種と判断できる。また、上述したように、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーのうち、炭疽病抵抗性が低下する形質に連鎖するイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーが非存在であれば、炭疽病抵抗性に優れる系統・品種と判断できる。
　特に、上述した方法では、供試イチゴ属植物を実際の炭疽病抵抗性試験を実施可能な程度まで成長させる必要はなく、例えば後代系統の種子や当該種子を発芽させた幼苗を使用することができる。したがって、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを利用することによって、供試イチゴ属植物を生育させるための圃場やその他、生育のためのコストを大幅に削減することができる。また、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを利用することによって、実際に炭疽菌の原因微生物（Glomerella cingulate及び/又はColletotrichum acutatum）を感染させる必要がなく、大規模専用温室や専用圃場、外部との隔離施設など設備等にかかるコストを削減できる。
　特に、イチゴ属植物の新品種作出に際して、先ず、交配により数万種類の交配種を作製した後、実生選抜に先立って若しくは実生選抜に代えて、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを利用した判断を行うことが好ましい。これにより、実際の圃場において、優良な系統を栽培する数を大幅に削減することができ、イチゴ属植物の新品種作出に係る手間やコストを大幅に抑制することができる。
　或いは、イチゴ属植物の新品種作出に際して、先ず、交配に使用する親品種におけるイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在の有無を判定し、炭疽病抵抗性に優れた親品種を選抜することもできる。炭疽病抵抗性に優れた親品種を優先的に使用して後代系統を作出することで、炭疽病抵抗性に優れた後代系統が高頻度に出現すると期待できる。これにより、優良な系統を栽培する数を大幅に削減することができ、イチゴ属植物の新品種作出に係る手間やコストを大幅に抑制することができる。
　以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
１．DNAマイクロアレイ用プローブの作成
(1)材料
　栽培いちご品種：さちのか及びいちご中間母本農２号を用いた。
(2)制限酵素処理 
　これら栽培いちご品種からそれぞれゲノムDNAをCTAB法（Cetyl trimethyl ammonium bromide法）により抽出した。抽出したゲノムDNA(180ng)を制限酵素PstI(NEB社、6unit)で37℃、1時間処理した。その後、PstI処理後のゲノムDNA(150ng)を制限酵素BstNI(NEB社、5unit)を添加、60℃で1時間処理した。
(3)アダプターライゲーション 
　(2)で処理したゲノムDNA断片(120ng)にPstI配列アダプター(5’-CACGATGGATCCAGTGCA-3’（配列番号１１）、5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’ （配列番号１２）)とT4 DNA Ligase(NEB社、800 unit)を加え、16℃で4時間以上の条件でライゲーション反応を行った。これにより、(2)で処理したゲノムDNA断片のうち、両末端にPstI認識配列を有するゲノムDNA断片に対して選択的にアダプターを付加した。
(4)PCR増幅
　(3)で得られたアダプターを有するゲノムDNA断片(15ng)にPstI配列アダプター認識プライマー(5’-GATGGATCCAGTGCAG-3’（配列番号１３）)とTaq polymerase(タカラバイオ社PrimeSTAR、1.25unit)を加え、PCR(98℃を10秒間、55℃を15秒間、72℃を1分間を1サイクルとして30サイクル実施後、72℃で3分間処理後、4℃で保存)でゲノムDNA断片を増幅した。
(5)ゲノムシークエンス取得
　(4)においてPCR増幅したゲノムDNA断片についてGAII(Illumina社)を用いて塩基配列を決定した。
(6)プローブ設計及びDNAマイクロアレイの作成
　(5)のゲノムシークエンス情報をもとに50～75bpのプローブを設計した。設計したプローブの塩基配列情報をもとに、これらプローブを有するDNAマイクロアレイを作製した。
２．DNAマイクロアレイを用いたシグナルデータの取得
(1)材料
　栽培いちご品種：さちのか、いちご中間母本農２号及びこれらの交雑後代133系統を用いた。
(2)制限酵素処理
　これら栽培いちご品種及び交雑後代からそれぞれゲノムDNAをCTAB法により抽出した。抽出したゲノムDNA(180ng)を制限酵素PstI(NEB社、6unit)で37℃、1時間処理した。その後、PstI処理後のゲノムDNA(150ng)を制限酵素BstNI(NEB社、5unit)を添加、60℃で1時間処理した。
(3)アダプターライゲーション
　(2)で処理したゲノムDNA断片(120ng)にPstI配列アダプター(5’-CACGATGGATCCAGTGCA-3’（配列番号１１）、5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’ （配列番号１２）)とT4 DNA Ligase(NEB社、800 unit)を加え、16℃で4時間以上の条件でライゲーション反応を行った。これにより、(2)で処理したゲノムDNA断片のうち、両末端にPstI認識配列を有するゲノムDNA断片に対して選択的にアダプターを付加した。
(4)PCR増幅
　(3)で得られたアダプターを有するゲノムDNA断片(15ng)にPstI配列アダプター認識プライマー(5’-GATGGATCCAGTGCAG-3’（配列番号１３）)とTaq polymerase(タカラバイオ社PrimeSTAR、1.25unit)を加え、PCR(98℃を10秒間、55℃を15秒間、72℃を1分間を1サイクルとして30サイクル実施後、72℃で3分間処理後、4℃で保存)でゲノムDNA断片を増幅した。
(5)ラベル化
　上述した(4)で得られたPCR増幅断片をカラム(Qiagen社)で精製後、NimbleGen Arrays User’s Guideに従ってNimbleGen One-Color DNA Labelingを用いてラベル化サンプルを調整した。
(6)ハイブリ・シグナル検出 
　(5)のラベル化サンプルを用い、NimbleGen Array User's Guideに従い、上記１．で作製したDNAマイクロアレイを用いてハイブリダイズを行い、ラベルに基づくシグナルを検出した。
３．イチゴ属植物炭疽病抵抗性のQTLの同定及びマーカーの開発
(1)遺伝地図データ作成
　さちのか、いちご中間母本農２号、交雑後代133系統のシグナルデータから、さちのか型の1,502個のマーカー及びいちご中間母本農２号型の2,162個のマーカーとなりうる遺伝子型データを取得した。遺伝子型データをもとに、遺伝地図作成ソフトウェアAntMap（Iwata H, Ninomiya S (2006) AntMap: constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm. Breed Sci 56: 371-378）を使用し、遺伝距離計算式Kosambiにより染色体におけるマーカーの位置情報を算出してマーカーの遺伝地図データを取得した。
(2)イチゴ炭疽病検定試験データの取得
　さちのか、いちご中間母本農２号、交雑後代103系統のランナー増殖したクローン株を検定株とした。各検定株について１区５株×３反復で栽培した。接種２日前までに展開葉が３～４枚になるように下葉を除去して葉数をそろえた。
　そして、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構の野菜茶業研究所が保有しているイチゴ炭疽病菌株（Glomerella cingulate）をPS液体培地(1000mlに対しマッシュポテト20g、しょ糖2％)中にて５日間振盪培養(120rpm)した。培養液をガーゼで濾過した後、分生胞子を105個/mlの濃度に調整したものを接種源(分生胞子懸濁液)とした。2012年9月19日、気温が低下し始める午後３時より、調整した接種源(分生胞子懸濁液)を電池式肩掛け動力噴霧器にて、展着剤などは添加せずに、植物体が全体的に濡れる程度まで噴霧した。
　その後、寒冷紗で内張遮光をしたガラス室内で発病させた。接種当日から翌日の昼までガラス室を閉めきり、多湿に保った。その後、天窓・側窓を自動開閉(25℃)として、温度は成り行きで管理した。イチゴ炭疽病罹病株の調査は、10月19日に各品種・系統について萎凋もしくは枯死した株の割合として調査した。調査結果を図３に示した。
(3)量的形質（Quantitative trait loci: QTL）の解析
　上記(1)で得られた遺伝地図データ及び上記(2)で得られたイチゴ炭疽病検定試験データ（萎凋・枯死株率）をもとに、遺伝解析ソフトQTL Cartographer（Wang S., C. J. Basten, and Z.-B. Zeng (2010). Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC）を使用し、Composite interval mapping（CIM）法によりQTL解析を行った。LODの閾値は2.5を用いた。その結果、図４に示すように、いちご中間母本農２号の第23連鎖群のマーカーIA204069からIA201502の区間内にLOD値18.3のイチゴの炭疽病抵抗性に関する遺伝子の存在を示唆するピークを確認することができた。得られたピークは表２に示すように特定することができ、当該ピークの位置に炭疽病抵抗性を向上させる機能を有する原因遺伝子（群）が存在することが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　なお、表２において効果（％）の欄は、炭疽病萎凋・枯死株率を示している。よって、効果（％）の数値が負である場合、当該QTLは炭疽病抵抗性が向上する形質に連鎖することを意味している。
　そして、図４に示すように、当該ピークの近傍に位置するマーカーは、炭疽病抵抗性を向上させる機能を有する原因遺伝子（群）と連鎖して遺伝するため、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーとして使用できることが示された。すなわち、図４に示した１０種類のマーカーは、イチゴ属植物炭疽病抗性関連マーカーとして使用できることが明らかとなった。
　また、本実施例で作成したプローブの塩基配列及びシグナル値の閾値を表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示したプローブを利用して、さちのか及びいちご中間母本農２号、並びに後代系統について、マーカーIA204069からIA201502のシグナルを検出した結果をそれぞれ図５乃至１４に示した（なお、図５乃至１４において中母２号＊はいちご中間母本農２号を意味している）。また、検出結果を表４に纏めて示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４及び図５～１４に示すように、いちご中間母本農２号の第23連鎖群のマーカーIA204069からIA201502の領域は、イチゴ属植における炭疽病萎凋・枯死株率(%)と高い関連性を示すことが明らかとなった。
４．PCRベースマーカーの開発 
　また、本実施例では、いちご中間母本農２号の第23連鎖群のマーカーIA204069からIA201502の領域のなかからマーカーIA202631及びIA200826をPCRによって増幅するプライマーを設計した。
(1)プライマー作製
　シーケンスアセンブリソフトウェアATGC ver.6を使い、マーカーIA202631及びIA200826の配列情報から、それぞれの配列を識別するプライマーを作製した。すなわち、IA202631についてはCGGTTAACCCCTCCTAGAAAATC（IA202631F_2A：配列番号２４）とTGCAGCTGTGAGGTTGTCTTTAT（IA202631R_111A：配列番号２５）を設計し、IA200826についてはCTGCAGAAAAGGGAGAAGAAGTTC（IA200826F_1A：配列番号２６）とGCCAGATGAAATAGAAGATTAGCACC（IA200826R_259A：配列番号２７）を設計した。 
　また、同様に、シーケンスアセンブリソフトウェアATGC ver.6を使い、マーカーIA202531及びIA200064の配列情報から、それぞれの配列を識別するプライマーを作製した。すなわち、IA202531についてはGCTACTCATAGTAGGTCGATTGGAAG：配列番号２８とCTGCAGTTTACATGCAGCAGA：配列番号２９を設計し、IA200064についてはAAGTTCAACATTATCAAGGAAAATGAA：配列番号３０とAATTGATAACTATTAACAGCAGTCAGG：配列番号３１を設計した。
(2)PCR増幅
　イチゴ品種さちのか、いちご中間母本農２号および交雑後代12系統のゲノムDNA（15ng）に、上記プライマーペアとTaq polymerase（タカラバイオ社、PrimeSTAR、0.5 unit）を加え、PCR（98℃を10秒間、55℃を5秒間、72℃を1分間、30サイクル後、72℃で3分間処理後、4℃で保存）で増幅した。PCR増幅したDNA断片は、電気泳動（2.0 %アガロースゲル、TAE、100 v 30分）により確認した。マーカーIA200826をPCR増幅した結果を図１５に示し、マーカーIA202631をPCR増幅した結果を図１６に示した。図１５及び図１６に示すように、表４に示したシグナルデータと一致して、いずれのプライマーペアも目的のバンドパターンを増幅できることが示された。
　また、マーカーIA202531をPCR増幅した結果を図２０に示した。図２０に示すように、マーカーIA202531についても、表４に示したシグナルデータと一致して、上述のように設計したプライマーペアにより目的のバンドパターンを増幅できることが示された。
　ところで、マーカーIA200064については、イチゴ品種さちのか、いちご中間母本農２号のゲノムDNAを鋳型としたPCRの後、PCR増幅したDNA断片をサンガー法でシーケンスした。その結果、さちのかゲノムからは配列番号３２に示す配列情報が得られ、中間母本農２号ゲノムからは配列番号３２に示す配列情報と配列番号４に示す配列情報とが得られた。配列番号３２と配列番号４とにおける257番目は、SNP（配列番号３２ではA、配列番号４ではT）であることが判明した。配列番号３２において、257番目のAから６塩基（ATGCAT）は、制限酵素Nsi Iの認識配列（ATGCAT）と一致していた。
　そして、マーカーIA200064を上記他のマーカーと同様にPCR増幅し、PCR増幅したDNA断片にNsi I（NEB社、2 unit）を加え、37℃で1時間処理した。制限酵素処理したDNA断片は、電気泳動（2.0 %アガロースゲル、TAE、100 v 30分）により確認した。マーカーIA200064をPCR増幅し、制限酵素処理した結果を図２１に示した。制限酵素認識部位を有するさちのかでは247塩基と261塩基近傍にバンドが現れたが、一方、中間母本農２号では、247塩基と261塩基近傍のバンドに加え500塩基近傍にバンドが現れた。図２１に示すように、500塩基近傍のバンドは、表４に示したシグナルデータと一致して、上述のように設計したプライマーペアにより目的のバンドパターンを増幅できることが示された。
５．炭疽病抵抗性系統の選抜
(1)遺伝子型データと炭疽病萎凋・枯死株率
　イチゴ品種さちのか、いちご中間母本農２号および交雑後代133系統の選抜マーカーIA200826の遺伝子型データと炭疽病萎凋・枯死株率を比較した（図１７）。イチゴ炭疽病への抵抗性に優れる系統の多くは、選抜マーカーIA200826を持っていた（平均10.6%）。一方、イチゴ炭疽病への罹病性を示す系統の多くは、選抜マーカーIA200826を持っていなかった（平均49.8%）。T検定の結果、有意水準1%で両平均値に有意な差が認められた。
(2)未知系統の選抜 
I.ゲノムDNAの抽出 
　新たに、イチゴ品種さちのか、いちご中間母本農２号の交雑後代2系統(A及びB)について、CTAB法によりゲノムDNAを抽出した。 
II.選抜マーカーによる検定 
　イチゴ品種さちのか、いちご中間母本農２号および交雑後代2系統(A及びB)のゲノムDNA（15ng）に、上記４．で設計したIA202631プライマーペア（IA202631F_2A及びIA202631R_111A）或いはIA200826プライマーペア（IA200826F_1A及びIA200826R_259A）とTaq polymerase（タカラバイオ社、PrimeSTAR、0.5 unit）を加え、PCR（98℃を10秒間、55℃を5秒間、72℃を1分間、30サイクル後、72℃で3分間処理後、4℃で保存）で増幅した。PCR増幅したDNA断片は、電気泳動（2.0 %アガロースゲル、TAE、100 v 30分）により確認した。その結果を図１８に示した。図１８に示すように、交雑後代A系統は、IA202631及びIA200826のいずれのマーカーも保有していなかった。一方、交雑後代B系統は、IA202631及びIA200826の両方のマーカーを保有していた。 
III.炭疽病検定試験データとの比較
　炭疽病検定試験の結果、交雑後代A系統及び交雑後代B系統の炭疽病萎凋・枯死株率は、それぞれ80.0%と13.3%であった。T検定の結果、有意水準1%で系統Aおよび系統Bの炭疽病萎凋・枯死株率に有意な差が認められた。IA202631及びIA200826マーカーを保有していた交雑後代B系統は、炭疽病萎凋・枯死株率が低く、イチゴ炭疽病の抵抗性に優れていた。一方、IA202631及びIA200826のマーカーをいずれも保有していなかった交雑後代A系統は、炭疽病萎凋・枯死株率が高く、イチゴ炭疽病の抵抗性が劣っていた。以上の結果から、これらのマーカーを利用することで、炭疽病抵抗性に優れる系統、炭疽病抵抗性に劣る系統を判別できることが明らかとなった。
IV.マーカー間領域でのPCR増幅
　イチゴ品種さちのか、いちご中間母本農２号のゲノムDNA（15ng）に、プライマーペア（IA200826F_1AおよびIA202631R_111A）とTaq polymerase（タカラバイオ社、PrimeSTAR、0.5 unit）を加え、PCR（98℃を10秒間、55℃を5秒間、72℃を2分間、25サイクル後、72℃で3分間処理後、4℃で保存）で増幅した。PCR増幅したDNA断片は、電気泳動（2.0 %アガロースゲル、TAE、100 v 30分）により確認した。その結果を図１９に示した。図１９に示すように、いちご中間母本農２号では、1.4kbpのPCR増幅したDNA断片が確認された。すなわち、いちご中間母本農２号の第23連鎖群のマーカーIA204069からIA201502の領域のなかからマーカーIA202631及びIA200826を含む領域をPCRによって増幅することができた。
　この結果から、いちご中間母本農２号の第23連鎖群のマーカーIA204069からIA201502の領域のなかから複数のマーカーを一対のプライマーペアで増幅して、イチゴ属植物炭疽病を判別できることが明らかとなった。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (7)

  1. イチゴ属植物の染色体における配列番号１に示す塩基配列及び配列番号１０に示す塩基配列により挟まれる連続する核酸領域からなる、イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカー。
  2. 上記核酸領域は、配列番号１～１０からなる群から選ばれるいずれか１の塩基配列又は当該塩基配列の一部を含むことを特徴とする請求項１記載のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカー。
  3. 上記核酸領域は、イチゴ属植物の染色体における配列番号４に示す塩基配列と配列番号８に示す塩基配列とにより挟み込まれる領域に位置することを特徴とする請求項１記載のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカー。
  4. 少なくとも一方の親がイチゴ属植物である後代植物の染色体及び/又は当該親のイチゴ属植物の染色体を抽出する工程と、
    　上記で得られた染色体における上記請求項１乃至３いずれか１に記載のイチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を測定する工程とを含む、炭疽病抵抗性が向上したイチゴ属植物系統の製造方法。
  5. 上記測定する工程では、上記イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーを特異的に増幅するプライマーを用いた核酸増幅反応により当該イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーの存在・非存在を測定することを特徴とする請求項４記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
  6. 上記測定する工程では、上記イチゴ属植物炭疽病抵抗性関連マーカーに対応するプローブを備えるDNAチップを使用することを特徴とする請求項４記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
  7. 上記後代植物は種子又は幼苗であり、当該種子又は幼苗から染色体を抽出することを特徴とする請求項４記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
PCT/JP2014/073460 2013-09-09 2014-09-05 イチゴ属植物の炭疽病抵抗性関連マーカーとその利用 WO2015034040A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/917,045 US10982292B2 (en) 2013-09-09 2014-09-05 Marker associated with anthracnose resistance in plant of the genus Fragaria and use thereof
KR1020167005694A KR101789948B1 (ko) 2013-09-09 2014-09-05 딸기속 식물의 탄저병 저항성 관련 마커와 그 이용
CN201480047115.4A CN105531369B (zh) 2013-09-09 2014-09-05 草莓属植物的炭疽病抵抗性相关标志物及其利用
EP14842687.7A EP3045533B1 (en) 2013-09-09 2014-09-05 Marker associated with anthracnose resistance in plants of the genus fragaria and use thereof

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013186688 2013-09-09
JP2013-186688 2013-09-09
JP2014-165405 2014-08-15
JP2014165405A JP6253132B2 (ja) 2013-09-09 2014-08-15 イチゴ属植物の炭疽病抵抗性関連マーカーとその利用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015034040A1 true WO2015034040A1 (ja) 2015-03-12

Family

ID=52628501

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2014/073460 WO2015034040A1 (ja) 2013-09-09 2014-09-05 イチゴ属植物の炭疽病抵抗性関連マーカーとその利用

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10982292B2 (ja)
EP (1) EP3045533B1 (ja)
JP (1) JP6253132B2 (ja)
KR (1) KR101789948B1 (ja)
CN (1) CN105531369B (ja)
WO (1) WO2015034040A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016148275A1 (ja) * 2015-03-18 2016-09-22 トヨタ自動車株式会社 イチゴ属植物の四季成り性関連マーカーとその利用
WO2016148279A1 (ja) * 2015-03-18 2016-09-22 トヨタ自動車株式会社 イチゴ属植物のうどんこ病抵抗性関連マーカーとその利用
JP2016174603A (ja) * 2015-03-18 2016-10-06 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 イチゴ属植物のうどんこ病抵抗性関連マーカーとその利用
JP2016174602A (ja) * 2015-03-18 2016-10-06 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 イチゴ属植物の四季成り性関連マーカーとその利用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102053753B1 (ko) * 2019-01-14 2019-12-09 한국생명공학연구원 탄저병 저항성 딸기 품종 선별용 snp 마커 및 이의 용도

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007125958A1 (ja) 2006-04-28 2007-11-08 National Agriculture And Food Research Organization テンサイ黒根病抵抗性品種選抜マーカーとその選抜方法
JP2010516236A (ja) 2007-01-18 2010-05-20 シンジェンタ・パティシペーションズ・アクチェンゲゼルシャフト 新規なトウモロコシ植物
WO2011074510A1 (ja) 2009-12-14 2011-06-23 トヨタ自動車株式会社 Dnaマイクロアレイにおけるプローブ設計方法、当該方法により設計されたプローブを有するdnaマイクロアレイ
JP2013186688A (ja) 2012-03-08 2013-09-19 Nec Computertechno Ltd ストレージ制御装置、ストレージ装置、ストレージ装置の制御方法及びプログラム
CN103667427A (zh) * 2012-09-07 2014-03-26 上海市农业科学院 用于鉴定草莓种质资源炭疽病抗性的引物序列及其鉴定方法
JP2014165405A (ja) 2013-02-27 2014-09-08 Kyocera Corp 流路部材、これを用いた真空吸着装置および冷却装置ならびに流路部材の製造方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009183224A (ja) 2008-02-07 2009-08-20 Mie Prefecture 病害抵抗性種子繁殖型イチゴ品種の一代雑種育種法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007125958A1 (ja) 2006-04-28 2007-11-08 National Agriculture And Food Research Organization テンサイ黒根病抵抗性品種選抜マーカーとその選抜方法
JP2010516236A (ja) 2007-01-18 2010-05-20 シンジェンタ・パティシペーションズ・アクチェンゲゼルシャフト 新規なトウモロコシ植物
WO2011074510A1 (ja) 2009-12-14 2011-06-23 トヨタ自動車株式会社 Dnaマイクロアレイにおけるプローブ設計方法、当該方法により設計されたプローブを有するdnaマイクロアレイ
JP2011120558A (ja) 2009-12-14 2011-06-23 Toyota Motor Corp Ｄｎａマイクロアレイにおけるプローブ設計方法、当該方法により設計されたプローブを有するｄｎａマイクロアレイ
JP2013186688A (ja) 2012-03-08 2013-09-19 Nec Computertechno Ltd ストレージ制御装置、ストレージ装置、ストレージ装置の制御方法及びプログラム
CN103667427A (zh) * 2012-09-07 2014-03-26 上海市农业科学院 用于鉴定草莓种质资源炭疽病抗性的引物序列及其鉴定方法
JP2014165405A (ja) 2013-02-27 2014-09-08 Kyocera Corp 流路部材、これを用いた真空吸着装置および冷却装置ならびに流路部材の製造方法

Non-Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"A Whitehead Institute for Biomedical Research Technical Report", January 1993
"Abstracts of Research Results", article "Tochigi Prefectural Agricultural Experiment Station", pages: 51 - 52
"Tochigi Prefectural Agricultural Experiment Station", ABSTRACTS OF RESEARCH RESULTS, pages 51 - 52
"Tochigi Prefectural Agricultural Experiment Station", ABSTRACTS OF RESEARCH RESULTS, vol. 29, pages 51 - 52
ANTMAP; IWATA, H; NINOMIYA, S.: "AntMap: constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm", BREED SCI., vol. 56, 2006, pages 371 - 378
DNA RESEARCH, vol. 20, 2013, pages 79 - 92
HIROMASA ENOKI ET AL.: "Array Marker Gijutsu ni yoru Saibai Ichigo Rensa Chizu Kaihatsu Oyobi Tansobyo Teikosei Idenshi Rensa Marker no Kaihatsu", BREEDING RESEARCH, vol. 15, 12 October 2013 (2013-10-12), pages 27, XP008181706 *
IWATA, H.; NINOMIYA, S.: "AntMap: constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm", BREED SCI., vol. 56, 2006, pages 371 - 378
LERCETEAU-KOHLER, E. ET AL.: "Identification of SCAR markers linked to Rca2 anthracnose resistance gene and their assessment in strawberry germplasm", THEORETICAL AND APPLIED GENETICS, vol. 111, 8 July 2005 (2005-07-08), pages 862 - 870, XP019322044 *
MICROBIOL. CULT. COLL., vol. 25, no. 1, 2009, pages 27 - 32
MOUHU, K. ET AL.: "Identification of flowering genes in strawberry, a perennial SD plant", BMC PLANT BIOLOGY, vol. 9, 28 September 2009 (2009-09-28), pages 122, XP021062470, Retrieved from the Internet <URL:http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1471-2229-9-122.pdf> [retrieved on 20141105] *
See also references of EP3045533A4
TOMOHIRO YAMADA ET AL.: "Ichigo Junkan Senbatsu Shudan ni Okeru Tansobyo Teikosei Idenshi no Sonzai ni Tsuite", HORTICULTURAL RESEARCH ( JAPAN, vol. 10, no. 1, 20 March 2011 (2011-03-20), pages 126, XP008180113 *
WANG S.; C. J. BASTEN; Z.-B. ZENG, WINDOWS QTL CARTOGRAPHER 2.5. DEPARTMENT OF STATISTICS, 2010
WHILE DNA RESEARCH, vol. 20, 2013, pages 79 - 92
YUDAI MATSUSHIMA ET AL.: "Micro Array-ho o Mochiita Ichigo Tansobyo Otosei Idenshi no Kensaku", TOCHIGI-KEN NOGYO SHIKENJO KENKYU SEIKASHU, 2010, pages 49, 50, XP008180112 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016148275A1 (ja) * 2015-03-18 2016-09-22 トヨタ自動車株式会社 イチゴ属植物の四季成り性関連マーカーとその利用
WO2016148279A1 (ja) * 2015-03-18 2016-09-22 トヨタ自動車株式会社 イチゴ属植物のうどんこ病抵抗性関連マーカーとその利用
JP2016174603A (ja) * 2015-03-18 2016-10-06 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 イチゴ属植物のうどんこ病抵抗性関連マーカーとその利用
JP2016174602A (ja) * 2015-03-18 2016-10-06 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 イチゴ属植物の四季成り性関連マーカーとその利用
US10704109B2 (en) 2015-03-18 2020-07-07 Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha Marker associated with everbearing properties in plant of genus Fragaria and use thereof
US10724093B2 (en) 2015-03-18 2020-07-28 Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha Marker associated with powdery mildew resistance in plant of genus Fragaria and use thereof
US11384395B2 (en) 2015-03-18 2022-07-12 Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha Marker associated with powdery mildew resistance in plant of genus Fragaria and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US20160201145A1 (en) 2016-07-14
EP3045533A4 (en) 2016-09-07
JP2015070833A (ja) 2015-04-16
KR20160032248A (ko) 2016-03-23
KR101789948B1 (ko) 2017-10-25
CN105531369A (zh) 2016-04-27
US10982292B2 (en) 2021-04-20
CN105531369B (zh) 2018-11-09
EP3045533B1 (en) 2018-07-11
JP6253132B2 (ja) 2017-12-27
EP3045533A1 (en) 2016-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6253132B2 (ja) イチゴ属植物の炭疽病抵抗性関連マーカーとその利用
JP5653957B2 (ja) サトウキビ属植物の黒穂病抵抗性関連マーカーとその利用
US11384395B2 (en) Marker associated with powdery mildew resistance in plant of genus Fragaria and use thereof
JP7161727B2 (ja) サトウキビ属植物の黒穂病抵抗性関連マーカーとその利用
JP6566479B2 (ja) イチゴ属植物の四季成り性関連マーカーとその利用
WO2016148275A1 (ja) イチゴ属植物の四季成り性関連マーカーとその利用
JP2012050429A (ja) サトウキビ属植物の茎長関連マーカーとその利用
WO2016148279A1 (ja) イチゴ属植物のうどんこ病抵抗性関連マーカーとその利用
US20240043862A1 (en) Marker associated with smut resistance in plant belonging to genus saccharum and use thereof
WO2012017682A2 (en) Leaf-blade-length-related marker of plant of the genus saccharum and the use thereof
JP2012115239A (ja) サトウキビの茎数関連マーカーとその利用
JP2012115245A (ja) サトウキビの茎径関連マーカーとその利用
JP2012034626A (ja) サトウキビ属植物の葉面積関連マーカーとその利用
AU2011335966B2 (en) Sugarcane-stalk-sugar-content-related marker and the use thereof
WO2012073496A2 (en) Sugarcane-stalk-weight-related marker and the use thereof
JP2012115244A (ja) サトウキビの可製糖量関連マーカーとその利用
JP2012115238A (ja) サトウキビの一茎重関連マーカーとその利用
KR20170003748A (ko) 토마토 근부위조병 저항성 유전자 선발용 분자마커

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201480047115.4

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14842687

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2014842687

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2014842687

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20167005694

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14917045

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE